Summary
Biz yetişkin fare kardiyomiyositlerin izolasyonu için güvenilir bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol, genetik olarak tadil edilmiş farelerin çeşitli fonksiyonel yetişkin kardiyomiyositlerde kültürü için tutarlı bir sonuç elde edilir.
Abstract
Teknolojik gelişmeler transjenik ve gen knockout farelerde, bir çok araştırma alanlarında gerekli bir araç da dahil olmak üzere, genetik olarak modifiye edilmiş fareler yaptık. Yetişkin kardiyomiyositler yaygın iyi bir kalp hücresel fizyoloji ve patofizyolojisi için model yanı sıra ilaç müdahale olarak kabul edilir. Genetik olarak modifiye edilmiş farenin nedeniyle kardiyomiyositlerde 'terminal farklılaşma verimsiz olan arzu edilen genotip oluşturmak için karmaşık kardiyomiyosit enfeksiyon işlemleri için duyulan ihtiyacı ortadan kaldıracak. Yüksek miktar ve kalite fonksiyonel kardiyomiyositlerin izolasyonu ve kültürü önemli ölçüde kardiyovasküler araştırma yararlanacak ve hücre sinyal iletimi araştırma ve ilaç geliştirme için önemli bir araç sağlayacaktır. Burada, küçük eğitim ile uygulanabilecek yetişkin fare kardiyomiyositlerde izolasyonu için iyi kurulmuş bir yöntemi tarif eder. Fare kalp kesilmiş ve izole edilmiş kalp sistemine kanül, daha sonra, kalsiyum içermeyen ve yüksek p ile perfüzeotassium Langendorff retrograd perfüzyon modu tip II kollajenaz sindirimi ve ardından tampon. Bu protokol, genetiği değiştirilmiş farelerde çeşitli fonksiyonel bir yetişkin fare kardiyomiyositlerin toplanması için tutarlı bir sonuç verir.
Introduction
Kardiyomiyositler proliferatif değildir. HL-1 ve atriyal fare tümörlerinden türetilmiş AT-1 hücreleri gibi bazı atrial kardiyomiyosit hücre çizgileri, vardır; Ancak, araştırma için hiçbir yetişkin ventriküler kardiyomyosit hücre hatları vardır. Yetişkin fare kardiyomiyositlerin birincil hücre kültürleri hücresel ve moleküler seviyede kalp araştırma için güçlü bir model sağlar. Bugüne kadar, bunlar, biyokimyasal, fizyolojik ve farmakolojik araştırmalar 1 için yaygın olarak kullanılmaktadır. Ayrıca, genetiği değiştirilmiş farelerin sık kullanılması kardiyomyosit tecrit etkili yöntemler gerektirmiştir. Saf kültür diğer organlar ile etkileşimden şartlar ve bu endojen nörohormonal ve hormon benzeri faktörler 2,3 aracılığıyla gibi sistemik dolaşım sağlar. Ancak, kardiyomiyositlerin başarılı izolasyonu zor olabilir.
Biz burada tanıtmak protokol erişkin sıçan cardiomyocyt ile tecrübelere dayanmaktadıres ve O'Connell ve ark 4,5 tarafından tanımlanan metot. Özellikle 2007 5'de, bu hücre kültürü ve işlevsel tahlil tampon preparatlar ayrıntılı teknikleri tarif. Fare myocytes Sıçan kardiyomiyositlerinde göre kontraktürü son derece duyarlı olduğu için, fare protokolünde perfüzyon, sindirim, Ca 2 + tolerans, kaplama ve kültür için kullanılan tamponlar veya ortamı, spesifik olmayan uyanlma-kasılma bağlama inhibitörü, 2 ile takviye edilmiştir kendiliğinden kasılmasını inhibe 3-Butandion monoxime (BDM), dolayısıyla canlılığı ve çubuk şekilli miyositlerin verimi önemli ölçüde artırır. Burada tanıtılan Protokolde, miyositler tip II kolajenaz ile modifiye edilmiş Langendorff perfüzyonu ile izole edilmiş kalp yüksek potasyum tamponu içinde ayrılır. Kolajenaz II etkili hücrelerarası matrisi ve bültenleri hücreleri ayırır. Perfüzyon çözelti, aynı zamanda düşük bir seviyede 6 hücresel metabolizmayı tutar. Additi yılında, biz burada kullanılan Harvard Apparatus izole kalp sistemi, hassas sıcaklık ve sabit basınç kontrolü 7 için iyi tasarlanmış. Bu yaklaşım, yüksek oranda tekrarlanabilir hazırlıklar ve hipertrofik kalp tahlilleri için sinyal proteinleri ya da 2-3 günlük kültür ölçülmesi için bir gece boyunca kültür içinde kullanılabilecek tek bir hücre tipi, homojen popülasyonları içerir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fareler üzerinde tüm araştırma işlemleri ve Sağlık Ulusal Enstitüleri kurallarına göre yapıldığını ve protokolleri Toledo Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu, Tıp ve Yaşam Bilimleri Koleji tarafından kabul edildi.
1.. Perfüzyon Sistem Hazırlama
- Izolasyon bir gün önce, hızla alkali tortu içermeyen bir deterjan çözeltisi (rezervuar da dahil olmak üzere), tüm perfüzyon doldurun. Çözelti bir kaç saat veya gece boyunca sisteme emmek için izin verin.
- Ertesi sabah, 37 ° C'ye kadar PCR sıcaklığını ayarlamak ve çözelti ısınmaya bırakın. Deterjan çözeltisini çıkarın ve steril damıtılmış su ile iyice yıkayın sistemi. Tüm yan dalları unutma.
- Sabit bir peristaltik pompa vasıtasıyla perfüzyon tamponu ile sistemini doldurun ve herhangi bir hava korumak için bir yan monte şırınga ile aorta odasının (kabarcık tuzak) dışarı kabarcıklar çekmekkoroner tıkanmasından kaynaklanan kalp. Peristaltik pompanın akış hızı, rutin olarak kontrol edilmelidir.
2.. Tamponlar hazırlanması, Kültür Medya ve Yemekleri
- Perfüzyon Tamponu: 1x perfüzyon tamponu 500 ml kullanım öncesinde emin olun. Bu, kalsiyum içermeyen tampon maddesi 113 mM NaCI, 4.7 mM KCI, 0.6 mM KH 2 PO 4, 0.6 mM Na 2 HPO 4, 1.2 mM MgSO 4, 10 mM Na-HEPES, 12 mM NaHCO 3, 10 mM KHCO 3 içerir, 0.032 Kırmızı mM fenol, 30 mM taurin, 10 mM BDM ve 5.5 mM glukoz. 2 M HCI ile 7.0 'a pH ayarlamak ve 4 ° C' de bir 0.2 mikron filtre içinden geçirilerek filtre mağaza
Not: kullanıldığında a) perfüzyon çözeltisi aynı gün hazırlanmalıdır. Bazı durumlarda, bu, 4 ° C de en az 3 gün için bir çözüm depolamak için kabul edilebilir b) Bu tampon ATP c'yi azaltmak, hareketsiz kardiyomiyositlerin tutabilirsiniz 15.3 mM yüksek potasyum konsantrasyonu kadar, varonsumption ve Ca 2 +-toleranslı yeteneğini artırır. - Sindirim Tampon (300 U / ml, 25-50 ml / kalp): hemen öncesinde perfüzyon hazırlamak. Kültürü kaputu 50 ml perfüzyon tamponunda çözülür, tip II kollajenazının toplam aktivitenin 15.000 U tartılır. Nihai kalsiyum konsantrasyonu 50 uM olmak için 100 mM CaCl, 2 25 ul (steril stok solüsyonu, filtre) ilave edin. Izolasyonu için hazır 37 ° C tampon ısıtın. Tripsin farklı olarak, kolajenaz 50-100 uM Ca 2 + varlığında, en iyi şekilde çalışır.
- Dur Buffer (50 ml / kalp): kültürü kaputu İşlet. , 5 ml steril FBS ile perfüzyon tampon maddesi 45 ml karıştırın.
- Ca 2 + çözeltisi (12.5 uM Ca 2 +): durdurma tamponu, 20 ml 100 mM CaCI2 2.5 ul ilave et ve karıştır.
- Ca 2 + II çözeltisi (100 uM Ca 2 +): durdurma tamponu, 10 ml 100 mM CaCI2 içinde 10 ul ilave et ve karıştır.
- Ca 2 + III çözeltisi (400 uM Ca 2 +) Durdurma tamponu, 10 ml 100 mM CaCI2 içinde 40 ul ilave et ve karıştır.
- Ca 2 + IV çözeltisi (900 uM Ca 2 +): durdurma tamponu, 10 ml 100 mM CaCI2 içinde 90 ul ilave et ve karıştır.
- Aktarım kültürü kaputu steril 50 ml konik tüp içine 2 mM L-glutamin ve 1.26 mM CaCl2 ihtiva eden ve FBS 5 ml MEM içinde 43 mi, BDM stok çözeltisinden 1 ml ((50 ml / kalp) orta Kaplama 500 mM, süzülerek sterilize edilmiş) ve 0.5 ml penisilin / streptomisin (10,000 U / ml). Karıştır ve% 2 CO2, gevşek kapakları ile 37 ° C inkübatör önce miyosit izolasyon 2-3 saat boyunca dengeye getirin. Sağ miyosit kaplama önce, ortama 200 mM ATP, 0.5 ml (pH 7.2, stok çözeltisi, steril filtre) ekleyin.
- Kültür ortamı (50 ml / kalp): Aktarım 48 kültür başlığı içinde steril bir 50 ml'lik konik bir tüp içine 2 mM L-glutamin ve 1.26 mM CaCl2 ihtiva eden MEM ile ml BDM stok çözeltisi (500 mM, 1 ml, filte eklemekr) sterilize edilmesi ve 0.5 ml penisilin / streptomisin (10,000 U / ml). Mix ve% 2 CO 2, 37 ° C inkübatör önce miyositlerdeki izolasyon dengeye. Kullanımdan önce, ortama 100 mg / ml BSA, 0.5 ml (steril filtre) ekleyin.
Not:% 2 CO2 inkübatör kullanarak myoctyes 24 saate kadar kendi çubuk-benzeri morfolojiye korunmasına yardımcı olur 6,9-7,0 de kültür ortamı pH, muhafaza kolaylaştırır. - Laminin (1-2 ug / cm 2) ile kaplanmış tabaklar veya plakalar: steril PBS (w / o kalsiyum ve magnezyum), 20 ml ve karıştırın Aktarma / ml doğal fare laminin 1 mg 200 ul. , 100 mm yemekleri 35 mm yemekleri, 60-mm yemekleri, 2.5 ml veya 5 ml için 1 ml ekleyin eşit yüzeylerini sallamak, yer ve CO 2% 2, 37 ° C inkübatör miyositlerdeki kaplama kadar.
Not: yemekler veya kaplanmış plakalar gününde kullanılmaz, bunlar Parafilm ile kapatılır ve 4 ° C'de gece boyunca (Slow Coating) saklanabilir. Sızdırmazlık requ olduğunuired buharlaşmayı ve kirlenmeyi önlemek için. Kaplanmış plakalar, 1 hafta boyunca 4 ° C'de muhafaza edilebilir.
3.. Fare Kalp Kaldırma ve Kanülasyon
- 30 dakika boyunca% 70 etanol içinde makas ve forseps ıslatın ve kurumaya bırakın.
- 0.1 gram fare tartılır. Onun vücut ağırlığı, gerginlik, seks ve doğum tarihini kaydedin.
- 200 ul heparin enjekte edilir (100 IU / fare) 10 dakika önce ip koroner arterlerde kan pıhtılaşmasını önlemek için anesteziye. 200 ketamin / kg vücut ağırlığı mg ve ip enjeksiyonu ile ksilazin 10 mg / kg vücut ağırlığı ile fare anestezi ve fare kuyruk / ayak tutam yanıt vermiyor 5-10 dakika kadar bekleyin.
- Hafifçe perfüzyon sistemine yakın bir hayvan cerrahisi tepsi veya masa bankta bir pinnable çalışma yüzeyi (yani strafor) için forepaws ve pençelerin sabitleme tarafından yatar pozisyonda fare sabitleyin.
- % 70 etanol ile göğüs ve karın silin. Ortahat cilt i yapmakBir cerrahi makas ile diyaframa orta karın ncision.
- Başka bir cerrahi makas ile diyaframı kesin ve kavisli dişli forseps ile sternum tutun. Bilateral kesilmiş ve kalp maruz göğüs kafesi retroflect.
- Ince kavisli tırtıklı ve atravmatik forseps kullanarak hafifçe kalp kaldırın ve dorsal göğüs duvarı mümkün olduğunca yakın göğüs boşluğundan dışarı kalbini incelemek.
- Soğuk perfüzyon tampon içeren bir 100 mm tabak için kalp aktarın. Dikkatle akciğerler, timus, ve bronşlar gibi bağ dokuları uzak trim.
- Genellikle timus ve yağ yastığı tarafından gizli aorta ve kranial dalları, tanımlayın. Kalp kaldırın, aort duvarı kavramak, ilk şubesini 13 aşağıda aort kesin ve hafifçe perfüzyon sıvı dolu aort kanül (düz / künt ucu ve çentikler yukarıdaki 1 ve 2 mm ile 1,0 mm OD paslanmaz çelik kanül için slip iki ultra ince uçlu f kullanarak veya 22 G yeniden beslenme iğne); ucuorceps.
Not: a) perfüzyon sıvısı koroner arterleri girmesini gaz kabarcıklarını önlemek için kalp kanülasyonu sırasında damlayan olmalıdır; b) sadece aort üzerinde kanül ucu tutun. - Kanül aort Kelepçe ve 6-0 cerrahi ipek ile kanül aort Arter. Bütün kanulasyon 120 saniyeden az almalıdır.
4. Kalp Perfüzyon ve Sindirim
- 4 ml akış hızında, kalsiyum içermeyen perfüzyon tamponu ile kalp serpmek / dakika, yaklaşık 4-5 dakika da çıkış berrak hale gelene kadar, daha sonra 50 mM CaCl 2 ihtiva eden sindirim tamponu değiştirmek ve fare türüne bağlı olarak, 3,5-20 dakika boyunca perfüze, perfüzyon basıncı ve kolajenaz aktivitesi. Varsa sindirildiği zaman, 70-80 mmHg aorta basıncını artırır. Gerekli olduğunda, enzim 'in perfüze sindirim için yeniden sirküle edilebilir. Tipik haliyle, 300 U / ml enzim tamponu ml / dak, 4 'lık bir akış hızında, 10-12 dakika içinde, bir kalp sindirir;70 mmHg basınç uygulayarak yükleme sonrası durumu varsa, 300 U / ml 4 ml / dk 'lık bir akış hızında gerekli olan sadece 3,5-5,5 dakika sürer.
- Kalp biraz soluk ve sarkık olduğunda sindirim durdurmak. Nazikçe sıkışmak zaman süngerimsi olmalıdır.
5. Hücreler çözüşüm ve kalsiyum yeniden yerleştirilmesi
- % 70 etanol-batırılmış forseps ile kanül aort çekin ve 2.5 ml sindirim tampon içeren steril bir 60 mm çanak içine kalbini koydu. Bu steril tekniklerin dikkatli kalan ve takip adımlar, steril malzemeleri kullanarak kültürü kaputu içine taşıyın.
- Ince cerrahi makas ile aort, atrial ve büyük damarları çıkarın. Yavaşça iki ucu ince forseps ile 10-12 küçük parçalar halinde ventrikül kızdırmak.
- Yavaşça 10 ml transfer pipet ile kalp parçaları ve hücreleri yukarı ve aşağı ~ 10x pipet ve daha sonra bir 15-ml polipropilen konik tüp transferi. Ben 12.5 mM CaCl 2 ve transferini içeren 7.5 ml kalsiyum çözeltisi ile çanak durulayınBu tüp içine, 10 ml 'lik bir son hacim elde edilir.
- Yavaşça yukarı ve kalp dokusunun büyük parçalarını dağıtmak için ince uçlu transfer pipet kullanarak aşağı hücre süspansiyonu pipetle.
- Daha sonra, endotelyal hücreler ve fibroblastlar gibi küçük olmayan miyosit hücreleri ayırmak için 20 x g'de 3 dakika boyunca santrifüj.
- Süpernatan aspire ve 10 mi kalsiyum çözeltisi içindeki miyosit pelet tekrar süspansiyon 200 mM ATP, 100 ul (pH 7.2, stok çözeltisi, steril filtre) bir takviyesi ile I. 3-5 dakika için kaputu tüp bırakın.
- Transferi çubuk şekilli ve yuvarlak miyositleri saymak için bir hemasitometrede 10 ul hacimde çoğaltmak. Miyositlerin toplam sayısını hesaplayın ve çubuk şekilli miyositlerin yüzdesini hesaplamak.
- 20 x g'de 3 dakika boyunca miyositleri santrifüjleyin. Süpernatantı ve 100 uM 2 CaCl ihtiva eden 10 ml kalsiyum çözeltisi II pelet tekrar süspansiyon. Pipetleme ucu ince bir transfer pipet miyositleri Dağılanyukarı ve aşağı.
- Sırasıyla, kalsiyum III çözeltisi (400 uM CaCl2) ve IV (900 uM CaCl2) kullanılarak, yukarıdaki adım (5.8) tekrarlayın.
- Fare miyosit Birincil kültür için, orta kaplama 5 ml nihai miyosit pelletini. Miyositlerin toplam sayısını ve çubuk şekilli miyositlerin yüzdesini hesaplamak.
6.. Hücre Kültürü
- 50 ml bir tüp içinde 25.000 çubuk şeklinde bir myocytes / ml 'ye çubuk şekilli miyosit konsantrasyonunu ayarlayın. Yavaşça de onları askıya almak için bir 10 ml pipet kullanarak miyositleri pipetle. Her bir tabak veya levha için eşit hücre yoğunluğu sağlamak için pipet ve tüp hücre sedimantasyon kaçının.
- Laminin kaplama çözümü aspire sonra, bu yemekleri veya plakalar halinde miyositleri plaka. Yavaşça kültürü kaputu yüzeyinde yemekler veya plakaları öne ve arkaya doğru ve yan-yana bir haç şeklinde bir örüntü içinde 3-4 kez kaydırın.
- % 2 CO yemekleri veya tabak yerleştirin37 ° C'de 2 inkübatör Yaklaşık% 80 arasında bir oranda miyosit bağlantısı oluşturmak için 1-3 saat boyunca inkübe edin.
- Eki sonra, yavaşça serbest miyositleri ve hücre artıkları içeren orta aspire. Yavaşça yemekler veya levha yanlarına kültür ortamı ilave edin. Biri tarafından bu orta değişim birini yapın. Hemen inkübatör yemekleri veya plakaları dönmek.
- O / N kültürden sonra, kısa süreli myocytes hücre sinyal çalışmaları daha önce BDM olmayan aynı ortam için değiştirilebilir. Hipertrofik ya da apoptoz tahliller için uzun vadeli kültür BDM tutun.
Not: BDM (2,3-bütandion monoxime) miyozin-ATPaz inhibe ve kasılmasını önlemek olabilir. Miyozin-tabanlı daralmanın bunun önlenmesi kolayca tersine çevrilebilir. Bu BDM örneğin spesifik olmayan bir fosfataz olarak hareket SR kalsiyum serbest kalmasını arttırır ve serbest kalsiyum konsantrasyonu ve hücresel elektrik prope değiştirilmesi gibi bazı potansiyel yan etkilere sahip olduğu rapor edilmiştirilgili taraflar, bu nedenle tedavi öncesi, BDM çıkarılmalıdır. Ayrıca, bazı durumlarda, belirli bir miyozin II inhibitörü Blebbistatin kardiyomiyosit daralma 8,9 inhibe etmek için alternatif bir ilaç olabilir. Ancak, bizim durumlarda, BDM kardiyomiyositlerin nitelik ve nicelik uğruna Blebbistatin daha iyidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1.. Başarılı İzolasyon Kantitasyonu
Iki kriter izolasyonu başarısını ölçmek için kullanılır: İlk olarak, toplam izole kardiyomiyositlerde sayısı, ve ikinci olarak, çubuk şeklinde kalsiyum toleranslı yuvarlak olmayan dayanıklı miyosit oranıdır. Genellikle bu protokol kalp kaldırılması miyosit kaplama ve bir yetişkin fare kalbinden verimleri yaklaşık 1 milyon çubuk şeklindeki kardiyomiyositlerin (hasat toplam miyositlerin% 70-90) yaklaşık 75-90 dakika sürer. Bu fare vücut ağırlığı ve suş ile değişebilir. Tipik haliyle, 0.7-1.0 milyon çubuk şeklinde bir myocytes ~ 25 g C57BL/6J fare, ~ 35 g siyah İsviçre fare 1,2-1600000 çubuk şeklindeki uzaması, ve 0,7-1200000 çubuk şekilli miyositlerden toplanabilir can a ~ 30 g Na / K +-ATPase, heterozigot (α1 S / R) ya da 10 ~ 22 g kardiyak spesifik NCX-KO fare 11 toplanabilir. İzole miyositler normalde, dikdörtgen uçları ve açık çapraz-izlerse ile ayrı bir çubuk şekli varŞekil 1 'de gösterilmektedir.
2.. Hücre Fonksiyon Tanımlama
Bizim önceki verileri açıkça kültürlü yenidoğan sıçan kardiomyositlerindeki, 100 mcM ouabain PI 3 K-bağımlı Akt fosforilasyonu etkinleştirmek ve hipertrofisi 12 neden olduğunu göstermiştir. Ayrıca yetişkin fare kardiyomiyositlerde Bu sonuçları teyit etmek için, yetişkin fare C57BL/6J kardiyomiyositlerde kültürlendi ve ouabain ile muamele edildi. 2 ve 3, açık Ouabain, doza bağımlı bir şekilde Akt fosforilasyonunun artırmak ve [3H]-lösinin dahil edilmesini neden olduğunu göstermektedir protein sentezi sırasında.
Şekil 1.. Siyah Swiss fare Normal çubuk şeklindeki kardiyomiyositler gecede sonrakültür. myocytes fotoğraf yazılımını kullanarak faz kontrast mikroskobu altında fotoğraflandı.
Kültür yetişkin fare C57BL/6J kardiyomiyositlerde ouabain ile Akt'nin Şekil 2.. Etkinleştirilmesi. Miyositlerde 5 dakika için 0-50 uM ouabain maruz edildi ve lizatlar western fosforillenmiş (Ser 473) Akt'nin (p-Akt) ve Akt için tahlil edildi benekleri. Aktivasyon, toplam Akt fosforile oranı (n = 5-10) olarak belirlendi. * P <0.05 'e karşı kontrol, ** P <0.01' e karşı kontrol.
Şekil 3,. Ouabai. n, 4 saat sonra, serum yoksunluğu, miyositler birlikte ouabain veya 100 nM ET-1 (pozitif kontrol) varlığında veya yokluğunda, [3 H] 'de belirtilen koşullar ile muamele edilmiş kültüre yetişkin fare C57BL/6J kardiyomiyositlerde protein sentezini uyarır - 12 saat boyunca lösin (1 uCi / ml). Hücre lizatları% 5 TCA ile çökeltilmiş ve 0.2 M NaOH/0.1% SDS içinde yeniden süspansiyona alınmış, ve radyoaktivite bir ışıma sayacı içinde sayılmıştır edilmiştir. Örnek başına protein sentezi / mg protein ve kontrol ile karşılaştırıldığında normalize cpm hesaplanmıştır.
| Çözüm / Tampon | Perfüzyon Tampon | Sindirim Tampon | Durdurma tamponu | Ca 2 + Solüsyon I | Ca 2 + Çözüm II | Ca 2 + Çözüm III | Ca 2 + Çözüm IV |
| 113 | 113 | 113 | 113 | 113 | 113 | 113 | |
| KCI, mM | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 |
| KH 2 PO 4, mM | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 |
| Na 2 HPO 4 mM | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 |
| MgSO4, mM | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 |
| Na-HEPES, mM | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| NaHCO 3 mM | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 |
| KHCO 3 mM | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| Fenol kırmızı, iM | 32 | 32 | 32 | 32 | 32 | 32 | 32 |
| Taurin, mM | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 |
| BDM, mM | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| Glikoz, mM | 5.5 | 5.5 | 5.5 | 5.5 | 5.5 | 5.5 | 5.5 |
| FBS,% (v / v) | 0 | 0 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| Kolajenaz II, mg / ml | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| CaCl2, uM | 0 | 50 | 0 | 12.5 | 100 | 400 | 900 |
Yetişkin fare kardiyomiyositler izolasyonu için Tablo 1. Çözümleri / tamponlar.
| Isim | Şirket | Catalog # | Hazırlık | Depolama |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biolgoicals | S11550 | N / A | -20 ° C'de, 50 ml steril tüplerde 25 ml lik bir kısmı |
| Sığır serum albümini (BSA) 100 mg / ml, 100x | Sigma | A7906 | 50 ml diH 2 O, 0.22 mikron steril şırınga ile f steril filtre 5 gilter | -20 ° C'de 15 ml steril tüplerde 5 ml alikotları |
| CaCl2, 100 mM, 100x | Sigma | C4901 | 0.22 um steril bir şırınga filtreden geçirilmiştir 0,555 50 ml diH 2 O g, ve steril filtre | Oda sıcaklığında 15 ml steril tüplerde 10 ml lik bir kısmı. |
| Laminin 1 mg / ml, 100x | Hayat teknolojileri | 23017-015 | N / A | -20 ° C'de 0.5 ml steril mikrosantrifüj tüpleri içinde 200 ul alikotları |
| 2,3-Butandion monoxime (DGM) 500 mM, 50x | Sigma | B0753 | 20 ml 2 O dihidro 1.01 g BDM, kaput 0.22 mikron filtre içinden süzme ile çözelti sterilize edin. | 4 ° C'de saklayın |
| Adenozin-5'-trifosfat disodyum tuzu (Na 2-ATP) 200 mM, 100x | Sigma | A6419 | Ekle 5 ml diH 2 O1 g, 50 ml bir santrifüj tüpüne 2-ATP Na çözülür, daha sonra pH'ı 7.2 'ye ayarlayın ve diH 2 O ile 9 ml nihai hacme getirmek için 2 mol / l NaOH kullanımı 0.22 mikron bir şırınga filtreden geçirilmiştir çözeltiyi sterilize edin. | -20 ° C de, 1.5 ml steril mikrosantrifüj tüpleri içinde, 0.5 ml alikotları |
| 3.77 M NaCl, 33.3x | Sigma | S7653 | 300 ml diH 2 O 66 g | 4 ° C'de saklayın |
| KCI 470 mM, 100x | Fisher Scientific | P217 | 100 mi diH 2 O'da 3.5 g | 4 ° C'de saklayın |
| KH 2 PO 4 60 mM, 100x | Sigma | P5379 | 100 mi diH 2 O'da 0.82 g | 4 ° C'de saklayın |
| 2 HPO 4 60 mM, 100x Na | Sigma | S0876 | 100 mi diH 2 O'da 0.85 g | 4 ° C'de saklayın |
| MgSO 4 120 mM, 100x | Sigma | M-1880 | 100 mi diH 2 O 3 g | 4 ° C'de saklayın |
| HEPES 1 M, 100x | Hayat teknolojileri | 15630-080 | N / A | 4 ° C'de saklayın |
| NaHCO 3 600 mM, 50x | Sigma | S6014 | 200 ml diH 2 O'da 10.1 g | 4 ° C'de saklayın |
| KHCO 3 1 M, 100x | Fisher Scientific | P235 | 100 mi diH 2 O'da 10.1 g | 4 ° C'de saklayın |
| Fenol kırmızı 3.2 mM, 100x | Sigma | P5530 | 100 mi diH 2 O'da 0.12 g | oda sıcaklığında saklayın. |
Tablo 2.. Yetişkin fare kardiyomiyositler izolasyonu ve kültürü için Stok çözelti hazırlama ve saklama.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En iyi hazırlanması için, en kritik adımlar şunlardır: 1) derhal çıkarıldıktan sonra kanül fare kalp çengel; 2) uygun kalp perfüzyon. Ayrıca, bu su kalitesini, perfüzyon sıcaklığı, tampon pH, sterilizasyon, kimyasal saflığı ve temiz, kirli olmayan boru ve odaları da önemli faktörlerdir unutmayın. M 18.2 moleküler biyoloji dereceli H 2 O yüksek tampon hazırlanması için özellikle tavsiye edilir. 200 mM ATP stok çözeltisinin pH değeri 7.2, kolaylıkla kaçırılmaz bir adıma ayarlanmalıdır.
Hızla aorta belirlemek ve Flynn 13 tarafından gösterildiği gibi, sadece ilk şubesini kesim için esastır. Verimli kanca-up için, çentikler ve küçük tırtıklı çapraz kelepçe ile uygun boyutlardaki paslanmaz çelik kanül tavsiye edilir. Ligasyondan sonra, kanül ucu kolajenaz tam koroner dolaşım sırasında kalp dokusu ile etkileşim yardımcı olmak amacıyla aort üzerinde olmalıdır. Bazı durumlarda, ilk olarak hücre verimi büyük görünmektedirancak birçok hücreleri yuvarlak şekilli kalsiyum tolerans aşamasından sonra vardır. Bunun bir açıklaması, damarlarda pıhtılaşmış kan tamamen yetersiz sindirime yol açan kalp, çıkarılabilir olmayabilir olmasıdır. Diğer bir olasılık, kalbin sindirim üzerindedir. Kolajenaza uzun süreli maruz kalma miyositlerdeki kalsiyum tolerans 2 azaltır. Ayrışma ve kalsiyum yeniden yerleştirilmesi sırasında, bu gibi yumuşak miyosit canlılığını korumak için mümkün kardiyomiyositlerde işlemek için de önemlidir.
Özetle, genetik olarak değiştirilmiş farelerin yetişkin kardiyomyosit kültür kalp araştırmaları için güçlü bir araçtır. Sonuçlarını yorumlarken Ancak, gelecekteki çalışma akılda insanlar ve kemirgenler arasında genetik fark tutmalı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü Hibe HL-36573 tarafından desteklenmiştir. Biz bu metni düzenlemek için Sayın David Sowa teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolated heart system for small rodent | Harvard Apparatus | IHSR-mouse 73-4019 | |
| Aortic Cannula, OD 1.0 mm | Harvard Apparatus | 73-2816 | |
| Dumont #4 Forceps | Fine science tools | 11294-00 | |
| Straight sharp serrated scissors | Fine science tools | 14070-12 | |
| Serrated Graefe forceps | Fine science tools | 11050-10 | |
| Curved, serrated Graefe forceps | Fine science tools | 11052-10 | |
| Straight Mini Serrefines clamps | Fine science tools | 18054-28 | |
| MEM | Gibco | 11575-032 | |
| Collagenase II | Worthington | 4176 | |
| Mucosal universal detergent | Sigma | Z637181 | Mucasol is a fast alkaline residue-free detergent. |
References
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. J. Mol. Cell. 51, 288-298 (2011).
- Gross, D. R. Isolated heart preparations, problems, and pitfalls. In: Animal Models in Cardiovascular Research. Gross, D. R. , 3rd edition, Springer. 109-130 (2009).
- Schlüter, K. D., Piper, H. M. Isolation and culture of adult ventricular cardiomyocytes. Practical Methods in Cardiovascular Research. Dheim, S., Mohr, F. W., Delmar, M. , Springer. 557-567 (2005).
- O'Connell, T. D., Ni, Y. G., Lin, K. M., Han, H. P., Yan, Z. Isolation and culture of adult cardiac myocytes for signaling studies. AfCS research reports. 1 (5), 1-9 (2003).
- O'Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpon, P. C. Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes. Methods in Molecular Biology. Vivanco, F. 35, Humana Press. 271-296 (2007).
- Nilolskaya, A., Sharma, V. Cell culture models and methods. Cardiac Electrophysiology Methods and Models. Sigg, D. C., Laizzo, P. S., Xiao, Y. F. , Springer. 213-235 (2010).
- Merx, M. W., Schrader, M. The working heart. Practical Methods in Cardiovascular Research. Dhein, S., Mohr, F. W., Delmar, M. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg, Germany. 173-189 (2005).
- Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, 1667-1674 (2008).
- Lou, Q., Li, W., Efimov, I. R. The role of dynamic instability and wavelength in arrhythmia maintenance as revealed by panoramic imaging with blebbistatin vs. 2,3-butanedione monoxime. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 262-269 (2012).
- Liu, C. X., et al. Reduction of Na/K-ATPase potentiates Marinobufagenin-induced cardiac dysfunction and myocyte apoptosis. J. Biol. Chem. 287 (20), 16390-16398 (2012).
- Bai, Y., et al. Different roles of the cardiac Na+/Ca2+-exchanger in ouabain-induced inotropy, cell signaling, and hypertrophy. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 304, 427-435 (2013).
- Liu, L. J., Zhao, X. C., Pierre, S. V., Askari, A. Association of PI3K-AKT signaling pathway with digitalis-induced hypertrophy of cardiac myocytes. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 293, 1489-1497 (2007).
- Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (58), (2011).
