Summary
병원균 감염에 대한 숙주 면역 반응은 긴밀하게 규제 과정이다. 생쥐의 리포 다당류 폐 노광 모델을 이용해서, 그 질병 병인과 관련된 복잡한 메커니즘은 고해상도 평가를 수행하는 것이 가능하다.
Abstract
병원체에 대한 숙주 면역 반응은 복잡한 생물학적 과정이다. 생체 내 연구의 대부분은 고전적인 호스트 병원체 상호 작용이 생쥐를 선택 세균이나 병원균 관련 분자 패턴 (PAMPS)의 복강 내 주사의 장점을 특성화하기 위해 사용. 이러한 기술은 감염증 한테 진찰 Pathobiology와 관련된 엄청난 데이터를 산출하고 있지만, 복강 내 주사 모델은 항상 폐에 호스트 병원체 상호 작용 연구에 적합하지 않다. 생쥐의 급성 폐 염증 모델을 이용해서, 그 선천적 면역 반응은 리포 폴리 사카 라이드 (LPS)를 이용하여 호스트의 고해상도 분석을 수행 할 수있다. 여기서는, 비수술 인두 기관 내 투여를 이용하여 LPS를 관리 질병 병인과 관련된 임상 매개 변수를 모니터링하고, 숙주 면역 반응을 평가하기 위해 기관지 세정액을 활용하는 방법을 설명한다. 설명하는 기술PAMPS 및 병원균의 다양한 범위에 호스트 타고난 면역 반응을 연구하는데 널리 적용 할 수있다. 마찬가지로, 약간의 수정과 함께, 이들 기술은 또한 알레르기 성기도 염증을 평가 연구 및 약리학 애플리케이션에 적용될 수있다.
Introduction
병원성 박테리아 종과 관련된 폐 감염은 글로벌 병적 상태와 사망률의 흔한 원인이다. 이들 병원균에 대한 숙주 면역 반응을 구동 메커니즘을 결정하는 것은 이러한 감염의 영향을 약하게 할 신규 예방 전략 및 치료제의 개발을 촉진 할 것이다. 여기에 설명 된 프로토콜의 전반적인 목표는 생균에 대한 대리 병원체 관련 분자 패턴 (PAMP)를 사용하여 병원균 감염에 대한 숙주 선천성 면역 반응을 평가하기 위해 유연한 방식으로 사용자에게 제공하는 것이다. 박테리아 숙주 선천성 면역 반응을 평가하기 이전 연구의 대부분은 의한 실행의 상대적 용이성 복막 모델에 초점을 맞추고있다. 이 모델은 매우 유용하고 호스트 병원체 상호 작용과 전신 염증의 분야에서 상당한 발전시킬 수도 있지만,이 모델에서 생성 된 데이터는 항상 연구에 적합하지 involvi호흡기를 겨. 여기서, 급성 폐 염증의 폐 모델은 고전 복강 내 (IP) 주입 모델과 실제 임상 적으로 관련된 확장으로서 제안되어있다. 제안 된 기술은 특정 장기 모델 시스템에서의 선천성 면역 반응의 평가를 위해 로컬 허용한다.
여기서 설명한 방법은 사용자가 공통 PAMP이다 LPS에 숙주 면역 반응을 평가할 수있는 간단하고 강력한 기술을 제공하도록 설계된다. 방법은 기관 내 마우스 및 호흡기 질환 및 급성 폐 손상 1에서 고통받는 인간의 환자에서 관찰되는 병리 생리 학적 기능의 많은 모방의 폐에 강력한 선천성 면역 반응을 유도 LPS의 (IT) 점안을 기반으로합니다. 이 기술의 주요 장점은 사용자가 생체 내 연구에서 수행과 관련된 교란 변수 및 안전 우려없이 숙주 면역 반응을 평가할 수 있다는 것이다살아있는 박테리아를 사용하여. 마찬가지로,이 프로토콜에 설명 된 노출의 인두 IT 관리 경로 관리 (의) 비강 수술 IT 관리 등 다른 일반적으로 사용 기술에 비해 상당한 장점이 있습니다. 예를 들어, 인두 IT 관리는 일반적으로 인해 비강에있는 에이전트의 손실로 폐 증착의 변동성이 증가 시달리고 2-4 부비동 관리,의에 비해 상대적으로 정확한 dosaging과 폐 증착 할 수 있습니다. 그것의 투여 경로는 이러한 충치를 우회하고 기관과기도에 직접 액세스 할 수 있습니다. 마찬가지로, 수술의 IT 접근 방식은 훨씬 더 병적 관리 방법 및 마스터에 광범위한 교육이 필요합니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 또한 일반적인 기술 및 염증의 진행을 평가하고 LU를 제조하는데 적절한 기술을 설명하는 프로토콜을 종료하는 데 사용되는 대리 마커 설명을 포함조직 병리학 평가를위한 NGS. 이러한 프로토콜은 각각의 동물에서 생성 된 데이터를 최대화함으로써 각각의 연구에 필요한 생쥐의 수를 최소화하는 데 초점을 맞추고있다.
설명하는 프로토콜은 매우 유연하고 쉽게 다양한 범위의 PAMPS 손상 관련 분자 패턴 (감쇠)을 평가하기 위해 수정 될 수 있습니다. 또한, 몇 가지 추가 수정,이 프로토콜은 또한 알레르기 성기도 질환의 진행 또는 살아있는 박테리아, 바이러스 또는 곰팡이 5-10와 호스트 병원체 상호 작용을 평가하는 연구에 적용될 수있다.
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Protocol
모든 연구는 버지니아 공대의 기관 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인하에 및 실험 동물의 관리 및 사용을위한 건강 가이드의 국립 연구소에 따라 수행 하였다.
1. 구인두 관리를 사용하여 LPS의 기관 내 (IT) 예방 접종
- 각 동물의 고유 귀 펀치, 귀 태그, 또는 다른 제도적으로 승인 된 방법 중 하나를 사용하여 식별되어 있는지 확인합니다.
- 기준 체중과 각각의 동물에 대한 몸의 온도를 기록한다.
- LPS의 작업 주식을 준비합니다. 각 마우스 1X 인산염 완충 생리 식염수 (PBS) 1 ㎎ / ㎏ LPS의 50 μL의 복용량을 받게됩니다. 모의 치료 동물은 1X PBS의 50 μl의 선량을 받게됩니다.
- 다음 드롭 방법을 사용하여 이소 플루 란을 투여에 적합한 실을 준비합니다. 기관 지침으로 시작할 수있는 이소 플루 란과 다른 마취제와 이전의 사용에 관한 다양어떤 연구를 보내고, 사람은 모든 지침을 적절하게 충족 보장하기 위해 동물 보호 / 복지의 자신의 기관의 부서에 문의해야합니다. 드롭 방법 이소 플루 란이 옵션을 선택하지 않으면, 다른 마취제는 대체가 있습니다.
- 적절한 안전 캐비닛에, 500 ㎖ 비커의 바닥에 접혀 흡수 종이 타월과 장소에 이소 플루 란의 약 3 ㎖를 적용합니다.
- 종이 타월 위에 알루미늄 호일의 작은 조각을 놓고 투명 뚜껑이있는 비이커를 포함한다.
- 그것은 접종시 활용 될 도구와 시약을 준비합니다. 동물 삽관 스탠드에 머리를 확보 고무 밴드를 배치합니다. 이 절차는 직선 포셉 한 쌍의 각도 또는 곡선 포셉 한 쌍의와 팁 P200 피펫을 필요로 할 것이다.
- 삽관 스탠드 옆에 쉽게 액세스 할 수있는 위치에있는 피펫 팁과 장소에 부하 LPS의 50 μl를.
- 마우스를 마취이소 플루 란 챔버에 동물을 배치하고 투광성 덮개와 챔버를 덮는 따라. 첫 번째 챔버에 배치 할 때 신속하고 얕은 될, 동물의 호흡 패턴을 관찰한다. 호흡 속도는 일반적으로 챔버에 배치하는 30 초 이내에 도달 한 호흡 / 2 초를 접근 할 때 동물이 충분히 마취됩니다. 드롭 방법 이소 플루 란을 사용하여 승인 된 동물 프로토콜에 명시된 바와 같이 마우스를 마취해야합니다.
- 챔버에서 마취 된 쥐를 제거하고 그 앞니 대기 삽관에 동물을 일시 중지합니다. 동물이 안전하게 억제하고 입과 혀에 액세스 할 수있는 것을 확실히한다.
- 부드럽게 직선 집게로 혀를 고정합니다. 각진 집게로 혀를 잡고 약간의 저항이 느껴질 때까지 부드럽게 입에서 빼냅니다. 이 조치는 후두개 블록 및 기관지에 액세스하기에 충분하다.
- 에 혀를 잡고 계속하면서확장 된 위치는 목의 뒷면에 LPS의 50 μL 용량을 관리하고 즉시 장갑을 낀 손가락으로 동물의 콧 구멍을 커버합니다. 마우스를 흡입 할 때까지 LPS는 목구멍의 뒤쪽에서 볼 수 있습니다.
- 콧 구멍을 커버 5-10 추가 호흡 연장 혀를 계속 누르고 있습니다.
- 삽관 대에서 마우스를 제거하고 마취에서 회복 될 때까지 새 케이지에 동물을 배치합니다.
- 질병의 진행과 관련된 대리 마커를 모니터링합니다. 체중과 체온은 연구 기간 동안 매 4-8 시간 감시되어야한다. 마찬가지로, 행동 특성 및 사망률 증가와 관련된 임상 증상을 평가.
- LPS에 노출 다음과 같은 특정 시간 지점에서 질병의 진행, 수확 마우스를 평가합니다. LPS 노출 다음 수확에 대한 일반적인 시간 포인트는 0, 6, 12, 18, 24, 및 48 시간이 (가) 있습니다. 회복과 생존을 평가하기 위해, 7 다의 쥐를 평가YS 후 접종.
2. 혈청 및 기관지 세척 유체 (BALF) 컬렉션
- 제도적으로 승인 된 방법을 사용하여 마우스를 희생.
- 그 뒷면에 동물을 배치하고 높이 (1.27 cm)에 이상적으로 0.5, 부검 보드에 고정합니다.
- 70 % 에탄올로 전체 마우스를 적셨다.
- 27 G 바늘로 1 ML의 주사기를 사용하여 이전의 어떤 절개를 만들기 위해 심장 천자를 실시하고 있습니다. 그것은 하나의 마우스에서 전체 혈액의 500 ~ 800 μl를 철회 할 수 있어야한다.
- 주사기에서 바늘을 제거하고 prelabeled 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 전체 혈액을 전송합니다. 혈청 수집을 위해 전체 혈액은 실온에서 적어도 30 분 동안 응고 할 수 있습니다. 혈청 컬렉션에 더하여,이 절차는 또한 이전에 면역 세포를 순환 공부, 전혈을 수집하는 관과 주사기로 항응고제를 통합함으로써 수정 될 수있다.
- 수평 절개를합니다마우스의 아래턱에 복강의 길이 및 복강으로부터 수직 절개를 건너.
- 집게를 사용하여 절개의 양면을 잡고 가볍게 멀리 내부 복막 및 흉부 캐비티로부터 피부를 당겨.
- 다이어프램을 절단하지 않도록주의하면서, 성기에서 흉골에 복강의 길이를 따라 큰 절개를합니다. 부드럽게 신장 중 하나에 대한 액세스를 허용하도록 복강 창자 시프트.
- 관류에 대한 배수 지점 역할을하는 신장으로 이어지는 신장 정맥을 잘라.
- 닉 다이어프램은, 가위를 사용하여 심장의 좌측을 노출, 폐 및 심장을 피하도록주의하면서.
- 수동으로 27 G 바늘과 1X PBS 용액 10 ㎖ 주사기를 사용하여 마음을 perfuse. 식염수가 폐에 강제되지 않도록 재관류시 무리한 힘을 가하지 마십시오. 남아있는 혈액이 포털 정맥 절개로부터 배출한다.
- 조심스럽게 심장과 폐를 절단되지 않도록주의하면서, 무딘 / 무딘 가위를 사용 흉골을 따라 갈비뼈를 잘라. 실수로이 절차를 수행하는 동안 폐를 절단하는 것은 상당히 수집 BALF의 양을 줄일 수 있고 제대로 정착과 폐를 팽창 할 수없는 결과를 초래할 것입니다.
- 부드럽게 마음과 멀리 집게를 이용하여 흉곽에서 폐를 분리. 조심스럽게 가능한 한 척추에 가까운 무딘 / 무딘 가위를 이용하여 흉곽의 각 부분을 잘라 완전히 두 섹션을 제거합니다.
- 집게를 사용하여 침샘을 분리하거나 가위를 사용하여 제거, 기관을 노출.
- 조심스럽게 가위를 사용하여기도를 오버레이 근육을 잘라. 이 기관은이 과정에서 절단하지 않는 것이 중요합니다.
- 가위를 사용하여 기관을 덮는 쇄골을 구분합니다.
- 부드럽게 집게를 사용하여 흉선을 단단히 잡고 마음에서 조직을 올립니다. 에주의하면서, 가위를 사용 흉선을 제거심장이나 폐를 절단하지 마십시오.
- 1-2 링 각도 가위 (45 ~ 90 º 각도, 샤프 / 샤프)를 사용하여 후두 아래의 기관에있는 작은 수평 절개를합니다. 절개 단단히 정맥을 확보 할 수있을만큼 충분히 커야합니다.
- 테이퍼 끝이 절개 아래에 2 ~ 3 기관 반지를 나오도록 캐뉼라를 삽입하고 실크 봉합사를 사용하는 곳에서 정맥을 확보. 봉합은 기관과 식도 사이를 통과하고, 정맥에 꽉 뽑아되어 있는지 확인합니다.
- 행크스 버퍼 식염수 (HBSS) 1 ㎖에 1 ML의 주사기를 입력하고 조심스럽게 캐 뉼러에의 루어를 삽입합니다.
- 천천히, 그러나 지속적인 운동을 사용하여 폐를 팽창, 기관에 ~ 900 μl를 주입, 즉시 HBSS를 철회. 15 ML 원뿔 관에 복구 BALF를 놓습니다.
- 미래 분석 BALF 약 3 ㎖를 수집하기 위해 세척을 2 회 추가를 반복합니다. 사용 준비가 될 때까지 얼음에 4 º C에서 BALF를 저장합니다.
- 폐의 팽창 대에 10 ML의 주사기를 삽입합니다. 루어, 코크에 루어, 주사기로 꼭지에 호스를 조립합니다. 마개가 닫힌 위치에 있는지 확인합니다. 10 ML의 주사기는 중력 흐름 저수지 역할을합니다. 저수지는 동물의 위의에 4.75을 서서 저수지의 상단이 동물의 위 10.5을 확장해야합니다 인플레이션에 연결해야합니다.
- 중성 포르말린 용액을 주사기를 채우십시오. 주사기가 완전히 정착 가득되어 있는지 확인합니다.
- 튜브의 개방 단부에서 흡수 수건을 놓고 정착이 튜브를 채울 수 있도록 꼭지를 엽니 다. 정착이 튜브에서 흐르는 시작되면, 즉시 마개를 닫고 정착과 상단에 주사기를 리필. 이것은 주사기 완전히 폐 인플레이션 압력의 적절한 양을 제공하기 위해 충전하는 것이 중요하다.
- 봉합에 하나의 느슨한 매듭을 짓고; 그러나, 매듭 꽉 잡아 당기지 마십시오.
- 정맥에 서 마우스 인플레이션 튜브를 삽입합니다.
- 마개를 열고 폐 중력 인플레이션을 작성 할 수 있습니다.
- 폐는 자신의 최대 인플레이션 수준에 도달하면, 봉합 꽉 끌어와 두 번째 매듭을 짓고.
- 마개를 닫고 정맥에서 튜브를 제거합니다.
- Gently 포셉 한 쌍 봉합사을 잡고 손가락 캐뉼라 잡고 기관에서 캐뉼라 제거합니다. 단단히 흉강 다시 마우스의 코쪽으로 정맥을 향해 아래로 봉합을 당깁니다.
- 부드럽게 집게로 기관 또는 봉합을 단단히 잡고 목 공동의기도를 올립니다.
- 무딘 가위를 사용하여 연결 봉합에 기관의 꼬리를 절단.
- 일단 trache이 기본 조직에서 무료로, 마우스에서 멀리 기관을 끌어 시작합니다. 부드럽게 흉강 중 폐를 들어 올립니다.
- 조심스럽게 흉강에 폐를 유지하는 결합 조직을 잘라. 멀리 마우스의 몸에서기도를 당겨 계속 기본 연결을 절단하면서 꾸준히 상향 력을 적용합니다. 폐를 절단하지 않도록주의하십시오. 심장이 왼쪽으로이 방법을 사용하여 폐에 연결해야합니다.
- 폐를 제거하고 나면, 포르말린 10 ㎖에 배치합니다.
- 유전자형에 대한 마우스의 꼬리 부분을 제거합니다.
- 해당 기관의 지침에 따라 마우스의 시체를 폐기하십시오.
4. 사이토 카인의 평가
- 혈청을 분리하기 위해 5 분 동안 12,000 XG에서 2.5 단계에서 수집 된 전혈을 원심 분리기. -80 ° C에서 prelabeled 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브 및 저장소에 혈청을 전송
- 오는 평가ELISA 또는 다른 유사한 분석에 의해 m 사이토 카인 수준. 혈청 1:5 희석 - 다음, 분석에 따라 적절한 희석 버퍼에 1:20 지침을 제조하고 있습니다. 이러한 희석은 실험적으로 이전 샘플의 부피를 실행으로 결정되어야한다.
- 때문에 수집 된 혈청의 낮은 볼륨으로, 반으로 ELISA 플레이트에 장착 된 샘플 볼륨을 줄일 수 있습니다. 예를 들어, 대부분의 상업적 ELISAs는 표준 및 샘플을 100 μL 부피를 이용한다. 표본 표준 부하 50 μl를 희석 혈청을 절약마다 잘합니다.
- 원심 분리기 5 분 200 XG에 냉장 테이블 탑 원심 분리기에서 BALF. 두 가지로 세포 상등액을 전송 -80 ° C에서 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브 및 저장소를 prelabeled
- 희석하지 않고 ELISA 또는 다른 유사한 분석에 의해 BALF 사이토 카인을 평가합니다.
- C. ° -80에서 보관되지 않은 혈청 및 BALF
5. 차동 염색 및 BAL 세포질 평가
- BALF 원심 HBSS하고 완전한 제거에 따라, 저장성 염수를 사용하여 펠렛 화 적혈구를 용해. 증류수 900 μL에 세포를 재현 탁. 즉시 배 PBS 100 μl를 추가합니다.
- 개별적으로 각각의 샘플을 용해. 샘플은 적혈구의 과도한 양을 포함하는 경우, 세포를 5 분 및 적혈구 세포 용해 프로토콜이 반복 될 수있다 400 XG에서 테이블 탑 원심 분리기에서 펠렛 화 될 수있다.
- 트리 판 블루 염색과 10X 20 X 배율에서 hemacytometer를 사용하여 1 ㎖ 서스펜션 총 BALF의 세포질을 결정합니다. 평가 및 세포 / ml로 이러한 데이터를 제공.
- cytospin 및 차등 염색 재료를 준비합니다. 연필이나 용매 저항하는 펜을 사용하여 표준 현미경 슬라이드 레이블을 지정합니다. cytospin 브래킷 및 깔때기에 슬라이드를 고정합니다. cytospin의 회 전자에 슬라이드 어셈블리를 고정합니다.
- 5 분 100 XG에 BALF의 Cytospin 150 μL. 세포 밀도 효과적으로 너무 크면, 세포 형태를 평가 슬라이드에 스핀 다운 볼륨을 줄일 수 있습니다. 슬라이드 밤새 건조 공기를 허용합니다.
- 차등 제조 프로토콜 다음 슬라이드를 얼룩. 슬라이드 밤새 건조 공기를 허용합니다. 글라스를 덮고 퍼 마운트로 봉입을 사용하여 슬라이드를 커버 슬립하고 20X 및 40X 대물 탑재 현미경을 사용하여 슬라이드를 평가한다.
- 그러한 FACS, 전자 현미경, 공 초점 현미경, 유전자 발현의 평가를 위해 RNA 추출 및 / 또는 웨스턴 블롯에 대한 단백질 추출 등의 후속 분석을 위해 남아있는 세포를 수확.
6. 조직 병리학의 평가
- 조직 병리학 평가를위한 폐를 준비합니다. 포르말린 고정의 24-48 시간 후, 배쪽으로 전체 비정상적으로 폐의 방향과 파라핀. 메인 전도기도를 노출하는 결과 블록을 잘라.
- 채점의 정확도를 개선하기 위해, 동일한 위치에있는 폐 위치 및 t의 최대 길이 시각화를 수득 각 블록 트림그는 주요 축기도를 폐내. 이 시점에서, 5 미크론 시리얼 섹션과 헤 마톡 실린과 에오신 (H & E)와 얼룩을 잘라. 추가 부분은 잘라 표준 프로토콜을 사용하여 현장 하이브리드 화에 대한 제조 할 수있다.
- 0 (결석) 및 3 (중증) 사이에 득점하는 다음과 같은 염증 매개 변수에 기초하여 반 정량적 평가 시스템 사용 조직 병리를 평가 : 단핵구와 다형 핵 세포 침윤; 상피 세포의 증식과 부상을기도; 넘쳐; 혈관 주위와 peribroncheolar 바지를 접; 염증과 관련된 폐의 비율. 폐 조직 병리는 경험 병리학 자에 의해 평가되어야한다.
- 총 조직 병리학 점수를 생성하거나 질병의 진행의 특정 측면을 정량화 개별 점수를 사용하는 매개 변수의 점수 모두 평균. 유전자형과 치료에 모두 눈을 멀게 검토와 함께, 이중 맹검 방식으로 모든 채점을 실시한다. 이 채점 시스템은 previousl왔다Y는 6,7,10을 설명했다.
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Representative Results
그람 음성 박테리아의 세포벽은 환경에 매우 풍부 LPS로 구성된다. 민감한 인간의 인구에 LPS를 흡입하면기도 반응성을 악화하고 강력한 면역 response11을 트리거 할 수 있습니다. LPS는 또한 강력한 선천성 면역 반응을 유도하도록 마우스 모델에서 사용되는 일반적인 PAMP이다. 프로토콜이 여기에 설명에서는, 마우스는 E.에서 격리 LPS의 그것의 복용량을받은 대장균 : 인두 IT 관리를 사용하여 (혈청 형 0111 B4). LPS 노출 모델에서 체온과 체중 모두 동물의 사망률과 질병의 진행의 전형적인 대리 마커입니다. LPS의 문제는 점차적으로 24 시간 (그림 1A)의 과정을 통해 다시 기준선에 증가하는 최초의 6 시간 내에 체온 크게 감소의 원인이됩니다. 이 피크 서서히 N에 복구 곳에 그러나 체중은 꾸준히, 24 시간의 과정 (그림 1B) 이상 감소 할 것이다48 ~ 72 시간 내선. 따라서, 체온은 염증의 개시의 초기 단계를 평가하기 위해 더 적절한 마커이고; 반면, 체중은 발병 기전 및 복구 이후 단계에서 더 신뢰할 수있다.
기도 LPS 노출은 폐에 백혈구의 상당한 유입을 초래한다. 처음 6 시간 내에, 호스트 선천적 면역 반응과 관련된 세포 BALF (도 1C)에서 관찰 될 수있다. BALF의 세포질 이후 면역 반응 봉우리와 염증 해상도의 기간을 입력, 다음 24-48 시간 (그림 1C)에 증가하고 있습니다. 24 시간으로 호중구의 상당수는 폐에 존재하고 차동 염색법 (도 1D 및 1E) 다음 BALF에서 관찰 될 수있다. BALF의 세포질 평가는 폐의 숙주 면역 반응과 관련된 세포의 특징을 정량화하고 강력한 기술을 제공한다. INCRBALF의 세포질 완화는기도, 혈관과 폐 실질 (그림 1 층 및 1G)의에 호중구의 상당한 유입과 일치한다. 폐 조직 병리학 효과적으로 반 정량적 평가 시스템 (도 1F)을 사용하여 평가 될 수있다. 폐 정확하게 정착과 폐 내 주요 축기도의 최대 길이 시각화를 공개 처리 부분과 동일한 크기로 팽창 할 때 정확하게 다른 동물의 폐에 특정 랜드 마크에서 조직 병리학을 득점 할 수있다. 여기에 설명 된 중력 기반 인플레이션 프로토콜은, 현재 점수 시스템을 용이하게하도록 설계된다. LPS는 중요한 혈관 주위의 증가, peribroncheolar 및 실질 염증 (그림 1G)를 유도한다.
LPS의 투여와 관련된 여러 가지 사이토 카인을 포함하여 로컬 및 전신 염증성 매개 물질의 높은 수준을 유도타고난 면역 반응. 로컬 사이토 카인 수준은 ELISA와 같은 통상적 인 기술을 사용 BALF에서 평가 될 수있다. LPS의 투여 후 폐에서 상향 조절되어 일반 사이토 카인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 (그림 2A) 등이 있습니다. 전신 사이토킨 수준 BALF 평가 (도 2b)에 대해 기재된 것과 동일한 기술을 이용하여 혈청에서 평가 될 수있다. 어떤 매개체가 로컬 미세 환경에 존재하지만, 혈청없는 경우는 드물지 않다. 예를 들어, TNF-α는 일상적 LPS를 다음 폐에서 높은 수준으로 발견되지만, 통상적으로이 프로토콜에 설명 된 조건 하에서 체계적 발견되지 않는다 (도 2a 및도 2b, 검출 수준 아래).
그림 1. 구인두 기관 내 LPS 투여는 생쥐의 사망률과기도 염증을 증가합니다. 남성 마우스 E. 1 ㎎ / ㎏을받은 . 대장균 LPS (혈청 형 0111 : B4) 그것과 질병 발병 기전은 AB) LPS를 투여 6 시간 내에 체온에있는 뜻 깊은 감소를 유도하는 24 시간의 과정을 통해 평가 하였다; 체중 손실 이후 시점에서 더욱 명백하게 반면. C) LPS는 BALF에서 분리 된 세포에서 차이 염색 계시. DE) 호중구, LPS의 투여 후 24 시간 폐에 존재하는 지배 세포 유형, 총 BALF의 세포질에있는 뜻 깊은 증가를 유도한다. 이러한 데이터는 전형적 BALF에서 본 각 세포 유형의 백분율로 설명된다. F) 폐 조직 병리학은 두 개의 독립적 인 평가에 기초하여 반 정량적 평가 시스템을 사용하여 평가할 수있다혈관 주위 및 peribroncheolar 바지를 접, 가벼운 실질 염증과 약간의 폐포 폐쇄 상당한 양의은 일반적으로 폐의 LPS에 노출 된 후 24 시간을 관찰 폐 내 주요 축기도. G)를 둘러싼 염증의. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. 로컬 및 전신 사이토 카인의 증가 수준에 LPS 결과에 노출을기도. A) LPS 노출에 따라, 염증성 사이토 카인의 넓은 스펙트럼의 지역 수준의 TNF-α, IL-1β 및 IL-6를 포함, 처음 24 시간 이내에 BALF에서 관찰 할 수있다. 이러한 사이토 카인 사용하여 평가할 수있다다음과 같이 ELISA는 24 시간 LPS 노출 다음. B) 여러 사이토 카인은 혈청에서 체계적으로 검출 할 수있다. 그러나, 혈청 BALF에서 높은 수준에있는 것이 아니라, TNF-α 등 일부 주목할만한 예외가 있습니다. 혈청에 대한 관심의 사이토 카인은 경험적으로 이전의 대규모 평가에 평가되어야한다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3. 감소 된 조직 병리학 변동과 향상된 시각화 중력 변위 결과를 사용하여 폐 인플레이션.이 프로토콜에 설명 된 고정 중력 변위 방법은 최적의 조직 병리학 평가 비교 예 수 있습니다 중력 인플레이션에 의해 고정 불지 폐 또는 수동 인플레이션 ED. AB) 폐는 일반적으로의 불균일 한 영역에서 결과를 정확한 득점을 허용 균일 기능, 폐포 손상, 향상된 시각화 및 폐의 염증. CD) 수동 인플레이션의 높은 해상도의 평가를 감소 보여 인플레이션. C)이 균일 영역은 종종 부분적으로 수동 인플레가 광범위하게 손상 폐포 결과 과도한 팽창하는 폐의 지역에서 발생 초보자 검토. D)에 의해 병적 인 기능으로 일반적으로 착각 붕괴 지역의 결과로 팽창하고 있습니다 공간. E) 불지 폐는 축소 된 폐포 공간과 광범위한 훈련없이 해결하고 평가하기 어려운 영역을 보여줍니다. 그들이 현장에 나타나는 마찬가지로, 때문에이 기술을 붕괴되는 기관에 폐의 시각화를 허용하지 않습니다.e.com/files/ftp_upload/51391/51391fig3highres.jpg "대상 ="_blank "> 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
다음과 같이 성공적으로 마우스의 폐에서 호스트 면역 반응을 평가하기위한 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 1) 평가중인 모델에 대한 적절한 마우스 긴장과 섹스를 선택; 2) 폐에 PAMP 전달을 최적화; 3) 제대로 수집하고 BALF를 처리; 4) 제대로 해결 및 조직 병리학 적 평가를위한 폐의 준비.
마우스 균주의 선택은 숙주의 면역 반응을 평가하는 중요한 요소이다. C57BL / 6 마우스는 일반적으로 인해 대부분의 PAMPS에 자신의 TH1 기울이기 강력한 대응에 선천성 면역 연구를위한 최적의 마우스 배경으로 간주됩니다. 마찬가지로, BALB / c 마우스는 일반적으로 인해 TH2의 기울이기로 알레르기 질환 모델 연구에 사용됩니다. 폐암 모델에서 세 번째 일반적으로 사용되는 균주는 유전자 변형 동물을 생성하는 공통의 사용으로 인해 129SvEv 배경에 마우스입니다. 모든 경우에,주의는 실험 설계와 가능하면, 연령과 성별에 엄마시주의해야한다tched 리터 메이트 대조군은 야생형 동물과 유 전적으로 변형 된 쥐를 비교 연구에 사용되어야한다. 일반적으로 LPS 프로토콜 기재 6-12 주령 성 정합 C57BL / 6 마우스가 사용되어야하고, 20g의 최소 계량한다. 그것은 LPS 노출에 민감한 마우스 종자 또는 유전자형의 병적 상태와 사망률의 높은 수준의 결과 않을 수 있습니다. 이 경우에는, LPS 투여를 감소 큰 동물을 사용하고, 실험에 사용 된 동물의 성별 전환 등이 프로토콜의 여러 측면을 조정할 필요가있다. 소규모 실험 동물의 감도를 결정하기 위해 초기에 수행되어야하고, 각 실험을위한 조건은 가장 민감한 유전자형 또는 실험 조건에 기초한다.
구인두 IT 관리는 폐 2 에이전트 전달의 다른 형태의보다 더 정확한 것으로 밝혀졌다. 이는 AI에 직접 액세스 큰 부분에rway 비강 및 부비동 증착과 관련된 문제를 우회. 그러나, 모든 동물의 절차와 마찬가지로 행정 능력을 달성하기 위해 다양한 손재주와 연습이 필요합니다. 부적절한 기술은 동물을 입을 비효율적 인 폐 증착 및 경우에 발생할 수 있습니다. 일반적으로, 에반스 블루 염료 (EBD)가 효율적으로이 절차 또는 증착 4와 관련된 잠재적 인 문제를 해결하는 훈련 도구 중 하나로 이용 될 수있다. EBD는 투여이어서 포름 아미드를 사용하여 조직으로부터 추출 할 수있다. EBD의 양은 표준 곡선과 비교 흡수 수치를 사용하여 계산 될 수있다. 우리 손에, 전형적인 EBD 복구는 90 %에서 98 % 사이의 범위. 미 회수 염료의 대부분은 식도로 누설과 관련 될 것으로 예상된다. 그것의 정확도, IT 관리 기술은 약제로 폐에 투여 민감한 에이전트의 다양한 범위를 제공하는 이상적입니다또는 감염성 생물체.
BALF 및 BALF 세포질 분석 숙주 면역 반응의 전체적인 진행에 대한 통찰력의 상당량을 제공 할 수있다. 자극을 다음 폐 염증 매개 국부적 방출은 효과적으로 ELISA 및 웨스턴 블롯과 같은 일반적인 면역학 기술을 사용 BALF 정량화 될 수있다. 마찬가지로, BALF의 셀룰러 조성물 차등 세포 얼룩 또는 유동 세포 계측법을 사용하여 평가할 수있다. 적절한 기술과 손재주를 개발하는 것은 기관지 폐포 세척액 (BAL)을 수행의 가장 중요한 부분입니다. BAL 동안 발생하는 가장 일반적인 문제 중 하나는 완전히 원래 폐에 배치 유체의 최대 볼륨을 철회 할 수있는 오류입니다. 바늘 캐 뉼러는 실제 대신에 사용될 때 일반적으로 부적절하게 고정 뉼러와 연관되거나. 전문 기관 캐 뉼러는 상업적으로 사용할 수 있습니다. 또한 중요하다 모션 및 포스삽입하고 식염수 절차를 통해 원활하고 일관성이 철수하는 데 사용됩니다. 여기에 설명 된 프로토콜 BALF 수집 셀의 차동 염색을 위해 최적화되었다. 차동 염색은 수정 된 라이트 지엠 사 (Giemsa) 염색과 형태를 기반으로 세포의 식별을 수행 할 수있는 매우 효과적인 기술이다. 이 염색 기법을 자신의 고유 한 과립 염색 속성에 따라 호중구와 호산구의 분화 할 수 있습니다. 단핵구 유래 세포는 쉽게 식별 할 수 있으며 일반적으로 BALF에서 관찰된다. 이러한 대 식세포와 수지상 세포 (가) 있습니다. 마찬가지로, T-세포와 B-세포는 또한 일반적으로 관찰된다. 대부분의 연구자가 정확하게 혼자 형태에 따라 차별화하는 그러나 이러한 단핵구 세포와 림프구는 종종 어렵다. 유동 세포 계측법의 활용은 이러한 평가에 더 높은 해상도를 추가 할 수 있습니다. 단, 대조 동물로부터 회수 저 세포 수를 종종 제한적인 인자이다. 따라서, 만약 흐름 cytom풀어서,이 실험 설계 세포 회복을 늘리기 위해 추가 네거티브 대조군을 포함한다, 사용되어야한다.
폐 조직 병리 평가는이 프로토콜의 또 다른 중요한 구성 요소이며, 질병의 진행을 직접 시각화 (그림 3a 및 3b)에 대한 수 있습니다. 폐는 제대로 준비하는 경우, 조직 병리학은 정확하게 정량 평가 및 특징으로 할 수있다. 조직 병리학의 폐를 준비에서 가장 중요한 단계가 제대로 정착로 팽창한다. 인플레이션의 수동 방법은 일반적으로 과도하게 팽창되어 폐에 발생, 아래 팽창 된 차선의 시각화 및 형태의 평가 (각각도 3C 및 3D)에서 발생하는, 또는 부분적으로 팽창. 마찬가지로, 이전에 고정으로 팽창하지 않는 폐 정확하게 평가하기가 매우 어렵습니다 자주 (그림 3 매우 다양 조직 병리학 점수 결과 E). 여기에서 논의 인플레이션의 중력 방법은 최소한의 변화와 인플레이션의 재현성이 높은 방법을 제공한다. 이 기술을 사용하면, 실험 동물 간의 일관성이 폐에 특정 마크를 평가할 수있다. 또한, 인플레이션 스탠드를 사용하여 중력 인플레이션은 20mm (12)의 정착 압력으로 폐를 팽창시키기 위하여 보였다. 이 기술은 대부분의 생리학 관련 크기와 형상으로 폐의 시각화를 허용하고 민감한 병리 생리 학적 프로세스 (12)의 평가를위한 매우 효과적인 것으로 밝혀졌다. 그것은 인플레이션 스탠드가 적절한 압력을 생성하는 마우스의 적절한 높이로 설정하는 것이 중요합니다. 차선의 팽창이 관찰되는 경우, 팽창 스탠드 높이가 경험적으로 결정되어야한다. 적절한 높이를 보장합니다 시중에서 작은 설치류 폐 인플레이션 스탠드의 사용은 권장합니다.
t ">이 절차는 생쥐의 폐에 LPS 및 기타 PAMPS의 전달을 위해 최적화되었습니다.이 기술을 마스터하고 나면, 추가 연구가 효과적으로 살아있는 병원체를 사용하여 호스트 병원체 상호 작용을 평가하기 위해 수정 된 프로토콜을 사용하여 시작할 수 있습니다. 마찬가지로, 여기에 설명 된 기술들은 매우 다양한이며 실험적 또는 약제의 임상 적 및 생리 학적 관련성을 평가하는데 관심있는 연구에 적용될 수있다. 때문에 투약의 정확성,이 기술은 또한 높은 요구 생체 내 연구에 최적 에이전트 배달 정밀도 수준.이 절차는 생쥐의 폐에 LPS 및 기타 PAMPS의 전달을 위해 최적화되었습니다. 이러한 기술들은 마스터되면, 추가적인 연구가 효과적으로 살아있는 병원체를 이용한 호스트 병원체 상호 작용을 평가하기 위해 수정 된 프로토콜을 사용하여 개시 될 수있다. 마찬가지로, 여기에 설명 된 기술은 매우 다양한이며, B 수전자는 실험 또는 약제의 임상 적 및 생리 학적 관련성을 평가에 관심이있는 연구에 적용. 때문에 투약의 정확성,이 기술은 또한 에이전트 전달에 높은 수준의 정밀도를 요구하는 생체 내 연구에 이상적입니다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는이 프로젝트의 핵심 및 기술 지원을 제공하는 동물 용 의약품의 VA-MD 지역 대학 감사합니다. 이 작품은 NIH 경력 개발 상 (K01DK092355)에 의해 지원된다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57Bl/6J | The Jackson Laboratory | Stock 000664 | |
| Compact Scale | Ohaus Scale Corporation | 71142845 | |
| Small Animal Rectal Thermometer | Braintree Scientific | TH 5 | |
| Rectal Probe for Rodents | Braintree Scientific | RET 3 | |
| Ear Punch | Braintree Scientific | EP-S 901 | |
| Lipopolysaccharide from E. coli 0111:B4 | InvivoGen | LPS-EB | |
| 1x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-023 | |
| Isoflurane | Baxter | 40032609 | |
| Intratrachael Administration and Lung Inflation Stand | ICAP Manufacturing | n/a | |
| Rodent Intubation Stand | Braintree Scientific | RIS 100 | |
| Scissors (blunt/sharp) | Fisher Scientific | 13-806-2 | |
| forceps (straight) | Fisher Scientific | 22-327-379 | |
| forceps (45º, curved) | Fisher Scientific | 10-275 | |
| Scissors (blunt/blunt) | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Pipette (200 µl Capacity) | Gilson | F123601 | |
| Ethanol | Sigma | 459844 | |
| 1 ml Syringe | BD Medical | 301025 | |
| 10 ml Syringe | BD Medical | 301604 | |
| 27 G x 0.5 in Needle | BD Medical | 305109 | |
| Refrigerated Microcentrifuge | Fisher Scientific | 13-100-676 | |
| 1.2 mm Tracheal Cannulae with Luer-adapter | Harvard Apparatus | 732836 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-076 | |
| 4-0 Silk Braided Surgical Suture | Ethicon | A183 | |
| Luer to Tube Connector Kits | Harvard Apparatus | 721406 | |
| Luer Stopcock Kit | Harvard Apparatus | 721664 | |
| Tygon formula E-3603 Laboratory Tubing | Sigma | R-3603 | |
| Formalin Solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128-4L | |
| Mouse IL-1β OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 559603 | |
| Mouse IL-6 OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 550950 | |
| Mouse TNF-α OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 560478 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3520 | |
| Hemocytometer Cover Glasses | Thermo Scientific | 22-021-801 | |
| Trypan Blue | Thermo Scientific | SV3008401 | |
| Cytology Funnel Clips | Fisher Scientific | 10-357 | |
| Cytology Funnels | Fisher Scientific | 10-354 | |
| Filter Cards | Fisher Scientific | 22-030-410 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| Cover Glasses | Fisher Scientific | 12-540A | |
| Cytospin Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | |
| Diff Quick Staining Kit | Fisher Scientific | 47733150 | |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 |
References
- Matute-Bello, G., et al. An official American Thoracic Society workshop report: features and measurements of experimental acute lung injury in animals. Am. J. respir. Cell Mol. Biol. 44, 725-738 (2011).
- Egger, C., et al. Administration of bleomycin via the oropharyngeal aspiration route leads to sustained lung fibrosis in mice and rats as quantified by UTE-MRI and histology. PloS one. 8, (2013).
- Rayamajhi, M., et al. Nonsurgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. J. Vis. Exp. , (2011).
- Revelli, D. A., Boylan, J. A., Gherardini, F. C. A non-invasive intratracheal inoculation method for the study of pulmonary melioidosis. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2, 164 (2012).
- Allen, I. C., et al. Analysis of NLRP3 in the development of allergic airway disease in mice. J. Immunol. 188, 2884-2893 (2012).
- Allen, I. C., et al. Characterization of NLRP12 during the in vivo host immune response to Klebsiella pneumoniae and Mycobacterium tuberculosis. PloS one. , (2013).
- Allen, I. C., et al. Expression and function of NPSR1/GPRA in the lung before and after induction of asthma-like disease. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 291, 1005-1017 (2006).
- Kebaier, C., et al. Staphylococcus aureus alpha-hemolysin mediates virulence in a murine model of severe pneumonia through activation of the NLRP3 inflammasome. J. Infect. Dis. 205, 807-817 (2012).
- Roberts, R. A., et al. Analysis of the murine immune response to pulmonary delivery of precisely fabricated nano- and microscale particles. PloS one. 8, (2013).
- Willingham, S. B., et al. NLRP3 (NALP3, Cryopyrin) facilitates in vivo caspase-1 activation, necrosis, and HMGB1 release via inflammasome-dependent and -independent pathways. J. Immunol. 183, 2008-2015 (2009).
- Kline, J. N., et al. Variable airway responsiveness to inhaled lipopolysaccharide. Am. J. Respir. Crit. Med. 160, 297-303 (1999).
- Cressman, V. L., Hicks, E. M., Funkhouser, W. K., Backlund, D. C., Koller, B. H. The relationship of chronic mucin secretion to airway disease in normal and CFTR-deficient mice. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 19, 853-866 (1998).
