Het gebruik van Oropharyngeal Intratracheaal PAMP Administratie en bronchoalveolaire lavage om de immuunrespons van de gastheer in Muizen Evalueer

Summary

De gastheer immuunrespons op pathogene infectie een strak gereguleerd proces. Met behulp van een lipopolysaccharide long exposure model in muizen, is het mogelijk om hoge resolutie evaluaties van de complexe mechanismen van pathogenese voeren.

Abstract

De immuunrespons tegen pathogenen is een complex biologisch proces. De meerderheid van de in vivo studies klassiek gebruikt om karakteriseren gastheer-pathogeen interacties profiteer van intraperitoneale injecties van geselecteerde bacteriën of pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs) bij muizen. Hoewel deze technieken enorm gegevens in verband met besmettelijke ziekte pathobiology hebben opgeleverd, intraperitoneale injectie modellen zijn niet altijd geschikt voor de gastheer-pathogeen interactie studies in de long. Gebruik makend van een acute longontsteking model bij muizen, is het mogelijk om een ​​hoge resolutie analyse van de gastheer aangeboren immuunrespons gebruik lipopolysaccharide (LPS) te voeren. Hier beschrijven we de methoden LPS beheren via chirurgische orofaryngeale intratracheale toediening bewaken klinische parameters geassocieerd met de ziekte pathogenese en gebruiken bronchoalveolaire lavage vloeistof naar de gastheer immuunreactie te evalueren. De technieken die worden beschrevenzijn breed toepasbaar voor de studie van de gastheer aangeboren immuunrespons op een breed scala van PAMPs en ziekteverwekkers. Ook met kleine modificaties, deze technieken kunnen ook worden toegepast in studies die allergische luchtwegontsteking en farmacologische toepassingen.

Introduction

Longinfecties geassocieerd met pathogene bacteriesoorten zijn een veelvoorkomende oorzaak van de opwarming van morbiditeit en mortaliteit. Het bepalen van de mechanismen die de gastheer immuunrespons op deze pathogenen rijden zal de ontwikkeling van nieuwe preventiestrategieën en therapeutische middelen die het effect van deze infecties verminderen bevorderen. Het algemene doel van het hier beschreven protocol is om de gebruiker te voorzien van een flexibele methode voor de gastheer aangeboren immuunrespons op pathogene infectie te evalueren middels een pathogeen geassocieerde moleculaire patroon (PAMP) als een surrogaat voor levende bacteriën. De meeste eerdere studies die de gastheer aangeboren immuunrespons op bacteriën gericht op peritoneale modellen door het relatieve gemak van uitvoering. Hoewel deze modellen zijn zeer nuttig en hebben geleid tot aanzienlijke vooruitgang op het gebied van gastheer-pathogeen interacties en systemische ontsteking, de uit deze modellen gegenereerd gegevens niet altijd geschikt voor studies involving de luchtwegen. Hier wordt een model van acute pulmonale longontsteking voorgesteld als een praktisch en klinisch relevante uitbreiding van de klassieke intraperitoneale (ip) injectie modellen. Deze techniek maakt lokale beoordeling van de aangeboren immuunrespons in een orgaanspecifieke modelsysteem.

De hier beschreven methoden zijn ontworpen om een ​​eenvoudige en robuuste techniek zodat gebruikers de gastheer immuunrespons op LPS, wat een gemeenschappelijk PAMP evalueren. De methoden zijn gebaseerd op intratracheale (it) indruppelen van LPS, die een robuuste aangeboren immuunrespons in de longen van muizen en bootst vele pathofysiologische functies waargenomen bij menselijke patiënten die lijden aan respiratoire infecties en acute longschade ¹ induceert. Een primair voordeel van deze techniek is dat het de gebruiker de immuunrespons te evalueren zonder verstorende factoren en veiligheidszorgen verbonden aan het in vivo studiesmet behulp van levende bacteriën. Ook de orofaryngeale het beheer blootstellingsroute beschreven in dit protocol heeft belangrijke voordelen ten opzichte van andere vaak gebruikte technieken, waaronder intranasale (in) administratie en chirurgische het bestuur. Bijvoorbeeld, het orofaryngeale toediening kan relatief nauwkeurig doseren en longafzetting ten opzichte van toediening die typisch lijdt aan verhoogde variabiliteit van longdepositie door het verlies van agenten in de neusholte en sinussen ^2-4. Het is toedieningsweg omzeilt deze holten en biedt direct toegang tot de luchtpijp en de luchtwegen. Ook de chirurgische aanpak is het een significant meer morbide administratie methode en vereist uitgebreide training te beheersen. De hier beschreven protocollen tevens een beschrijving van de gebruikte technieken en surrogaat markers gebruikt om ontstekingen progressie te evalueren en eindigen met een protocol waarin de juiste technieken voor het bereiden van de lungs voor histopathologie assessments. Deze protocollen zijn gericht op het minimaliseren van het aantal muizen voor elke studie door maximaal gegenereerd uit elke afzonderlijke diergegevens.

De beschreven protocollen zijn zeer flexibel en kan gemakkelijk worden aangepast aan een breed scala PAMPs en schade geassocieerde moleculaire patronen (gedempt) te evalueren. Bovendien met een paar extra aanpassingen deze protocollen kunnen ook worden toegepast op studies die allergische luchtwegen ziekteprogressie of gastheer-pathogeen interacties met levende bacteriën, virussen of schimmels ^5-10.

Protocol

Alle studies werden uitgevoerd in het kader van de goedkeuring van de Institutionele Zorg en gebruik Comite (IACUC) voor Virginia Tech en in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide voor de zorg en het gebruik van proefdieren.

1. Intratracheale (it) Enten van LPS behulp Oropharyngeal Administration

1. Zorg ervoor dat elk dier uniek wordt geïdentificeerd met behulp van een oor punch, oormerk, of andere institutioneel goedgekeurde methode.
2. Noteer de basislijn lichaamsgewicht en lichaamstemperatuur voor elk dier.
3. Bereid de werkvoorraad van LPS. Elke muis wordt een 50 pl dosis van 1 mg / kg LPS ontvangt 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Mock behandelde dieren wordt een 50 pl dosis 1x PBS ontvangen.
4. Bereid een geschikte kamer voor de toediening van isofluraan met de volgende neerzetten. Institutionele richtlijnen verschillen betreffende het gebruik van isofluraan en andere anesthetica en vóór initiating studies, moeten personen contact Vakgroep Dierlijke Care / welzijn van hun instelling te verzekeren de alle richtlijnen adequaat tegemoet wordt gekomen. Als neerzetten isofluraan is geen optie, andere anesthetica zijn aanvaardbare alternatieven.
   1. In een geschikte veiligheidskast, gelden ongeveer 3 ml isofluraan een gevouwen absorberende papieren handdoek en plaats in de bodem van een bekerglas van 500 ml.
   2. Leg een klein stukje aluminiumfolie op de top van de papieren handdoek en dek het bekerglas af met een transparante deksel.
5. Bereid de instrumenten en reagentia die tijdens de het inenting zal worden gebruikt. Plaats de rubberen band die zullen zorgen de dieren hoofd op de intubatie stand. Deze procedure zal een paar rechte tang, een paar schuine of gebogen pincet en een p200 pipet tips vereisen.
6. Load 50 ul van LPS in de pipet tip en plaats in een gemakkelijk bereikbare locatie naast de intubatie stand.
7. Verdoven van de muisdoor het plaatsen van de dieren in de isofluraan kamer en die de kamer met het transparante deksel. Observeer het dier ademhaling, die snel en oppervlakkig zal zijn als eerst geplaatst in de kamer. Het dier zal voldoende worden verdoofd bij het ademhalen tarieven benaderen 1 adem / 2 sec, die meestal binnen 30 seconden na het plaatsen in de kamer wordt bereikt. De muis moet worden verdoofd, zoals vermeld in het goedgekeurde protocol met behulp van dierlijke druppel methode isofluraan.
8. Verwijder de verdoofde muis uit de kamer en hang het dier op de intubatie vasthouden aan haar voorste snijtanden. Verzekeren dat het dier veilig wordt vastgehouden en de mond en tong zijn toegankelijk.
9. Voorzichtig zet de tong met de rechte tang. Pak de tong met de schuine pincet en trek het voorzichtig uit de mond totdat een lichte weerstand voelt. Deze actie is voldoende om de epiglottis blokkeren en toegang tot de luchtpijp krijgen.
10. Terwijl u de mond te houden in deuitgestrekte positie, dienen de 50 ul dosis LPS in de achterkant van de keel en meteen daarna neusgaten van het dier met een gehandschoende vinger. De LPS is zichtbaar in de achterkant van de keel tot de muis inhaleert.
11. Blijf de neusgaten bedekken en houd de tong verlengd voor 5-10 extra adem.
12. Verwijder de muis uit de intubatie stand en plaats het dier terug in een nieuwe kooi totdat deze herstelt van de narcose.
13. Monitor surrogaat markers ziekteprogressie. Lichaamsgewicht en lichaamstemperatuur worden gecontroleerd om de 4-8 uur gedurende de duur van het onderzoek. Ook evalueren gedragskenmerken en klinische symptomen geassocieerd met verhoogde morbiditeit.
14. Tot ziekteprogressie, oogst muizen evalueren op specifieke tijdstippen na de blootstelling aan LPS. Typische tijdstippen voor oogst na LPS-blootstelling zijn 0, 6, 12, 18, 24 en 48 uur. Om herstel en overleving te evalueren, evalueren de muizen gedurende 7 days post-inenting.

2. Serum en Bronchoalveolaire spoelvloeistof (BALF) Collectie

1. Offer de muis met behulp van een institutioneel goedgekeurde methode.
2. Leg het dier op zijn rug en zet het om een ​​necropsie boord, ideaal 0.5 inch (1,27 cm) in hoogte.
3. Bevochtig de hele muis met 70% ethanol.
4. Met behulp van een 1 ml spuit met een 27 G naald, voeren een hartpunctie alvorens tot een incisies. Het moet mogelijk zijn om 500-800 gl volbloed trekken uit een enkele muis.
5. Verwijder de naald uit de injectiespuit en het volbloed dragen aan een prelabeled 1,5 ml microcentrifugebuis. Voor serum verzamelen, zodat het bloed te stollen gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Naast serum verzameling kan deze procedure ook worden gemodificeerd door het opnemen van een anti-coagulant in de buis en spuit vóór verzamelen volbloed, studeren circulerende immuuncellen.
6. Maak een horizontale incisie eenkruis van de lengte van de peritoneale holte en een verticale insnijding van de peritoneale holte van de onderkaak van de muis.
7. Met behulp van een tang, Pak beide zijden van de incisie en trek de huid weg van de onderliggende peritoneale en thoracale holtes.
8. Voeg een grote incisie langs de lengte van de peritoneale holte van de genitaliën het borstbeen en zorg ervoor zaag het membraan. Voorzichtig verschuiven de darmen in de buikholte om de toegang tot een van de nieren mogelijk.
9. Snijd de renale ader die naar de nieren te dienen als een afvoerpunt voor perfusie.
10. Nick het membraan met een schaar, zorg ervoor dat de longen en het hart te voorkomen, aan de linkerkant van het hart bloot te leggen.
11. Handmatig perfuse het hart met behulp van een 10 ml spuit met een 27 G naald en 1x PBS-oplossing. Oefen overmatige kracht tijdens de perfusie zodat de zoutoplossing niet in de longen wordt gedwongen. De overige bloed moet worden afgevoerd uit de poortader incisie.
12. Knip de ribbenkast langs het borstbeen met behulp van stompe / botte schaar, zorg om te voorkomen dat het snijden van het hart en de longen. Ongeluk snijden van de longen tijdens deze procedure zal de hoeveelheid BALF verzameld aanzienlijk verminderen en leidt tot een onvermogen om goed opblazen van de longen met fixeermiddel.
13. Voorzichtig isoleren hart en longen verwijderd van de ribbenkast behulp van een tang. Snijd zorgvuldig elke sectie van de ribbenkast gebruik stomp / stomp schaar zo dicht bij de wervelkolom mogelijk en volledig te verwijderen beide secties.
14. Scheid de speekselklieren met behulp van een tang of verwijder ze met een schaar, om de luchtpijp bloot.
15. Snijd voorzichtig de spieren die de luchtpijp bedekken met een schaar. Het is essentieel dat de trachea niet tijdens dit proces worden gesneden.
16. Met een schaar, scheiden het sleutelbeen bovenop de luchtpijp.
17. Voorzichtig pakt u de thymus behulp van een tang en til het weefsel van het hart. Verwijder de thymus met een schaar, terwijl de zorg voorzaag het hart of de longen.
18. Maak een kleine horizontale incisie in de luchtpijp 1-2 ringen onder het strottenhoofd met behulp van schuine schaar (45-90 º hoek, scherp / scherp). De incisie moet groot genoeg zijn om stevig vast de canule zijn.
19. Plaats de canule, zodat het taps toelopende einde strekt 2-3 tracheale ringen onder de incisie en zet de canule op zijn plaats met behulp van een zijden hechtdraad. Zorg ervoor dat de hechting verstrijkt tussen de luchtpijp en de slokdarm en wordt strak getrokken op de canule.
20. Vul een spuit 1 ml met 1 ml Hanks gebufferde zoutoplossing (HBSS) en breng dan de luer in de canule.
21. Met behulp van een langzame, maar constante beweging, injecteer ~ 900 ul in de luchtpijp, het opblazen van de longen, en onmiddellijk in te trekken de HBSS. Plaats de herstelde BALF in een 15 ml conische buis.
22. Herhaal deze spoeling 2 extra keer tot ongeveer 3 ml BALF voor toekomstige analyse verzamelen. Bewaar de BALF op ijs of bij 4 º C tot klaar voor gebruik.

1. Plaats een spuit 10 ml in de longen inflatie stand. Monteer de slang aan de luer de luer de kraan en de kraan op de spuit. Controleer de kraan in de gesloten stand. De spuit 10 ml zal dienen als een zwaartekracht reservoir. Het reservoir moet worden gehecht aan de inflatie staan ​​4.75 hierboven het dier en de bovenkant van het reservoir moet 10,5 breiden boven het dier.
2. Vul de spuit met een neutraal gebufferde formaline-oplossing. Zorg ervoor dat de spuit volledig is gevuld met het fixeermiddel.
3. Een absorberende handdoek onder het open uiteinde van de buis en open de kraan om het fixeermiddel om de slang te vullen. Zodra het fixeermiddel begint stroomt uit de slang, onmiddellijk sluit de kraan en vul de spuit aan de top met een fixatief. Het is belangrijk dat de spuit volledig gevuld om de juiste hoeveelheid druk voor long inflatie.
4. Maak een enkele losse knoop in de hechtdraad; echter, de knoop strak niet trekken.
5. Steek de slang van de muis inflatie staan ​​in de canule.
6. Open de kraan en laat de longen te vullen door de zwaartekracht inflatie.
7. Zodra de longen hun maximale inflatie niveau te bereiken, trek de hechtdraad strak en leg een tweede knoop.
8. Sluit de kraan en verwijder de slang van de canule.
9. Verwijder voorzichtig de canule van de luchtpijp door grijpen de hechtdraad met een pincet en houdt de canule met de vingers. Trek stevig aan de hechtdraad naar beneden richting de borstholte en de canule terug naar de neus van de muis.
10. Voorzichtig grijpen de luchtpijp of de hechtingen met een tang en til de luchtpijp van de hals holte.
11. Sever de luchtpijp caudaal van de bond hechtdraad behulp botte schaar.
12. Zodra de trancheeen vrij is van de onderliggende weefsels, begint de luchtpijp van het muis trekken. Til de longen uit de borstholte.
13. Stuurde de bindweefsel die de longen in de borstholte voorzichtig. Trek net de luchtpijp van het lichaam van de muis en breng gestage opwaartse kracht tijdens het snijden van de onderliggende verbindingen. Let er op dat het snijden van de longen. Merk op dat de linker hart moet worden gehecht aan de longen met deze methode.
14. Nadat de longen zijn verwijderd, plaats ze in 10 ml gebufferde formaline.
15. Verwijderen van een gedeelte van de muis staart voor genotypering.
16. Gooi de muis karkas volgens de toepasselijke institutionele richtlijnen.

4. Cytokine Evaluatie

1. Centrifugeer het bloed, in stap 2.5 verzameld bij 12.000 xg gedurende 5 minuten om het serum te isoleren. Breng het serum een ​​prelabeled 1,5 ml microcentrifugebuis en bewaar bij -80 ° C.
2. Evalueer de serum cytokine niveaus door ELISA of andere soortgelijke assay. Verdun het serum 1:05-1:20 in een geschikte verdunning buffer, afhankelijk van de test volgens de instructies van de fabrikant. Deze verdunningen moeten empirisch worden bepaald voorafgaand aan het uitvoeren van het grootste deel van de monsters.
3. Door de geringe omvang van serum verzameld, verminderen het monstervolume op de ELISA-plaat geplaatst met de helft. Bijvoorbeeld, de meeste commerciële ELISA's gebruiken 100 gl hoeveelheden standaarden en monsters. Specimens, belasting 50 pi van normen en verdund serum per well besparen.
4. Centrifugeer de BALF in een gekoelde tafelblad centrifuge bij 200 xg gedurende 5 minuten. Breng de celvrije supernatant in twee prelabeled 1,5 ml microcentrifuge buizen en bewaar bij -80 ° C.
5. Evalueer BALF cytokinen door ELISA of een andere soortgelijke test zonder verdunnen.
6. Bewaar ongebruikte serum en BALF bij -80 ° C.

5. Differentiële kleuring en BAL cellulariteit Evaluatie

1. Na BALF centrifugeren en volledige HBSS verwijdering, lyseren het ingehulde rode bloedcellen met behulp van hypotone zoutoplossing. Resuspendeer de cellen in 900 pl gedestilleerd water. Onmiddellijk toevoegen van 100 ul van 10x PBS.
2. Individueel lyseren elk monster. Indien monsters bevatten grote hoeveelheden rode bloedcellen, kunnen de cellen worden gepelleteerd in het tafelblad centrifuge bij 400 xg gedurende 5 minuten en de rode bloedcellen lysis protocol kan worden herhaald.
3. Bepaal de totale BALF cellulariteit in de suspensie 1 ml met behulp van een hemacytometer onder 10X of 20 X vergroting met Trypan Blue kleuring. Evalueren en presenteren deze gegevens als cellen / ml.
4. Bereid materialen voor de Cytospin en differentiële kleuring. Label standaard microscoop dia's met behulp van een potlood of solventbestendige pen. Maak de dia's in een cytospin beugel en trechter. Zet de schuif montage in de cytospin rotor.
5. Cytospin 150 ui BALF bij 100 xg gedurende 5 minuten. Als de celdichtheid te groot om effectiefevalueren celmorfologie, het volume afgedraaid op de glijbanen verminderen. Laat de dia's te drogen 's nachts de lucht.
6. Differentiële vlek dia na de vervaardiging protocollen. Laat de dia's te drogen 's nachts de lucht. Dekglaasje dia met Permount en dia evalueren met een microscoop met een 20X en 40X objectief.
7. Oogst de resterende cellen voor verdere analyse, zoals FACS, elektronenmicroscopie, confocale microscopie, RNA extractie genexpressie evaluatie en / of eiwit-extractie voor western blot.

6. Histopathologie Evaluatie

1. Bereid de longen voor histopathologie evaluatie. Na 24-48 uur formaline fixatie, ventraal oriënteren geheel opgeblazen longen en ingebed in paraffine. Snijd de resulterende blokken naar de belangrijkste geleidende luchtwegen bloot.
2. Om de nauwkeurigheid scoren te verbeteren, de positie van de longen in dezelfde positie en trim elk blok om de maximale lengte-visualisatie van t opleverenhij intrapulmonale belangrijkste axiale luchtwegen. Vanaf dit punt, snijd 5 micron seriecoupes en vlek met hematoxyline en eosine (H & E). Aanvullende secties kunnen worden gesneden en bereid in situ hybridisatie onder toepassing van standaardprotocollen.
3. Evalueer histopathologie met een semi-kwantitatieve scoresysteem gebaseerd op de volgende inflammatoire parameters, die zijn ingelopen tussen 0 (afwezig) en 3 (ernstig): mononucleaire en polymorfonucleaire cel infiltratie; luchtwegepitheelcellen celhyperplasie en de schade; extravasatie; perivasculaire en peribroncheolar cuffing; en het percentage van de long betrokken bij ontsteking. Long histopathologie moeten worden geëvalueerd door een ervaren patholoog.
4. Gemiddelde van alle van de parameter scores tot een totaal histopathologie score te genereren of te gebruiken individuele scores van specifieke aspecten van progressie van de ziekte te kwantificeren. Over tot alle scoren in een dubbelblind mode, met reviewers blind voor zowel genotype en behandeling. Dit scoresysteem is previousl geweesty beschreven ^6,7,10.

Representative Results

De celwanden van gramnegatieve bacteriën bestaan ​​uit LPS, die zeer overvloedig in het milieu. Inademen van LPS in gevoelige menselijke populaties verergert luchtweg reactiviteit en is in staat van triggering een robuust immuun response11. LPS is ook een gemeenschappelijke PAMP in muismodellen om een ​​robuuste aangeboren immuunrespons opwekken. In de hier beschreven het protocol, ontving de muizen een dosis van het LPS geïsoleerd van E. coli (serotype 0111: B4) met behulp van orofaryngeale het bestuur. In modellen van LPS blootstelling zowel lichaamstemperatuur en gewicht zijn typisch surrogaat markers van dierlijke morbiditeit en ziekteprogressie. De LPS uitdaging zal een significante daling van de lichaamstemperatuur veroorzaken binnen de eerste 6 uur, die geleidelijk toeneemt naar basislijn in de loop van 24 uur (Figuur 1A). Echter, het lichaamsgewicht geleidelijk afnemen in de loop van 24 uur (Figuur 1B), waar het zal pieken en geleidelijk herstellen via next 48-72 uur. Aldus lichaamstemperatuur een geschikter marker om de vroege stadia van ontsteking inleiding evalueren; dat het lichaamsgewicht is meer betrouwbaar tijdens de latere stadia van de pathogenese en herstel.

Airway LPS blootstelling resulteert in aanzienlijke instroom van leukocyten naar de longen. Binnen de eerste 6 uur, kunnen de cellen verbonden aan de gastheer aangeboren immuunrespons worden waargenomen in de BALF (figuur 1C). De BALF cellulariteit blijft stijgen in de komende 24-48 uur (figuur 1C), waarbij de immuunrespons pieken en vervolgens gaat gedurende ontsteking resolutie. Door 24 uur, een aanzienlijk aantal neutrofielen in de longen en kan worden waargenomen in de BALF volgende differentiële kleuring (figuren 1D en 1E). BALF cellulariteit evaluaties vormen een robuust en kwantificeerbare techniek om de cellen gekoppeld aan de immuunrespons in de longen karakteriseren. De incrgemak in BALF celrijkdom is met een grote instroom van neutrofielen in de luchtwegen, bloedvaten en in het longparenchym (fig. 1F en 1G). Long histopathologie kan effectief worden geëvalueerd met behulp van een semi-kwantitatieve scoring systeem (Figuur 1F). Het is mogelijk om nauwkeurig scoren de histopathologie op specifieke monumenten in de longen van verschillende dieren wanneer de longen nauwkeurig opgeblazen dezelfde grootte met fixatief en bewerkt om de maximale longitudinale weergave van de intrapulmonale belangrijkste luchtwegen axiale secties tonen. De zwaartekracht gebaseerde inflatie protocol, hier beschreven, is ontworpen om dit scoresysteem vergemakkelijken. LPS induceert een aanzienlijke toename van perivasculaire, peribroncheolar en parenchymale ontsteking (figuur 1G).

LPS toediening induceert hoge niveaus van lokale en systemische pro-inflammatoire mediatoren, waaronder een aantal cytokinen geassocieerd metde aangeboren immuunrespons. Local cytokine niveaus kunnen worden beoordeeld in de BALF gebruikelijke technieken zoals ELISA. Gemeenschappelijke cytokinen die opwaarts gereguleerd in de longen na LPS toediening omvatten TNF-α, IL-1β en IL-6 (figuur 2A). Systemische cytokine niveaus worden geëvalueerd in het serum met dezelfde technieken als beschreven voor de BALF evaluaties (figuur 2B). Het is niet ongewoon voor een aantal bemiddelaars aanwezig in de lokale micro-omgeving, maar afwezig in het serum is. Bijvoorbeeld, is TNF-α routinematig in hoge concentraties in de longen na LPS, maar meestal niet systemisch vinden onder de in dit protocol beschreven voorwaarden (Figuren 2A en 2B, onder het detectieniveau).

Figuur 1. Orofaryngeale Intratracheaal LPS Administration de morbiditeit en de luchtwegontsteking in Muizen. Mannelijke muizen kregen 1 mg / kg van E. coli LPS (serotype 0111: B4) en het ziektepathogenese werd geëvalueerd in de loop van 24 uur AB) LPS leidt tot een significante verlaging van de lichaamstemperatuur binnen 6 uur van toediening;. terwijl gewichtsverlies is meer duidelijk bij de latere tijdstippen. C)   LPS induceert een aanzienlijke stijging van BALF cellulariteit. DE) Neutrofielen zijn de dominante celtype aanwezig in de longen 24 uur na LPS toediening, zoals onthuld door differentiële kleuring van cellen geisoleerd uit de BALF. Deze gegevens worden doorgaans weergegeven als het percentage van elk celtype in de BALF. F) long histopathologie kan worden geëvalueerd met behulp van een semi-kwantitatieve scoresysteem gebaseerd op twee onafhankelijke evaluaties van de ontsteking rondom de intrapulmonale belangrijkste axiale luchtwegen. G) Een aanzienlijk bedrag van perivasculaire en peribroncheolar cuffing, milde parenchymatische ontsteking en enkele lichte alveolaire occlusie wordt meestal waargenomen 24 uur na blootstelling long LPS. Klik hier voor grotere afbeelding .

Figuur 2. Luchtwegen Blootstelling aan LPS resulteert in een verhoogde van lokale en systemische cytokinen. A)   Na blootstelling LPS, kunnen lokale een breed spectrum van pro-inflammatoire cytokines in de BALF worden waargenomen binnen de eerste 24 uur, inclusief TNF-α, IL-1β en IL-6. Deze cytokinen kunnen worden geëvalueerd met behulpELISA, zoals hier 24 uur na blootstelling LPS. B) Verscheidene cytokinen kan ook systemisch worden gedetecteerd in het serum. Er zijn echter enkele opvallende uitzonderingen, zoals TNF-α, die worden aangetroffen in hoge concentraties in de BALF maar niet in het serum. Cytokines van belang in het serum moeten empirisch voorafgaand aan grootschalige evaluatie worden geëvalueerd. Klik hier voor grotere afbeelding .

Figuur 3. Lung Inflatie behulp Zwaartekrachtverplaatsing resulteert in verminderde Histopathology Variabiliteit en verbeterde visualisatie. De zwaartekrachtverplaatsing methode van fixatie beschreven in dit protocol zorgt voor een optimale histopathologie evaluatie vergelijkbare ed om niet opgeblazen longen of handmatige inflatie. AB) door de zwaartekracht inflatie vaste Longen aantonen uniforme kenmerken wat een nauwkeurig noteren, verminderde alveolaire schade, verbeterde visualisatie en hogere resolutie evaluaties van ontsteking. CD) Handmatige inflatie van de longen meestal resulteert in een niet-uniforme gebieden van inflatie. C) Deze uniforme gebieden vaak gedeeltelijk opgeblazen, waardoor samengevouwen gebieden die vaak verward als pathologische door beginnende beoordelingen. D) Handmatige inflatie resulteert ook in gebieden van de longen die zijn opgeblazen, waardoor zwaar beschadigd alveolaire ruimten. E) niet opgeblazen longen tonen ingestorte alveolaire ruimten en gebieden die moeilijk op te lossen en te evalueren zonder uitgebreide training zijn. Ook door het orgaan wordt samengevouwen deze techniek geen visualisatie van de longen laten zoals ze in situ.e.com/files/ftp_upload/51391/51391fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier voor grotere afbeelding.

Discussion

De meest kritische stappen voor succesvolle evaluatie van de immuunrespons in muizenlongen is als volgt: 1) Kies de juiste muizenstam en geslacht van het model geëvalueerd; 2) optimaliseren PAMP levering aan de longen; 3) correct verzamelen en verwerken de BALF; en 4) goed vast te stellen en voor te bereiden van de longen voor histopathologisch assessments.

De keuze van de muis stam is een belangrijke factor bij de evaluatie van de immuunrespons. C57Bl / 6 muizen worden doorgaans beschouwd als de optimale muis achtergrond voor het bestuderen van aangeboren immuniteit als gevolg van hun Th1 scheeftrekken en robuust antwoord op de meeste PAMPs. Evenzo worden BALB / c muizen meestal gebruikt voor het bestuderen van allergische ziekte modellen door de Th2 scheeftrekken. Een derde gebruikte stam longmodellen zijn muizen op de 129SvEv achtergrond vanwege hun algemeen gebruik bij het genereren van genetisch gemodificeerde dieren. In alle gevallen dient voorzichtigheid tijdens experimenteel ontwerp en, waar mogelijk, leeftijd en geslacht ma worden genomentched liter-mate controle dieren moeten worden gebruikt voor vergelijkende studies met genetisch gemodificeerde muizen met wild-type dieren. Kenmerkend voor de LPS hier beschreven protocol moet 6-12 weken oude geslacht overeenkomstige C57BL / 6 muizen worden gebruikt en moet minstens 20 g zou wegen. Het is mogelijk dat blootstelling aan LPS leidt tot hoge morbiditeit en mortaliteit in gevoelige muizenstammen of genotypen. Als dit gebeurt, kan het noodzakelijk zijn om verschillende aspecten van het protocol, zoals het verminderen van de dosis LPS, met grotere dieren, en schakelen het geslacht van de dieren die in het experiment passen. Kleinschalige experimenten worden aanvankelijk uitgevoerd om de gevoeligheid van dieren te bepalen en de voorwaarden voor elk experiment moet worden gebaseerd op de meest gevoelige genotype of experimentele conditie.

Orofaryngeale het beheer is gebleken nauwkeuriger dan andere agens aflevering aan de longen ² zijn. Dit is grotendeels te wijten aan de directe toegang tot de aiNoorwegen in en het omzeilen van problemen in verband met nasale en sinus holte depositie. Echter, zoals met alle dierlijke procedures, het beheer vergt veel handigheid en praktijk om vaardigheid te bereiken. Onjuiste techniek kan leiden tot inefficiënte longdepositie en in sommige gevallen resulteren in dierlijke letsel. Meestal kan Evans Blue Dye (EBD) effectief worden gebruikt als ofwel een hulpmiddel voor deze procedure of om mogelijke problemen in verband met afzetting ⁴ op te lossen. EBD kan worden toegediend, en vervolgens uit het weefsel met behulp van formamide. De hoeveelheid EBD kan worden berekend met de absorptie niveaus vergeleken met een standaardcurve. In onze handen, typisch EBD herstel varieert tussen de 90-98%. Het grootste deel van de niet-herstelde kleurstof verwachting geassocieerd met lekkage in de slokdarm. Vanwege de nauwkeurigheid, de IT-beheer techniek is ideaal voor het leveren van een breed scala van dosis gevoelig agenten naar de longen, zoals farmaceutische middelenof infectieuze organismen.

Analyse van de BALF en BALF cellulariteit kan een aanzienlijke hoeveelheid inzicht geven in de algemene vooruitgang van de immuunrespons. Ontstekingsmediatoren lokaal vrijgegeven in de longen na stimulatie effectief kan worden gekwantificeerd in de BALF gebruikelijke immunologische technieken, zoals ELISA en Western blot. Evenzo kan de cellulaire samenstelling van de BALF worden geëvalueerd met behulp van differentiële cel kleuring en flowcytometrie. Het ontwikkelen van de juiste techniek en handvaardigheid is het meest kritische deel van het uitvoeren van de bronchoalveolaire lavage (BAL). Een van de meest voorkomende problemen die zich voordoen tijdens de BAL is niet het maximale vloeistofvolume oorspronkelijk in de longen geheel verwijderen. Dit wordt vaak geassocieerd met een onjuist bevestigd canule of wanneer naalden worden gebruikt in plaats van de werkelijke canules. Gespecialiseerde tracheale canules zijn commercieel verkrijgbaar. Het is ook belangrijk dat de beweging en krachtgebruikt om in te voegen en trekken de zoutoplossing is glad en consistent tijdens de gehele procedure. De hier beschreven protocol werd geoptimaliseerd voor differentiële kleuring van cellen in de BALF verzameld. Differentiële kleuring is een gemodificeerde Wright Giemsa kleuring en is een zeer effectieve techniek om morfologie gebaseerde mobiele identificatie voeren. Deze kleuring techniek maakt de differentiatie van neutrofielen en eosinofielen basis van hun unieke eigenschappen korrel kleuring. Monocyten afgeleide cellen zijn ook gemakkelijk te identificeren en worden vaak waargenomen in de BALF. Deze omvatten macrofagen en dendritische cellen. Ook T-cellen en B-cellen worden ook vaak waargenomen. Echter, deze monocytische cellen en lymfocyten zijn vaak moeilijk voor de meeste onderzoekers nauwkeurig te differentiëren op basis van morfologische kenmerken. Het gebruik van flowcytometrie kan veel hogere resolutie toe te voegen aan deze evaluaties. Echter, lage aantallen cellen hersteld van controle dieren is vaak een beperkende factor. Dus, als het debiet cytommetrie wordt gebruikt, proefopzet moet ook additionele negatieve controledieren naar cel, te verhogen.

Lung histopathologie assessments zijn een ander essentieel onderdeel van dit protocol en zorgen voor de directe visualisatie van de progressie van de ziekte (Figuren 3A en 3B). Wanneer de longen goed voorbereid, kan histopathologie nauwkeurig worden geëvalueerd, gekwantificeerd en gekarakteriseerd. De meest kritische stap in de voorbereiding van de longen voor histopathologie is ze goed opblazen met een fixatief. Handmatige methoden van de inflatie meestal resulteren in longen die zijn opgeblazen, onder-opgeblazen of gedeeltelijk opgeblazen, wat resulteert in suboptimale visualisatie en morfologie assessments (Figuren 3C en 3D, respectievelijk). Ook longen die niet opgeblazen vóór fixatie zeer moeilijk om nauwkeurig te evalueren en vaak resulteert in sterk wisselende histopathologische score (Figuur 3 E). De gravimetrische methode inflatie besproken verschaft een reproduceerbare werkwijze voor inflatie met minimale variabiliteit. Met deze techniek is het mogelijk specifieke oriëntatiepunten evalueren de longen die vergelijkbaar bij experimentele dieren. Voorts heeft de zwaartekracht inflatie gebruikt een inflatie stand blijkt de longen blazen op een fixatief druk van 20 mm ^12. Deze techniek maakt de visualisatie van de longen hun meest fysiologisch relevante grootte en vorm en is zeer effectief gebleken voor de beoordeling van gevoelige pathofysiologische processen ¹² zijn. Het is essentieel dat de inflatie stand worden ingesteld op de juiste hoogte van de muis om de juiste druk te genereren. Als suboptimale inflatie wordt waargenomen, moet de hoogte van de inflatie stand empirisch worden bepaald. Het gebruik van een in de handel verkrijgbare kleine knaagdier long inflatie stand, die zal zorgen voor de juiste hoogte, wordt aanbevolen.

t "> Deze procedure is geoptimaliseerd voor de levering van LPS en andere PAMPs de longen van muizen. Wanneer deze technieken worden beheerst, kunnen aanvullende studies eveneens ingeleid met gemodificeerd protocollen effectief evalueren gastheer-pathogeen interacties met levende pathogenen. Evenzo de hier beschreven technieken zijn zeer veelzijdig en kan worden toegepast op elke studie vindt het beoordelen van de klinische en fysiologische relevantie van een experimentele of farmaceutisch middel. Door de nauwkeurigheid van de dosering is deze techniek ook geschikt voor in vivo studies waarbij hoge eisen mate van precisie in agensafgifte.

Deze procedure is geoptimaliseerd voor de levering van LPS en andere PAMPs de longen van muizen. Zodra deze technieken onder de knie, kan aanvullende studies ook worden gestart met behulp van aangepaste protocollen om effectief te evalueren gastheer-pathogeen interacties met levende ziekteverwekkers. Ook de hier beschreven technieken zijn zeer veelzijdig en kan be toegepast op elke studie die geïnteresseerd zijn in de beoordeling van de klinische en fysiologische relevantie van een experimentele of farmaceutisch middel. Door de nauwkeurigheid van de dosering is deze techniek ook geschikt voor in vivo studies die een hoge mate van precisie middel levering.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57Bl/6J	The Jackson Laboratory	Stock 000664
Compact Scale	Ohaus Scale Corporation	71142845
Small Animal Rectal Thermometer	Braintree Scientific	TH 5
Rectal Probe for Rodents	Braintree Scientific	RET 3
Ear Punch	Braintree Scientific	EP-S 901
Lipopolysaccharide from E. coli 0111:B4	InvivoGen	LPS-EB
1x Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	10010-023
Isoflurane	Baxter	40032609
Intratrachael Administration and Lung Inflation Stand	ICAP Manufacturing	n/a
Rodent Intubation Stand	Braintree Scientific	RIS 100
Scissors (blunt/sharp)	Fisher Scientific	13-806-2
forceps (straight)	Fisher Scientific	22-327-379
forceps (45º, curved)	Fisher Scientific	10-275
Scissors (blunt/blunt)	Fisher Scientific	08-940
Pipette (200 µl Capacity)	Gilson	F123601
Ethanol	Sigma	459844
1 ml Syringe	BD Medical	301025
10 ml Syringe	BD Medical	301604
27 G x 0.5 in Needle	BD Medical	305109
Refrigerated Microcentrifuge	Fisher Scientific	13-100-676
1.2 mm Tracheal Cannulae with Luer-adapter	Harvard Apparatus	732836
Hank's Balanced Salt Solution	Life Technologies	14025-076
4-0 Silk Braided Surgical Suture	Ethicon	A183
Luer to Tube Connector Kits	Harvard Apparatus	721406
Luer Stopcock Kit	Harvard Apparatus	721664
Tygon formula E-3603 Laboratory Tubing	Sigma	R-3603
Formalin Solution, neutral buffered, 10%	Sigma	HT501128-4L
Mouse IL-1β OptEIA ELISA Kit	BD Biosciences	559603
Mouse IL-6 OptEIA ELISA Kit	BD Biosciences	550950
Mouse TNF-α OptEIA ELISA Kit	BD Biosciences	560478
Hemocytometer	Hausser Scientific	3520
Hemocytometer Cover Glasses	Thermo Scientific	22-021-801
Trypan Blue	Thermo Scientific	SV3008401
Cytology Funnel Clips	Fisher Scientific	10-357
Cytology Funnels	Fisher Scientific	10-354
Filter Cards	Fisher Scientific	22-030-410
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-544-1
Cover Glasses	Fisher Scientific	12-540A
Cytospin Cytocentrifuge	Thermo Scientific	A78300003
Diff Quick Staining Kit	Fisher Scientific	47733150
Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-500