Utnyttelsen av orofaryngeal røret PAMP Administrasjon og Bronchoalveolar Lavage å evaluere vertens immunrespons i Mus

Summary

Vertsimmunresponsen mot patogen infeksjon er en strengt regulert prosess. Ved hjelp av en lipopolysakkarid lunge eksponering modell i mus, er det mulig å drive med høy oppløsning evalueringer av de komplekse mekanismer forbundet med sykdoms patogenesen.

Abstract

Vertsimmunresponsen mot patogener er en kompleks biologisk prosess. De fleste in vivo studier klassisk anvendt for å karakterisere verts-patogen interaksjoner utnytte intraperitoneale injeksjoner av utvalgte bakterier eller patogen forbindelse molekyl mønstre (PAMPs) i mus. Mens disse teknikkene har gitt enorme data i forbindelse med smittsomme sykdommer patobiologi, intraperitoneal injeksjon modeller er ikke alltid hensiktsmessig for host-patogen interaksjonsstudier i lungen. Ved hjelp av en akutt lungebetennelse modell i mus, er det mulig å gjennomføre en høyoppløsnings-analyse av verten medfødte immunrespons anvendelse av lipopolysakkarid-(LPS). Her beskriver vi metoder for å administrere LPS hjelp nonsurgical orofaryngeal intratrakeal administrasjon, overvåke kliniske parametere forbundet med sykdom pathogenesis, og utnytte bronchoalveolar lavage væske til å evaluere vertens immunrespons. De teknikkene som beskriveser allment gjeldende for å studere verts medfødte immunforsvar til et mangfoldig utvalg av PAMPs og patogener. På samme måte, med mindre modifikasjoner, er disse teknikker kan også bli anvendt i studier evaluere allergisk luftveisinflammasjon og i farmakologiske anvendelser.

Introduction

Lungeinfeksjoner i forbindelse med sykdomsfremkallende bakterier arter er en vanlig årsak til global sykelighet og dødelighet. Avgjøre hvilke mekanismer som driver vertens immunrespons mot disse patogener vil fremme utviklingen av nye forebyggende strategier og terapeutiske midler som vil dempe virkningen av disse infeksjonene. Det overordnede målet i protokollen er beskrevet her, er å gi brukeren en fleksibel metode for å evaluere verts medfødte immunrespons mot patogen infeksjon ved hjelp av et patogen assosiert molekylær mønster (PAMP) som et surrogat for levende bakterier. Flertallet av tidligere studier som evaluerte verten medfødte immunrespons mot bakterier har fokusert på peritoneal modeller på grunn av den relativt enkelt gjennomføring. Selv om disse modellene er meget nyttige og har resultert i betydelige fremskritt innen host-patogen interaksjoner og systemisk inflammasjon, data generert fra disse modellene er ikke alltid hensiktsmessig for studier involving luftveiene. Her blir en lungemodell for akutt lungebetennelse foreslått som en praktisk og klinisk relevant ekspansjon av de klassiske intraperitoneal (ip) injeksjon modeller. Den foreslåtte teknikk gjør det mulig for den lokale vurdering av den medfødte immunrespons hos et organ bestemt modellsystem.

Metodene som beskrives her, er utformet for å tilveiebringe en enkel og robust teknikk for å tillate brukere å evaluere vertens immunrespons overfor LPS, som er en vanlig PAMP. Metodene er basert på intratrakeal (it) instillasjon av LPS, som induserer en sterk medfødte immunrespons i lungene til mus og etterligner mange av de patofysiologiske funksjoner observert i humane pasienter som lider av respiratoriske infeksjoner og akutt lungeskade ^1.. Den viktigste fordelen med denne teknikken er at den tillater brukeren å evaluere vertens immunrespons uten konfunderende faktorer og sikkerhetsmessige bekymringer knyttet til å gjennomføre in vivo studierved hjelp av levende bakterier. Likeledes har det i munnhule og svelg administrering svei beskrevet i denne protokollen betydelige fordeler i forhold til andre vanlig anvendte teknikker, inkludert intranasal (i) administrering og kirurgisk det administrering. For eksempel lar orofaryngeal det administrasjonen relativt nøyaktig en doserings og lungedeponering i forhold til i administrasjonen, som vanligvis lider av økt variabilitet av lungedeponering på grunn av tap av agenter i nesehulen og bihuler ^2-4. Den det tilførselsvei omgår disse hulrom og gir direkte tilgang til luftrøret og luftveier. Likeledes er det kirurgiske det opplegget betydelig mer morbid administrasjon metode og krever omfattende opplæring for å mestre. Protokollene er beskrevet her også inneholde en beskrivelse de vanligste teknikkene og surrogatmarkører som brukes til å evaluere betennelse progresjon og avslutte med en protokoll som beskriver de riktige teknikkene for å forberede luNGS for histopatologi vurderinger. Disse protokollene er fokusert på å minimere antall mus som kreves for hver studie ved å maksimere data generert fra hvert enkelt dyr.

Protokollene er beskrevet er svært fleksibel og kan lett modifisert for å evaluere et variert spekter PAMPs og skader forbundet molekylære mønstre (demper). Videre med noen ytterligere endringer, disse protokollene kan også brukes til studier som evaluerte allergisk luftveissykdomsprogresjon eller host-patogen interaksjoner med levende bakterier, virus eller sopp ^5-10.

Protocol

Alle studiene ble gjennomført under godkjenning av det institusjonelle Care og bruk Committee (IACUC) for Virginia Tech og i samsvar med National Institutes of Health Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr.

En. Intratrakeal (det) Inoculation av LPS Bruke Orofaryngeale Administrasjon

1. Sørg for at hvert dyr er entydig identifisert ved hjelp av enten en øre punch, øremerke, eller andre institusjonelt godkjent metode.
2. Ta opp den opprinnelige kroppsvekt og kroppstemperatur for hvert dyr.
3. Forbered arbeids lager av LPS. Hver mus får 50 pl dose på 1 mg / kg LPS i 1 x fosfatbufret saltvann (PBS). Mock behandlede dyr vil motta en 50 mL dose 1x PBS.
4. Tilbered en passende kammer for administrering av isofluran ved hjelp av følgende dråpe-metode. Institusjonelle retningslinjer variere med hensyn til bruk av isofluran og andre anestetika og før sette iganging noen studier, bør personer kontakte sin institusjonens Department of Animal Care / Welfare å forsikre alle retningslinjene er tilstrekkelig oppfylt. Hvis slipp-metoden isoflurane er ikke et alternativ, andre anestetika er akseptable alternativer.
   1. I en passende sikkerhetskabinett, påfør ca 3 ml av isofluran til en foldet absorberende papirhåndkle og legges i bunnen av en 500 ml begerglass.
   2. Plasser et lite stykke folie på toppen av papirhåndkle og dekker begerglasset med et gjennomsiktig lokk.
5. Forbered verktøy og reagenser som vil bli benyttet i løpet av den inokulasjon. Plasser gummi band som vil sikre dyrene hodet på intubasjon stativ. Denne fremgangsmåten krever at et par rette tang, et par vinklede eller buede tang, og en P200-pipette med tips.
6. Load 50 mL av LPS i pipettespissen og sted i et lett tilgjengelig sted ved intubasjon stativ.
7. Anesthetize musved å plassere dyret inn i den isofluran kammeret og dekker kammeret med gjennomsiktig lokk. Observer dyrets pustemønstre, noe som vil være en rask og grunt når den først er plassert i kammeret. Dyret blir tilstrekkelig bedøvet når puste priser nærme en pust / 2 sek, som vanligvis nås innen 30 sekunder for å plassere i kammeret. Musen skal bedøves som angitt i den godkjente dyre protokollen med slipp-metoden isofluran.
8. Fjern bedøvet mus fra kammeret og suspen dyret på intubasjon stå ved sine foran fortenner. Forsikre deg om at dyret er sikkert festet og munnen og tungen er tilgjengelige.
9. Forsiktig sikre tungen med de rette tang. Ta tak i tungen med vinklet pinsett og dra det forsiktig ut av munnen til svak motstand. Denne handling er tilstrekkelig til å blokkere epiglottis og få adgang til luftrøret.
10. Mens du fortsatt holder tungen iutstrakte posisjon, administrere 50 mL dose av LPS inn på baksiden av halsen og umiddelbart dekker dyrets nese med en behansket finger. Den LPS vil være synlig på baksiden av halsen inntil musen inhalerer.
11. Fortsett å dekke neseborene og hold tungen utvidet for 5-10 ekstra åndedrag.
12. Fjern musen fra intubasjon stativ og plassere dyret tilbake i en ny kassen til den gjenoppretter fra anestesi.
13. Monitor surrogatmarkører forbundet med sykdomsprogresjon. Kroppsvekt og kroppstemperaturen bør overvåkes hver 4-8 time for varigheten av undersøkelsen. Likeledes, evaluere atferdsmessige egenskaper og kliniske symptomer assosiert med økt sykelighet.
14. For å vurdere sykdomsprogresjon, høste mus på bestemte tidspunkter følgende LPS eksponering. Typiske tidspunkter for innhøsting følgende LPS eksponering inkluderer 0, 6, 12, 18, 24, og 48 hr. Å evaluere utvinning og overlevelse, evaluere mus for 7 days post-vaksinasjon.

2. Serum og Bronchoalveolar Lavage Fluid (Balf) Collection

1. Sacrifice musen med en institusjonelt godkjent metode.
2. Plasser dyret på ryggen og fest den til en obduksjon bord, ideelt 0,5 i (1,27 cm) i høyde.
3. Fukt hele mus med 70% etanol.
4. Ved hjelp av en 1 ml sprøyte med en 27 G nål, gjennomføre en hjerte punktering før å gjøre noen snitt. Det bør være mulig å ta ut 500-800 pl fullblod fra en enkelt mus.
5. Fjern kanylen fra sprøyten og overføre hele blod til en prelabeled 1,5 ml mikrosentrifuge tube. For serumsamling, la helblod til å koagulere for minst i 30 minutter ved romtemperatur. I tillegg til serumsamling, kan denne fremgangsmåten også bli modifisert ved å inkorporere et anti-koagulant i røret og sprøyten, forut for oppsamling av fullblod, for å studere sirkulerende immunceller.
6. Lag en horisontal snitt enkrysse lengden av bukhulen, og et vertikalt snitt fra bukhulen til den nedre kjeve av musen.
7. Bruk pinsett, ta tak i begge sider av snittet og trekk forsiktig huden bort fra de underliggende peritoneal og thorax hulrom.
8. Lag et stort snitt langs lengden av bukhulen fra kjønnsorganene til brystbenet, idet forsiktighet for å unngå å skjære membranen. Forsiktig forskyve tarmen i bukhulen for å tillate tilgang til en av nyrene.
9. Skjær renalis fører til nyren for å tjene som et drenerings-punkt for perfusjon.
10. Nick mellomgulvet ved hjelp av saks, ta vare å unngå lungene og hjertet, for å avsløre den venstre side av hjertet.
11. Manuelt perfuse hjertet ved hjelp av en 10 ml sprøyte med en 27 G nål og 1 x PBS-løsning. Unngå å anvende for stor kraft under perfusjon for å sikre at saltløsning ikke er tvunget inn i lungene. De resterende blodet skal renne fra portalen blodåre innsnitt.
12. Skjær forsiktig brystkasse langs brystbenet med butte / sløv saks, ta vare å unngå å kutte hjertet og lungene. Tilfeldigvis skjære lungene i løpet av denne fremgangsmåten vil i betydelig grad redusere mengden av Balf samlet og vil resultere i en manglende evne til blåse lungene med fiksativ.
13. Forsiktig isolere hjertet og lungene unna fra brystkasse ved hjelp av tang. Skjær forsiktig hver del av brystkasse med butte / sløv saks så nær ryggraden som mulig og fullt ut fjerne begge deler.
14. Separer spyttkjertlene ved hjelp av pinsett eller fjerne dem ved hjelp av saks, for å avsløre luftrøret.
15. Skjær forsiktig musklene som ligger over luftrøret ved hjelp av saks. Det er viktig at luftrøret ikke bli kuttet under denne prosessen.
16. Ved hjelp av saks, skiller kragebeinet liggende luftrøret.
17. Forsiktig tak thymus med tang og løfte vevet bort fra hjertet. Fjern thymus bruke saks, mens du tar vare påunngå å skjære hjertet eller lungene.
18. Lag en liten horisontal snitt i luftrøret 1-2 ringer under strupehodet ved hjelp vinklet saks (45-90 º vinkel, skarp / skarpe). Snittet skal være stor nok til å fast feste kanylen.
19. Sett kanylen slik at den spisse enden strekker seg 2-3 tracheal ringer under snittet, og fest kanylen på plass ved hjelp av en silke sutur. Kontroller at sutur passerer mellom luftrøret og spiserøret og er stram på kanylen.
20. Fyll en 1 ml sprøyte med 1 ml Hanks bufret saltoppløsning (HBSS) og før forsiktig dens luer inn i kanylen.
21. Ved hjelp av en langsom, men konstant bevegelse, injisere ~ 900 mL inn i luftrøret, blåse opp lungene, og umiddelbart trekke HBSS. Plasser den gjen Balf i en 15 ml konisk tube.
22. Gjenta dette kylling to ekstra ganger for å samle inn ca 3 ml Balf for fremtidig analyse. Oppbevar Balf på is eller ved 4 º C til alt er klart til bruk.

1. Sett en 10 ml sprøyte inn i lunge inflasjon stativ. Monter slangen til luer, luer til vannkranen, og stoppekran til sprøyten. Kontroller at vannkranen er i lukket posisjon. Den 10 ml sprøyte vil tjene som en tyngdekraft flyt reservoaret. Beholderen bør være festet til den inflasjon stå 4.75 i over dyret og toppen av reservoaret bør strekke 10.5 i over dyret.
2. Fyll sprøyten med nøytral bufret formalin-løsning. Sørg for at sprøyten er helt fylt med fiksativ.
3. Plasser en absorberende håndkle under den åpne enden av slangen og åpner vannkranen for å tillate fikseringsmiddel for å fylle slangen. Når fiksativ begynner strømmer fra slangen, umiddelbart stenge stoppekranen og fyll sprøyten til toppen med fiksativ. Det er viktig at sprøyten fylles helt for å gi den riktige mengde trykk for lunge inflasjon.
4. Knyt en eneste løs knute i sutur; imidlertid ikke trekke knuten stramt.
5. Sett slangen fra musen inflasjon stå i kanylen.
6. Åpne vannkranen og la lungene for å fylle opp av inflasjonen tyngdekraften.
7. Når lungene nå sin maksimale inflasjonsnivået, trekke sutur stram og knyt en annen knute.
8. Steng vannkranen og ta ut slangen fra kanylen.
9. Fjern forsiktig kanylen fra luftrøret ved å ta tak sutur med en pinsett og holde kanylen med fingrene. Fast trekk sutur ned mot brysthulen og kanylen tilbake mot musens nesen.
10. Forsiktig tak i luftrøret eller sting med pinsett og løfte luftrøret vekk fra halsen hulrom.
11. Sever luftrøret caudal til bundet sutur ved hjelp sløv saks.
12. Når Trachea er fri fra de underliggende vev, begynne å trekke luftrøret bort fra mus. Løft forsiktig lungene ut av brysthulen.
13. Skjær forsiktig bindevevet som holder lungene i brysthulen. Fortsett å trekke luftrøret vekk fra musens kropp og anvende jevn oppadgående kraft samtidig kutte de underliggende sammenhenger. Vær nøye med å unngå å kutte i lungene. Legg merke til at hjertet skal igjen festet til lungene ved hjelp av denne metoden.
14. Når lungene er fjernet, plassere dem i 10 ml av formalin.
15. Fjerne en del av musehale for genotyping.
16. Kvitt deg med muse kadaveret henhold til de aktuelle institusjonelle retningslinjer.

4. Cytokin Evaluering

1. Sentrifuger helblod, oppsamlet i henhold til trinn 2.5, ved 12 000 xg i 5 minutter for å isolere serum. Overfør serum til en prelabeled 1,5 ml mikro rør og oppbevar ved -80 ° C.
2. Vurdere serum cytokin nivåer ved ELISA eller en annen lignende analysen. Fortynn serum 1:05 til 1:20 på en hensiktsmessig fortynningsbuffer, avhengig av analysen, etter produsentens anbefalinger. Disse fortynninger må bestemmes empirisk forut for kjøring av hoveddelen av prøvene.
3. På grunn av det lave volum av serum oppsamlet, redusere prøvevolumet påsatt på en ELISA-plate med halvparten. For eksempel, de fleste kommersielle ELISAs utnytte 100 mL volumer av standarder og prøver. For å spare prøver, last 50 mL av standarder og fortynnet serum per brønn.
4. Sentrifuger Balf i en kjølebordsentrifuge ved 200 xg i 5 min. Overfør cellen gratis supernatanten i to prelabeled 1,5 ml mikrosentrifugerør og oppbevar ved -80 ° C.
5. Evaluere Balf cytokiner ved ELISA eller en annen lignende analysen uten fortynning.
6. Oppbevar ubrukte serum og Balf ved -80 ° C.

5. Differential Flekker og BAL cellularity Evaluering

1. Etter Balf sentrifugering og komp HBSS fjerning, lyserer de pelleterte røde blodlegemer ved hjelp av hypotonisk saltoppløsning. Resuspender cellene i 900 pl destillert vann. Umiddelbart tilsett 100 mL av 10x PBS.
2. Individuelt lysere hver prøve. Hvis prøvene inneholde store mengder av røde blodlegemer, kan cellene pelleteres i bordsentrifuge ved 400 xg i 5 min, og den røde blodcellelyse protokollen kan bli gjentatt.
3. Bestem den totale Balf cellularity i en ml suspensjonen med en hemacytometer henhold 10X eller 20 x forstørrelse med Trypan blå flekker. Evaluere og presentere disse dataene som celler / ml.
4. Forbered materialer for cytospin og differensialfarging. Etikett standard objektglass ved hjelp av en blyant eller løsemiddelbestandig penn. Sikre lysbildene i en cytospin brakett og trakt. Sikre raset forsamlingen i cytospin rotoren.
5. Cytospin 150 ul Balf ved 100 xg i 5 min. Hvis celletettheten er for stor til å effektivtevaluere cellemorfologi, redusere volumet spunnet ned på skinnene. Tillat lysbildene lufttørke over natten.
6. Differensial flekken lysbildene følge produserer protokoller. Tillat lysbildene lufttørke over natten. Dekk lysbildene hjelp Permount og evaluere lysbilder ved hjelp av et mikroskop utstyrt med en 20X og 40X objektiv.
7. Høste de gjenværende celler for påfølgende analyse, slik som FACS, elektronmikroskopi, konfokal mikroskopi, RNA ekstraksjon for genekspresjon evaluering, og / eller proteinutvinning for western blot.

6. Histopatologi Evaluering

1. Forbered lungene for histopatologi evaluering. Etter 24-48 timer av formalin fiksering, ventralt orientere hele oppblåste lunger og innebygd i parafin. Skjær de resulterende blokker for å avsløre den viktigste ledende luftveiene.
2. For å forbedre nøyaktigheten scoring plassere lungene i samme stilling og trimme hver blokk for å gi den maksimale lengde visualisering av than intrapulmonary hoved aksiale luftveier. Fra dette punktet, kuttet 5 mikron seriesnitt og flekken med hematoxylin og eosin (H & E). Ytterligere seksjoner kan kuttes og klargjort for in situ hybridisering ved hjelp av standard protokoller.
3. Evaluere histopatologi ved hjelp av en semi-kvantitativ poengsystem basert på følgende inflammatoriske parametre, som har skjært seg mellom 0 (fraværende) og 3 (alvorlig): mononukleær og polymorfonucleære celle infiltrasjon; luftled epithelial celle hyperplasi og skade; bloduttredelse; perivascular og peribroncheolar cuffing; og prosenten av lungen som er involvert med inflammasjon. Lunge histopatologi skal evalueres av en erfaren patolog.
4. Gjennomsnittlig alle parameter score for å generere en total histopatologi scorer eller bruke individuelle score for å kvantifisere spesifikke aspekter av sykdomsprogresjon. Gjennomføre all scoring i en dobbel blind mote, med anmeldere blindet for både genotype og behandling. Dette poengsystemet har vært previously beskrevet ^6,7,10.

Representative Results

Celleveggene av gram-negative bakterier er sammensatt av LPS, som er svært rik på miljøet. Innånding av LPS i følsomme befolknings forverrer luftveis reaktivitet og er i stand til å utløse en robust immun response11. LPS er også en vanlig PAMP brukes i musemodeller for å fremkalle en robust medfødte immunrespons. I protokollen beskrevet her, fikk musene en det dose av LPS isolert fra E. coli (serotype 0111: B4) ved hjelp av orofaryngeal det administrasjon. I modeller av LPS eksponering, både kroppstemperatur og vekt er typiske surrogatmarkører av animalsk sykelighet og sykdomsutvikling. Den LPS Utfordringen vil føre til en betydelig reduksjon i kroppstemperaturen innen de første 6 timer, som gradvis øker tilbake til basislinjen i løpet av 24 timer (figur 1A). Imidlertid vil kroppsvekten jevnt avta i løpet av 24 timer (figur 1 B), hvor den vil topp og gradvis opp over next 48-72 hr. Dermed er kroppstemperatur en mer passende markør for å evaluere de tidlige stadier av inflammasjon initiering; mens, er kroppsvekt mer pålitelig under senere stadier av patogenesen og utvinning.

Airway LPS eksponering resulterer i en betydelig tilstrømning av leukocytter til lungene. I løpet av de første 6 timer, kan celler som er knyttet til verts medfødte immunrespons observeres i Balf (figur 1C). Den Balf cellularity fortsetter å øke over de neste 24-48 timer (figur 1C), hvor immunresponsen topper og senere går inn i en periode med betennelse oppløsning. Etter 24 timer, en signifikant antallet nøytrofiler er tilstede i lungene, og kan observeres i Balf følgende differensial farging (figurene 1D og 1E). Balf cellularitet vurderingene tilveiebringe en robust og kvantifiserbare teknikk for å karakterisere de celler som er knyttet til vertsimmunrespons hos lungene. Den incrlette i Balf cellularity er forenlig med en betydelig tilstrømning av nøytrofile i luftveiene, blodårer og i lungene parenchyma (Tall 1F og 1G). Lung histopatologi kan effektivt evalueres ved hjelp av en semikvantitativ scoringssystem (fig. 1F). Det er mulig å nøyaktig vurdering av histopatologi på bestemte landemerker i lungene til forskjellige dyr når lungene blir nøyaktig fylt opp til samme størrelse med bindemiddel, og seksjoner som behandles for å vise den maksimale lengde visualisering av intrapulmonær hoved aksial luftveier. Alvoret basert inflasjon protokollen, som er beskrevet her, er designet for å forenkle dette poengsystemet. LPS induserer en betydelig økning i perivascular, peribroncheolar og parenchymal betennelse (figur 1G).

LPS administrasjon induserer høye nivåer av lokale og systemiske pro-inflammatoriske mediatorer, deriblant flere cytokiner forbundet meddet medfødte immunrespons. Lokale cytokin nivåer kan bli vurdert i Balf med konvensjonelle teknikker, for eksempel ELISA. Vanlige cytokiner som er oppregulert i lungene etter LPS administrasjon inkluderer TNF-α, IL-1β, og IL-6 (figur 2A). Systemiske cytokin-nivåer kan bli evaluert i serum ved hjelp av de samme teknikker som er beskrevet for de Balf vurderingene (figur 2B). Det er ikke uvanlig for enkelte mediatorer som kan være tilstede i den lokale mikromiljøet, men ikke tilstede i serumet. For eksempel er TNF-α rutinemessig funnet ved et høyt nivå i lungene etter LPS, men er ikke vanligvis finnes systemisk under betingelsene beskrevet i denne protokoll (figurene 2A og 2B, under nivået for påvisning).

Figur 1. Orofaryngeal røret LPS Administration Øker Sykelighet og Airway betennelse i Mus. Mann mus fikk en mg / kg av E. coli LPS (serotype 0111: B4), og den sykdoms patogenesen ble evaluert i løpet av 24 timer AB) LPS induserer en signifikant reduksjon i kroppstemperatur i løpet av 6 timer fra administrasjonen,. mens kropps vekttap er mer tydelig på senere tidspunkter. C)   LPS induserer en signifikant økning i total Balf cellularitet. DE) Nøytrofiler er den dominerende celletype tilstede i lungene 24 timer etter LPS administrasjon, som åpenbart av differensial farging av celler isolert fra Balf. Disse data blir typisk vist som prosent av hver celletype tilstede i Balf. F) Lung histopatologi kan evalueres ved hjelp av en semikvantitativ scoringssystem basert på to uavhengig evaluerings av betennelse rundt intrapulmonary hoved aksiale luftveier. G) En betydelig mengde perivascular og peribroncheolar cuffing, mild parenchymal betennelse og noen liten alveolar okklusjon er vanligvis observert 24 timer etter lunge LPS eksponering. Klikk her for å se større bilde .

Figur 2. Airway Eksponering for LPS resulterer i økt nivå av lokale og systemiske cytokiner. A)   Etter LPS-eksponeringen, kan lokale nivåer av et bredt spektrum av pro-inflammatoriske cytokiner observeres i Balf innenfor de første 24 timer, inkludert TNF-α, IL-1β, og IL-6. Disse cytokiner kan evalueres ved hjelpELISA, som vist her 24 timer etter LPS-eksponeringen. B) Flere cytokiner kan også påvises systemisk i serumet. Men det er noen bemerkelsesverdige unntak, inkludert TNF-α, som finnes i høye nivåer i Balf men ikke i serum. Cytokiner av interesse i serum bør vurderes empirisk før storskala evaluering. Klikk her for å se større bilde .

Figur 3. Lung Inflasjon Bruke Gravity Displacement Resultater i Redusert Histopathology Variasjon og forbedret visualisering. Alvoret fortrengning metode for fiksering er beskrevet i denne protokollen tillater optimal histopatologi evaluering Compar ed å uninflated lungene eller manuell inflasjon. AB) Lunger løst av inflasjon gravitasjon demonstrere ensartede funksjoner slik at for nøyaktig score, redusert alveolar skade, forbedret visualisering, og høyere oppløsning evalueringer av betennelse. CD) Manuell inflasjon av lungene vanligvis resulterer i uniformt områder av inflasjon. C) Disse uniformt områdene er ofte delvis oppblåst, noe som resulterer i sammenraste områder som ofte feilaktig som patologiske funksjoner av uerfarne lesere. D) Manuell inflasjon resulterer også i områder av lungene som er over-oppblåst, noe som resulterer i omfattende skadet alveolar arealer. E) uninflated lungene demonstrere kollapset alveolære områder og områder som er vanskelige å løse og evaluere uten omfattende opplæring. Likeledes, på grunn av det organ som blir kollapset denne teknikk ikke tillater visualisering av lungene som de vises in situ.e.com/files/ftp_upload/51391/51391fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større bilde.

Discussion

De mest kritiske trinnene for vellykket evaluering av vertens immunrespons hos mus lungene er som følger: 1) velge riktig mus belastning og sex for modellen blir vurdert; 2) optimalisere PAMP levering til lungene; 3) riktig samle inn og behandle Balf; og 4) skal fikse og forberede av lungene for histopatologiske vurderinger.

Valget av musestamme er en viktig faktor i å vurdere vertens immunrespons. C57Bl / 6 mus er vanligvis ansett som den optimale muse bakgrunn for å studere medfødt immunitet på grunn av sin Th1 forvrenger og robust svar på de fleste PAMPs. Likeledes er BALB / c-mus som vanligvis brukes for å studere allergiske sykdomsmodeller på grunn av deres Th2 forvrenger. En tredje brukte belastning i lunge modeller er mus på 129SvEv bakgrunnen, på grunn av deres felles bruk i generere genmodifiserte dyr. I alle tilfeller bør man vise forsiktighet ved eksperimentell design og når det er mulig, alder og kjønn matched liter-mate kontroll dyr skal brukes til studier som sammenligner genmodifiserte mus med vill type dyr. Typisk for LPS-protokollen beskrevet her, bør 6-12 uker gamle kjønns passet C57Bl / 6 mus anvendes, og bør veie et minimum på 20 g. Det er mulig at LPS eksponering vil føre til høye nivåer av sykelighet og dødelighet i følsomme musestammer eller genotyper. Hvis dette skjer, kan det være nødvendig å justere flere aspekter av denne protokollen, inkludert reduksjon av LPS dose, ved bruk av større dyr, og å slå av kjønnet til dyrene som brukes i eksperimentet. Småskala eksperimenter må utføres for å bestemme utgangspunktet dyr følsomhet og betingelsene for hvert forsøk bør være basert på det mest følsomme genotype eller eksperimentell tilstand.

Orofaryngeal den administrering har vist seg å være mer nøyaktig enn andre former for middelavgi til lungene ^2. Dette er i stor grad på grunn av direkte tilgang til airway og omgå problemene forbundet med nasal og lomme hulrom deponering. Men som med alle prosedyrer dyr, det administrasjonen krever omfattende fingerferdighet og praksis for å oppnå ferdigheter. Feil teknikk kan resultere i ineffektiv lungeavsetning, og i noen tilfeller resultere i skade dyret. Vanligvis kan Evans Blå Dye (EBD) være effektivt utnyttet som enten et treningsverktøy for denne prosedyre eller å feilsøke eventuelle problemer knyttet til deponering ^fire. EBV kan tilføres den, og deretter ekstrahert fra vevet ved hjelp av formamid. Mengden av EBV kan beregnes ved bruk av absorpsjons-nivåer sammenlignet mot en standardkurve. I våre hender, typisk EBD utvinning varierer mellom 90-98%. Hoveddelen av unrecovered fargestoff er forventet å være forbundet med lekkasje inn i spiserøret. På grunn av dens nøyaktighet, er det administrasjon teknikk er ideelt for å levere en rekke forskjellige dosefølsomme midler til lungene, for eksempel farmasøytiske midlereller smittsomme organismer.

Analyse av Balf og Balf cellularitet kan gi en betydelig mengde av innsikt i den generelle progresjon av vertens immunrespons. Inflammatoriske mediatorer frigitt lokalt i lungene etter stimulering kan effektivt kvantifiseres på Balf ved hjelp av vanlige immunologiske teknikker, slik som ELISA og Western Blot. På samme måte kan den cellulære sammensetning av Balf evalueres ved hjelp av enten differensialcellefarging eller strømningscytometri. Utvikling av riktig teknikk og fingerferdighet er den mest kritiske delen av utfører bronchoalveolar lavage (BAL). En av de vanligste problemer som oppstår i løpet av BAL er manglende evne til fullt ut å trekke det maksimale volum av fluid som opprinnelig er lagt inn i lungene. Dette er vanligvis forbundet med et feil festet kanyle eller når nålene blir brukt i stedet for selve kanyler. Specialized tracheal kanyler er kommersielt tilgjengelig. Det er også viktig at bevegelsen og kraftenbrukes til å sette inn og ta ut saltløsning er glatt og ensartet under hele prosedyren. Protokollen er beskrevet her har blitt optimalisert for differensial farging av celler samlet i Balf. Differential farging er en modifisert Wright Giemsa beis, og er en meget effektiv teknikk for å gjennomføre morfologi basert celleidentifikasjon. Dette farging teknikken gjør det mulig for differensiering av nøytrofile og eosinofile basert på deres unike granule flekker egenskaper. Som stammer fra monocytter celler er også lett å identifisere og blir ofte observert i Balf. Disse inkluderer makrofager og dendrittiske celler. Likeledes er T-celler og B-celler også ofte observert. Men disse monocyttisk celler og lymfocytter er ofte vanskelig for de fleste forskere til nøyaktig å skille basert på morfologi alene. Utnyttelsen av flowcytometri kan legge mye høyere oppløsning til disse vurderingene. Imidlertid er lavt antall celler gjenvunnet fra kontrolldyr ofte en begrensende faktor. Dermed, hvis flyt cytomgeometri skal benyttes, den eksperimentelle utforming bør omfatte ytterligere negative kontrolldyrene for å øke celle utvinning.

Lunge histopatologi vurderingene er en annen viktig del av denne protokollen og gir mulighet for direkte visualisering av sykdomsprogresjon (Tall 3A og 3B). Når lungene er skikkelig forberedt, kan histopatologi være nøyaktig vurderes, kvantifiseres, og karakterisert. Den mest kritiske trinnet i å forberede lungene for histopatologi er riktig å blåse dem med fiksativ. Manuelle metoder for inflasjon typisk resultere i lungene som er over-oppblåst, under-oppblåst eller delvis oppblåst, noe som resulterer i suboptimal visualisering og morfologi vurderinger (Tall 3C og 3D, henholdsvis). Likeledes, lungene som ikke er oppblåst før fiksering er svært vanskelig å nøyaktig evaluere og ofte resulterer i store variasjoner i histopatologi skårer (Figur 3 E). Alvoret metode for inflasjon diskutert her gir en svært reproduserbar metode for inflasjon med minimal variasjon. Ved hjelp av denne teknikk, er det mulig å vurdere bestemte landemerker i lungene som er forenlig mellom forsøksdyr. Videre har inflasjonen tyngdekraften ved hjelp av en inflasjons stand vist seg å blåse lungene til en fikseringstrykk på 20 mm ^12. Denne teknikken gjør det mulig for visualisering av lungene i sin mest fysiologisk relevante størrelse og form, og har vist seg å være svært effektive for evaluering av følsomme patofysiologiske prosesser ^12. Det er viktig at settes inflasjons standen i riktig høyde fra musen til å generere de riktige trykk. Hvis suboptimal inflasjon observeres, skal høyden av inflasjons standen bestemmes empirisk. Bruken av et kommersielt tilgjengelig gnager liten lunge inflasjon stand, som vil sikre den riktige høyde, er anbefalt.

t "> Denne prosedyren har blitt optimalisert for levering av LPS og andre PAMPs til lungene av mus. Når disse teknikkene er mestret, kan flere studier også bli satt i gang ved hjelp av modifiserte protokoller for å effektivt vurdere vert-patogen interaksjoner ved bruk av live patogener. Likeledes de teknikkene som er beskrevet her, er meget allsidig og kan anvendes på en hvilken som helst undersøkelse interessert i å vurdere den kliniske og fysiologiske relevans av en eksperimentell-eller farmasøytisk middel. På grunn av nøyaktigheten ved dosering, er denne teknikken også ideell for in vivo-studier som krever en høy presisjonsnivået i middelavgi.

Denne fremgangsmåten har blitt optimalisert for levering av LPS og andre PAMPs til lungene av mus. Når disse teknikkene er mestret, kan flere studier også bli satt i gang ved hjelp av modifiserte protokoller for å effektivt vurdere vert-patogen interaksjoner ved hjelp av levende patogener. Likeledes, de teknikkene som beskrives her er svært allsidig og kan be brukes på alle studie interessert i å vurdere den kliniske og fysiologiske betydningen av en eksperimentell eller farmasøytisk agent. På grunn av nøyaktigheten ved dosering, er denne teknikken også ideell for in vivo-studier som krever en høy grad av presisjon i middelavgi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57Bl/6J	The Jackson Laboratory	Stock 000664
Compact Scale	Ohaus Scale Corporation	71142845
Small Animal Rectal Thermometer	Braintree Scientific	TH 5
Rectal Probe for Rodents	Braintree Scientific	RET 3
Ear Punch	Braintree Scientific	EP-S 901
Lipopolysaccharide from E. coli 0111:B4	InvivoGen	LPS-EB
1x Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	10010-023
Isoflurane	Baxter	40032609
Intratrachael Administration and Lung Inflation Stand	ICAP Manufacturing	n/a
Rodent Intubation Stand	Braintree Scientific	RIS 100
Scissors (blunt/sharp)	Fisher Scientific	13-806-2
forceps (straight)	Fisher Scientific	22-327-379
forceps (45º, curved)	Fisher Scientific	10-275
Scissors (blunt/blunt)	Fisher Scientific	08-940
Pipette (200 µl Capacity)	Gilson	F123601
Ethanol	Sigma	459844
1 ml Syringe	BD Medical	301025
10 ml Syringe	BD Medical	301604
27 G x 0.5 in Needle	BD Medical	305109
Refrigerated Microcentrifuge	Fisher Scientific	13-100-676
1.2 mm Tracheal Cannulae with Luer-adapter	Harvard Apparatus	732836
Hank's Balanced Salt Solution	Life Technologies	14025-076
4-0 Silk Braided Surgical Suture	Ethicon	A183
Luer to Tube Connector Kits	Harvard Apparatus	721406
Luer Stopcock Kit	Harvard Apparatus	721664
Tygon formula E-3603 Laboratory Tubing	Sigma	R-3603
Formalin Solution, neutral buffered, 10%	Sigma	HT501128-4L
Mouse IL-1β OptEIA ELISA Kit	BD Biosciences	559603
Mouse IL-6 OptEIA ELISA Kit	BD Biosciences	550950
Mouse TNF-α OptEIA ELISA Kit	BD Biosciences	560478
Hemocytometer	Hausser Scientific	3520
Hemocytometer Cover Glasses	Thermo Scientific	22-021-801
Trypan Blue	Thermo Scientific	SV3008401
Cytology Funnel Clips	Fisher Scientific	10-357
Cytology Funnels	Fisher Scientific	10-354
Filter Cards	Fisher Scientific	22-030-410
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-544-1
Cover Glasses	Fisher Scientific	12-540A
Cytospin Cytocentrifuge	Thermo Scientific	A78300003
Diff Quick Staining Kit	Fisher Scientific	47733150
Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-500