Summary
La respuesta inmune del huésped a la infección por patógenos es un proceso estrechamente regulado. Utilizando un modelo de exposición de pulmón lipopolisacárido en los ratones, es posible llevar a cabo las evaluaciones de alta resolución de los complejos mecanismos asociados con la patogénesis de la enfermedad.
Abstract
La respuesta inmune del huésped a patógenos es un proceso biológico complejo. La mayoría de los estudios in vivo empleado clásicamente para caracterizar las interacciones huésped-patógeno se aprovechan de inyecciones intraperitoneales de seleccionar las bacterias o los patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) en ratones. Si bien estas técnicas han rendido enormes de datos relacionados con patobiología enfermedad infecciosa, los modelos de inyección intraperitoneal no siempre son apropiadas para estudios de interacción huésped-patógeno en el pulmón. Utilizando un modelo de inflamación pulmonar aguda en ratones, es posible llevar a cabo un análisis de alta resolución de la respuesta inmune del huésped innata la utilización de lipopolisacárido (LPS). A continuación, describimos los métodos para administrar el uso de la administración intratraqueal LPS orofaríngea no quirúrgico, el seguimiento de parámetros clínicos asociados con la patogénesis de la enfermedad, y utilizar el líquido de lavado broncoalveolar para evaluar la respuesta inmune del huésped. Las técnicas que se describenson ampliamente aplicables para el estudio de la respuesta inmune innata de acogida a un rango diverso de PAMP y patógenos. Del mismo modo, con pequeñas modificaciones, estas técnicas pueden también ser aplicadas en los estudios que evalúan la inflamación de las vías respiratorias alérgica y en aplicaciones farmacológicas.
Introduction
Las infecciones pulmonares asociadas a especies de bacterias patógenas son una causa frecuente de morbilidad y mortalidad global. La determinación de los mecanismos que conducen a la respuesta inmune del huésped a estos patógenos, promoverá el desarrollo de estrategias de prevención novedosas y agentes terapéuticos que atenuar el impacto de estas infecciones. El objetivo general del protocolo descrito aquí es proporcionar al usuario un método flexible para evaluar la respuesta inmune innata huésped a la infección del patógeno utilizando un patrón molecular asociado patógeno (PAMP) como un sustituto de bacterias vivas. La mayoría de los estudios previos de evaluación de la respuesta inmune innata de acogida a las bacterias se han centrado en modelos peritoneales debido a la relativa facilidad de ejecución. Aunque estos modelos son muy útiles y han dado lugar a avances significativos en el campo de las interacciones huésped-patógeno y la inflamación sistémica, los datos generados a partir de estos modelos no siempre son apropiadas para estudios involving el sistema respiratorio. Aquí, un modelo pulmonar de la inflamación pulmonar aguda se propone como una expansión práctico y clínicamente relevante de los modelos de inyección clásicos intraperitoneal (ip). La técnica propuesta permite la evaluación local de la respuesta inmune innata en un sistema de modelo específico de órganos.
Los métodos descritos aquí se han diseñado para proporcionar una técnica simple y robusto para permitir a los usuarios evaluar la respuesta inmune del huésped a LPS, que es un PAMP común. Los métodos se basan en intratraqueal (IT) de la instilación de LPS, que induce una respuesta inmune innata robusto en los pulmones de los ratones y imita muchas de las características fisiopatológicas observadas en los pacientes humanos que sufren de infecciones respiratorias y la lesión pulmonar aguda 1. Una ventaja principal de esta técnica es que permite al usuario evaluar la respuesta inmune del huésped y sin los factores de confusión y problemas de seguridad asociados con la realización de estudios in vivoel uso de bacterias vivas. Del mismo modo, la vía de administración que orofaríngea de la exposición descrita en este protocolo tiene ventajas significativas sobre otras técnicas comúnmente utilizadas, incluyendo intranasal (in) administración y gestión se quirúrgico. Por ejemplo, la administración que orofaríngea permite la dosificación relativamente precisa y la deposición de pulmón en comparación con en la administración, que típicamente sufre de aumento de la variabilidad de la deposición en los pulmones debido a la pérdida de agentes en la cavidad nasal y los senos paranasales 2-4. La vía de administración, elude estas cavidades y permite el acceso directo a la tráquea y las vías respiratorias. Del mismo modo, el enfoque que se quirúrgica es un método de administración mucho más morboso y requiere una amplia formación de dominar. Los protocolos descritos aquí también incluyen una descripción de las técnicas comunes y marcadores indirectos utilizados para evaluar la progresión de la inflamación y terminar con un protocolo que describe las técnicas adecuadas para la preparación de la luones para las evaluaciones de histopatología. Estos protocolos se centran en reducir al mínimo el número de ratones requeridos para cada estudio mediante la maximización de los datos generados a partir de cada animal individual.
Los protocolos descritos son altamente flexibles y pueden ser fácilmente modificados para evaluar una diversa gama PAMPs y los daños asociados a patrones moleculares (apaga). Por otra parte, con algunas modificaciones, estos protocolos también pueden ser aplicados a los estudios que evalúan la progresión de la enfermedad de las vías respiratorias alérgicas o interacciones huésped-patógeno con bacterias vivas, virus u hongos 5-10.
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Protocol
Se realizaron todos los estudios bajo la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso (IACUC) de Virginia Tech y de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.
1. Intratraqueal (it) La inoculación de LPS mediante Administración de orofaringe
- Asegúrese de que cada animal se identifica unívocamente usando un punzón oído, marca auricular, u otro método aprobado institucionalmente.
- Anotar el peso corporal inicial y la temperatura corporal de cada animal.
- Preparar la solución de trabajo de LPS. Cada ratón recibe una dosis de 50 l de 1 mg / kg de LPS en 1x tampón fosfato salino (PBS). Animales tratados Mock recibirán una dosis de 50 l de PBS 1x.
- Preparar una cámara apropiada para la administración de isoflurano usando el método de la gota siguiente. Directrices institucionales varían con respecto al uso del isoflurano y otros agentes anestésicos y antes de la iniciatuso de todo tipo de estudios, las personas deben comunicarse con el Departamento de Atención / Bienestar Animal de su institución para asegurar que las todas las directrices que se cumplan adecuadamente. Si método de la gota isoflurano no es una opción, otros agentes anestésicos son alternativas aceptables.
- En una cabina de seguridad apropiado, aplicar aproximadamente 3 ml de isoflurano a una toalla de papel absorbente plegada y el lugar en el fondo de un vaso de precipitados de 500 ml.
- Coloque un pequeño trozo de papel de aluminio en la parte superior de la toalla de papel y cubrir el recipiente con una tapa transparente.
- Preparar las herramientas y reactivos que se utilizarán durante la inoculación ella. Coloque la banda de goma y que asegure los animales se dirigen en el stand de la intubación. Este procedimiento requiere un par de pinzas rectas, un par de pinzas en ángulo o curvados, y una pipeta P200 con puntas.
- Carga 50 l de LPS en la punta de la pipeta y colocar en un lugar fácilmente accesible junto al stand de la intubación.
- Anestesiar el ratóncolocando el animal en la cámara de isoflurano y que cubre la cámara con la tapa transparente. Observar los patrones de respiración del animal, que será rápida y superficial cuando primero colocado en la cámara. El animal será suficientemente anestesiado cuando las tasas de respiración aproximan 1 respiración / 2 seg, que normalmente se encuentra a 30 segundos de colocar en la cámara. El ratón debe ser anestesiado como se indica en el protocolo aprobado animales utilizando el método de caída de isoflurano.
- Retire el ratón anestesiado de la cámara y suspender el animal en la intubación de pie por sus incisivos delanteros. Asegúrese de que el animal está bien sujetos y de la boca y la lengua son accesibles.
- Asegurar la lengua suavemente con las pinzas rectas. Sujete la lengua con la pinza en ángulo y tire de él hacia fuera de la boca hasta que se note una ligera resistencia. Esta acción es suficiente para bloquear la epiglotis y obtener acceso a la tráquea.
- Sin soltar la lengua en elposición extendida, administrar la dosis de 50 l de LPS en la parte posterior de la garganta y cubrir inmediatamente las fosas nasales del animal con un dedo enguantado. El LPS será visible en la parte posterior de la garganta hasta que inhala el ratón.
- Continuar para cubrir las ventanas de la nariz y mantenga la lengua extendida durante 5-10 respiraciones adicionales.
- Retire el ratón desde el stand de la intubación y coloque el animal de nuevo en una nueva jaula hasta que se recupere de la anestesia.
- Monitorear marcadores indirectos asociados con la progresión de la enfermedad. El peso corporal y la temperatura corporal deben ser controlados cada 4-8 horas durante la duración del estudio. Del mismo modo, evaluar las características de comportamiento y síntomas clínicos asociados con una mayor morbilidad.
- Para evaluar la progresión de la enfermedad, los ratones de cosecha en los puntos de tiempo específicos después de la exposición LPS. Puntos de tiempo típicos para la cosecha después de la exposición LPS incluyen 0, 6, 12, 18, 24 y 48 h. Para evaluar la recuperación y la supervivencia, evaluar los ratones durante 7 days después de la inoculación.
2. El suero y lavado broncoalveolar de fluido (BALF) Colección
- Sacrificar el ratón usando un método aprobado institucionalmente.
- Colocar el animal sobre su espalda y fijarlo a un tablero de la necropsia, lo ideal es 0,5 en (1.27 cm) de altura.
- Mojar todo el ratón con etanol al 70%.
- Con una jeringa de 1 ml con una aguja de 27 G, llevar a cabo una punción cardíaca antes de hacer ninguna incisión. Debería ser posible retirar 500-800 l de sangre entera de un solo ratón.
- Retire la aguja de la jeringa y transfiera toda la sangre a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml premarcan. Para la recolección de suero, permite toda la sangre para coagular durante al menos 30 min a temperatura ambiente. En adición a la colección de suero, este procedimiento también se puede modificar mediante la incorporación de un anti-coagulante en el tubo y la jeringa, antes de recoger la sangre entera, para estudiar células inmunes circulantes.
- Haga una incisión horizontal acruzar la longitud de la cavidad peritoneal y una incisión vertical de la cavidad peritoneal a la mandíbula inferior del ratón.
- Con unas pinzas, sujete ambos lados de la incisión y tire suavemente de la piel lejos de las cavidades peritoneales y torácicas subyacentes.
- Hacer una incisión grande a lo largo de la longitud de la cavidad peritoneal de los genitales con el esternón, teniendo cuidado de evitar el corte de la membrana. Desplazar suavemente los intestinos en la cavidad peritoneal para permitir el acceso a uno de los riñones.
- Cortar la vena renal que conduce a la riñón para servir como un punto de drenaje para la perfusión.
- Nick el diafragma con unas tijeras, teniendo cuidado de evitar los pulmones y el corazón, para exponer el lado izquierdo del corazón.
- Perfundir manualmente el corazón con una jeringa de 10 ml con una aguja de 27 G y 1 x solución de PBS. Evitar la aplicación de fuerza excesiva durante la perfusión para asegurar que la solución salina no está forzada en los pulmones. La sangre restante debe escurrirse de la incisión de la vena porta.
- Corte con cuidado la caja torácica a lo largo del esternón utilizando tijeras de punta roma / roma, teniendo cuidado de no cortar el corazón y los pulmones. Cortar accidentalmente los pulmones durante este procedimiento reducirá significativamente la cantidad de BALF recogido y dará lugar a una incapacidad para inflar correctamente los pulmones con fijador.
- Aislar suavemente el corazón y los pulmones de distancia de la caja torácica con fórceps. Corte cuidadosamente cada sección de la caja torácica con unas tijeras romas / roma tan cerca de la columna vertebral como sea posible y completamente eliminar ambas secciones.
- Separe las glándulas salivales utilizando fórceps o eliminarlos con unas tijeras, para exponer la tráquea.
- Corte cuidadosamente los músculos que cubren la tráquea con una tijera. Es esencial que la tráquea no ser cortado durante este proceso.
- Con unas tijeras, separar de la clavícula que recubre la tráquea.
- Agarre suavemente el timo utilizando pinzas y levantar el tejido desde el corazón. Retire el timo utilizando tijeras, velando al mismo tiempoevitar cortar el corazón o los pulmones.
- Haga una pequeña incisión horizontal en la tráquea 1-2 anillos debajo de la laringe con tijeras en ángulo (ángulo de 45-90 º, agudo / agudo). La incisión debe ser lo suficientemente grande para asegurar firmemente la cánula.
- Inserte la cánula de manera que el extremo cónico se extiende 2-3 anillos traqueales por debajo de la incisión y asegurar la cánula en su lugar usando una sutura de seda. Asegúrese de que la sutura pasa entre la tráquea y el esófago y se tensa en la cánula.
- Llene una jeringa de 1 ml con 1 ml de solución salina tamponada de Hanks (HBSS) e insertar suavemente su luer dentro de la cánula.
- Con un movimiento lento, pero constante, inyectar ~ 900 l en la tráquea, inflar los pulmones, y el retiro inmediato del HBSS. Coloque el BALF recuperado en un tubo cónico de 15 ml.
- Repita este lavado 2 veces adicionales para recoger aproximadamente 3 ml de BALF para el análisis futuro. Guarde el BALF en hielo oa 4 º C hasta que esté listo para su uso.
- Inserte una jeringa de 10 ml en el soporte de la inflación pulmonar. Montar el tubo a la de luer, el luer a la llave de paso, y la llave de paso a la jeringa. Asegúrese de que la llave de paso está en la posición cerrada. La jeringa de 10 ml servirá como un depósito de flujo por gravedad. El depósito debe estar unido a la inflación de pie por encima de 4,75 en el animal y la parte superior del depósito debe extenderse en 10,5 por encima del animal.
- Llene la jeringa con solución de formalina tamponada neutra. Asegúrese de que la jeringa se llena completamente con el fijador.
- Coloque una toalla absorbente debajo del extremo abierto del tubo y abrir la llave de paso para permitir que el fijador para llenar el tubo. Una vez que el fijador comienza a fluir desde el tubo, cerrar inmediatamente la llave de paso y volver a llenar la jeringa hasta el tope con fijador. Es importante que la jeringa se llena por completo para proporcionar la cantidad apropiada de presión para la inflación pulmonar.
- Haga un solo nudo flojo en la sutura; Sin embargo, no tire el apretado nudo.
- Insertar el tubo de la inflación del ratón de pie dentro de la cánula.
- Abra la llave de paso y permitir que los pulmones se llenen por la inflación gravedad.
- Una vez que los pulmones llegan a su nivel máximo de inflación, tirar de la sutura apretada y ata un segundo nudo.
- Cierre la llave de paso y quite el tubo de la cánula.
- Retire con cuidado la cánula de la tráquea agarrando la sutura con un par de pinzas y la celebración de la cánula con los dedos. Jale firmemente la sutura hacia abajo, hacia la cavidad torácica y la cánula de nuevo hacia la nariz del ratón.
- Agarre suavemente la tráquea o los puntos de sutura con las pinzas y levante la tráquea fuera de la cavidad del cuello.
- Cortar el caudal tráquea a la sutura atada con unas tijeras romas.
- Una vez que el Tracheuna es libre de los tejidos subyacentes, empiezan a tirar de la tráquea de distancia del ratón. Levante suavemente los pulmones fuera de la cavidad torácica.
- Corte cuidadosamente el tejido conectivo que sostiene los pulmones en la cavidad torácica. Continuar tirando de la tráquea de distancia del cuerpo del ratón y aplicar fuerza ascendente constante, mientras que el corte de las conexiones subyacentes. Tenga cuidado de no cortar los pulmones. Tenga en cuenta que el corazón se debe dejar conectado a los pulmones utilizando este método.
- Una vez que se han eliminado de los pulmones, el lugar en 10 ml de formalina tamponada.
- Eliminar una sección de cola de ratón para el genotipado.
- Deshágase de la canal del ratón siguiendo las directrices institucionales apropiados.
4. Evaluación de citocinas
- Centrifugar la sangre total, recogido en la etapa 2.5, a 12.000 xg durante 5 min para aislar el suero. Transferir el suero a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml premarcan y almacenar a -80 ° C.
- Evaluar la Seruniveles m de citoquinas por ELISA u otro ensayo similar. Diluir el suero 1:05-1:20 en un tampón de dilución apropiado, dependiendo del ensayo, siguiendo las instrucciones del fabricante. Estas diluciones se deben determinar empíricamente antes de ejecutar la mayor parte de las muestras.
- Debido al bajo volumen de suero recogido, reducir el volumen de la muestra se carga en la placa de ELISA por medio. Por ejemplo, la mayoría de las pruebas ELISA comerciales utilizan volúmenes de 100 l de estándares y muestras. Para conservar las muestras, carga 50 l de normas y suero diluido por pocillo.
- Centrifugar el BALF en una centrífuga de mesa refrigerada a 200 xg durante 5 min. Transferir el sobrenadante libre de células en dos premarcan 1,5 ml tubos de microcentrífuga y se almacena a -80 ° C.
- Evaluar citoquinas BALF por ELISA u otro ensayo similar sin diluir.
- Tienda de suero utilizados y BALF a -80 ° C.
5. La tinción diferencial y BAL celularidad Evaluación
- Después de la centrifugación BALF y la eliminación completa de HBSS, lisar las células rojas de la sangre sedimentadas utilizando solución salina hipotónica. Resuspender las células en 900 l de agua destilada. Inmediatamente después, añadir 100 l de 10x PBS.
- Individualmente lisar cada muestra. Si las muestras contienen cantidades excesivas de las células rojas de la sangre, las células pueden ser sedimentaron en la centrífuga de mesa superior a 400 xg durante 5 min y la sangre protocolo de lisis de glóbulos rojos se puede repetir.
- Determine la celularidad total de BALF en la suspensión 1 ml utilizando un hemocitómetro bajo 10X o 20X de aumento con la tinción de azul de tripano. Evaluar y presentarán los datos como células / ml.
- Preparar los materiales para la cytospin y tinción diferencial. Etiquetar los portaobjetos de microscopio estándar utilizando un lápiz o un bolígrafo resistente a los disolventes. Asegure las diapositivas en un soporte cytospin y embudo. Fije el conjunto de diapositivas en el rotor cytospin.
- Cytospin 150 l de BALF en 100 xg durante 5 min. Si la densidad celular es demasiado grande para efectivamenteevaluar la morfología celular, reducir el volumen hilado hacia abajo sobre las diapositivas. Permitir a las diapositivas para aire durante la noche seca.
- Mancha Diferencial las diapositivas siguiendo los protocolos de confección. Permitir a las diapositivas para aire durante la noche seca. Cubreobjetos las diapositivas usando Permount y evaluar los portaobjetos usando un microscopio equipado con un objetivo de 20X y 40X.
- Recoger las células restantes para su posterior análisis, tales como FACS, microscopía electrónica, microscopía confocal, la extracción de RNA para la evaluación de la expresión génica, y / o extracción de proteína de transferencia de western.
6. Evaluación Histopatología
- Preparar los pulmones para la evaluación de histopatología. Después de 24 a 48 horas de fijación en formol, ventralmente orientar enteros los pulmones inflados e incluidos en parafina. Cortar los bloques resultantes para exponer la principal vía aérea conductora.
- Para mejorar la precisión de puntuación, la posición de los pulmones en la misma posición y recorte cada bloque para producir la visualización longitudinal máximo de tque las vías respiratorias intrapulmonares axial principal. Desde este punto, corte 5 micras secciones seriadas y se tiñen con hematoxilina y eosina (H & E). Las secciones adicionales se pueden cortar y se prepararon para la hibridación in situ utilizando protocolos estándar.
- Evaluar la histopatología usando un sistema de puntuación semicuantitativo basándose en los siguientes parámetros inflamatorios, que se puntúan entre 0 (ausentes) y 3 (grave): mononucleares y polimorfonucleares infiltración de células; vías respiratorias hiperplasia de las células epiteliales y lesiones; extravasación; perivascular y manguitos peribroncheolar; y el porcentaje del pulmón implicado con la inflamación. Histopatología de pulmón debe ser evaluada por un patólogo experimentado.
- Promedio de todas las puntuaciones de los parámetros para generar una puntuación total histopatología o utilizar las puntuaciones individuales para cuantificar aspectos específicos de la progresión de la enfermedad. Llevar a cabo todos los de puntuación de una manera doble ciego, con revisores cegados a ambos genotipo y tratamiento. Este sistema de puntuación ha sido previously describió 6,7,10.
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Representative Results
Las paredes celulares de las bacterias gram-negativas se componen de LPS, que es altamente abundante en el medio ambiente. La inhalación de LPS en las poblaciones humanas sensibles exacerba la reactividad de las vías respiratorias y es capaz de desencadenar una response11 inmune robusta. LPS es también un PAMP común utilizado en modelos de ratón para provocar una respuesta inmune innata robusta. En el protocolo descrito aquí, los ratones recibieron una dosis de LPS es aislado a partir de E. coli (serotipo 0111: B4) mediante la administración que orofaríngea. En los modelos de la exposición LPS, tanto la temperatura del cuerpo y el peso son marcadores indirectos típicos de la morbilidad de los animales y la progresión de la enfermedad. El desafío de LPS causará una disminución significativa en la temperatura del cuerpo dentro de la primera 6 horas, lo que aumentará gradualmente de nuevo a la línea de base en el transcurso de 24 h (Figura 1A). Sin embargo, el peso corporal disminuye de forma constante durante el transcurso de las 24 horas (Figura 1B), donde llegará a su máximo y poco a poco recuperar el next 48-72 horas. Por lo tanto, la temperatura del cuerpo es un marcador más apropiado para evaluar las primeras etapas de iniciación de la inflamación; mientras que, el peso corporal es más confiable durante las etapas posteriores de la patogénesis y la recuperación.
La exposición de las vías respiratorias LPS resulta en una significativa afluencia de leucocitos en los pulmones. Dentro de las primeras 6 horas, las células asociadas con la respuesta inmune innata de acogida pueden ser observados en la BALF (Figura 1C). La celularidad BALF sigue aumentando durante el próximo 24-48 h (Figura 1C), donde los picos de la respuesta inmune y, posteriormente entra en un período de resolución inflamación. Por 24 horas, un número significativo de los neutrófilos están presentes en los pulmones y se puede observar en el BALF después de la tinción diferencial (figuras 1D y 1E). Evaluaciones celularidad BALF proporcionan una técnica robusta y cuantificable para caracterizar las células asociadas con la respuesta inmune del huésped en los pulmones. El incrfacilidad en BALF celularidad es consistente con una importante afluencia de neutrófilos en las vías respiratorias, los vasos sanguíneos y en el parénquima pulmonar (Figuras 1F y 1G). Histopatología de pulmón se puede evaluar de manera efectiva el uso de un sistema de puntuación semicuantitativo (Figura 1F). Es posible marcar con precisión la histopatología en puntos de referencia específicos en los pulmones de diferentes animales cuando los pulmones se inflan con precisión para el mismo tamaño con el fijador y las secciones procesadas para revelar la visualización longitudinal máxima de la vía aérea principal axial intrapulmonar. El protocolo de la inflación basada en la gravedad, que se describe aquí, está diseñado para facilitar este sistema de puntuación. LPS induce un aumento significativo en perivascular, peribroncheolar y la inflamación del parénquima (Figura 1G).
La administración de LPS induce altos niveles de mediadores pro-inflamatorios locales y sistémicos, incluyendo varias citoquinas asociadas conla respuesta inmune innata. Niveles de citoquinas locales pueden ser evaluados en el BALF usando técnicas convencionales, tales como ELISA. Citoquinas comunes que son regulados hasta en los pulmones después de la administración de LPS incluyen TNF-α, IL-1β e IL-6 (Figura 2A). Los niveles de citoquinas sistémicas pueden ser evaluados en el suero usando las mismas técnicas que las descritas para las evaluaciones de BALF (Figura 2B). No es raro que algunos mediadores estén presentes en el microambiente local, pero ausente en el suero. Por ejemplo, el TNF-α se encuentra de forma rutinaria en altos niveles en los pulmones después de LPS, pero no se encuentra típicamente sistémicamente en las condiciones descritas en este protocolo (Figuras 2A y 2B; por debajo del nivel de detección).
Figura 1. Administración de orofaringe intratraqueal LPS aumenta la morbilidad y la inflamación de las vías respiratorias en los ratones. Ratones macho recibió 1 mg / kg de E. coli LPS (serotipo 0111: B4) y la enfermedad patogénesis se evaluó en el transcurso de 24 horas AB) LPS induce una reducción significativa en la temperatura corporal dentro de 6 horas de la administración;. mientras que la pérdida de peso corporal es más evidente en los puntos de tiempo posteriores. C) LPS induce un aumento significativo en la celularidad total de BALF. DE) Los neutrófilos son el tipo de célula dominan presente en los pulmones 24 h después de la administración de LPS, según lo revelado por tinción diferencial de las células aisladas a partir de la BALF. Estos datos están típicamente ilustrados como el porcentaje de cada tipo de célula presente en el BALF. Histopatología F) de pulmón puede ser evaluada utilizando un sistema de puntuación semicuantitativo basado en dos evaluación independientes de la inflamación que rodea las vías respiratorias intrapulmonares axial principal. G) Una cantidad significativa de manguitos perivasculares y peribroncheolar, la inflamación del parénquima suave y una ligera oclusión alveolar se observa típicamente 24 horas después de la exposición LPS pulmón. Haz clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 2. Las vías respiratorias exposición a LPS resultados en el aumento de citocinas locales y sistémicos. Una) Después de la exposición con LPS, los niveles locales de un amplio espectro de citoquinas pro-inflamatorias pueden ser observados en el BALF dentro de la primera 24 horas, incluyendo el TNF-α, IL-1β, y IL-6. Estas citocinas pueden evaluarse utilizandoELISA, como se muestra aquí 24 horas después de la exposición de LPS. B) Varias citoquinas puede también ser detectado sistémicamente en el suero. Sin embargo, hay algunas excepciones notables, incluyendo el TNF-α, que se encuentran en niveles altos en el BALF, pero no en el suero. Las citoquinas de interés en el suero deben ser evaluadas empíricamente antes de la evaluación a gran escala. Haz clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 3. La inflación de pulmón Uso de la gravedad de desplazamiento provoca una menor Histopatología Variabilidad y mejorar la visualización. El método de desplazamiento de la gravedad de la fijación se describe en este protocolo permite la óptima compar evaluación histopatología ed a los pulmones desinflados o inflado manual. AB) Pulmones fijados por la inflación gravedad demuestran características uniformes que permitan la puntuación exacta, reducen el daño alveolar, visualización mejorada, y las evaluaciones de mayor resolución de la inflamación. CD) Manual de la inflación de los pulmones por lo general da lugar a zonas no uniformes de la inflación. C) Estas zonas no uniformes son a menudo parcialmente inflados, lo que resulta en áreas colapsadas que son comúnmente confundido con características patológicas por los revisores del principiante. D) la inflación manual también resulta en áreas de los pulmones que están demasiado inflados, lo que resulta en alveolar muy dañado espacios. E) sin inflar los pulmones muestran espacios y áreas que son difíciles de resolver y evaluar sin una amplia formación alveolares colapsadas. Asimismo, debido a la órgano que se está colapsado esta técnica no permite la visualización de los pulmones, tal como aparecen en situ.e.com/files/ftp_upload/51391/51391fig3highres.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
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Discussion
Los pasos más importantes para evaluar con éxito la respuesta inmune del huésped en los pulmones del ratón es el siguiente: 1) elegir la cepa de ratón apropiado y sexo para el modelo que se está evaluando; 2) optimizar la entrega de PAMP a los pulmones; 3) recopilar y procesar correctamente la BALF; y 4) fijan correctamente y preparar los pulmones para las evaluaciones histopatológicas.
La elección de la cepa de ratón es un factor importante en la evaluación de la respuesta inmune del huésped. C57BL / 6 ratones se consideran típicamente el fondo óptima de ratón para el estudio de la inmunidad innata debido a su inclinación y robusta respuesta Th1 a la mayoría de PAMP. De la misma manera, los ratones BALB / c se utilizan normalmente para el estudio de modelos de enfermedades alérgicas debido a su sesgo Th2. Una tercera cepa comúnmente utilizado en los modelos de pulmón son de los ratones en el fondo 129SvEv, debido a su uso común en la generación de animales modificados genéticamente. En todos los casos, se debe tener cuidado durante el diseño experimental y siempre que sea posible, la edad y el sexo maanimales de control litros compañero encend da deben ser utilizados para los estudios que compararon ratones modificados genéticamente con animales de tipo salvaje. Típicamente, para el protocolo de LPS describe aquí, sexo 6-12 semanas de edad emparejados C57BL / 6 ratones deben ser utilizadas y deben pesar un mínimo de 20 g. Es posible que la exposición LPS dará lugar a altos niveles de morbilidad y mortalidad en las cepas de ratón sensibles o genotipos. Si esto ocurre, puede ser necesario ajustar varios aspectos de este protocolo, incluyendo la reducción de la dosis de LPS, la utilización de animales de mayor tamaño, y cambiar el sexo de los animales utilizados en el experimento. Experimentos a pequeña escala deben realizarse inicialmente para determinar la sensibilidad de los animales y las condiciones de cada experimento deben estar basadas en el genotipo más susceptible o condición experimental.
Administración, la orofaringe se ha encontrado para ser más preciso que otras formas de suministro de agente a los pulmones 2. Esto es en gran parte debido al acceso directo al airway y eludir los problemas asociados con la nariz y los senos paranasales deposición cavidad. Sin embargo, como con todos los procedimientos con animales, la administración requiere una amplia destreza y práctica manual para lograr habilidad. Técnica inadecuada puede dar lugar a la deposición pulmonar ineficiente y en algunos casos puede producir lesiones animal. Típicamente, colorante azul de Evans (EBD) se puede utilizar con eficacia, ya sea como herramienta de entrenamiento para este procedimiento o para solucionar posibles problemas asociados con la deposición de 4. EBD se puede administrar y posteriormente se extrajo a partir del tejido usando formamida. La cantidad de EBD se puede calcular utilizando niveles de absorción en comparación con una curva estándar. En nuestras manos, oscila recuperación típica EBD entre 90-98%. Se espera que la mayor parte de el tinte no recuperada para ser asociado con la fuga hacia el esófago. Debido a su precisión, la técnica de la administración, es ideal para la entrega de una amplia gama de agentes sensibles dosis a los pulmones, tales como agentes farmacéuticoso los organismos infecciosos.
Análisis de la celularidad BALF y BALF puede proporcionar una cantidad significativa de conocimiento de la progresión global de la respuesta inmune del huésped. Los mediadores inflamatorios liberados localmente en los pulmones después de la estimulación se pueden cuantificar de manera efectiva en el BALF usando técnicas de inmunología comunes, tales como ELISA y Western Blot. Del mismo modo, la composición celular de la BALF se puede evaluar utilizando tinción diferencial de células o citometría de flujo. El desarrollo de la técnica y la destreza manual adecuada es la parte más crítica de realizar el lavado broncoalveolar (BAL). Uno de los problemas más comunes que se producen durante la BAL es el fracaso para retirar completamente el volumen máximo de fluido originalmente colocado en los pulmones. Esto se asocia comúnmente con una cánula protegido inadecuadamente o cuando se utilizan agujas en lugar de cánulas reales. Cánulas traqueales especializados están disponibles comercialmente. También es importante que el movimiento y la fuerzase utiliza para insertar y retirar la solución salina es suave y consistente durante todo el procedimiento. El protocolo descrito aquí ha sido optimizado para la tinción diferencial de las células recogidas en el BALF. Tinción diferencial es una mancha de Wright Giemsa modificado y es una técnica altamente efectiva para llevar a cabo la morfología basado identificación de célula. Esta técnica de tinción permite la diferenciación de neutrófilos y eosinófilos en base a sus propiedades únicas de tinción gránulo. Células derivadas de monocitos también son fáciles de identificar y se observan comúnmente en el BALF. Estos incluyen los macrófagos y las células dendríticas. Del mismo modo, las células T y las células B también son comúnmente observados. Sin embargo, estas células monocíticas y los linfocitos son a menudo difícil para la mayoría de los investigadores para diferenciar con precisión sobre la base de la morfología solo. La utilización de la citometría de flujo puede añadir mucho más alta resolución de estas evaluaciones. Sin embargo, el número de células bajos recuperados de animales de control es a menudo un factor limitante. Por lo tanto, si citometría de flujoetría se va a utilizar, el diseño experimental debe incluir en los controles negativos adicionales para incrementar la recuperación de células.
Evaluaciones de histopatología de pulmón son otro componente crítico de este protocolo y permiten la visualización directa de la progresión de la enfermedad (Figuras 3A y 3B). Cuando los pulmones están preparados adecuadamente, histopatología se puede evaluar con precisión, cuantifica y caracteriza. El paso más importante en la preparación de los pulmones para histopatología ellos se infla correctamente con fijador. Los métodos manuales de inflación resultan típicamente en los pulmones que son demasiado inflado,-bajo inflado o parcialmente inflado, lo que resulta en la visualización subóptima y las evaluaciones de la morfología (Figuras 3C y 3D, respectivamente). Del mismo modo, los pulmones que no están inflados antes de la fijación son muy difíciles de evaluar con precisión y a menudo resulta en las puntuaciones de la histopatología muy variables (Figura 3 E). El método de la gravedad de la inflación discutido aquí proporciona un método altamente reproducible de la inflación con una variabilidad mínima. Usando esta técnica, es posible evaluar puntos de referencia específicos en los pulmones que son consistentes entre animales de experimentación. Además, la inflación gravedad utilización de una base de inflación se ha demostrado para inflar los pulmones a una presión de fijación de 20 mm 12. Esta técnica permite la visualización de los pulmones en su más fisiológicamente relevantes tamaño y forma y ha demostrado ser muy eficaz para la evaluación de los procesos fisiopatológicos sensibles 12. Es muy importante que el stand de la inflación puede ajustar a la altura adecuada del ratón para generar la presión adecuada. Si se observa la inflación subóptima, la altura del soporte de la inflación se debe determinar empíricamente. , Se recomienda el uso de una pequeña disponible en el mercado de pulmón roedor stand de la inflación, lo que asegurará la altura adecuada.
t "> Este procedimiento ha sido optimizado para la entrega de LPS y otros PAMPs a los pulmones de los ratones. Una vez que estas técnicas se dominan, los estudios adicionales también se pueden iniciar mediante protocolos modificados para evaluar eficazmente la interacción huésped-patógeno utilizando patógenos vivos. Del mismo modo, las técnicas descritas aquí son muy versátiles y se pueden aplicar a cualquier estudio interesados en la evaluación de la relevancia clínica y fisiológica de un agente experimental o farmacéutica. Debido a la precisión en la dosificación, esta técnica también es ideal para estudios in vivo que requieren un alto nivel de precisión en el suministro de agente.Este procedimiento ha sido optimizado para la entrega de LPS y otros PAMP a los pulmones de los ratones. Una vez que estas técnicas se dominan, los estudios adicionales también se pueden iniciar mediante protocolos modificados para evaluar eficazmente las interacciones huésped-patógeno usando patógenos vivos. Del mismo modo, las técnicas descritas aquí son muy versátiles y pueden be aplicar a cualquier estudio interesados en evaluar la relevancia clínica y fisiológica de un agente experimental o farmacéutico. Debido a la precisión en la dosificación, esta técnica también es ideal para estudios in vivo que requieren un alto nivel de precisión en el suministro de agente.
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Disclosures
Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Los autores agradecen a la Universidad Regional del VA-MD de la medicina veterinaria para proporcionar núcleo y soporte técnico para este proyecto. Este trabajo es apoyado por un premio de Desarrollo Profesional de los NIH (K01DK092355).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57Bl/6J | The Jackson Laboratory | Stock 000664 | |
| Compact Scale | Ohaus Scale Corporation | 71142845 | |
| Small Animal Rectal Thermometer | Braintree Scientific | TH 5 | |
| Rectal Probe for Rodents | Braintree Scientific | RET 3 | |
| Ear Punch | Braintree Scientific | EP-S 901 | |
| Lipopolysaccharide from E. coli 0111:B4 | InvivoGen | LPS-EB | |
| 1x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-023 | |
| Isoflurane | Baxter | 40032609 | |
| Intratrachael Administration and Lung Inflation Stand | ICAP Manufacturing | n/a | |
| Rodent Intubation Stand | Braintree Scientific | RIS 100 | |
| Scissors (blunt/sharp) | Fisher Scientific | 13-806-2 | |
| forceps (straight) | Fisher Scientific | 22-327-379 | |
| forceps (45º, curved) | Fisher Scientific | 10-275 | |
| Scissors (blunt/blunt) | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Pipette (200 µl Capacity) | Gilson | F123601 | |
| Ethanol | Sigma | 459844 | |
| 1 ml Syringe | BD Medical | 301025 | |
| 10 ml Syringe | BD Medical | 301604 | |
| 27 G x 0.5 in Needle | BD Medical | 305109 | |
| Refrigerated Microcentrifuge | Fisher Scientific | 13-100-676 | |
| 1.2 mm Tracheal Cannulae with Luer-adapter | Harvard Apparatus | 732836 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-076 | |
| 4-0 Silk Braided Surgical Suture | Ethicon | A183 | |
| Luer to Tube Connector Kits | Harvard Apparatus | 721406 | |
| Luer Stopcock Kit | Harvard Apparatus | 721664 | |
| Tygon formula E-3603 Laboratory Tubing | Sigma | R-3603 | |
| Formalin Solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128-4L | |
| Mouse IL-1β OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 559603 | |
| Mouse IL-6 OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 550950 | |
| Mouse TNF-α OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 560478 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3520 | |
| Hemocytometer Cover Glasses | Thermo Scientific | 22-021-801 | |
| Trypan Blue | Thermo Scientific | SV3008401 | |
| Cytology Funnel Clips | Fisher Scientific | 10-357 | |
| Cytology Funnels | Fisher Scientific | 10-354 | |
| Filter Cards | Fisher Scientific | 22-030-410 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| Cover Glasses | Fisher Scientific | 12-540A | |
| Cytospin Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | |
| Diff Quick Staining Kit | Fisher Scientific | 47733150 | |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 |
References
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