Summary

Het gebruik van Oropharyngeal Intratracheaal PAMP Administratie en bronchoalveolaire lavage om de immuunrespons van de gastheer in Muizen Evalueer

Published: April 02, 2014
doi:

Summary

De gastheer immuunrespons op pathogene infectie een strak gereguleerd proces. Met behulp van een lipopolysaccharide long exposure model in muizen, is het mogelijk om hoge resolutie evaluaties van de complexe mechanismen van pathogenese voeren.

Abstract

De immuunrespons tegen pathogenen is een complex biologisch proces. De meerderheid van de in vivo studies klassiek gebruikt om karakteriseren gastheer-pathogeen interacties profiteer van intraperitoneale injecties van geselecteerde bacteriën of pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs) bij muizen. Hoewel deze technieken enorm gegevens in verband met besmettelijke ziekte pathobiology hebben opgeleverd, intraperitoneale injectie modellen zijn niet altijd geschikt voor de gastheer-pathogeen interactie studies in de long. Gebruik makend van een acute longontsteking model bij muizen, is het mogelijk om een ​​hoge resolutie analyse van de gastheer aangeboren immuunrespons gebruik lipopolysaccharide (LPS) te voeren. Hier beschrijven we de methoden LPS beheren via chirurgische orofaryngeale intratracheale toediening bewaken klinische parameters geassocieerd met de ziekte pathogenese en gebruiken bronchoalveolaire lavage vloeistof naar de gastheer immuunreactie te evalueren. De technieken die worden beschrevenzijn breed toepasbaar voor de studie van de gastheer aangeboren immuunrespons op een breed scala van PAMPs en ziekteverwekkers. Ook met kleine modificaties, deze technieken kunnen ook worden toegepast in studies die allergische luchtwegontsteking en farmacologische toepassingen.

Introduction

Longinfecties geassocieerd met pathogene bacteriesoorten zijn een veelvoorkomende oorzaak van de opwarming van morbiditeit en mortaliteit. Het bepalen van de mechanismen die de gastheer immuunrespons op deze pathogenen rijden zal de ontwikkeling van nieuwe preventiestrategieën en therapeutische middelen die het effect van deze infecties verminderen bevorderen. Het algemene doel van het hier beschreven protocol is om de gebruiker te voorzien van een flexibele methode voor de gastheer aangeboren immuunrespons op pathogene infectie te evalueren middels een pathogeen geassocieerde moleculaire patroon (PAMP) als een surrogaat voor levende bacteriën. De meeste eerdere studies die de gastheer aangeboren immuunrespons op bacteriën gericht op peritoneale modellen door het relatieve gemak van uitvoering. Hoewel deze modellen zijn zeer nuttig en hebben geleid tot aanzienlijke vooruitgang op het gebied van gastheer-pathogeen interacties en systemische ontsteking, de uit deze modellen gegenereerd gegevens niet altijd geschikt voor studies involving de luchtwegen. Hier wordt een model van acute pulmonale longontsteking voorgesteld als een praktisch en klinisch relevante uitbreiding van de klassieke intraperitoneale (ip) injectie modellen. Deze techniek maakt lokale beoordeling van de aangeboren immuunrespons in een orgaanspecifieke modelsysteem.

De hier beschreven methoden zijn ontworpen om een ​​eenvoudige en robuuste techniek zodat gebruikers de gastheer immuunrespons op LPS, wat een gemeenschappelijk PAMP evalueren. De methoden zijn gebaseerd op intratracheale (it) indruppelen van LPS, die een robuuste aangeboren immuunrespons in de longen van muizen en bootst vele pathofysiologische functies waargenomen bij menselijke patiënten die lijden aan respiratoire infecties en acute longschade 1 induceert. Een primair voordeel van deze techniek is dat het de gebruiker de immuunrespons te evalueren zonder verstorende factoren en veiligheidszorgen verbonden aan het in vivo studiesmet behulp van levende bacteriën. Ook de orofaryngeale het beheer blootstellingsroute beschreven in dit protocol heeft belangrijke voordelen ten opzichte van andere vaak gebruikte technieken, waaronder intranasale (in) administratie en chirurgische het bestuur. Bijvoorbeeld, het orofaryngeale toediening kan relatief nauwkeurig doseren en longafzetting ten opzichte van toediening die typisch lijdt aan verhoogde variabiliteit van longdepositie door het verlies van agenten in de neusholte en sinussen 2-4. Het is toedieningsweg omzeilt deze holten en biedt direct toegang tot de luchtpijp en de luchtwegen. Ook de chirurgische aanpak is het een significant meer morbide administratie methode en vereist uitgebreide training te beheersen. De hier beschreven protocollen tevens een beschrijving van de gebruikte technieken en surrogaat markers gebruikt om ontstekingen progressie te evalueren en eindigen met een protocol waarin de juiste technieken voor het bereiden van de lungs voor histopathologie assessments. Deze protocollen zijn gericht op het minimaliseren van het aantal muizen voor elke studie door maximaal gegenereerd uit elke afzonderlijke diergegevens.

De beschreven protocollen zijn zeer flexibel en kan gemakkelijk worden aangepast aan een breed scala PAMPs en schade geassocieerde moleculaire patronen (gedempt) te evalueren. Bovendien met een paar extra aanpassingen deze protocollen kunnen ook worden toegepast op studies die allergische luchtwegen ziekteprogressie of gastheer-pathogeen interacties met levende bacteriën, virussen of schimmels 5-10.

Protocol

Alle studies werden uitgevoerd in het kader van de goedkeuring van de Institutionele Zorg en gebruik Comite (IACUC) voor Virginia Tech en in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide voor de zorg en het gebruik van proefdieren. 1. Intratracheale (it) Enten van LPS behulp Oropharyngeal Administration Zorg ervoor dat elk dier uniek wordt geïdentificeerd met behulp van een oor punch, oormerk, of andere institutioneel goedgekeurde methode. Noteer de b…

Representative Results

De celwanden van gramnegatieve bacteriën bestaan ​​uit LPS, die zeer overvloedig in het milieu. Inademen van LPS in gevoelige menselijke populaties verergert luchtweg reactiviteit en is in staat van triggering een robuust immuun response11. LPS is ook een gemeenschappelijke PAMP in muismodellen om een ​​robuuste aangeboren immuunrespons opwekken. In de hier beschreven het protocol, ontving de muizen een dosis van het LPS geïsoleerd van E. coli (serotype 0111: B4) met behulp van orofaryngeale het bestu…

Discussion

De meest kritische stappen voor succesvolle evaluatie van de immuunrespons in muizenlongen is als volgt: 1) Kies de juiste muizenstam en geslacht van het model geëvalueerd; 2) optimaliseren PAMP levering aan de longen; 3) correct verzamelen en verwerken de BALF; en 4) goed vast te stellen en voor te bereiden van de longen voor histopathologisch assessments.

De keuze van de muis stam is een belangrijke factor bij de evaluatie van de immuunrespons. C57Bl / 6 muizen worden doorgaans beschouwd …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs danken de VA-MD Regional College of Veterinary medicine voor het verstrekken van de kern en technische ondersteuning voor dit project. Dit werk wordt ondersteund door een NIH Career Development Award (K01DK092355).

Materials

C57Bl/6J The Jackson Laboratory Stock 000664
Compact Scale Ohaus Scale Corporation 71142845
Small Animal Rectal Thermometer Braintree Scientific TH 5
Rectal Probe for Rodents Braintree Scientific RET 3
Ear Punch Braintree Scientific EP-S 901
Lipopolysaccharide from E. coli 0111:B4 InvivoGen LPS-EB
1x Phosphate Buffered Saline Life Technologies 10010-023
Isoflurane Baxter 40032609
Intratrachael Administration and Lung Inflation Stand ICAP Manufacturing n/a
Rodent Intubation Stand Braintree Scientific RIS 100
Scissors (blunt/sharp) Fisher Scientific 13-806-2
forceps (straight) Fisher Scientific 22-327-379
forceps (45º, curved) Fisher Scientific 10-275
Scissors (blunt/blunt) Fisher Scientific 08-940
Pipette (200 µl Capacity) Gilson F123601
Ethanol Sigma 459844
 1 ml Syringe BD Medical 301025
10 ml Syringe BD Medical 301604
27 G x 0.5 in. needle BD Medical 305109
Refrigerated Microcentrifuge Fisher Scientific 13-100-676
1.2 mm Tracheal Cannulae with Luer-adapter Harvard Apparatus 732836
Hank's Balanced Salt Solution Life Technologies 14025-076
4-0 Silk Braided Surgical Suture Ethicon A183
Luer to Tube Connector Kits Harvard Apparatus 721406
Luer Stopcock Kit Harvard Apparatus 721664
Tygon formula E-3603 laboratory tubing Sigma R-3603
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma HT501128-4L
Mouse IL-1β OptEIA ELISA Kit BD Biosciences 559603
Mouse IL-6 OptEIA ELISA Kit BD Biosciences 550950
Mouse TNF-α OptEIA ELISA Kit BD Biosciences 560478
Hemacytometer Hausser Scientific 3520
Hemacytometer Cover Glasses Thermo Scientific 22-021-801 
Trypan Blue Thermo Scientific SV3008401
Cytology Funel Clips Fisher Scientific 10-357
Cytology Funels Fisher Scientific 10-354
Filter Cards Fisher Scientific 22-030-410
Microscope Slides Fisher Scientific 12-544-1
Cover Glasses Fisher Scientific 12-540A
Cytospin Cytocentrifuge Thermo Scientific A78300003 
Diff Quick Staining Kit Fisher Scientific 47733150
Permount Mounting Medium Fisher Scientific SP15-500

References

  1. Matute-Bello, G., et al. An official American Thoracic Society workshop report: features and measurements of experimental acute lung injury in animals. Am. J. respir. Cell Mol. Biol. 44, 725-738 (2011).
  2. Egger, C., et al. Administration of bleomycin via the oropharyngeal aspiration route leads to sustained lung fibrosis in mice and rats as quantified by UTE-MRI and histology. PloS one. 8, (2013).
  3. Rayamajhi, M., et al. Nonsurgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. J. Vis. Exp. , (2011).
  4. Revelli, D. A., Boylan, J. A., Gherardini, F. C. A non-invasive intratracheal inoculation method for the study of pulmonary melioidosis. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2, 164 (2012).
  5. Allen, I. C., et al. Analysis of NLRP3 in the development of allergic airway disease in mice. J. Immunol. 188, 2884-2893 (2012).
  6. Allen, I. C., et al. Characterization of NLRP12 during the in vivo host immune response to Klebsiella pneumoniae and Mycobacterium tuberculosis. PloS one. , (2013).
  7. Allen, I. C., et al. Expression and function of NPSR1/GPRA in the lung before and after induction of asthma-like disease. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 291, 1005-1017 (2006).
  8. Kebaier, C., et al. Staphylococcus aureus alpha-hemolysin mediates virulence in a murine model of severe pneumonia through activation of the NLRP3 inflammasome. J. Infect. Dis. 205, 807-817 (2012).
  9. Roberts, R. A., et al. Analysis of the murine immune response to pulmonary delivery of precisely fabricated nano- and microscale particles. PloS one. 8, (2013).
  10. Willingham, S. B., et al. NLRP3 (NALP3, Cryopyrin) facilitates in vivo caspase-1 activation, necrosis, and HMGB1 release via inflammasome-dependent and -independent pathways. J. Immunol. 183, 2008-2015 (2009).
  11. Kline, J. N., et al. Variable airway responsiveness to inhaled lipopolysaccharide. Am. J. Respir. Crit. Med. 160, 297-303 (1999).
  12. Cressman, V. L., Hicks, E. M., Funkhouser, W. K., Backlund, D. C., Koller, B. H. The relationship of chronic mucin secretion to airway disease in normal and CFTR-deficient mice. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 19, 853-866 (1998).

Play Video

Cite This Article
Allen, I. C. The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice. J. Vis. Exp. (86), e51391, doi:10.3791/51391 (2014).

View Video