Die Nutzung der Oropharyngeale Intratracheale PAMP Verwaltung und bronchoalveoläre Lavage, um die Immunantwort in Mäusen Bewerten

Summary

Die Immunantwort des Wirts auf Pathogen-Infektion ist eine streng reguliert Prozess. Mit Hilfe eines Lipopolysaccharid Lungenexpositionsmodell in Mäusen, ist es möglich, hochauflösende Auswertungen der komplexen Mechanismen der Krankheitsentstehung verbunden durch.

Abstract

Die Immunantwort auf Pathogene ist ein komplexer biologischer Vorgang. Die Mehrheit der in-vivo-Studien eingesetzt, um klassisch zu charakterisieren Wirt-Pathogen-Interaktionen nutzen intraperitoneale Injektionen von ausgewählten Bakterien oder Erreger associated molecular patterns (PAMPs) bei Mäusen. Während diese Techniken haben enorme Daten mit Infektionskrankheiten assoziiert Pathobiologie ergab, sind intraperitoneale Injektion Modelle nicht immer für Wirt-Pathogen-Interaktionsstudien in der Lunge geeignet. Mit Hilfe einer akuten Lungenentzündungsmodell bei Mäusen, ist es möglich, eine hochauflösende Analyse der Host angeborenen Immunantwort Verwendung Lipopolysaccharide (LPS) durchzuführen. Hier beschreiben wir die Methoden, um LPS verwalten mit nicht-chirurgischen oropharyngeal intratracheale Verwaltung, Überwachung klinischer Parameter mit der Krankheitsentstehung verbunden sind, und nutzen bronchoalveolären Lavage, um die Immunantwort zu beurteilen. Die Techniken, die beschrieben werden,sind weit für das Studium der Wirt angeborenen Immunantwort auf ein breites Spektrum von PAMPs und Pathogene. Ebenso können mit kleineren Modifikationen dieser Techniken können auch in Studien, die allergische Entzündung der Atemwege und in pharmakologischen Anwendungen eingesetzt werden.

Introduction

Pulmonale Infektionen mit pathogenen Bakterienspezies verbunden sind, sind eine häufige Ursache von Morbidität und Mortalität weltweit. Die Bestimmung der Mechanismen, die die Immunantwort auf diese Krankheitserreger treiben die Entwicklung von neuen Präventionsstrategien und Therapeutika, die die Auswirkungen dieser Infektionen dämpft fördern. Das übergeordnete Ziel des hier beschriebenen Protokolls ist es, den Anwender mit einer flexiblen Verfahren zu schaffen, zu bewerten, den Host angeborenen Immunantwort auf Krankheitserreger Infektion mit einem Erregermuster (PAMP) als Surrogat für die lebenden Bakterien. Die Mehrheit der früheren Studien, die die Host angeborenen Immunantwort auf Bakterien auf peritoneale Modelle aufgrund der relativen Leichtigkeit der Ausführung konzentriert. Während diese Modelle sind sehr nützlich und in bedeutende Fortschritte auf dem Gebiet der Wirt-Pathogen-Interaktionen und systemischen Entzündung geführt hat, sind die aus diesen Modellen generierten Daten nicht immer für die entsprechenden Studien involving der Atemwege. Dabei wird ein Modell der akuten Lungenlungenentzündung als praktische und klinisch relevante Ausdehnung der klassischen intraperitoneale (ip) Injektion Modelle vorgeschlagen. Die vorgeschlagene Technik ermöglicht die lokale Bewertung der angeborenen Immunantwort bei einem organspezifischen Modellsystem.

Die hier beschriebenen Verfahren sind für eine einfache und robuste Technik, um Benutzern, die Immunantwort des Wirts auf LPS, die eine gemeinsame PAMP ist, beurteilen zu können. Die Methoden basieren auf intratracheale (IT) Instillation von LPS, die eine robuste angeborene Immunantwort in den Lungen von Mäusen und ahmt viele der in menschlichen Patienten, die an Infektionen der Atemwege und akuter Lungenverletzung ¹ beobachtet pathophysiologische Funktionen induziert basiert. Ein Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es dem Benutzer, den Host-Immunantwort ohne die Störfaktoren und Sicherheitsbedenken bei der Durchführung in vivo Studien verbunden zu bewertenmit lebenden Bakterien. Auch die Mund-Rachen es Verwaltung Weg der Exposition in diesem Protokoll beschrieben ist, hat erhebliche Vorteile gegenüber anderen häufig verwendeten Techniken, einschließlich intranasale (in) Verwaltung und chirurgische es Verwaltung. Zum Beispiel ermöglicht es oropharyngealen Verabreichung relativ genaue Dosierung und Lungenablagerung im Vergleich zu in der Verwaltung, die in der Regel leidet erhöhte Variabilität Lung durch den Verlust von Mitteln in der Nasenhöhle und Nasennebenhöhlen ^2-4. Die IT-Administration Route umgeht diese Hohlräume und ermöglicht den direkten Zugriff auf die Luftröhre und der Atemwege. Ebenso ist es die chirurgische Ansatz eine deutlich krankhaften Verabreichungsmethode und erfordert umfangreiche Ausbildung zu meistern. Die hier beschriebenen Protokolle umfassen auch eine Beschreibung der gemeinsamen Techniken und Surrogat-Marker verwendet, um Entzündung Progression zu bewerten und am Ende mit einem Protokoll beschreibt die richtigen Techniken für die Vorbereitung der lungs für die Histopathologie Einschätzungen. Diese Protokolle basieren auf der Minimierung der Anzahl der Mäuse durch Maximierung der von jedem einzelnen Tier gewonnenen Daten für jede Studie erforderlich konzentriert.

Die beschriebenen Protokolle sind sehr flexibel und kann leicht geändert werden, um ein breites Spektrum und die damit verbundenen Schäden PAMPs molekulare Muster (gedämpft) zu beurteilen. Außerdem mit ein paar zusätzliche Modifikationen, diese Protokolle auch auf Studien, die allergischen Atemwegskrankheitsprogression oder Wirt-Pathogen-Interaktionen mit lebenden Bakterien, Viren oder Pilzen ^5-10 angewendet werden.

Protocol

Alle Untersuchungen wurden im Rahmen der Genehmigung des Institutional Care und Verwenden Committee (IACUC) für Virginia Tech und in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt.

1. Intratracheale (es) Inokulation von LPS Mit Oropharyngeale Verwaltung

1. Stellen Sie sicher, dass jedes Tier ist einzigartig entweder ein Ohr Schlag, Ohrmarke oder andere institutionell anerkannte Methode identifiziert.
2. Notieren Sie die Ausgangskörpergewicht und die Körpertemperatur für jedes Tier.
3. Bereiten Sie die Arbeits Bestand von LPS. Jede Maus wird mit 50 ul Dosis von 1 mg / kg LPS in 1 × phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) erhalten. Mock-behandelten Tiere erhalten eine Dosis von 50 ul 1x PBS.
4. Bereiten Sie eine entsprechende Kammer für die Verwaltung von Isofluran mit dem folgenden Drop-Methode. Institutionelle Leitlinien variieren hinsichtlich der Verwendung von Isofluran und anderen Narkosemitteln und vor der initiatten keine Studien sollten Personen, Abteilung Tierpflege / Wohlfahrt ihre Institution wenden, um sicherzustellen, die alle Richtlinien hinreichend erfüllt werden. Wenn Isofluran-Drop-Methode ist keine Option, anderen Narkosemitteln sind akzeptable Alternativen.
   1. In einem geeigneten Sicherheitsschrank, gelten etwa 3 ml Isofluran zu einem gefalteten absorbierenden Papiertuch und in den Boden eines 500 ml-Becherglas.
   2. Legen Sie ein kleines Stück Aluminiumfolie auf der Oberseite des Papiertuch abdecken und das Becherglas mit einem transparenten Deckel.
5. Bereiten Sie die Instrumente und Reagenzien, die es während der Impfung verwendet wird. Positionieren Sie das Gummiband, das sichern die Tiere den Kopf auf das Intubation Stand wird. Dieses Verfahren wird ein Paar von geraden Zangen, ein Paar von abgewinkelten oder gebogenen Pinzette und ein p200 mit Spitzen erfordern.
6. Last 50 ul von LPS in die Pipettenspitze und in einer leicht zugänglichen Lage neben dem Stand der Intubation.
7. Anesthetize der Mausindem das Tier in die Kammer Isofluran und Abdecken der Kammer mit dem transparenten Deckel. Beachten Atemmuster des Tieres, der schnell und flach sein wird, wenn in der ersten Kammer angeordnet. Das Tier ausreichend betäubt werden, wenn die Atmung Raten heran 1 Atemzug / 2 sec, die in der Regel innerhalb von 30 Sekunden der Platzierung in der Kammer erreicht ist. Die Maus sollte betäubt werden, wie in der zugelassenen Tier-Protokoll mit Isofluran-Drop-Methode bilanziert.
8. Entfernen Sie den narkotisierten Maus aus der Kammer und die Aussetzung der Tier auf der Intubation stehen mit ihrem vorderen Schneidezähne. Versichern, dass das Tier sicher zurückgehalten und der Mund-und Zungen zugänglich sind.
9. Sichern Sie vorsichtig die Zunge mit den geraden Pinzette. Fassen Sie die Zunge mit den abgewinkelten Pinzette und ziehen Sie sie vorsichtig aus dem Mund, bis ein leichter Widerstand zu spüren ist. Diese Maßnahme reicht aus, um den Kehldeckel zu blockieren und Zugang zu der Luftröhre.
10. Während Sie die Zunge in die haltenausgefahrenen Position, die Verwaltung der 50 ul Dosis von LPS in die Rückseite der Kehle und Nase des Tieres sofort Abdeckung mit einem behandschuhten Finger. Das LPS wird in der Rückseite der Kehle sichtbar, bis die Maus einatmet.
11. Weiterhin die Nase bedecken und halten Sie die Zunge für 5-10 zusätzliche Atemzüge erweitert.
12. Entfernen Sie die Maus von der Intubation Stand und legen Sie das Tier wieder in einen neuen Käfig, bis er aus der Narkose erholt.
13. Überwachung Surrogatmarker mit Fortschreiten der Krankheit verbunden sind. Körpergewicht und die Körpertemperatur sollten alle 4-8 h für die Dauer der Studie überwacht. Ebenso beurteilen Verhaltensmerkmale und klinische Symptome, die mit einer erhöhten Morbidität verbunden.
14. Um den Krankheitsverlauf, Zwergmäuse zu bestimmten Zeitpunkten nach der LPS-Exposition zu beurteilen. Typische Zeitpunkte für die Ernte nach der LPS-Exposition sind 0, 6, 12, 18, 24 und 48 Stunden. Um eine Wiederherstellung und Überlebens bewerten, bewerten die Mäuse für 7 days nach der Inokulation.

2. Serum-und bronchoalveolären Lavage (BAL) Sammlung

1. Sacrifice Sie die Maus über ein institutionell anerkannte Methode.
2. Legen Sie das Tier auf den Rücken und befestigen Sie es an eine Obduktion Karte, die optimal in 0,5 (1,27 cm) in der Höhe.
3. Befeuchten Sie die gesamte Maus mit 70% Ethanol.
4. Mit einer 1-ml-Spritze mit einer 27 G-Nadel, eine Herzpunktion durchzuführen, bevor irgendwelche Einschnitte. Es sollte möglich sein, 500-800 ul Vollblut von einem einzigen Mausklick zurücktreten.
5. Entfernen Sie die Nadel aus der Spritze und übertragen das ganze Blut zu einem vormarkiert 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Zur Serumgewinnung ermöglichen das Vollblut für mindestens 30 min bei Raumtemperatur koagulieren. Zusätzlich zur Serumgewinnung, kann dieses Verfahren auch durch Einarbeiten eines Antikoagulans in das Rohr und Spritze vor dem Sammeln des Vollbluts, zu studieren zirkulierenden Immunzellen verändert werden.
6. Machen Sie einen horizontalen Schnitt einqueren die Länge der Peritonealhöhle und einen vertikalen Schnitt von der Peritonealhöhle zu dem Unterkiefer des Maus.
7. Mit einer Pinzette, fassen die beiden Seiten des Einschnitts und ziehen Sie die Haut von den zugrunde liegenden Peritoneal-und Brusthöhle.
8. Einen großen Einschnitt entlang der Länge der Bauchhöhle von den Genitalien auf dem Brustbein, wobei darauf zu vermeiden, schneiden die Membran. Leicht verschieben die Eingeweide in die Bauchhöhle, um den Zugang zu einer der Nieren zu ermöglichen.
9. Schneiden Sie die Nierenvene, die zur Niere als Drainagepunkt für die Durchblutung zu dienen.
10. Nick die Membran mit einer Schere, kümmert sich um die Lunge und Herz zu vermeiden, um die linke Seite des Herzens aus.
11. Manuell Perfusion des Herzens unter Verwendung einer 10 ml-Spritze mit einer 27 G Nadel und 1x PBS-Lösung. Vermeiden Sie die Anwendung exzessiver Gewalt während der Durchblutung, um sicherzustellen, dass die Kochsalzlösung ist nicht in die Lungen gepresst. Das restliche Blut sollten aus der Pfortader Einschnitt abtropfen lassen.
12. Schneiden Sie vorsichtig den Brustkorb entlang des Brustbeins mit stumpf / stumpf Schere, wobei darauf zu vermeiden, schneiden das Herz und die Lunge. Versehentlich Schneiden der Lunge während dieser Prozedur wird die Menge der gesammelten BALF deutlich zu reduzieren und wird in einer Unfähigkeit, richtig aufblasen die Lungen mit Fixiermittel führen.
13. Sanft isolieren das Herz und die Lunge aus dem Brustkorb mit einer Pinzette. Jeden Abschnitt des Brustkorbs mit stumpf / stumpf Schere so nah an der Wirbelsäule wie möglich vorsichtig geschnitten und vollständig zu entfernen beide Abschnitte.
14. Trennen Sie die Speicheldrüsen mit einer Pinzette oder entfernen Sie sie mit einer Schere, um die Luftröhre freizulegen.
15. Schneiden Sie vorsichtig die Muskeln, die die Luftröhre überlagern mit einer Schere. Es ist wesentlich, dass der Luftröhre dabei nicht geschnitten werden.
16. Mit einer Schere, trennen Sie die Schlüsselbein, die über der Luftröhre.
17. Fassen Sie die Thymusdrüse mit einer Pinzette und heben das Gewebe vom Herzen. Entfernen Sie die Thymusdrüse mit einer Schere, während die Pflege zuvermeiden Schneiden des Herzens oder der Lunge.
18. Machen Sie einen kleinen horizontalen Schnitt in der Luftröhre 1-2 Ringe unterhalb des Kehlkopfes mit abgewinkelten Scheren (45-90 º Winkel, scharf / scharf). Der Schnitt sollte groß genug sein, um sicher zu befestigen die Kanüle sein.
19. Legen Sie die Kanüle, so dass das verjüngte Ende erstreckt 03.02 Trachealringe unter dem Schnitt und sichern Sie die Kanüle an Ort und Stelle mit einem Seidenfaden. Sicherzustellen, daß das Nahtmaterial läuft zwischen der Luftröhre und der Speiseröhre und wird fest an der Kanüle gezogen wird.
20. Füllen Sie eine 1-ml-Spritze mit 1 ml Hanks Salzlösung (HBSS) und schieben Sie dessen Dorn in die Kanüle.
21. Mit einem langsam, aber ständig in Bewegung, injizieren ~ 900 ul in die Luftröhre, das Aufblasen der Lunge, und sofort zurückziehen HBSS. Legen Sie die wieder BALF in einem 15 ml konischen Röhrchen.
22. Wiederholen Sie diesen Lavage 2 weitere Male auf ca. 3 ml BALF für zukünftige Analysen zu sammeln. Bewahren Sie die BALF auf Eis oder bei 4 º C bis zur Verwendung.

1. Legen Sie eine 10-ml-Spritze in die Lunge Inflation Stand. Montieren Sie den Schlauch an den Luer, Luer auf den Hahn, und der Hahn an der Spritze. Sicherstellen, dass der Hahn in der geschlossenen Position. Die 10-ml-Spritze wird als Schwerkraftreservoir dienen. Der Behälter sollte auf die Inflation angebracht werden stehen in 4,75 über das Tier und die Oberseite des Behälters sollte in 10,5 über das Tier zu verlängern.
2. Füllen Sie die Spritze mit neutral gepufferten Formalin-Lösung. Sicherzustellen, dass die Spritze vollständig mit der Fixierlösung gefüllt.
3. Platzieren Sie ein saugfähiges Tuch unter dem offenen Ende des Rohres, und öffnen Sie den Wasserhahn, damit das Fixiermittel, um den Schlauch zu füllen. Sobald das Fixiermittel beginnt aus dem Schlauch fließt, sofort den Absperrhahn schließen und füllen Sie die Spritze an die Spitze mit Fixiermittel. Es ist wichtig, dass die Spritze vollständig gefüllt werden, um die geeignete Menge für Lungeninflationsdruck bereitzustellen.
4. Binden Sie einen einzigen lockeren Knoten in der Naht; jedoch nicht ziehen die Knoten fest.
5. Stecken Sie den Schlauch von der Maus Inflation stehen in die Kanüle.
6. Öffnen Sie den Wasserhahn und lassen die Lunge durch die Schwerkraft der Inflation zu füllen.
7. Sobald die Lunge erreichen ihre maximale Inflationsniveau, ziehen Sie den Faden fest und binden einen zweiten Knoten.
8. Schließen Sie den Wasserhahn und den Schlauch von der Kanüle entfernen.
9. Entfernen Sie vorsichtig die Kanüle aus der Luftröhre durch Ergreifen der Naht mit einer Pinzette und Halten der Kanüle mit den Fingern. Ziehen Sie den Faden nach unten zum Brusthöhle und der Kanüle zurück in Richtung der Maus die Nase.
10. Fassen Sie die Luftröhre oder die Nähte mit einer Pinzette und heben die Luftröhre vom Hals Höhle.
11. Sever die Luftröhre kaudal der Naht verbunden mit einer stumpfen Schere.
12. Sobald die Tracheein frei ist von den darunter liegenden Geweben, beginnen die Luftröhre von der Maus ziehen. Vorsichtig heben die Lunge aus der Brusthöhle.
13. Schneiden Sie vorsichtig das Bindegewebe hält die Lungen in der Brusthöhle. Weiter zieht die Luftröhre vom Körper des Maus und gelten stetige Aufwärtskraft beim Schneiden die zugrunde liegenden Verbindungen. Achten Sie darauf, um zu vermeiden, schneiden die Lunge. Man beachte, dass die linke Herz sollte in die Lungen unter Verwendung dieses Verfahrens angebracht werden.
14. Sobald die Lunge entfernt worden sind, legen Sie sie in 10 ml Formalin.
15. Entfernen Sie einen Teil der Schwanz der Maus für die Genotypisierung.
16. Entsorgen Sie die Maus Karkasse nach den geeigneten institutionellen Richtlinien.

4. Zytokin-Bewertung

1. Zentrifugieren Sie die Vollblut, unter Schritt 2.5 gesammelt, bei 12.000 xg für 5 min um das Serum zu isolieren. Das Serum in einer vormarkiert 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und bei -80 ° C
2. Bewerten Sie die serum Cytokinspiegel durch ELISA oder einem ähnlichen Test. Verdünnte Serum von 1.05 bis 1.20 in einer geeigneten Verdünnungspuffer je nach Assay nach den Anweisungen des Herstellers. Diese Verdünnungen sollten empirisch vor dem Ausführen der Großteil der Proben bestimmt werden.
3. Aufgrund des geringen Volumens der Serum gewonnen Verringerung des Probenvolumens auf die ELISA-Platte mit Halb geladen. Zum Beispiel verwenden die meisten kommerziellen ELISAs 100 ul-Volumina von Standards und Proben. Um Proben, Last 50 ul von Standards und verdünnten Serum sparen pro Vertiefung.
4. Zentrifuge der BALF in einem gekühlten Tischzentrifuge bei 200 g für 5 min. Übertragen Sie die zellfreie Überstand in zwei vormarkiert 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und bei -80 ° C
5. Bewerten BALF Zytokinen durch ELISA oder einem ähnlichen Test ohne Verdünnung.
6. Nicht verwendete Serum und BALF bei -80 ° C

5. Differentielle Färbung und BAL Zellularität Bewertung

1. Nach BALF Zentrifugation und vollständige Entfernung HBSS, die Lyse pelletiert roten Blutkörperchen mit hypotonischen Kochsalzlösung. Resuspendieren der Zellen in 900 ul destilliertem Wasser. Sofort im 100 ul von 10x PBS.
2. Individuell Lyse jede Probe. Wenn Proben enthalten große Mengen an roten Blutzellen können die Zellen in der Tischzentrifuge bei 400 g für 5 min, und die Lyse der roten Blutkörperchen Protokoll kann wiederholt werden pelletiert werden.
3. Bestimmen Sie die Gesamtzellzahl in der BALF 1 ml Suspension mit einer Hämazytometer unter 10X oder 20-facher Vergrößerung mit Trypan-Blau-Färbung. Bewerten und präsentieren diese Daten als Zellen / ml.
4. Bereiten Materialien für die Zytospin und Differenz Färbung. Beschriften Sie Standardobjektträger mit einem Bleistift oder lösungsmittelbeständig Stift. Sichern Sie sich die Folien in eine Zytospin Halterung und Trichter. Befestigen Sie die Schieberanordnung in der Zytospin Rotors.
5. Cytospin 150 ul BALF bei 100 × g für 5 min. Wenn die Zelldichte zu groß ist, um effektivbewerten Zellmorphologie, reduzieren Sie die Lautstärke nach unten auf den Folien gesponnen. Die Objektträger über Nacht trocknen Luft.
6. Differential färben die Folien produziert nach den Protokollen. Die Objektträger über Nacht trocknen Luft. Deckglas die Folien mit Permount und bewerten die Objektträger unter dem Mikroskop mit 20X und 40X-Objektiv ausgestattet.
7. Ernte der verbleibenden Zellen für eine nachfolgende Analyse, wie FACS, Elektronenmikroskopie, konfokale Mikroskopie, die RNA-Extraktion zur Genexpression Auswertung und / oder Proteinextraktion für Western Blot.

6. Histopathologie Bewertung

1. Bereiten Sie die Lunge für die Histopathologie Auswertung. Nach 24-48 h Formalin-Fixierung, ventral orientieren die ganzen aufgeblasenen Lungen und in Paraffin eingebettet. Schneiden Sie die Blöcke, um die daraus resultierenden Hauptstromatemwege freizulegen.
2. Um die Genauigkeit zu verbessern Scoring, positionieren die Lunge in der gleichen Position und trimmen jeden Block, die maximale Längs Visualisierung von t ergebener Intrapulmonale axialen Hauptatemwege. Von diesem Punkt schneiden 5 Mikron Serienschnitte und Fleck mit Hämatoxylin und Eosin (H & E). Zusätzliche Abschnitte geschnitten und in-situ-Hybridisierung unter Verwendung von Standard-Protokollen vorbereitet werden.
3. Auswerten Histopathologie unter Verwendung eines semi-quantitativen Bewertungssystem auf der Basis der folgenden Entzündungsparameter, der zwischen 0 (fehlt) und 3 (schwere) erzielt werden: einkernige und polymorphkernige Zellinfiltration; Atemwegsepithelzellen Zell-Hyperplasie und Verletzungen; Extravasation; perivaskuläre und peribroncheolar knuffen; und der Prozentsatz der Lunge mit Entzündung beteiligt. Lung Histopathologie sollte von einem erfahrenen Pathologen ausgewertet werden.
4. Durchschnittlich alle Parameterwerte, um eine Gesamt Histopathologie Wert zu generieren oder verwenden Einzelwertungen für die spezifische Aspekte der Krankheitsprogression zu quantifizieren. Führen Sie alle Scoring in einer doppelblinden Mode, mit Rezensenten sowohl Genotyp und Behandlung geblendet. Das Scoring-System wurde previously beschrieben ^6,7,10.

Representative Results

Die Zellwände von Gram-negativen Bakterien von LPS, die sehr reichlich in der Umgebung besteht. Inhalation von LPS in sensiblen menschlichen Populationen verschlimmert Atemwegs-Reaktivität und kann zur Auslösung einer Immun response11 robust. LPS ist auch eine gemeinsame PAMP im Mausmodell verwendet, um eine robuste angeborene Immunantwort hervorzurufen. In der hier beschriebenen Protokoll erhielten die Mäuse eine Dosis von LPS es isoliert aus E. coli (Serotyp 0111: B4) mit oropharyngealen es Verwaltung. Bei den Modellen von LPS Exposition, sowohl die Körpertemperatur und Gewicht sind typische Surrogatmarker der Tier Morbidität und Fortschreiten der Krankheit. Die LPS wird eine signifikante Abnahme der Körpertemperatur innerhalb der ersten 6 Stunden führen, die nach und nach im Laufe von 24 Stunden (Abbildung 1A) zurück zum Ausgangswert erhöht. Allerdings wird das Körpergewicht stetig im Verlauf von 24 h (Fig. 1B) zu verringern, wo sie ihren Höhepunkt erreichen und allmählich erholen über dem next 48-72 Std. So ist die Körpertemperatur eine entsprechende Markierung, um die frühen Stadien der Entzündung Einleitung zu bewerten; der Erwägung, dass das Körpergewicht während der späteren Stadien der Pathogenese und Erholung zuverlässiger.

Atemwegs LPS Exposition führt zu einer signifikanten Zustrom von Leukozyten in die Lunge. Innerhalb der ersten 6 Stunden können die Zellen mit dem Host angeborenen Immunantwort zugeordnet ist, in dem BALF (Fig. 1C) zu beachten. Die BALF Zellularität weiterhin über die nächsten 24-48 h (1C), wo die Immunantwort Spitzen und tritt anschließend in eine Zeit der Entzündung Auflösung zu erhöhen. Nach 24 Stunden eine signifikante Anzahl von Neutrophilen in der Lunge vor und können in der BALF folgende Differentialfärbung (Fig. 1D und 1E) beobachtet werden. BALF Zellularität Abschätzungen eine robuste und quantifizierbare Technik, um die Zellen mit der Immunantwort in den Lungen zugeordneten charakterisieren. Die incrLeichtigkeit in der BALF Zellularität ist konsistent mit einer signifikanten Zustrom von Neutrophilen in die Atemwege, Blutgefäße und im Lungenparenchym (1F und 1G). Lunge Histopathologie effektiv unter Verwendung eines semi-quantitativen Bewertungssystem (Fig. 1F) ausgewertet werden. Es ist möglich, genau das Tor Histopathologie in bestimmten Landmarken in den Lungen verschiedener Tiere, wenn die Lunge genau der gleichen Größe mit Fixiermittel und Abschnitten verarbeitet, um die maximale Längs Visualisierung der intrapulmonalen Atemwege axialen Haupt offenbaren aufgeblasen. Die Schwerkraft basierend Inflation Protokoll, hier beschrieben, soll dieses Bewertungssystems zu erleichtern. LPS induziert eine signifikante Erhöhung der perivaskulären, peribroncheolar und parenchymatösen Entzündung (Fig. 1G).

LPS-Verabreichung induziert hohe lokale und systemische pro-inflammatorischen Mediatoren, darunter mehrere Zytokine im Zusammenhang mitder angeborenen Immunantwort. Lokale Zytokinspiegel in der BALF unter Verwendung herkömmlicher Techniken, wie ELISA beurteilt. Gemeinsame Zytokine, die in der Lunge nach der LPS-Verabreichung nach oben reguliert werden, umfassen TNF-α, IL-1β und IL-6 (Fig. 2A). Systemischen Cytokin-Niveaus im Serum unter Verwendung der gleichen Technik wie die BALF Abschätzungen (2B) beschrieben, bewertet werden. Es ist nicht ungewöhnlich, dass einige Mediatoren in der lokalen Mikroumgebung vorhanden, aber in dem Serum vorhanden ist. Zum Beispiel ist TNF-α routinemäßig in hohen Konzentrationen in der Lunge nach der LPS gefunden, aber typischerweise nicht systemisch unter den in diesem Protokoll beschriebenen Bedingungen festgestellt (Fig. 2A und 2B; unterhalb der Nachweisgrenze).

Fig. 1 ist. Oropharyngeale Intratracheale LPS Verwaltung Erhöht Morbidität und Atemwegsentzündung bei Mäusen. Männliche Mäuse erhielten 1 mg / kg von E. . coli LPS (Serotyp 0111: B4) und es Pathogenese der Erkrankung wurde im Laufe von 24 Stunden AB) LPS induziert eine signifikante Reduktion der Körpertemperatur innerhalb von 6 Stunden der Verwaltung ausgewertet; wohingegen Körpergewichtsverlust ist bei den späteren Zeitpunkten noch deutlicher. C)   LPS induziert eine signifikante Erhöhung der Gesamt BALF Zellularität. DE) Neutrophile sind die dominieren Zelltyp in der Lunge vorhanden 24 Stunden nach der LPS-Verwaltung, wie von Differential-Färbung von Zellen aus der BALF isoliert enthüllt. Diese Daten werden typischerweise als Prozentsatz jedes Zelltyps in der BALF vorliegenden dargestellt. Kann F) Lung Histopathologie unter Verwendung eines semi-quantitativen Bewertungssystem basierend auf zwei unabhängigen Auswertung ausgewertet werdens der Entzündung rund um den intrapulmonalen axialen Hauptatemwege. G) Ein wesentlicher Teil der perivaskulären und peribroncheolar knuffen, mild parenchymatösen Entzündung und einigen leichten alveolären Okklusion in der Regel beobachtet 24 Stunden nach Lungen LPS-Exposition. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

2. Atemwegs Exposition gegenüber LPS führt zu erhöhten Niveaus von lokalen und systemischen Zytokine. A)   Nach der LPS-Exposition kann eine lokale Ebenen eines breiten Spektrums von proinflammatorischen Zytokinen in der BALF innerhalb der ersten 24 Stunden beobachtet werden, einschließlich TNF-α, IL-1β und IL-6. Diese Cytokine können mit ausgewertet werdenELISA, wie hier gezeigt, 24 Stunden nach der LPS-Exposition. B) Mehrere Zytokine können auch systemisch im Serum nachgewiesen werden. Es gibt jedoch einige Ausnahmen, einschließlich TNF-α, die in hohen Konzentrationen in der BALF im Serum zu finden sind, jedoch nicht. Zytokine von Interesse im Serum sollte empirisch vor großen Maßstab Auswertung ausgewertet werden. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

3. Lung Inflation Mit Gravity Verdrängung führt zu einer verringerten Variabilität Histopathologie und verbesserte Visualisierung. Die Schwere der Verdrängungsmethode in diesem Protokoll beschriebenen Fixierung ermöglicht eine optimale histopathologische Auswertung Vergleichbarkeit ed auf aufgeblasenen Lungen oder manuelle Inflation. AB) durch die Schwerkraft der Inflation fest Lungen zeigen einheitliche Merkmale, die es für eine genaue Scoring, reduziert Alveolarschaden, verbesserte Visualisierung und höhere Auflösung Auswertungen der Entzündung. CD) Manuelle Inflation der Lunge führt in der Regel ungleichmäßig Bereichen Inflation. C) Diese ungleichmäßige Bereiche sind oft teilweise aufgeblasen, was in Gebieten zusammengebrochen, die häufig fälschlicherweise als pathologischen Merkmale von Novize Rezensenten. D) Manuelle Inflation führt auch in Bereichen der Lunge, die zu stark aufgeblasen sind, die stark beschädigt sind, ergibt alveolären Plätze. E) Nicht aufgeblasene Lunge kollabierte Alveolen zeigen und Bereiche, die schwer zu lösen und ohne umfangreiche Schulungen bewerten sind. Ebenso aufgrund des Organs diese Technik klappt erlaubt keine Visualisierung der Lunge, wie sie in situ angezeigt.e.com/files/ftp_upload/51391/51391fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Discussion

Die wichtigsten Schritte für die erfolgreiche Bewertung der Immunantwort in der Maus Lunge ist wie folgt: 1) wählen Sie die entsprechende Maus-Stamm und Geschlecht für das Modell evaluiert; 2) Optimierung PAMP Lieferung in die Lunge; 3) richtig sammeln und verarbeiten die BALF; und 4) richtig fix und bereiten der Lunge für eine histopathologische Einschätzungen.

Die Auswahl des Maus-Stamm ist ein wichtiger Faktor bei der Bewertung der Immunantwort. C57BL / 6 Mäuse sind in der Regel als die optimale Maus Hintergrund für die Untersuchung der angeborenen Immunität durch ihre Schräg Th1 und robuste Antwort auf die meisten PAMPs. Ebenso werden BALB / c-Mäuse typischerweise zur Untersuchung allergischen Krankheitsmodelle aufgrund ihrer Schrägstellung Th2 verwendet. Ein dritter häufig verwendete Stamm der Lungenmodelle Mäuse auf dem 129SvEv Hintergrund aufgrund ihrer gemeinsamen Verwendung bei der Erzeugung genetisch veränderte Tiere. In allen Fällen ist Vorsicht geboten, während der experimentellen Design und, wann immer möglich, Alter und Geschlecht ma genommen werdentched Liter-mate Kontrolltiere sollten für Studien zum Vergleich von gentechnisch veränderten Mäusen mit Wildtyp-Tiere verwendet werden. Typischerweise ist für die LPS-Protokoll hier beschrieben ist, sollte 6-12 Wochen alten Geschlecht passende C57BL / 6 Mäusen verwendet werden, und sollte mindestens 20 g wiegen. Es ist möglich, dass LPS Exposition in hohen Morbidität und Mortalität bei empfindlichen Mäusestämmen oder Genotypen führen. Wenn dies auftritt, kann es notwendig sein, mehrere Aspekte des Protokolls, einschließlich einer Verringerung der LPS-Dosis, mit größeren Tieren, und Schalt das Geschlecht der im Versuch eingesetzten Tiere anzupassen. Kleinen Experimenten sollte zunächst durchgeführt, um Tier Empfindlichkeit zu bestimmen und die Bedingungen für jeden Versuch sollten am meisten anfällig Genotyp oder experimentellen Bedingungen basieren.

Oropharyngeale-Administration hat es sich herausgestellt, genauer als andere Formen der Mittelabgabe in die Lunge ² sein. Dies ist zum großen Teil durch den direkten Zugriff auf den airway und Umgehung Probleme mit Nasen-und Kieferhöhle Abscheidung verbunden. , Wie bei allen Tierversuchen, es Verwaltung erfordert jedoch umfangreiche manuelle Geschicklichkeit und Praxis, Kenntnisse zu erreichen. Falsche Technik kann ineffizient Lung und in einigen Fällen zu führen, in der Tier-Verletzung. Typischerweise kann Evans Blue Dye (EBD) effektiv entweder als Trainingsgerät für dieses Verfahren oder auf mögliche Probleme mit der Ablagerung ⁴ zugeordnet Fehlerbehebung genutzt werden. EBV kann verabreicht werden, und anschließend aus dem Gewebe unter Verwendung von Formamid extrahiert. Die Menge der EBD kann mit Absorptionsniveaus berechnet im Vergleich mit einer Standardkurve werden. In unseren Händen, reicht typischen EBD Erholung zwischen 90-98%. Der Großteil des nicht eingezogenen Farbstoff soll mit Leckage in der Speiseröhre verbunden ist. Aufgrund seiner Genauigkeit, ist die IT-Administration Technik ideal für die Bereitstellung einer Vielfalt von Dosis empfindlichen Stoffen in die Lunge, wie pharmazeutische Wirkstoffeoder infektiöse Organismen.

Analyse der BALF und BALF Zellularität kann eine erhebliche Menge der Einblick in den gesamten Verlauf der Immunantwort des Wirts bereitzustellen. Entzündungsmediatoren vor Ort in den Lungen nach Stimulation freigesetzt wird, kann effektiv in der BALF mit üblichen immunologischen Techniken wie ELISA und Western-Blot quantifiziert werden. Ebenso kann die zelluläre Zusammensetzung der BALF entweder Differentialzellfärbung oder Durchflußzytometrie ausgewertet werden. Die Entwicklung der richtigen Technik und Fingerfertigkeit ist der wichtigste Teil der Durchführung der bronchoalveolären Lavage (BAL). Eines der häufigsten Probleme, die während der BAL auftreten, nicht zu einer vollständig zurückziehen das maximale Volumen der Flüssigkeit in der Lunge ursprünglich platziert. Dies ist häufig mit einer nicht ordnungsgemäß gesichert Kanüle verbunden oder wenn Nadeln werden an Stelle der tatsächlichen Kanülen verwendet. Fach Trachealkanülen sind kommerziell erhältlich. Es ist auch wichtig, dass die Bewegung und Kraftzum Einfügen und ziehen die Salz ist glatt und konsistent während des gesamten Verfahrens. Das hier beschriebene Protokoll wurde für differentielle Färbung der Zellen in der BALF gesammelt optimiert. Differenzialfärbung ist eine modifizierte Wright-Giemsa-Färbung und ist eine hochwirksame Technik zur Morphologie Zellidentifikation durchzuführen. Diese Färbetechnik ermöglicht die Differenzierung von Neutrophilen und Eosinophilen auf der Grundlage ihrer einzigartigen Granulat Färbeeigenschaften. Monozyten-abgeleiteten Zellen sind auch leicht zu erkennen und werden üblicherweise in der BALF festgestellt. Dazu gehören Makrophagen und dendritischen Zellen. Ebenso werden T-Zellen und B-Zellen ebenfalls häufig beobachtet. Allerdings sind diese Monozyten und Lymphozyten sind oft schwierig für die meisten Forscher, basierend auf Morphologie allein genau zu differenzieren. Die Nutzung der Durchflusszytometrie können viel höhere Auflösung, um diese Auswertungen hinzuzufügen. Allerdings ist die Zellzahlen niedrig aus Kontrolltieren gewonnen oft ein limitierender Faktor. So, wenn Fluss cytomtrie verwendet werden soll, das experimentelle Design sollte zusätzliche negative Kontrolltieren beinhalten, um die Erholung der Zellen zu erhöhen.

Lung Histopathologie Einschätzungen sind ein weiterer wichtiger Bestandteil des Protokolls und ermöglichen die direkte Visualisierung der Krankheitsprogression (3A und 3B). Wenn die Lungen richtig vorbereitet, kann Histopathologie genau bewertet werden, quantifiziert und charakterisiert. Der wichtigste Schritt bei der Herstellung der Lungen für die Histopathologie wird sie mit Fixiermittel richtig aufzublasen. Manuelle Verfahren zur Inflation typischerweise in Lungen, die zu stark aufgeblasen sind Ergebnis unter aufgeblasenen oder teilweise aufgeblasenen, die suboptimal Visualisierung und Morphologie Abschätzungen (3C bzw. 3D) führt. Ebenso sind Lungen, die nicht vor der Fixierung aufgeblasen werden, sind sehr schwierig, genau zu beurteilen, und führt oft zu sehr variabel histopathologischen Scores (Fig. 3 E). Die Schwerpunktmethode der Inflation hier diskutiert bietet eine hoch reproduzierbare Methode der Inflation mit minimalen Schwankungen. Mit dieser Technik ist es möglich, bestimmte Ziele in der Lunge, die konsistent zwischen Versuchstiere eignen auszuwerten. Außerdem Schwerkraft Inflation mit einer Inflationsrate Stand wurde gezeigt, dass die Lunge bei einem Fixiermittel Druck von 20 mm ¹² aufzublasen. Diese Technik ermöglicht die Visualisierung der Lunge in ihrer physiologisch relevante Größe und Form und es wurde gezeigt, als hoch wirksam für die Bewertung der sensiblen pathophysiologischen Prozessen ^12. Es ist wichtig, dass die Inflation Stand auf der richtigen Höhe aus der Maus, um den richtigen Druck zu erzeugen, eingestellt werden. Wenn suboptimal Inflation beobachtet wird, ist die Höhe der Inflation Stand empirisch ermittelt werden. Die Verwendung eines handelsüblichen kleinen Nager Lungen Inflation Stand, der die richtige Höhe gewährleisten, wird empfohlen.

t "> Dieses Verfahren ist für die Lieferung von LPS und andere PAMPs den Lungen von Mäusen optimiert. Sobald diese Techniken beherrscht werden, können zusätzliche Untersuchungen auch mit modifizierten Protokolle effektiv zu bewerten Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen mit lebenden Pathogene ausgelöst werden. Ebenso Die hier beschriebenen Techniken sind sehr vielseitig und kann zu jeder Studie Interesse bei der Beurteilung der klinischen und physiologische Relevanz einer experimentellen oder pharmazeutisches Mittel eingesetzt werden. Aufgrund der Genauigkeit der Dosierung, ist auch diese Technik ideal für die in-vivo-Untersuchungen, die eine hohe verlangen Präzision in Mittelabgabe.

Dieses Verfahren ist für die Lieferung von LPS und andere PAMPs den Lungen von Mäusen optimiert. Sobald diese Techniken beherrscht, kann auch zusätzliche Studien mit modifizierten Protokolle, um effektiv zu bewerten Wirt-Pathogen-Interaktionen mit lebenden Erregern ausgelöst werden. Ebenso sind die hier beschriebenen Techniken sehr vielseitig und können be angewandt, um jeder Studie interessiert bei der Beurteilung der klinischen und physiologische Relevanz einer experimentellen oder pharmazeutische Mittel. Aufgrund der Genauigkeit der Dosierung ist diese Technik auch für in vivo-Untersuchungen, die eine hohe Genauigkeit bei der Wirkstoffabgabe erforderlich.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57Bl/6J	The Jackson Laboratory	Stock 000664
Compact Scale	Ohaus Scale Corporation	71142845
Small Animal Rectal Thermometer	Braintree Scientific	TH 5
Rectal Probe for Rodents	Braintree Scientific	RET 3
Ear Punch	Braintree Scientific	EP-S 901
Lipopolysaccharide from E. coli 0111:B4	InvivoGen	LPS-EB
1x Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	10010-023
Isoflurane	Baxter	40032609
Intratrachael Administration and Lung Inflation Stand	ICAP Manufacturing	n/a
Rodent Intubation Stand	Braintree Scientific	RIS 100
Scissors (blunt/sharp)	Fisher Scientific	13-806-2
forceps (straight)	Fisher Scientific	22-327-379
forceps (45º, curved)	Fisher Scientific	10-275
Scissors (blunt/blunt)	Fisher Scientific	08-940
Pipette (200 µl Capacity)	Gilson	F123601
Ethanol	Sigma	459844
1 ml Syringe	BD Medical	301025
10 ml Syringe	BD Medical	301604
27 G x 0.5 in Needle	BD Medical	305109
Refrigerated Microcentrifuge	Fisher Scientific	13-100-676
1.2 mm Tracheal Cannulae with Luer-adapter	Harvard Apparatus	732836
Hank's Balanced Salt Solution	Life Technologies	14025-076
4-0 Silk Braided Surgical Suture	Ethicon	A183
Luer to Tube Connector Kits	Harvard Apparatus	721406
Luer Stopcock Kit	Harvard Apparatus	721664
Tygon formula E-3603 Laboratory Tubing	Sigma	R-3603
Formalin Solution, neutral buffered, 10%	Sigma	HT501128-4L
Mouse IL-1β OptEIA ELISA Kit	BD Biosciences	559603
Mouse IL-6 OptEIA ELISA Kit	BD Biosciences	550950
Mouse TNF-α OptEIA ELISA Kit	BD Biosciences	560478
Hemocytometer	Hausser Scientific	3520
Hemocytometer Cover Glasses	Thermo Scientific	22-021-801
Trypan Blue	Thermo Scientific	SV3008401
Cytology Funnel Clips	Fisher Scientific	10-357
Cytology Funnels	Fisher Scientific	10-354
Filter Cards	Fisher Scientific	22-030-410
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-544-1
Cover Glasses	Fisher Scientific	12-540A
Cytospin Cytocentrifuge	Thermo Scientific	A78300003
Diff Quick Staining Kit	Fisher Scientific	47733150
Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-500