L'utilisation de l'oropharynx Intratrachéal PAMP administration et lavage broncho-alvéolaire pour évaluer l'hôte une réaction immunitaire chez la souris

Summary

La réponse immunitaire de l'hôte à l'infection par des pathogènes est un processus étroitement régulé. Utilisant un poumon modèle d'exposition de lipopolysaccharide chez la souris, il est possible de procéder à des évaluations de haute résolution des mécanismes complexes associés à la pathogenèse de la maladie.

Abstract

La réponse immunitaire de l'hôte à des agents pathogènes est un processus biologique complexe. La majorité des études in vivo utilisé classiquement pour caractériser les interactions hôte-pathogène profiter des injections intra-péritonéales de sélectionner des bactéries ou des motifs moléculaires de pathogènes associés (PAMP) chez la souris. Bien que ces techniques ont donné des données énormes liés à pathobiology des maladies infectieuses, les modèles d'injection intrapéritonéale sont pas toujours appropriés pour les études d'interaction hôte-pathogène dans les poumons. Utilisant un modèle d'inflammation pulmonaire aiguë chez la souris, il est possible de procéder à une analyse à haute résolution de l'hôte réponse immunitaire innée utilisant le lipopolysaccharide (LPS). Ici, nous décrivons les méthodes d'administration de LPS en utilisant non chirurgicale administration intratrachéale oropharyngée, de surveiller les paramètres cliniques associés à la pathogenèse de la maladie, et d'utiliser le liquide de lavage broncho-alvéolaire pour évaluer la réponse immunitaire de l'hôte. Les techniques qui sont décritessont largement applicable pour l'étude de la réponse immunitaire innée hôte à un large éventail de PAMP et les agents pathogènes. De même, avec des modifications mineures, ces techniques peuvent également être appliquées dans des études évaluant l'inflammation allergique des voies aériennes et dans des applications pharmacologiques.

Introduction

Les infections pulmonaires associés aux espèces de bactéries pathogènes sont une cause fréquente de morbidité et de mortalité dans le monde. Déterminer les mécanismes qui conduisent la réponse immunitaire de l'hôte à ces agents pathogènes favorisera le développement de nouvelles stratégies de prévention et des agents thérapeutiques qui atténuent l'impact de ces infections. L'objectif global du protocole décrit ici est de fournir à l'utilisateur une méthode flexible pour évaluer l'hôte réponse immunitaire innée à l'infection par des agents pathogènes en utilisant un modèle de l'agent pathogène associé moléculaire (PAMP) comme un substitut pour les bactéries vivantes. La majorité des études antérieures évaluant l'hôte réponse immunitaire innée aux bactéries ont mis l'accent sur les modèles péritonéale en raison de la relative facilité d'exécution. Bien que ces modèles sont très utiles et ont donné lieu à des avancées significatives dans le domaine des interactions hôte-pathogène et l'inflammation systémique, les données générées à partir de ces modèles ne sont pas toujours appropriés pour les études involving le système respiratoire. Ici, un modèle d'inflammation pulmonaire aiguë du poumon est proposé comme une extension pratique et cliniquement pertinente de l'intra-péritonéale (ip), les modèles d'injection classiques. La technique proposée permet l'évaluation locale de la réponse immunitaire innée dans un système de modèle spécifique d'organe.

Les méthodes décrites ici sont conçues pour fournir une technique simple et robuste pour permettre aux utilisateurs d'évaluer la réponse immunitaire de l'hôte au LPS, qui est un PAMP commun. Les méthodes sont basées sur intratrachéale (it) instillation de LPS, ce qui induit une réponse immunitaire innée robuste dans les poumons de souris et imite de nombreuses caractéristiques physiopathologiques observés chez des patients humains souffrant d'infections respiratoires et de lésions pulmonaires aiguës ^1. Un avantage principal de cette technique est qu'elle permet à l'utilisateur d'évaluer la réponse immunitaire de l'hôte sans les facteurs de confusion et des problèmes de sécurité liés à la réalisation des études in vivoà l'aide de bactéries vivantes. De même, l'administration de ce parcours oropharyngée de l'exposition décrite dans ce protocole présente des avantages significatifs par rapport aux autres techniques couramment utilisées, y compris par voie intranasale (dans) l'administration et la gestion de ce chirurgical. Par exemple, l'administration du dosage, il permet oropharyngée relativement précise et dépôt dans les poumons, comparativement à l'administration, qui souffre généralement d'une augmentation de la variabilité de dépôt dans les poumons à cause de la perte d'agents dans la cavité nasale, des sinus ^{de 2-4.} La voie d'administration de ces cavités, il contourne et permet un accès direct à la trachée et les voies respiratoires. De même, l'approche chirurgicale est une méthode d'administration beaucoup plus morbide et nécessite une formation approfondie à maîtriser. Les protocoles décrits ici comprennent également une description des techniques courantes et des marqueurs de substitution utilisés pour évaluer la progression de l'inflammation et se terminer par un protocole décrivant les techniques appropriées pour la préparation de la luNGS pour l'évaluation de l'histopathologie. Ces protocoles sont concentrés sur la réduction du nombre de souris requis pour chaque étude en maximisant les données générées à partir de chaque animal individuel.

Les protocoles décrits sont très flexibles et peuvent être facilement modifiés pour évaluer une diversité PAMP de gamme et des modèles moléculaires de dommages associé (atténue). En outre, moyennant quelques modifications supplémentaires, ces protocoles peuvent également être appliqués à des études évaluant allergique des voies aériennes progression de la maladie ou des interactions hôte-pathogène avec des bactéries vivantes, des virus ou des champignons ^5-10.

Protocol

Toutes les études ont été menées sous l'approbation du Comité des soins et institutionnel (IACUC) pour Virginia Tech et en conformité avec les National Institutes of Health Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire.

Une. Intratrachéale (it) inoculation de LPS aide de l'Administration de l'oropharynx

1. Assurez-vous que chaque animal est identifié en utilisant soit un coup de poing de l'oreille, une étiquette d'oreille, ou toute autre méthode approuvée institutionnellement.
2. Noter le poids corporel de base et la température du corps de chaque animal.
3. Préparer le stock de travail de LPS. Chaque souris reçoit une dose de 50 pi de 1 mg / kg de LPS dans 1 x tampon phosphate salin (PBS). Animaux traités Mock recevront une dose de 50 pi de PBS 1x.
4. Préparer une chambre chargée de l'administration de l'isoflurane en utilisant la méthode de la goutte suivante. Les directives institutionnelles varient en ce qui concerne l'utilisation de l'isoflurane et d'autres agents anesthésiques et avant Initiattion des études, les personnes doivent communiquer avec le Service de protection des animaux / Bien-être de leur institution pour assurer les toutes les directives sont satisfaits. Si la méthode de chute isoflurane n'est pas une option, d'autres agents anesthésiques sont des alternatives acceptables.
   1. Dans une armoire de sécurité approprié, appliquer environ 3 ml d'isoflurane à une serviette de papier absorbant plié et le placer dans le fond d'un bécher de 500 ml.
   2. Placer un petit morceau de papier d'aluminium sur le dessus de la serviette en papier et couvrir le bol avec un couvercle transparent.
5. Préparer les outils et les réactifs qui seront utilisés au cours de l'inoculation il. Placez la bande de caoutchouc afin de garantir les animaux se dirigent sur le stand de l'intubation. Cette procédure nécessite une paire de pinces droites, une paire de pinces inclinées ou courbes, et une pipette P200 avec des conseils.
6. Charge 50 pi de LPS dans la pointe de la pipette et le placer dans un endroit facilement accessible à côté du stand de l'intubation.
7. Anesthésier la sourisen plaçant l'animal dans la chambre de l'isoflurane et recouvrant la chambre avec le couvercle transparent. Respecter les modes de respiration de l'animal, qui sera rapide et superficielle lors de la première placée dans la chambre. L'animal sera suffisamment anesthésiée quand les taux de respiration s'approchent 1 souffle / 2 sec, qui est généralement atteint en 30 secondes à placer dans la chambre. La souris doit être anesthésié comme indiqué dans le protocole approuvé pour les animaux en utilisant la méthode de chute de l'isoflurane.
8. Retirez la souris anesthésiée de la chambre et de suspendre l'animal sur l'intubation tenir ses incisives. S'assurer que l'animal est bien retenu et la bouche et la langue sont accessibles.
9. Garantir doucement la langue avec la pince droite. Saisir la languette avec la pince à angles et tirez-le doucement hors de la bouche jusqu'à ce qu'une légère résistance se fait sentir. Cette action est suffisante pour bloquer l'épiglotte et avoir accès à la trachée.
10. Tout en continuant à tenir la langue dans laposition étendue, administrer la dose de 50 ul de LPS dans le fond de la gorge et couvrir immédiatement les narines de l'animal avec un doigt ganté. Le LPS sera visible à l'arrière de la gorge jusqu'à ce que la souris inhale.
11. Continuez à couvrir les narines et maintenez la langue étendu pendant 5-10 respirations supplémentaires.
12. Débranchez la souris de la position de l'intubation et placez le dos de l'animal dans une nouvelle cage jusqu'à ce qu'il récupère de l'anesthésie.
13. Surveillance de marqueurs de substitution associées à la progression de la maladie. Le poids corporel et la température du corps doivent être surveillés tous les 4-8 heures pour la durée de l'étude. De même, évaluer les caractéristiques de comportement et de symptômes cliniques associés à une morbidité accrue.
14. Pour évaluer la progression de la maladie, les souris de récolte aux points de contrôle spécifiques suite à l'exposition au LPS. Points de temps typiques de récolte après une exposition LPS comprennent 0, 6, 12, 18, 24, et 48 h. Pour évaluer le rétablissement et la survie, évaluer la souris pour 7 days après l'inoculation.

2. Sérum et lavage broncho-alvéolaire fluide (LBA) Collection

1. Sacrifier la souris en utilisant une méthode approuvée institutionnellement.
2. Placez l'animal sur son dos et le fixer à un bord de l'autopsie, idéalement 0,5 à (1,27 cm) de hauteur.
3. Mouillez l'ensemble souris avec 70% d'éthanol.
4. En utilisant une seringue de 1 ml avec une aiguille 27 G, procéder à une ponction cardiaque avant de faire des incisions. Il devrait être possible de retirer 500 à 800 pi de sang total à partir d'une seule souris.
5. Retirez l'aiguille de la seringue et transférer le sang total à un tube de 1,5 ml microtubes préalablement marqué. Pour la collecte de sérum, le sang total permet de coaguler pendant au moins 30 min à température ambiante. En plus de la collecte de sérum, ce procédé peut également être modifié par incorporation d'un anti-coagulant dans le tube et d'une seringue, avant de recueillir le sang entier, pour étudier les cellules immunitaires circulantes.
6. Faire une incision horizontale untraverser la longueur de la cavité péritonéale, et une incision verticale de la cavité peritoneale à la mâchoire inférieure de la souris.
7. En utilisant une pince, saisir des deux côtés de l'incision et tirez doucement la peau à l'écart des cavités péritonéale et thoraciques sous-jacents.
8. Faire une incision le long de la grande longueur de la cavité péritonéale des organes génitaux du sternum, en prenant soin d'éviter de couper le diaphragme. Déplacer doucement l'intestin dans la cavité péritonéale pour permettre l'accès à l'un des reins.
9. Couper la veine rénale conduisant à la rein à servir de point de perfusion de drainage.
10. Nick le diaphragme à l'aide de ciseaux, en prenant soin d'éviter les poumons et le cœur, pour exposer le côté gauche du cœur.
11. Perfuse manuellement le coeur à l'aide d'une seringue de 10 ml avec une aiguille de 27 G et une solution 1 x PBS. Éviter d'appliquer une force excessive lors de la perfusion afin de s'assurer que la solution saline n'est pas forcé dans les poumons. Le sang restant devrait s'écouler de l'incision de la veine porte.
12. Découpez soigneusement la cage thoracique le long du sternum avec des ciseaux émoussés / émoussés, en prenant soin d'éviter de couper le cœur et les poumons. Couper accidentellement les poumons au cours de cette procédure permettra de réduire considérablement la quantité de BALF recueillies et se traduira par une incapacité à gonfler correctement les poumons avec fixateur.
13. Isoler doucement le cœur et les poumons à l'extérieur de la cage thoracique à l'aide de pinces. Découpez soigneusement chaque section de la cage thoracique à l'aide contondants / émoussé ciseaux à proximité de la colonne vertébrale que possible et complètement enlever les deux sections.
14. Séparez les glandes salivaires à l'aide de forceps ou de les supprimer en utilisant des ciseaux, pour exposer la trachée.
15. Découpez soigneusement les muscles qui recouvrent la trachée avec des ciseaux. Il est essentiel que la trachée pas être coupé pendant ce processus.
16. Avec des ciseaux, séparer la clavicule recouvrant la trachée.
17. Saisir doucement le thymus aide d'une pince et soulever le tissu du coeur. Retirez le thymus l'aide de ciseaux, tout en veillant àéviter de couper le cœur ou les poumons.
18. Faire une petite incision horizontale dans la trachée 1-2 anneaux au-dessous du larynx à l'aide des ciseaux inclinés (45-90 º d'angle de, pointus / pointus). L'incision doit être suffisamment grande pour fixer solidement la canule.
19. Insérer la canule, de sorte que l'extrémité effilée s'étend anneaux trachéaux 3.2 ci-dessous de l'incision et de fixer la canule en place à l'aide d'une suture de soie. Assurez-vous que le fil de suture passe entre la trachée et l'œsophage et il est tendu sur la canule.
20. Remplir une seringue de 1 ml avec 1 ml de solution saline tamponnée de Hanks (HBSS) et introduire délicatement sa luer dans la canule.
21. En utilisant un mouvement lent, mais constant, injecter ~ 900 pi dans la trachée, ce qui gonfle les poumons, et de retirer immédiatement le HBSS. Placer le BALF récupéré dans un tube conique de 15 ml.
22. Répétez cette lavage 2 fois supplémentaires pour recueillir environ 3 ml de BALF pour une analyse future. Rangez le BALF sur la glace ou à 4 ° C jusqu'à utilisation.

1. Insérer une seringue de 10 ml dans la position de gonflage du poumon. Assembler les tubes à la luer, le luer sur le robinet et le robinet de la seringue. S'assurer que le robinet est en position fermée. La seringue de 10 ml servira de réservoir d'écoulement par gravité. Le réservoir doit être fixé à l'inflation 4,75 distingue en dessus de l'animal et de la partie supérieure du réservoir doit s'étendre au-dessus de 10,5 dans l'animal.
2. Remplir la seringue avec neutre solution de formol tamponné. S'assurer que la seringue est complètement remplie avec le fixateur.
3. Placer une serviette absorbante sous l'extrémité ouverte du tube et d'ouvrir le robinet d'arrêt pour permettre le fixateur pour remplir le tube. Une fois le fixateur commence coule du tuyau, fermer immédiatement le robinet et remplir la seringue vers le haut avec un fixateur. Il est important que la seringue soit complètement rempli de fournir la quantité appropriée de la pression de gonflage du poumon.
4. Faire un nœud simple en vrac dans la suture; cependant, ne tirez pas sur le noeud serré.
5. Insérez le tube de l'inflation de la souris se dans la canule.
6. Ouvrir le robinet et laisser les poumons se remplissent par gravité inflation.
7. Une fois que les poumons atteignent leur niveau de gonflage maximale, tirez le fil de suture serré et attacher un deuxième noeud.
8. Fermer le robinet et retirez le tube de la canule.
9. Retirer délicatement la canule de la trachée en saisissant le fil de suture avec une paire de pinces et en maintenant la canule avec les doigts. Tirez fermement le fil de suture vers le bas vers la cavité thoracique et la canule de retour vers le nez de la souris.
10. Saisir doucement la trachée ou les sutures avec une pince et soulever la trachée loin de la cavité du cou.
11. Couper la caudale de la trachée à la suture attaché avec des ciseaux émoussés.
12. Une fois que le Trachea est libre dans les tissus sous-jacents, de commencer à tirer sur la trachée à une distance à partir de la souris. Soulevez doucement les poumons de la cavité thoracique.
13. Découpez soigneusement le tissu conjonctif tenant les poumons dans la cavité thoracique. Continuer à tirer la trachée à distance du corps de la souris et appliquer une force constante à la hausse tout en réduisant les connexions sous-jacentes. Prenez soin de ne pas couper les poumons. Notez que le coeur doit être laissé attaché aux poumons en utilisant cette méthode.
14. Une fois que les poumons ont été retirés, placez-les dans 10 ml de formol tamponné.
15. Supprimer une section de la queue de la souris pour le génotypage.
16. Disposer de la carcasse de la souris suivant les directives institutionnelles appropriées.

4. Évaluation de cytokines

1. Centrifuger le sang total, recueillis à l'étape 2.5, à 12 000 g pendant 5 min à isoler le sérum. Transférer le sérum dans un tube de 1,5 ml microtubes pré-marqués et conserver à -80 ° C.
2. Évaluer la serum niveaux de cytokines par ELISA ou un autre test similaire. Diluer le sérum 01 heures 05-à-01:20 dans un tampon de dilution approprié, en fonction du dosage, suivant les instructions du fabricant. Ces dilutions doivent être déterminés de façon empirique avant l'exécution de la masse des échantillons.
3. En raison du faible volume de sérum recueilli, de réduire le volume de l'échantillon chargé sur la plaque ELISA de moitié. Par exemple, la plupart des tests ELISA commerciaux utilisent des volumes de 100 pi de normes et des échantillons. Pour conserver les échantillons, charge 50 pi de normes et de sérum dilué par puits.
4. Centrifugeuse la BALF dans une centrifugeuse de table réfrigérée à 200 g pendant 5 min. Transférer le surnageant acellulaire en deux préalablement marqué de 1,5 ml microtubes et conserver à -80 ° C.
5. Évaluer cytokines BALF par ELISA ou un autre test similaire sans diluer.
6. Magasin sérum utilisé et BALF à -80 ° C.

5. Différentiel coloration et BAL évaluation Cellularity

1. Suite à la centrifugation et BALF élimination complète du HBSS, lyser les globules rouges en culot à l'aide de la solution saline hypotonique. Remettre en suspension les cellules dans 900 ul d'eau distillée. Immédiatement ajouter 100 ul de PBS 10x.
2. Lyser individuellement chaque échantillon. Si les échantillons contiennent une quantité excessive de cellules rouges du sang, les cellules peuvent être rassemblées en un culot dans la centrifugeuse de paillasse à 400 xg pendant 5 min et le sang protocole de lyse des globules rouges peut être répété.
3. Déterminer la cellularité totale de BALF dans la suspension de 1 ml en utilisant un hématimètre à 10X ou 20 X grossissement avec coloration au bleu Trypan. Évaluer et présenter ces données comme cellules / ml.
4. Préparer le matériel pour la cytospin et coloration différentielle. Étiqueter les lames de microscope standard à l'aide d'un crayon ou stylo solvant résistant. Fixer les lames dans une tranche d'cytospin et entonnoir. Fixez l'ensemble de diapositives dans le rotor de cytospin.
5. Cytospin 150 ul de BALF à 100 xg pendant 5 min. Si la densité cellulaire est trop grand pour effectivementévaluer la morphologie des cellules, de réduire le volume filé vers le bas sur les diapositives. Laisser les lames à l'air sécher pendant la nuit.
6. Différentiel colorer les lames suivant les protocoles fabrique. Laisser les lames à l'air sécher pendant la nuit. Les lames couvre-objet en utilisant du Permount et évaluer les lames à l'aide d'un microscope équipé d'un objectif 20X et 40X.
7. Récolter les cellules restantes pour une analyse ultérieure, telles que FACS, microscopie électronique, microscopie confocale, l'extraction de l'ARN pour l'évaluation de l'expression des gènes, et / ou l'extraction des protéines de transfert de western.

6. évaluation histopathologique

1. Préparer les poumons pour l'évaluation histopathologique. Après 24-48 heures de la fixation au formol, orienter le ventre les poumons entiers gonflés et inclus en paraffine. Couper les blocs qui en résultent pour exposer le principal conducteur voies respiratoires.
2. Pour améliorer la précision de pointage, positionner les poumons dans la même position et couper chaque bloc pour obtenir la visualisation longitudinale maximale de til intrapulmonaires principal voies respiratoires axiale. De ce point, couper 5 microns de coupes en série et la tache avec de l'hématoxyline et de l'éosine (H & E). Des sections supplémentaires peuvent être découpés et préparés pour l'hybridation in situ en utilisant des protocoles standards.
3. Évaluer l'histopathologie l'aide d'un système de notation semi-quantitative basée sur les paramètres inflammatoires suivantes, qui sont notés entre 0 (absent) et 3 (sévère): mononucléaires et polynucléaires infiltration de cellules; des voies respiratoires hyperplasie des cellules épithéliales et des blessures; extravasation; périvasculaire et menottes peribroncheolar; et le pour cent du poumon associé à une inflammation. Poumon histopathologie doit être évaluée par un pathologiste expérimenté.
4. Moyenne de l'ensemble des scores de paramètres pour générer un score total de l'histopathologie ou utiliser scores individuels de quantifier les aspects spécifiques de la progression de la maladie. Effectuer tous notation dans un mode à double insu, avec les examinateurs en aveugle à la fois le génotype et le traitement. Ce système de notation a été previously décrit ^6,7,10.

Representative Results

Les parois cellulaires des bactéries Gram-négatives sont constituées de LPS, ce qui est très abondant dans l'environnement. L'inhalation de LPS dans les populations humaines sensibles exacerbe réactivité des voies respiratoires et est capable de déclencher une response11 immunitaire robuste. LPS est également un PAMP commun utilisé dans des modèles de souris pour induire une réponse immunitaire innée robuste. Dans le protocole décrit ici, les souris ont reçu une dose de LPS il isolé de E. coli (sérotype 0111: B4) à l'aide de l'administration, il oropharyngée. Dans les modèles d'exposition LPS, à la fois la température du corps et le poids sont des marqueurs de substitution typiques de morbidité des animaux et la progression de la maladie. Le défi LPS provoque une diminution significative de la température du corps dans les 6 premières heures, ce qui augmentera progressivement revenir à la ligne de base au cours de 24 heures (figure 1A). Cependant, le poids corporel diminue constamment, tandis au cours de 24 heures (figure 1B), où il sera à son maximum et de récupérer sur le n progressivementposte 48-72 h. Ainsi, la température du corps est un marqueur plus approprié pour évaluer les premiers stades de l'inflammation initiation; alors, le poids corporel est plus fiable au cours des étapes ultérieures de la pathogenèse et la récupération.

L'exposition des voies respiratoires LPS entraîne un afflux important de leucocytes dans les poumons. Dans le 6 premières heures, les cellules associées à l'hôte réponse immunitaire innée peuvent être observés dans la BALF (figure 1C). La cellularité BALF continue d'augmenter au cours de la prochaine 24-48 h (figure 1C), où les pics de la réponse immunitaire et ensuite entre dans une période de la résolution de l'inflammation. En 24 heures, un nombre important de neutrophiles présents dans les poumons et peut être observée dans la BALF après coloration différentielle (figures 1D et 1E). Évaluations de la cellularité BALF fournissent une technique robuste et quantifiable pour caractériser les cellules associées à la réponse immunitaire de l'hôte dans les poumons. Le incrfacilité dans BALF cellularité est compatible avec un afflux important de neutrophiles dans les voies respiratoires, les vaisseaux sanguins et dans le parenchyme pulmonaire (figures 1F et 1G). Histopathologie pulmonaire peut être évaluée de manière efficace en utilisant un système de notation semi-quantitative (figure 1F). Il est possible de marquer avec précision l'histopathologie de points de repère spécifiques dans les poumons des animaux différents lorsque les poumons sont gonflés avec précision de la même taille avec un fixateur et sections traitées pour révéler la visualisation longitudinale maximale de la principale voie respiratoire axiale intrapulmonaire. Le protocole d'inflation de gravité sur la base, décrit ici, est conçu pour faciliter ce système de notation. LPS induit une augmentation significative de la périvasculaire, peribroncheolar et l'inflammation parenchymateuse (figure 1G).

L'administration de LPS induit des niveaux élevés de médiateurs pro-inflammatoires locaux et systémiques, y compris plusieurs cytokines associées àla réponse immunitaire innée. Les taux de cytokines locales peuvent être évaluées dans le BALF en utilisant des techniques classiques, telles que l'ELISA. Cytokines communs qui sont régulés à la hausse dans les poumons après l'administration de LPS comprennent le TNF-α, IL-1β et d'IL-6 (figure 2A). Les taux de cytokines systémiques peuvent être évalués dans le sérum en utilisant les mêmes techniques que celles décrites pour les évaluations de la BALF (Figure 2B). Il n'est pas rare que certains médiateurs d'être présents dans le microenvironnement local, mais absent dans le sérum. Par exemple, le TNF-α est habituellement présent en grande quantité dans les poumons après le LPS, mais ne sont pas habituellement trouvé de manière systémique dans les conditions décrites dans le présent protocole (figures 2A et 2B, en dessous du seuil de détection).

Figure 1. Oropharyngée Intratrachéal LPS administration accroît la morbidité et inflammation des voies respiratoires chez les souris. Souris mâles reçu 1 mg / kg de E. coli LPS (serotype 0111: B4) et la pathogenèse des maladies a été évaluée au cours des 24 h AB) LPS induit une réduction significative de la température du corps à l'intérieur de 6 h d'administration;. considérant que la perte de poids corporel est plus apparente au niveau des points de temps ultérieurs. C)   LPS induit une augmentation significative de la cellularité de la BALF totale. DE) Les neutrophiles sont le type cellulaire dominent présent dans les poumons 24 heures après l'administration de LPS, comme le révèle la coloration différentielle à partir de cellules isolées à partir du BALF. Ces données sont typiquement illustrées comme le pour cent de chacun des types de cellules présents dans le BALF. F) histopathologie pulmonaire peut être évaluée en utilisant un système de notation semi-quantitative sur la base de deux évaluations indépendantess de l'inflammation autour de la intrapulmonaire principal voies respiratoires axiale. G) Une quantité importante de manchon périvasculaire et peribroncheolar, inflammation du parenchyme doux et une légère occlusion alvéolaire est généralement observée 24 heures après l'exposition au LPS du poumon. Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 2. L'exposition à des voies aériennes LPS Résultats dans les niveaux accrus de cytokines locales et systémiques. A)   À la suite de l'exposition au LPS, les concentrations locales d'un large spectre de cytokines pro-inflammatoires peuvent être observées dans le BALF à l'intérieur des 24 premières heures, y compris le TNF-α, IL-1β et IL-6. Ces cytokines peuvent être évaluées à l'aideELISA, comme indiqué ici 24 heures après l'exposition de LPS. B) Plusieurs cytokines peut également être détecté systématiquement dans le sérum. Cependant, il ya quelques exceptions notables, dont le TNF-α, qui se trouvent dans des niveaux élevés dans le LBA, mais pas dans le sérum. Cytokines d'intérêt dans le sérum doivent être évalués de façon empirique avant l'évaluation à grande échelle. Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 3. L'inflation du poumon utilisant la gravité de déplacement entraîne une réduction de la variabilité histopathologie et une meilleure visualisation. La méthode de déplacement de la gravité de la fixation décrite dans ce protocole permet optimale évaluation histopathologique comparable ed pour les poumons gonflés ou gonflage manuel. AB) Poumons fixées par la gravité de l'inflation présentent les caractéristiques uniformes permettant notation précise, réduits lésions alvéolaires, visualisation améliorée, et des évaluations de haute résolution de l'inflammation. CD) Manuel inflation des poumons se traduit généralement par des zones non uniformes de inflation. C) Ces zones non uniformes sont souvent partiellement gonflés, résultant dans des zones effondrées qui sont souvent confondus avec des caractéristiques pathologiques par leurs auteurs débutants. D) l'inflation Manuel Résultats aussi dans les zones des poumons qui sont trop gonflés, ce qui entraîne alvéolaire gravement endommagé espaces E). poumons dégonflé montrent des espaces et des zones qui sont difficiles à résoudre et évaluer sans formation approfondie alvéolaires effondrés. De même, en raison de l'orgue étant effondré cette technique ne permet pas la visualisation des poumons telles qu'elles apparaissent in situ.e.com/files/ftp_upload/51391/51391fig3highres.jpg "target =" _blank "> Cliquez ici pour agrandir l'image.

Discussion

Les étapes les plus critiques pour l'évaluation avec succès la réponse immunitaire de l'hôte dans les poumons de souris est comme suit: 1) choisir la souche de souris approprié et le sexe pour le modèle en cours d'évaluation; 2) optimiser la livraison de PAMP pour les poumons; 3) recueillir et traiter correctement la BALF; et 4) fixer correctement et préparer des poumons pour l'évaluation histopathologique.

Le choix de la souche de souris est un facteur important dans l'évaluation de la réponse immunitaire de l'hôte. C57BL / 6 souris sont généralement considérés comme le fond de la souris optimale pour l'étude de l'immunité innée en raison de leur inclinaison réponse Th1 et robuste à la plupart des PAMP. De même, des souris BALB / c sont généralement utilisés pour l'étude des modèles de maladies allergiques en raison de leur inclinaison Th2. Une troisième souche couramment utilisé dans les modèles de souris poumon sont sur le fond 129SvEv, en raison de leur utilisation en commun de générer des animaux transgéniques. Dans tous les cas, la prudence devrait être prise lors de la conception expérimentale et chaque fois que possible, l'âge et le sexe matched animaux témoins litre-mate doivent être utilisés pour des études comparant des souris génétiquement modifiées avec des animaux de type sauvage. Typiquement, pour le protocole LPS décrit ici, vieux 6-12 semaine sexe appariés C57BL / 6 souris doivent être utilisées et doivent peser un minimum de 20 g. Il est possible que l'exposition LPS se traduira par des taux élevés de morbidité et de mortalité dans les souches de souris sensibles ou des génotypes. Si cela se produit, il peut être nécessaire d'ajuster plusieurs aspects de ce protocole, y compris la réduction de la dose de LPS, en utilisant de plus grands animaux, et la commutation du sexe des animaux utilisés dans l'expérience. Expériences à petite échelle devraient être menées d'abord à déterminer la sensibilité des animaux et les conditions de chaque expérience devraient être fondées sur le génotype le plus sensible ou condition expérimentale.

Administration de l'oropharynx il a été trouvé pour être plus précis que les autres formes de prestation de l'agent vers les poumons ^2. C'est en grande partie grâce à l'accès direct à la marway et contourner les problèmes liés à nasale et des sinus dépôt de la cavité. Cependant, comme avec toutes les procédures de l'animal, il exige une grande dextérité administration et pratique manuelle à atteindre la maîtrise. Technique inadéquate peut entraîner de dépôt pulmonaire inefficaces et, dans certains cas entraîner des blessures des animaux. Typiquement, colorant bleu Evans (EBD) peut être utilisé efficacement comme étant un outil de formation pour cette procédure ou de résoudre les problèmes potentiels associés au dépôt ^4. EBD peut être administré et ensuite extrait à partir du tissu en utilisant le formamide. La quantité de EBD peut être calculée en utilisant les niveaux d'absorption par rapport à une courbe standard. Dans nos mains, la récupération typique EBD est comprise entre 90-98%. La majeure partie du colorant non récupéré est prévu pour être associé à une fuite dans l'œsophage. Grâce à sa précision, la technique d'administration, il est idéal pour fournir un large éventail d'agents sensibles à la dose dans les poumons, tels que des agents pharmaceutiquesou des organismes infectieux.

L'analyse de la cellularité et BALF BALF peut fournir une quantité importante d'un aperçu de la progression globale de la réponse immunitaire de l'hôte. Les médiateurs inflammatoires libérés localement dans les poumons après une stimulation peuvent être efficacement quantifiés dans le BALF en utilisant des techniques immunologiques courantes, telles que ELISA et Western Blot. De même, la composition cellulaire du BALF peut être évaluée en utilisant soit une coloration différentielle de cellules ou la cytométrie en flux. Développement de la technique et dextérité manuelle appropriée est la partie la plus critique de l'exécution du lavage broncho-alvéolaire (LBA). L'un des problèmes les plus courants qui se produisent au cours de la BAL est l'échec de retirer complètement le volume maximal de fluide à l'origine placé dans les poumons. Ceci est communément associé à une canule mal fixé ou lorsque les aiguilles sont utilisées à la place de canules réels. Canules trachéales spécialisés sont disponibles dans le commerce. Il est également important que le mouvement et la forceutilisé pour insérer et retirer la solution saline est lisse et uniforme tout au long de la procédure. Le protocole décrit ici a été optimisé pour la coloration différentielle des cellules recueillies dans le LBA. Coloration différentielle est un colorant de Wright Giemsa modifié et est une technique très efficace pour effectuer l'identification sur la base de la morphologie cellulaire. Cette technique de coloration permet la différenciation des neutrophiles et des éosinophiles en fonction de leurs propriétés uniques granule de coloration. cellules dérivées de monocytes sont également faciles à identifier et sont couramment observées dans le LBA. Il s'agit notamment des macrophages et des cellules dendritiques. De même, les cellules T et les cellules B sont également fréquemment observées. Cependant, ces cellules lymphocytes et monocytes sont souvent difficile pour la plupart des chercheurs pour différencier avec précision sur la base de la morphologie seul. L'utilisation de la cytométrie en flux peut ajouter résolution beaucoup plus élevée à ces évaluations. Cependant, de faibles nombres de cellules récupérées à partir d'animaux de contrôle est souvent un facteur limitant. Ainsi, si cytom de fluxétrie doit être utilisé, le modèle expérimental doit inclure les animaux témoins négatifs supplémentaires pour augmenter la récupération des cellules.

Évaluations histopathologiques pulmonaires sont un autre élément essentiel de ce protocole et permettent la visualisation directe de la progression de la maladie (figures 3A et 3B). Lorsque les poumons sont bien préparés, histopathologie peut être évaluée avec précision, quantifié et caractérisé. L'étape la plus critique dans la préparation des poumons pour l'histopathologie est correctement les gonfler avec un fixateur. Les méthodes manuelles de l'inflation entraînent généralement dans les poumons qui sont sur-gonflé, sous-gonflé ou partiellement gonflé, ce qui entraîne la visualisation optimale et des évaluations de la morphologie (figures 3C et 3D, respectivement). De même, les poumons qui ne sont pas gonflés avant la fixation sont très difficiles à évaluer avec précision et se traduit souvent par des scores histopathologiques très variables (Figure 3 E). La méthode de la gravité de l'inflation analysé ici constitue une méthode hautement reproductible de l'inflation avec une variabilité minimale. En utilisant cette technique, il est possible d'évaluer les points de repère spécifiques dans les poumons qui sont cohérentes entre les animaux de laboratoire. En outre, la gravité de l'inflation au moyen d'un stand de l'inflation a été montré pour gonfler les poumons à une pression fixateur de 20 mm ^12. Cette technique permet la visualisation des poumons lors de leur plus physiologiquement pertinent taille et de forme et a été montré pour être très efficaces pour l'évaluation des processus physiopathologiques sensibles ^12. Il est essentiel que la position de gonflage être réglé à la hauteur correcte de la souris afin de générer la pression appropriée. Si l'inflation sous-optimale est observée, la hauteur de la position de l'inflation devrait être déterminée de manière empirique. L'utilisation d'un petit rongeur poumon stand de l'inflation disponibles dans le commerce, ce qui assurera la bonne hauteur, est recommandé.

t "> Cette procédure a été optimisé pour la livraison de LPS et autres PAMP pour les poumons de souris. Une fois ces techniques sont maîtrisées, des études supplémentaires peuvent également être lancées à l'aide des protocoles modifiés pour évaluer efficacement les interactions hôte-pathogène à l'aide de pathogènes vivants. De même, les techniques décrites ici sont très polyvalents et peuvent être appliqués à toute étude s'intéresse à l'évaluation de la pertinence clinique et physiologique d'un agent expérimental ou pharmaceutique. Du fait de la précision dans le dosage, cette technique est également idéal pour des études in vivo qui nécessitent une grande niveau de précision dans la livraison de l'agent.

Ce procédé a été optimisé pour la livraison de LPS et d'autres PAMP pour les poumons de souris. Une fois ces techniques sont maîtrisées, des études supplémentaires peuvent également être lancées à l'aide des protocoles modifiés pour évaluer efficacement les interactions hôte-pathogène en utilisant des agents pathogènes vivants. De même, les techniques décrites ici sont très polyvalents et peuvent be appliquée à toute étude s'intéresse à l'évaluation de la pertinence clinique et physiologique d'un agent expérimental ou pharmaceutique. En raison de la précision dans le dosage, cette technique est également idéal pour les études in vivo qui nécessitent un haut niveau de précision dans la livraison de l'agent.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57Bl/6J	The Jackson Laboratory	Stock 000664
Compact Scale	Ohaus Scale Corporation	71142845
Small Animal Rectal Thermometer	Braintree Scientific	TH 5
Rectal Probe for Rodents	Braintree Scientific	RET 3
Ear Punch	Braintree Scientific	EP-S 901
Lipopolysaccharide from E. coli 0111:B4	InvivoGen	LPS-EB
1x Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	10010-023
Isoflurane	Baxter	40032609
Intratrachael Administration and Lung Inflation Stand	ICAP Manufacturing	n/a
Rodent Intubation Stand	Braintree Scientific	RIS 100
Scissors (blunt/sharp)	Fisher Scientific	13-806-2
forceps (straight)	Fisher Scientific	22-327-379
forceps (45º, curved)	Fisher Scientific	10-275
Scissors (blunt/blunt)	Fisher Scientific	08-940
Pipette (200 µl Capacity)	Gilson	F123601
Ethanol	Sigma	459844
1 ml Syringe	BD Medical	301025
10 ml Syringe	BD Medical	301604
27 G x 0.5 in Needle	BD Medical	305109
Refrigerated Microcentrifuge	Fisher Scientific	13-100-676
1.2 mm Tracheal Cannulae with Luer-adapter	Harvard Apparatus	732836
Hank's Balanced Salt Solution	Life Technologies	14025-076
4-0 Silk Braided Surgical Suture	Ethicon	A183
Luer to Tube Connector Kits	Harvard Apparatus	721406
Luer Stopcock Kit	Harvard Apparatus	721664
Tygon formula E-3603 Laboratory Tubing	Sigma	R-3603
Formalin Solution, neutral buffered, 10%	Sigma	HT501128-4L
Mouse IL-1β OptEIA ELISA Kit	BD Biosciences	559603
Mouse IL-6 OptEIA ELISA Kit	BD Biosciences	550950
Mouse TNF-α OptEIA ELISA Kit	BD Biosciences	560478
Hemocytometer	Hausser Scientific	3520
Hemocytometer Cover Glasses	Thermo Scientific	22-021-801
Trypan Blue	Thermo Scientific	SV3008401
Cytology Funnel Clips	Fisher Scientific	10-357
Cytology Funnels	Fisher Scientific	10-354
Filter Cards	Fisher Scientific	22-030-410
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-544-1
Cover Glasses	Fisher Scientific	12-540A
Cytospin Cytocentrifuge	Thermo Scientific	A78300003
Diff Quick Staining Kit	Fisher Scientific	47733150
Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-500