Summary
Patojen enfeksiyonuna karşı konak bağışıklık tepkisi sıkı bir şekilde düzenlenmiş bir süreçtir. Farelerde bir lipopolisakarit akciğer maruz modeli kullanarak, bu hastalığın patojenezi ile ilgili kompleks mekanizmalar yüksek çözünürlüklü değerlendirme yapmak mümkündür.
Abstract
Patojenlere karşı konak bağışıklık tepkisi karmaşık biyolojik süreçtir. In vivo çalışmaların çoğunluğu klasik konak-patojen ilişkileri farelerde seçin bakteri veya patojen ilişkili moleküler desenleri (PAMPs) intraperitoneal yararlanmak karakterize edilmesi için kullanılır. Bu teknikler, bulaşıcı hastalık patobiyolojisi ilişkili verileri vermiştir büyük olsa da, periton içine enjeksiyon modelleri her zaman akciğerde konukçu-patojen etkileşim çalışmalar için uygun değildir. Farelerde akut akciğer enflamasyonu kullanarak, bu doğuştan gelen bağışıklık tepkisi lipopolisakkarid (LPS) kullanılarak ana bir yüksek çözünürlüklü analizi yapmak mümkündür. Burada, biz, cerrahi olmayan orofaringeal İntratrakeal yönetimini kullanarak LPS yönetmek hastalığı patogenezi ile ilişkili klinik parametrelerini izlemek ve konak immün yanıtı değerlendirmek için, BAL sıvısında kullanmak için yöntemler açıklanmaktadır. Açıklanan tekniklerPAMPs ve patojenlerin çok çeşitli konakçı doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin incelenmesi için yaygın olarak uygulanabilir. Aynı şekilde, minör modifikasyonlarla, bu teknikler, aynı zamanda, alerjik nefes yolu iltihap değerlendiren çalışmalar ve farmakolojik uygulamalarda uygulanabilir.
Introduction
Patojenik bakteri türleri ile ilişkili pulmoner enfeksiyonlar küresel morbidite ve mortalite ortak bir nedenidir. Bu patojenlere karşı bağışıklık tepkisini tahrik mekanizmaları belirlenmesi bu enfeksiyonların etkisini hafifletecektir yeni önleme stratejilerinin ve terapötik ajanların geliştirilmesini teşvik edecektir. Burada açıklanan protokol genel amacı, canlı bakteriler için bir vekil olarak bir patojen ilişkili moleküler deseni (PAMP) kullanarak patojen enfeksiyona konak doğuştan gelen bağışıklık yanıtı değerlendirmek için esnek bir yöntem ile kullanıcıya sunmaktır. Bakteri konakçı doğuştan gelen bağışıklık tepkisini değerlendirmek önceki çalışmaların büyük çoğunluğu nedeniyle yürütme göreli kolaylığı için peritoneal modeller üzerinde odaklanmıştır. Bu modeller son derece yararlıdır ve evsahibi-patojen etkileşimlerinin ve sistemik inflamasyon alanında önemli gelişmelere yol olsa da, bu modeller üretilen veriler her zaman çalışmaları için uygun değildir involvisolunum sistemi ng. Burada, akut akciğer iltihabı bir akciğer modeli klasik intraperitoneal (ip) enjeksiyonu model bir pratik ve klinik olarak anlamlı bir genişleme olarak önerilmiştir. Önerilen teknik, bir organ spesifik model sistemde doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin değerlendirilmesi için yerel sağlar.
Burada açıklanan yöntemler kullanıcıların ortak PAMP olan LPS, konakçı bağışıklık tepkisini değerlendirmek için izin vermek için basit ve sağlam bir teknik sağlamak için tasarlanmıştır. Yöntem farelerde nefes borusu ve solunum yolu enfeksiyonları ve akut akciğer hasarı 1 geçiren insan hastalarda görülen patofizyolojik özellikleri birçok taklit akciğerlerinde sağlam bir doğuştan gelen bağışıklık tepkisi oluşturan LPS, (it) damlatma dayanmaktadır. Bu tekniğin bir avantajı, birinci kullanım in vivo çalışmalar yapılması ile ilişkili karıştırıcı faktörler ve güvenlik kaygıları olmayan bağışıklık tepkisini değerlendirmek için izin vermesidirCanlı bakteri kullanılmıştır. Aynı şekilde, bu protokolde tarif maruziyetin orofaringeal bu uygulama yolu, parenteral (in) burun ve cerrahi de dahil olmak üzere bu uygulama için diğer yaygın olarak kullanılan tekniklere göre önemli avantajları vardır. Örneğin, orofaringeal bu uygulama tipik olarak, burun boşluğunda ajanlar kaybına akciğer birikim artan değişiklere maruz kalır ve 2-4 sinüsler yönetim bölgesi ile karşılaştırıldığında nispeten doğru olan dozajlanmasını ve akciğer birikmesini sağlar. Bu uygulama yolu bu boşlukları circumvents ve trakea ve solunum doğrudan erişim sağlar. Aynı şekilde, cerrahi bu yaklaşımın bir ölçüde daha marazi uygulama yöntemidir ve master için kapsamlı bir eğitim gerektirir. Burada açıklanan protokolleri de ortak teknikleri ve inflamasyon ilerlemesini değerlendirmek ve lu hazırlanması için uygun teknikleri açıklayan bir protokol ile bitirmek için kullanılan vekil işaretçileri bir açıklama içerirhistopatolojik değerlendirmeler için NGS. Bu protokoller, her bir hayvandan elde edilen verileri maksimize her çalışma için gerekli olan farelerin sayısını en aza indirerek odaklandık.
Anlatılan protokoller oldukça esnek ve hali hazırda, bir dizi çeşitli PAMPs hasar ve ilişkili moleküler modelleri (DAMPS) değerlendirmek için modifiye edilebilir. Bundan başka, bir kaç ilave değişiklik ile, bu protokol, aynı zamanda, alerjik nefes yolu, hastalığın ilerlemesini ya da canlı bakteri, virüs veya mantar 5-10 ile konukçu-patojen etkileşimlerine değerlendiren çalışmalar uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm çalışmalar Virginia Tech için Kurumsal Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) onayı altında ve Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Sağlık Rehberi, National Institutes göre yapılmıştır.
1.. Orofarengeal Yönetimi'ni kullanarak LPS intratrakeal (it) Aşılama
- Her hayvan benzersiz bir kulak yumruk, kulak etiketi veya diğer kurumsal olarak onaylanmış bir yöntem kullanılarak tespit emin olun.
- Bazal vücut ağırlığı ve her bir hayvan için vücut ısısını kaydedin.
- LPS çalışma stok hazırlamak. Her fare, 1X fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 1 mg / kg LPS, 50 ul bir doz alacaktır. Mock 1 x PBS ile tedavi edilmiş hayvanlar için 50 ul bir doz alacaktır.
- Aşağıdaki damla yöntemiyle izofluran uygulama için uygun bir bölmeyi hazırlayın. Kurumsal kurallar initiat için izofluran ve diğer anestezik ajanların ve önceki kullanımına ilişkin değişiklikherhangi bir çalışma ing, kişilerin tüm esasların karşılandığı sigorta Hayvan Bakım / Refah onların kurumun Bölümü başvurmalısınız. Bırak yöntemi izofluran bir seçenek değilse, diğer anestezik ajanların kabul alternatiflerdir.
- Uygun bir güvenlik kabini içinde, 500 ml'lik bir cam kaba altındaki bir katlanmış emici kağıt havlu ve yere izofluran, yaklaşık 3 ml uygulanır.
- Kağıt havlu üzerine alüminyum folyo küçük bir parça koyun ve şeffaf bir kapak ile kabı kapsamaktadır.
- Bu aşılama sırasında yararlanılacak araçları ve reaktifler hazırlayın. Hayvanlar entübasyon standında baş güvenli olacak lastik bant yerleştirin. Bu işlem düz forseps bir çift, açılı veya kavisli bir forseps bir çift, ve ipuçları ile bir P200 pipet gerektirir.
- Entübasyon standın yanında kolayca erişilebilir bir yerde pipet ve yerine yük LPS 50 ul.
- Fare anestezisiizofluran odasına hayvan yerleştirilmesi ve şeffaf bir kapak ile odasını kaplayarak. Birinci odacık içinde yerleştirildiğinde, hızlı ve sığ olacak, hayvanın solunum şekilleri dikkate alınmalıdır. Nefes oranları genellikle odasında yerleştirerek 30 saniye içinde ulaşılır 1 nefes / 2 sn, yaklaştığınızda hayvan yeterince anestezi olacak. Drop yöntem izofluran ile onaylanan hayvan protokolü belirtildiği gibi fare anestezi olmalıdır.
- Odasından anestezi fareyi çıkarın ve ön kesici dişler tarafından ayakta entübasyon üzerinde hayvan askıya. Hayvan güvenli ölçülü ve ağız ve dil erişilebilir olduğunu sigortalayın.
- Yavaşça düz forseps ile dil sabitleyin. Açılı forseps ile dilini kavramak ve hafif bir direnç hissedene kadar yavaşça ağzından çekin. Bu eylem, epiglottis blok ve trakea erişmek için yeterlidir.
- De dilini tutmayı sürdürürkenuzatılmış pozisyon, boğazın arkasına LPS'nin 50 ul dozunu ve hemen bir eldivenli parmak ile hayvanın burun delikleri kapsamaktadır. Fare nefes kadar LPS boğazın arka görünür olacaktır.
- Burun delikleri kapak ve 5-10 ek nefesler için genişletilmiş dilini tutmaya devam edin.
- Entübasyon standından fareyi çıkarın ve anestezi kurtarır kadar geri yeni bir kafese hayvan.
- Hastalığın ilerlemesi ile ilişkili vekil belirteçler izleyin. Vücut ağırlığı ve vücut ısısı çalışma süresince her 4-8 saatte izlenmelidir. Aynı şekilde, davranışsal özellikleri ve artmış morbidite ile ilişkili klinik belirtileri değerlendirmek.
- LPS maruz kaldıktan sonra belirli bir zaman-noktalarında hastalığın ilerlemesi, hasat fareler değerlendirmek. LPS maruz kalma sonraki hasat için tipik zaman noktaları 0, 6, 12, 18, 24, ve 48 saat arasındadır. Kurtarma ve hayatta kalma değerlendirmek, 7 dekar için fareler değerlendirmekYS sonrası aşılama.
2. Serum ve Bronkoalveoler Lavaj Sıvısı (BAL) Koleksiyon
- Kurumsal olarak onaylanmış bir yöntem kullanarak fare Kurban.
- Sırtında hayvan koyun ve yüksekliği (1.27 cm), ideal 0.5, otopsi kuruluna sabitleyin.
- % 70 etanol ile tüm fare ıslatın.
- Bir 27 G iğne ile bir 1 ml şırınga kullanarak, önceden herhangi bir kesik yapmak için bir kardiyak ponksiyon yaparlar. Bu, tek bir fare, bütün haldeki kan 500-800 ul çekmek mümkün olmalıdır.
- Şırıngadan iğne çıkarın ve prelabeled 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne bütün kan aktarın. Serum toplanması için, bütün kan, oda sıcaklığında en az 30 dakika süreyle pıhtılaşmaya izin verir. Serum koleksiyonuna ek olarak, bu prosedür, aynı zamanda önce bağışıklık hücrelerini dolaşımdaki çalışma, tam kan toplama tüpü ve enjektör, bir anti-pıhtılaştırıcı madde dahil edilerek modifiye edilebilir.
- Yatay bir kesi a olunfare alt çenesine periton boşluğu uzunluğu ve periton boşluğundan dikey çapraz kesi.
- Forseps kullanarak, kesi her iki tarafını kavrayın ve yavaşça yatan periton ve göğüs boşluklarında gelen cilt çekin.
- Diyaframı kesim önlemek için dikkat çekici, genital sternum periton boşluğu uzunluğu boyunca büyük bir kesi yapmak. Yavaşça böbrekler birine erişim sağlamak için periton boşluğuna bağırsak geçiş.
- Perfüzyon için bir drenaj noktası olarak hizmet etmek böbrek giden renal ven kesti.
- Nick diyafram, makas kullanarak kalbin sol tarafını ortaya çıkarmak için, akciğerler ve kalbi önlemek için dikkat çekici.
- El ile bir 27 G iğne ve 1 x PBS çözeltisi ile bir 10 ml şırınga kullanarak kalp serpmek. Tuzlu akciğerlere zorunlu olmadığından emin olmak için perfüzyon sırasında aşırı kuvvet uygulayarak kaçının. Kalan kan portal ven kesi drenaj gerekir.
- Dikkatle kalp ve akciğerleri kesme önlemek için dikkat çekici, künt / künt makas kullanılarak sternum boyunca göğüs kafesi kesilmiş. Yanlışlıkla bu işlem sırasında akciğerleri kesme anlamlı toplanan BAL'da miktarını azaltacak ve düzgün sabitleyici ile akciğerlerini şişirmek için bir yetersizlik neden olur.
- Yavaşça kalp ve uzak forseps kullanarak göğüs kafesi akciğerleri izole. Dikkatle mümkün olduğunca omurga kadar yakın künt / künt makas kullanarak göğüs kafesi her bölümü kesilmiş ve tam iki bölümü çıkarın.
- Forseps kullanarak tükürük bezleri ayırmak veya makas kullanarak bunları kaldırmak, trakea ortaya çıkarmak için.
- Dikkatle makas kullanarak trakea kaplamak kasları kesti. Bu, soluk borusu, bu işlem sırasında kesilmeyebilir esastır.
- Makas kullanarak, trakea örten köprücük ayırmak.
- Yavaşça forseps kullanarak timus kavramak ve kalp uzak doku kaldırın. Dikkat çekerken, makas kullanarak timus çıkarınkalp ya da akciğerleri kesilmesini önlemek.
- 1-2 halkaları açılı makas (45-90 º açı, keskin / keskin) kullanarak gırtlak altında trakea küçük bir yatay kesi olun. Kesi sıkıca kanül güvenli yeterince büyük olmalıdır.
- Konik uç kesi altında 2-3 trakea halkaları uzanır, böylece kanül yerleştirin ve bir ipek dikiş kullanarak yerine kanül sağlamak. Sütür trakea ve özofagus arasında geçer ve kanül üzerinde sıkı çekti emin olun.
- Hanks tamponlu tuz çözeltisi (HBSS) içinde 1 ml bir 1 ml şırınga doldurun ve yavaşça kanül içine dişin yerleştirin.
- Yavaş, ama sürekli hareket kullanarak, akciğerler şişirme, trakea içine ~ 900 ul enjekte ve hemen HBSS çekilme. Bir 15 ml konik bir tüp içinde geri kazanılan BAL yerleştirin.
- Gelecek analizi için BAL'da yaklaşık 3 ml toplamak için bu lavaj 2 kez daha tekrarlayın. Kullanıma hazır olana kadar buz üzerinde ya da 4 ° C 'de BAL saklayın.
- Akciğer enflasyon stand içine 10 ml şırınga takın. Ucu, vana için dişe ve şırıngaya vana için boru birleştirin. Musluk kapalı konumda olduğundan emin olun. 10 ml'lik bir enjektör yerçekimi akış rezervuar olarak görev yapacak. Rezervuar hayvan yukarıda 4,75 durmak ve rezervuarın üst hayvan yukarıda 10,5 uzatmak gerekir enflasyona bağlı olmalıdır.
- Nötr tamponlu formalin çözeltisi şırınga ile doldurun. Şırınga tamamen sabitleyici ile dolu olduğundan emin olun.
- Hortumun açık ucu altında bir emici havlu yerleştirin ve sabitleyici boru doldurmak için izin vermek için musluğunu açın. Sabitleştirici borudan akan başladığında, hemen musluğunu kapatın ve sabitleyici ile üst şırınga doldurun. Bu enjektör tamamen akciğer enflasyonu için basınç temin etmek üzere uygun miktarda doldurulması önemlidir.
- Sütür tek gevşek bir düğüm; Ancak, düğüm sıkı çekmeyin.
- Kanül içine standı fare enflasyondan tüp yerleştirin.
- Musluğunu açın ve akciğerler yerçekimi enflasyon doldurmak için izin.
- Akciğerler maksimum enflasyon seviyesine ulaştıklarında, dikiş sıkı çekin ve ikinci bir düğüm.
- Su musluğunu kapatın ve kanül tüp çıkarın.
- Yavaşça, forseps bir çift dikiş tutup parmakları ile kanül tutarak trakea kanül çıkarın. Sıkıca göğüs boşluğuna ve geri fare burun doğru kanül aşağı doğru dikiş çekin.
- Forseps ile yavaşça trakea veya sütür kavramak ve uzak boyun boşluğundan trakea kaldırın.
- Künt makas kullanılarak bağlı sütür trakea caudal Sever.
- Bir kez trakeostomiBir alttaki dokulara arınmış, uzak fare trakea çekmeye başlar. Yavaşça göğüs boşluğundan dışarı akciğerler kaldırın.
- Dikkatle göğüs boşluğunda akciğerleri tutan bağ dokusu kesti. Uzakta fare vücuttan trakea çekerek devam edin ve altta yatan bağlantılarını keserken sürekli yukarı doğru kuvvet uygulanır. Akciğerleri kesim önlemek için özen gösterin. Kalp sol bu yöntem kullanılarak akciğerlere bağlı gerektiğini not edin.
- Akciğerler çıkarıldıktan sonra, tamponlu formalin 10 ml yerleştirin.
- Genotiplendirebilmek fare kuyruğu bir bölümü çıkarın.
- Uygun kurumsal yönergeleri izleyerek fare karkas imha edin.
4. Sitokin Değerlendirme
- Serum izole edilmesi için 5 dakika için 12,000 xg'de aşama 2.5 altında toplanan tam kan, santrifüj. -80 ° C'de, bir 1.5 ml mikrosantrifüj prelabeled tüp ve saklamak için serum transferi
- Seru değerlendirinELISA ya da başka bir benzer deney ile m sitokin seviyeleri. Serum 1:5 seyreltin - ardından, denemeye bağlı olarak, uygun bir seyreltme tamponu içinde 1:20 talimatları üretmektedir. Bu seyreltmeler önce deneysel örneklerin toplu çalışan belirlenmelidir.
- Dolayı toplanan serum içinde düşük bir hacme kadar, yarı yarıya ELISA plaka üzerine yüklenen numune hacmi azaltır. Örneğin, bir çok ticari ELISA standart ve 100 ul numune hacimleri kullanmaktadır. Örnekleri, standartların yük 50 ul ve seyreltilmiş serum korumak başına iyi belirleyin.
- Santrifüj 5 dakika boyunca 200 x g 'de bir buzdolabında masa üstü santrifüjde BALF. Ikiye hücresiz süpernatant aktarın -80 ° C'de 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri ve mağaza prelabeled
- Inceltmeden ELISA veya benzer başka bir deney ile BALS sitokinler değerlendirin.
- -80 ° C'de saklayın kullanılmayan serum ve BAL
5. Diferansiyel Boyama ve BAL Hücresellik Değerlendirme
- BALF santrifüj ve tam HBSS çıkarıldıktan sonra, hipotonik tuzlu su ile tane haline kırmızı kan hücrelerinin lize edildi. Damıtılmış su içinde 900 ul içinde tekrar süspansiyon hücreleri. Hemen 10x PBS 100 ul ekleyin.
- Tek tek her örnek lyse. Örnekleri, kırmızı kan hücrelerinin aşırı miktarda ise, hücreler 5 dakika ve kırmızı kan hücresi parçalama kuralı tekrarlanabilir boyunca 400 xg'de masa üstü bir santrifüj içerisinde topak haline edilebilir.
- Trypan Blue lekelemesi ile 10X ya da 20 X büyütme altında bir hemasitometre kullanılarak 1 ml süspansiyon içinde toplam BALF selülarite belirler. Değerlendirmek ve hücre / ml olarak bu verileri sunmak.
- Sitospin ve diferansiyel boyama malzemeleri hazırlayın. Bir kalem veya solvent dirençli kalem kullanarak standart bir mikroskop slaytlar etiketleyin. Bir sitospin dirsek ve huni içine slaytlar sabitleyin. Sitospin rotor slayt düzeneğini sabitleyen.
- 5 dakika boyunca 100 xg'de Sıvıda Cytospin 150 ul. Hücre yoğunluğu etkin bir şekilde çok büyük olursa, hücre morfolojisini değerlendirmek slaytlar üzerine aşağı bükülmüş hacmini azaltmak. Slaytlar kuru gecede havalandırmak için izin verin.
- Diferansiyel üretmektedir protokoller aşağıdaki slaytlar leke. Slaytlar kuru gecede havalandırmak için izin verin. Permount ile slaytlar lamel ve 20X ve 40X objektif ile donatılmış bir mikroskop kullanılarak slaytlar değerlendirir.
- Örneğin FACS, elektron mikroskobu, konfokal mikroskopi, gen ekspresyonu değerlendirmek için RNA ekstre etme, ve / veya western blot için protein ekstre etme gibi bir sonraki analiz için geri kalan hücreler, hasat.
6. Histopatoloji Değerlendirme
- Histopatolojik değerlendirilmesi için akciğer hazırlayın. Formalin tespit 24-48 saat sonra, ventral bütün şişirilmiş akciğer yönlendirmek ve parafin içine gömülmüştür. Ana iletken hava yolunu ortaya çıkarmak için elde edilen blok kesin.
- Skor doğruluğunu artırmak için, aynı konumda akciğerlere pozisyon ve t en fazla uzunlamasına görselleştirme elde etmek için, her blok Döşemeo ana eksen havayolunu İntrapulmoner. Bu noktadan itibaren, 5 mikrondan seri bölümleri ve hematoksilen ve eozin (H & E) ile leke kesti. Ek kesitler kesildi ve standart protokoller kullanılarak in situ melezleme için hazırlanabilir.
- 0 (yok) ve 3 (şiddetli) arasında puanlanır aşağıdaki inflamatuar parametrelere dayalı yarı-kantitatif skorlama sistemi kullanılarak histopatolojisini değerlendirin: mononükleer ve polimorfonükleer hücre infiltrasyonu; epitel hücre hiperplazisi ve yaralanma havayolu; salgısı; perivasküler ve peribroncheolar Kesilen; ve enflamasyon ile ilgili akciğer oranında. Akciğer histopatolojik deneyimli bir patolog tarafından değerlendirilmesi gerekir.
- Toplam puan histopatoloji oluşturmak ya da hastalığın ilerlemesinin belirli yönlerini ölçmek için tek tek puanları kullanılacak parametre puan her ortalama. Genotip ve tedavi hem kör yorumcular, bir çift kör tüm puanlama Davranış. Bu puanlama sistemi previousl olmuştury 6,7,10 tarif.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gram-negatif bakterilerin hücre duvarları ortamında çok bol LPS, oluşmaktadır. Hassas insan popülasyonlarında LPS solunumu solunum yolu reaktivitesi arttırır ve güçlü bir bağışıklık response11 tetikleme yeteneğine sahiptir. LPS aynı zamanda sağlam bir doğuştan gelen bağışıklık tepkisi ortaya çıkarmak için, fare modellerinde kullanılan bir PAMP olduğunu. Burada açıklanan protokol olarak, fareler, E izole LPS'nin bir o dozunu almıştır coli: orofarengeal bu yönetim kullanarak (serotip 0111 B4). LPS maruz modellerinde, vücut ısısı ve ağırlık hem de hayvan hastalık ve hastalığın ilerlemesine tipik temsili göstergeler vardır. LPS meydan kademeli olarak 24 saat (Şekil 1A) boyunca tekrar taban çizgisine dönünceye kadar artacak, ilk 6 saat içinde vücut sıcaklığında önemli bir düşüşe neden olur. Bu zirve ve yavaş yavaş n üzerinde iyileşir nerede Ancak, vücut ağırlığı giderek, 24 saat boyunca (Şekil 1B) azalacaktır48-72 saat ext. Böylece, vücut ısısı inflamasyon inisiyasyon erken aşamalarında değerlendirmek için daha uygun bir göstergesidir; oysa, vücut ağırlığı patogenezi ve iyileşmenin sonraki aşamalarında daha güvenilirdir.
Havayolu LPS maruz akciğerlere lökosit önemli bir akışı ile sonuçlanır. Ilk 6 saat içinde, konak doğal immün yanıt ile ilişkili hücreler, BAL sıvısında (Şekil 1C) gözlenebilir. BALF hücreli sonradan bağışıklık tepkisi tepe ve iltihap çözünürlükte bir süre girer, 24-48 saat (Şekil 1C), üzerinde artmaya devam etmektedir. 24 saatin sonunda, nötrofil önemli sayıda akciğerlerde bulunurlar ve diferansiyel lekeleme (Şekil 1D ve 1E) sonra BAL sıvısında gözlenebilir. BALF hücreli değerlendirmeler akciğerlerde konakçı bağışıklık tepkisi ile ilişkili hücreleri tanımlamak için sağlam ve ölçülebilir bir teknik sunmaktır. IncrBALS hücreselliğinde kolaylığı solunum yolları, kan damarları ve akciğer parankimi (Şekil 1F ve 1G) da içine nötrofil önemli bir akını ile tutarlıdır. Akciğer histopatolojik etkili bir yarı-kantitatif skorlama sistemi (Şekil 1F) kullanılarak değerlendirilebilir. Akciğerler doğru sabitleştirici ve akciğer içi, ana eksen solunum en fazla uzunlamasına görselleştirme ortaya çıkarmak için işlemden bölümleri ile aynı boyuta şişirilir zaman doğru farklı hayvanların akciğerlerinde belirli noktalara da histopatolojisini puan mümkündür. Burada anlatılan yerçekimi bazlı enflasyon protokol, bu puanlama sistemi kolaylaştırmak için tasarlanmıştır. LPS önemli bir perivasküler artış, peribroncheolar ve parenkimal iltihabı (Şekil 1G) neden olur.
LPS uygulamasından ile ilişkili çeşitli sitokinler dahil olmak üzere lokal veya sistemik pro-inflamatuar aracıların yüksek düzeyde indüklerDoğuştan gelen bağışıklık tepkisi. Yerel sitokin seviyeleri, ELISA gibi geleneksel teknikler kullanılarak BAL sıvısında değerlendirilebilir. LPS verilmesinden sonra, akciğerlerde up-regüle olan ortak sitokinler TNF-α, IL-1β, ve IL-6 (Şekil 2A) bulunmaktadır. Sistemik sitokin düzeyleri BALF değerlendirmeler (Şekil 2B) için anlatılan ile aynı teknikler kullanılarak, serum içinde değerlendirilebilir. Bazı aracılar, yerel mikro içerisinde mevcut olan ancak serumdaki yok olması için nadir değildir. Örneğin, TNF-α rutin LPS sonra akciğerlerdeki yüksek seviyelerde bulunan, ancak tipik olarak bu protokolde tarif edilen koşullar altında, sistemik bulunmazsa (Şekil 2A ve 2B, saptama seviyesinin altına).
Şekil 1. Orofarengeal intratrakeal LPS İdaresi Fare Morbidite ve Havayolu enflamasyonu artırır. Erkek fareler E. 1 mg / kg aldı . coli LPS (serotip 0111: B4) ve bu hastalık patogenez AB) LPS uygulamasından 6 saat içinde vücut sıcaklığında önemli bir azalmaya neden olur, 24 saat boyunca değerlendirilmiştir; vücut ağırlığı kaybı daha sonraki zaman noktalarında daha belirgin ise. ° C) LPS BAL sıvısında izole edilmiş hücrelerden diferansiyel lekelemesi ile ortaya koyduğu gibi. DE) Nötrofiller, LPS uygulamasından 24 saat sonra, akciğerlerde bulunan hakim hücre tipi olan toplam olarak BALF hücreselliğinde önemli bir artışı uyarmaktadır. Bu veriler, tipik olarak BAL sıvısında mevcut olan her hücre tipinin yüzdesi olarak gösterilmiştir. F) akciğer histopatoloji iki bağımsız değerlendirilmesine dayalı bir yarı-kantitatif puanlama sistemi kullanılarak değerlendirilebilirperivasküler ve peribroncheolar cuffing, hafif parankimal inflamasyon ve bazı hafif alveol tıkanıklığı önemli bir miktarı, tipik akciğer LPS maruz kaldıktan sonra 24 saat gözlenmektedir intrapulmaner ana eksenel havayolunu. G) çevreleyen inflamasyon s. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Şekil 2. Lokal ve Sistemik Sitokinler Artmış Düzeyleri LPS Sonuçları Pozlama Havayolu. A) LPS maruz bırakılmasının ardından, pro-inflamatuar sitokinlerin, geniş bir spektrumunun lokal seviyeleri TNF-α, IL-1β, ve IL-6 da dahil olmak üzere, ilk 24 saat içinde BAL sıvısında gözlenebilir. Bu sitokinler kullanılarak değerlendirilebilirBurada gösterildiği gibi, ELISA, 24 saat maruz kaldıktan sonra LPS. B) Çeşitli sitokinler aynı zamanda sistemik olarak serumda tespit edilebilir. Ancak serum içindeki BAL sıvısında yüksek seviyelerde bulunan, ancak olmayan TNF-α de dahil olmak üzere bazı önemli istisnalar vardır. Serum ilgi sitokinler ampirik öncesinde büyük ölçekli değerlendirmeye değerlendirilmelidir. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Şekil 3,. İndirimli Histopatoloji Değişkenlik ve Geliştirilmiş Görselleştirme Yerçekimi Hacmi Sonuçları kullanarak akciğer Enflasyon. Bu protokol açıklanan tespitin yerçekimi değiştirme yöntemi en uygun histopatoloji değerlendirme karş sağlar yerçekimi enflasyonun sabit uninflated akciğerlerde veya manuel enflasyona ed. AB) Akciğerler tipik kuralsız alanlarda sonuçlanır doğru puanlama sağlayan üniforma özellikleri, alveol hasarı, gelişmiş görselleştirme ve akciğer iltihabı. CD) Manuel enflasyonun yüksek çözünürlüklü değerlendirmelerini azaltılmış göstermek enflasyon. C) Bu kuralsız alanlar genellikle kısmen Manuel enflasyon da yoğun hasar alveoler sonuçlanan aşırı şişirilmiş olan akciğer alanlarında, sonuçları acemi yorumlara. D) ile patolojik özellikler yaygın olarak hatalıyız çökmüş alanlarda sonuçlanan, şişiyor uzaylar. E) uninflated akciğerler çökmüş alveol boşlukları ve kapsamlı eğitim olmadan çözmek ve değerlendirmek için zor olan alanlara göstermektedir. Bu yerinde görünür Aynı şekilde, bu nedeniyle teknik çökmüş olan organa akciğerlerin görselleştirme izin vermez.e.com/files/ftp_upload/51391/51391fig3highres.jpg "target =" _blank "> büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aşağıdaki gibi başarılı bir şekilde, farenin akciğerlerinde bulunan konakçı bağışıklık tepkisini değerlendirmek için en kritik adım: 1) değerlendirilen modeli için uygun fare suşu ve cinsiyet seçin; 2) akciğerlere PAMP teslim optimize edilmesi; 3) doğru toplamak ve Balf işlemek; ve 4) düzgün düzeltmek ve histopatolojik değerlendirmeler için akciğerlerin hazırlamak.
Fare soyunun seçimi konakçı bağışıklık tepkisini değerlendirmek için önemli bir faktördür. C57BL / 6 fareleri, tipik olarak en PAMPs kendi Th1 eğriltme ve sağlam bir yanıta doğuştan bağışıklık çalışmaları için uygun fare arka plan olarak kabul edilir. Aynı şekilde, BALB / c fareleri, tipik olarak da Th2 baskının eğri alerjik hastalık modelleri incelemek için kullanılır. Akciğer modellerinde üçüncü yaygın olarak kullanılan suş genetiği değiştirilmiş hayvanlar üreten bunların yaygın kullanımı nedeniyle 129SvEv arka plan üzerinde fareler vardır. Tüm durumlarda, dikkatli deneysel tasarım ve mümkün, yaş ve cinsiyet ma sırasında alınmalıdırtched litre-mate kontrol hayvanları yabani tip hayvanlara genetik olarak modifiye edilmiş fareler karşılaştırma çalışmaları için kullanılmalıdır. Tipik haliyle, LPS protokolü için burada tarif edilen, 6-12 haftalık cinsiyeti eşleştirilmiş C57BL / 6 fareleri kullanılmalıdır ve 20 g ağırlığında en az olmalıdır. Bu LPS maruz duyarlı fare suşları veya genotipleri morbidite ve mortalite yüksek düzeyde neden olur mümkündür. Bu ortaya çıkarsa, bu, LPS dozu azaltarak büyük hayvanları kullanarak ve deneyde kullanılan hayvanların cinsiyet değiştirme dahil olmak üzere bu protokolün birçok yönlerini ayarlamak için gerekli olabilir. Küçük ölçekli deneyler hayvan duyarlılığını belirlemek için ilk olarak yapılmalıdır ve her bir deney için koşullar, en duyarlı genotip veya deneysel durumuna göre olmalıdır.
Orofarengeal bu uygulama akciğerlere 2 madde teslimat diğer formları daha doğru olduğu bulunmuştur. Bu, ai için doğrudan erişim için büyük ölçüde birrway ve nazal ve sinüs boşluğuna birikimi ile ilgili sorunları engellemeyi. Ancak, tüm hayvan prosedürleri gibi, yönetim yeterlilik ulaşmak için kapsamlı el becerisi ve pratik gerektirir. Uygun olmayan bir teknik hayvan yaralanmaya neden verimsiz akciğer birikim ve bazı durumlarda neden olabilir. Tipik olarak, Evans Blue Dye (EBD) etkili bu prosedür için veya birikimi 4 ile ilgili olası sorunları gidermek için bir eğitim aracı ya olarak kullanılabilir. EBV o tatbik ve bunu takiben formamid kullanılarak dokusundan elde edilebilir. EBV miktarı standart bir eğri ile karşılaştırılır absorpsiyon seviyeleri kullanılarak hesaplanabilir. Bizim ellerde, tipik EBD kurtarma 90-98% arasında değişmektedir. Unrecovered boyanın toplu yemek borusu içine sızıntı ile bağlantılı olması beklenmektedir. Nedeniyle doğruluğu için, bu uygulama teknik, farmasötik maddeler olarak akciğer, doz duyarlı maddelerin çok çeşitli sunmak için idealdirveya bulaşıcı organizmalar.
BALF ve BALF selülarite analizi konak bağışıklık tepkisinin genel fikir ilerlemesinin önemli bir miktarda sağlayabilir. Uyarımı ardından akciğerlerde serbest lokal inflamatuar aracılar etkili bir ELISA ve Western Blot gibi ortak immünoloji teknikleri kullanılarak BAL sıvısında belirlenebilir. Aynı şekilde, BAL sıvısında hücresel kompozisyonu ayırıcı hücre boyama ya da akış sitometrisi kullanılarak değerlendirilebilir. Uygun teknik ve el becerisi gelişmekte bronkoalveoler lavaj (BAL) gerçekleştirme en önemli parçasıdır. BAL sırasında meydana gelen en yaygın konulardan biri tamamen orijinal akciğerlerde yerleştirilen sıvı maksimum ses çekilme için başarısızlıktır. Iğneler gerçek kanüller yerine kullanılır, bu yaygın bir şekilde bağlanmamış kanül ile ilişkili olduğu ya da. Uzman trakeal kanül ticari olarak mevcuttur. Ayrıca önemli olduğu kuvvet ve hareketyerleştirin ve tuzlu işlem boyunca düzgün ve tutarlı çekmek için kullanılır. Burada açıklanan protokol BAL sıvısında toplanan hücrelerin diferansiyel boyanması için optimize edilmiştir. Diferansiyel boyama modifiye Wright Giemsa leke ve morfolojisi tabanlı cep tanımlama yapmak için çok etkili bir tekniktir. Bu boyama tekniği eşsiz granül boyama özelliklerine göre nötrofil ve eozinofillerin farklılaşmasına izin verir. Monosit türetilmiş hücreler de tespit etmek kolaydır ve yaygın olarak BAL sıvısında gözlenmektedir. Bu makrofajlar ve dendritik hücreleri içerir. Benzer şekilde, T-hücreleri ve B-hücreleri, aynı zamanda yaygın olarak gözlenir. Çoğu araştırmacı doğru yalnız morfolojiye göre ayırt etmek için, ancak, bu monositik hücreler ve lenfositler genellikle zordur. Akış sitometrisinin kullanımı bu değerlendirmeler için çok daha yüksek çözünürlük ekleyebilirsiniz. Bununla birlikte, kontrol hayvanlarından geri düşükten hücre sayısı genellikle sınırlayıcı bir faktördür. Böylece, eğer akış CytomEtry deney tasarımı hücre kurtarma geliştirmek için, ek bir negatif kontrol hayvanları da içermelidir, kullanılacak.
Akciğer histopatolojik değerlendirmeler bu protokolün diğer önemli bileşeni olan ve hastalığın ilerlemesi doğrudan görselleştirme (Şekil 3A ve 3B) için izin verir. Akciğerler uygun şekilde hazırlandığı zaman, doğru bir histopatoloji, değerlendirildi miktarı ve karakterize edilebilir. Histopatoloji için akciğerlere hazırlanmasında en önemli adım doğru fiksatif ile şişen. Enflasyonun manuel yöntemler genellikle aşırı şişirilmiş akciğerlerde neden, altında şişirilmiş optimal görselleştirme ve morfolojisi değerlendirmeler (sırasıyla Şekil 3C ve 3D) neden olan, ya da kısmen-şişirilmiş. Aynı şekilde, önceden tespit şişirilmesi olmayan akciğer doğru değerlendirmek için çok zordur ve çoğu zaman (Şekil 3, son derece değişken histopatoloji puan ile sonuçlanır E). Burada tartışılan enflasyon yerçekimi metodu minimal değişkenlik enflasyonun yüksek tekrarlanabilir bir yöntem sağlar. Bu tekniği kullanarak, bu deney hayvanları arasında tutarlı olan akciğerlerde belirli işaretlerini değerlendirmek mümkündür. Bundan başka, bir şişirme standı ile ağırlık şişirme 20 mm 12 bir sabitleyici basınçta akciğerlere şişirmek gösterilmiştir. Bu teknik, bunların fizyolojik olarak uygun en boyutu ve şekli de akciğerlerin görselleştirme izin verir ve hassas patofizyolojik süreçlerin 12 değerlendirilmesi için son derece etkili olduğu gösterilmiştir. Bu enflasyonun tek doğru basınç oluşturmak için fare uygun yükseklikte ayarlanmış olması önemlidir. Suboptimal enflasyonu gözlenirse, şişirme standının yüksekliği ampirik olarak belirlenmelidir. Uygun yükseklik sağlayacak bir ticari olarak temin edilebilir küçük bir kemirgen akciğer enflasyonu standına kullanılması tavsiye edilir.
t "> Bu işlem, farelerin akciğerlere LPS ve diğer PAMPs teslim için optimize edilmiştir. bu teknikler hakim sonra, ek çalışmalar, aynı zamanda etkin bir canlı patojenlerin kullanılarak konukçu-patojen etkileşimlerine değerlendirmek için modifiye edilmiş protokoller kullanılarak başlatılabilir. Aynı şekilde, Burada tarif edilen teknikler, son derece esnek olup, deneysel ya da farmasötik maddenin klinik ve fizyolojik yeterliliğinin değerlendirilmesi ile ilgili bir çalışma uygulanabilir. için dozajlama hassasiyeti nedeniyle, bu teknik, aynı zamanda yüksek bir gerektiren in vivo çalışmalar için ideal ajan teslimat hassasiyet seviyesi.Bu prosedür, farelerin akciğerlerinde LPS ve diğer PAMPs teslim için optimize edilmiştir. Bu teknikler hakim sonra, ek çalışmalar aynı zamanda etkin bir canlı patojenlerin kullanılarak konukçu-patojen etkileşimlerine değerlendirmek için modifiye edilmiş protokoller kullanılarak başlatılabilir. Aynı şekilde, burada açıklanan teknikleri çok yönlü ve be bir deneysel veya farmasötik ajanın klinik ve fizyolojik önemi değerlendirirken ilgilenen herhangi bir çalışma uygulandı. Çünkü dozu doğruluğunun, bu teknik, aynı zamanda madde teslimat hassas yüksek düzeyde gerektiren in vivo çalışmalar için idealdir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarını beyan.
Acknowledgments
Yazarlar bu proje için temel ve teknik destek sağlamak için veteriner tıp VA-MD Regional College teşekkür ederim. Bu çalışma NIH Kariyer Geliştirme Ödülü (K01DK092355) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57Bl/6J | The Jackson Laboratory | Stock 000664 | |
| Compact Scale | Ohaus Scale Corporation | 71142845 | |
| Small Animal Rectal Thermometer | Braintree Scientific | TH 5 | |
| Rectal Probe for Rodents | Braintree Scientific | RET 3 | |
| Ear Punch | Braintree Scientific | EP-S 901 | |
| Lipopolysaccharide from E. coli 0111:B4 | InvivoGen | LPS-EB | |
| 1x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-023 | |
| Isoflurane | Baxter | 40032609 | |
| Intratrachael Administration and Lung Inflation Stand | ICAP Manufacturing | n/a | |
| Rodent Intubation Stand | Braintree Scientific | RIS 100 | |
| Scissors (blunt/sharp) | Fisher Scientific | 13-806-2 | |
| forceps (straight) | Fisher Scientific | 22-327-379 | |
| forceps (45º, curved) | Fisher Scientific | 10-275 | |
| Scissors (blunt/blunt) | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Pipette (200 µl Capacity) | Gilson | F123601 | |
| Ethanol | Sigma | 459844 | |
| 1 ml Syringe | BD Medical | 301025 | |
| 10 ml Syringe | BD Medical | 301604 | |
| 27 G x 0.5 in Needle | BD Medical | 305109 | |
| Refrigerated Microcentrifuge | Fisher Scientific | 13-100-676 | |
| 1.2 mm Tracheal Cannulae with Luer-adapter | Harvard Apparatus | 732836 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-076 | |
| 4-0 Silk Braided Surgical Suture | Ethicon | A183 | |
| Luer to Tube Connector Kits | Harvard Apparatus | 721406 | |
| Luer Stopcock Kit | Harvard Apparatus | 721664 | |
| Tygon formula E-3603 Laboratory Tubing | Sigma | R-3603 | |
| Formalin Solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128-4L | |
| Mouse IL-1β OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 559603 | |
| Mouse IL-6 OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 550950 | |
| Mouse TNF-α OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 560478 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3520 | |
| Hemocytometer Cover Glasses | Thermo Scientific | 22-021-801 | |
| Trypan Blue | Thermo Scientific | SV3008401 | |
| Cytology Funnel Clips | Fisher Scientific | 10-357 | |
| Cytology Funnels | Fisher Scientific | 10-354 | |
| Filter Cards | Fisher Scientific | 22-030-410 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| Cover Glasses | Fisher Scientific | 12-540A | |
| Cytospin Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | |
| Diff Quick Staining Kit | Fisher Scientific | 47733150 | |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 |
References
- Matute-Bello, G., et al. An official American Thoracic Society workshop report: features and measurements of experimental acute lung injury in animals. Am. J. respir. Cell Mol. Biol. 44, 725-738 (2011).
- Egger, C., et al. Administration of bleomycin via the oropharyngeal aspiration route leads to sustained lung fibrosis in mice and rats as quantified by UTE-MRI and histology. PloS one. 8, (2013).
- Rayamajhi, M., et al. Nonsurgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. J. Vis. Exp. , (2011).
- Revelli, D. A., Boylan, J. A., Gherardini, F. C. A non-invasive intratracheal inoculation method for the study of pulmonary melioidosis. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2, 164 (2012).
- Allen, I. C., et al. Analysis of NLRP3 in the development of allergic airway disease in mice. J. Immunol. 188, 2884-2893 (2012).
- Allen, I. C., et al. Characterization of NLRP12 during the in vivo host immune response to Klebsiella pneumoniae and Mycobacterium tuberculosis. PloS one. , (2013).
- Allen, I. C., et al. Expression and function of NPSR1/GPRA in the lung before and after induction of asthma-like disease. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 291, 1005-1017 (2006).
- Kebaier, C., et al. Staphylococcus aureus alpha-hemolysin mediates virulence in a murine model of severe pneumonia through activation of the NLRP3 inflammasome. J. Infect. Dis. 205, 807-817 (2012).
- Roberts, R. A., et al. Analysis of the murine immune response to pulmonary delivery of precisely fabricated nano- and microscale particles. PloS one. 8, (2013).
- Willingham, S. B., et al. NLRP3 (NALP3, Cryopyrin) facilitates in vivo caspase-1 activation, necrosis, and HMGB1 release via inflammasome-dependent and -independent pathways. J. Immunol. 183, 2008-2015 (2009).
- Kline, J. N., et al. Variable airway responsiveness to inhaled lipopolysaccharide. Am. J. Respir. Crit. Med. 160, 297-303 (1999).
- Cressman, V. L., Hicks, E. M., Funkhouser, W. K., Backlund, D. C., Koller, B. H. The relationship of chronic mucin secretion to airway disease in normal and CFTR-deficient mice. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 19, 853-866 (1998).
