Summary
התגובה החיסונית המארחת לזיהום הפתוגן היא תהליך מוסדר היטב. ניצול מודל חשיפת ריאות lipopolysaccharide בעכברים, ניתן לבצע הערכות ברזולוציה גבוהה של המנגנונים המורכבים הקשורים להיווצרות מחלה.
Abstract
התגובה החיסונית המארח לפתוגנים היא תהליך ביולוגי מורכב. רוב במחקרי vivo מועסק קלסי לאפיין אינטראקציות בין המאכסן לפתוגן לנצל את זריקות intraperitoneal של חיידקים בחרו או דפוסי הפתוגן הקשורים מולקולריים (PAMPs) בעכברים. בעוד טכניקות אלה הניבו נתונים עצומים הקשורים pathobiology מחלות זיהומיות, מודלים זריקת intraperitoneal הם לא תמיד מתאימים ללימודי אינטראקציה המאכסן לפתוגן בריאות. ניצול מודל דלקת ריאות חריף בעכברים, ניתן לבצע ניתוח ברזולוציה גבוה של מארח תגובה חיסונית מולדת ניצול lipopolysaccharide (LPS). כאן, אנו מתארים את השיטות לניהול LPS באמצעות ממשל intratracheal הלוע התחתון לא נזקק לניתוח, לעקוב אחר פרמטרים קליניים הקשורים להיווצרות מחלה, ולנצל את נוזל שטיפת רונכואלוואולרית כדי להעריך את התגובה החיסונית המארחת. הטכניקות המתוארותחלים נרחב ללימוד התגובה החיסונית המולדת המארח למגוון רחב של PAMPs ופתוגנים. כמו כן, עם שינויים קלים, יכולות להיות מיושמות גם בטכניקות אלה במחקרים להערכת דלקת בדרכי הנשימה ואלרגיות ביישומים תרופתיים.
Introduction
דלקות ריאה הקשורים למיני חיידקים פתוגניים הם גורמים שכיחים לתחלואה ותמותה בעולם. קביעת המנגנונים המניעים את התגובה החיסונית המארחת לפתוגנים אלה יהיו לקדם את הפיתוח של אסטרטגיות חדשניות למניעה וסוכנים טיפוליים שיהיה להחליש את ההשפעה של זיהומים אלה. המטרה הכללית של הפרוטוקול המתואר כאן היא לספק את המשתמש עם שיטה גמישה כדי להעריך את התגובה החיסונית המולדת המארח לזיהום הפתוגן באמצעות דפוס הפתוגן הקשורים מולקולרי (PAMP) כתחליף לחיידקים חיים. רוב המחקרים הקודמים להערכת התגובה החיסונית המולדת לחיידקי המארח התמקדו בדגמי הצפק בשל הקלות היחסית של ביצוע. בעוד מודלים אלה הם שימושיים מאוד והביאו להתקדמות משמעותית בתחום של אינטראקציות בין המאכסן לפתוגן ודלקת מערכתית, הנתונים המופקים ממודלים אלה לא תמיד מתאימים ללימודים involving מערכת הנשימה. הנה, מודל ריאות של דלקת ריאות חריפה מוצע כהרחבה מעשית ורלוונטית קליני של המודלים הזרקה (IP) intraperitoneal הקלאסיים. הטכניקה המוצעת מאפשרת להערכה המקומית של תגובת החיסון המולדת במערכת מודל ספציפית איברים.
השיטות שתוארו כאן נועדו לספק טכניקה פשוטה וחזקה כדי לאפשר למשתמשים להעריך את התגובה החיסונית המארחת לLPS, שהוא PAMP משותף. השיטות מבוססות על intratracheal החדרה (את זה) של LPS, אשר גורם לתגובה חיסונית מולדת חזקה לריאות של עכברים ומחקה רבים מהתכונות pathophysiological נצפו בחולים אנושיים הסובלים מזיהומים בדרכי הנשימה ופציעת ריאות חריפות 1. יתרון עיקרי של שיטה זו הוא שהיא מאפשרת למשתמש להעריך את התגובה החיסונית המארחת בלי גורמי בלבול וחששות בטיחות הקשורים לביצוע במחקרי vivoשימוש בחיידקים חיים. כמו כן, יש מסלול ממשלו הלוע התחתון של חשיפה שתוארה בפרוטוקול זה יתרונות משמעותיים על פני טכניקות אחרות מנוצלים בדרך כלל, כוללים אפי (ב) ממשל ומנהלו כירורגית. לדוגמא, ממשלו הלוע התחתון מאפשר dosaging מדויק יחסית ותצהיר ריאות בהשוואה בממשל, אשר בדרך כלל סובל מהשתנות מוגברת של תצהיר ריאות עקב האובדן של סוכנים בחלל האף והסינוסים 2-4. מסלול הממשל עוקף חללים אלו ומאפשר גישה ישירה לקנה הנשימה ודרכי הנשימה. כמו כן, גישתה כירורגית היא שיטת ממשל באופן משמעותי יותר חולנית ודורשת הכשרה מקיפה להורים. הפרוטוקולים המתוארים כאן כוללים גם תיאור טכניקות הנפוצות וסמנים פונדקאיות המשמשים להערכת התקדמות דלקת ומסתיים בפרוטוקול המתאר את הטכניקות המתאימות להכנת luNGS להערכות histopathology. פרוטוקולים אלה התמקדו במזעור מספר העכברים הנדרשים לכל מחקר על ידי למקסם את הנתונים המופקים מבעלי חיים הבודדים.
הפרוטוקולים שתוארו הם גמישים ביותר וניתן לשנות בקלות להעריך PAMPs מגוון רחב ודפוסי נזקים הקשורים מולקולריים (damps). יתר על כן, עם כמה שינויים נוספים, יכולים להיות מיושמים גם בפרוטוקולים אלה למחקרים להערכת התקדמות מחלה בדרכי הנשימה אלרגיות או אינטראקציות בין המאכסן לפתוגן עם חיידקים חיים, וירוסים או פטריות 5-10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל המחקרים נערכו באישור הוועדה המוסדי לטיפול ושימוש (IACUC) לוירג'יניה טק ובהתאם למכונים הלאומיים לבריאות מדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה.
1. חיסון Intratracheal (את זה) של LPS באמצעות מנהל מלוע תחתון
- ודא שכל חיה היא ייחודי מזוהות או באמצעות אגרוף באוזן, תג אוזן, או שיטה אחרת שאושרה מוסדי.
- רשום את משקל הגוף הבסיסי ואת טמפרטורת גוף לכל חיה.
- הכן את מניית העבודה של LPS. כל עכבר יקבל מינון 50 μl של 1 מ"ג / קילוגרם LPS בפוספט 1x סליין (PBS). בעלי חיים שטופלו מוק יקבלו מינון 50 μl של 1x PBS.
- הכן את החדר מתאים לניהול isoflurane בשיטת הטיפה הבאה. הנחיות מוסדיות להשתנות בנוגע לשימוש בisoflurane וחומרי הרדמה אחרים ולפני initiating כל מחקרים, אנשים צריכים ליצור קשר עם המחלקה של המוסד שלהם של טיפול בבעלי חיים / רווחה על מנת להבטיח את כל ההנחיות הם נפגשו כראוי. אם isoflurane שיטת הטיפה הוא לא אופציה, חומרי הרדמה אחרים הם חלופות מקובלות.
- בארון בטיחות מתאים, להחיל כ 3 מיליליטר של isoflurane למגבת מקופל סופגת נייר ומניחים בתחתית כוס 500 מיליליטר.
- מניחים חתיכה קטנה של נייר אלומיניום על גבי מגבת נייר ולכסות את הכוס עם מכסה שקוף.
- הכן את הכלים וחומרים כימיים שישמשו בחיסון זה. מקם את הגומייה שתבטיח את החיות על ראש דוכן אינטובציה. הליך זה ידרוש זוג מלקחיים ישרים, זוג מלקחיים זווית או עקומים, ופיפטה p200 עם טיפים.
- טען 50 μl של LPS לקצה פיפטה והמקום במיקום נגיש בקלות לצד דוכן אינטובציה.
- להרדים את העכברעל ידי הנחת את החיה לתוך תא isoflurane ומכסה תא עם המכסה השקוף. שים לב לדפוסי הנשימה של בעל החיים, אשר יהיו מהיר ושטחי, כאשר במקום הראשון בחדר. בעלי החיים יהיו בהרדמה מספיק כאשר שיעורי נשימה להתקרב שניות 1 נשימה / 2, אשר בדרך כלל מגיעה בתוך 30 שניות של הנחת בתא. העכבר צריך להיות מורדם כאמור בפרוטוקול שאושר על בעלי החיים באמצעות isoflurane שיטת טיפה.
- הסר את העכבר הרדים מהאולם ולהשעות את החיה על אינטובציה לעמוד על ידי השיניים החותכות הקדמיות שלה. להבטיח כי בעל החיים הוא מאופק באופן מאובטח והפה והלשון נגישים.
- בעדינות לאבטח את הלשון עם המלקחיים הישרים. לתפוס את הלשון עם המלקחיים זווית ובעדינות לשלוף אותו מהפה ועד התנגדות קלה מורגשת. פעולה זו די בכך כדי לחסום את מכסה הקנה ולהשיג גישה לקנה הנשימה.
- תוך כדי להחזיק את הלשון בעמדה מורחבת, לנהל את מינון 50 μl של LPS לחלק האחורי של הגרון ולכסות מייד נחיריו של בעל החיים באצבע בכפפות. LPS יהיה גלוי בחלק האחורי של הגרון ועד לעכבר שואף.
- תמשיך לכסות את הנחיריים והחזק את הלשון הוארכה 5-10 נשימות נוספות.
- הסר את העכבר מדוכן אינטובציה ולמקם את בעלי החיים בחזרה לכלוב חדש עד שהוא מתאושש מההרדמה.
- לפקח סמנים פונדקאיות קשורים עם התקדמות מחלה. משקל גוף וטמפרטורת גוף צריך להיות במעקב כל שעות 4-8 לתקופת המחקר. כמו כן, להעריך את המאפיינים התנהגותיים ותסמינים קליניים הקשורים לתחלואה מוגברת.
- כדי להעריך את התקדמות מחלה, עכברי קציר בזמן נקודות ספציפיות בעקבות חשיפת LPS. זמן נקודות אופייניות לקציר בעקבות חשיפת LPS כוללות 0, 6, 12, 18, 24, ו48 שעות. כדי להעריך את ההחלמה והישרדות, להעריך את העכברים ל7 דהי"ש שלאחר חיסון.
2. אוסף נוזל סרום ושטיפה ברונכואלוואולרית (בלף)
- להקריב את העכבר באמצעות שיטה שאושרה מוסדי.
- מניחים את החיה על הגב שלו ולאבטח אותו ללוח נתיחה לאחר מוות, באופן אידיאלי 0.5 ב( 1.27 סנטימטר) בגובה.
- להרטיב את כל העכבר עם 70% אתנול.
- באמצעות מזרק 1 מיליליטר עם מחט 27 G, לנהל לנקב לב לפני ביצוע חתכים. זה צריך להיות אפשרי לסגת 500-800 μl של דם מלא מעכבר אחת.
- הסר את המחט מהמזרק ולהעביר את כל הדם לצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר prelabeled. לאוסף סרום, לאפשר את כל הדם כדי להקריש לפחות 30 דקות בטמפרטורת חדר. בנוסף לאוסף בסרום, הליך זה יכול גם להיות שונה על ידי שילוב נוגד קרישה בצינור והמזרק, לפני איסוף הדם כולו, ללמוד במחזור תאים חיסוניים.
- הפוך חתך אופקיחוצה את אורכו של חלל הצפק וחתך אנכי מחלל הצפק ללסת התחתונה של העכבר.
- בעזרת מלקחיים, לתפוס את שני צידי החתך ומשוך בעדינות את העור מחללי הצפק וחזה הבסיסיים.
- לעשות חתך גדול לאורכו של חלל הצפק מאיבר המין לעצם החזה, לטפל כדי למנוע חיתוך הסרעפת. בעדינות להעביר את המעיים בחלל הצפק כדי לאפשר גישה לאחת מהכליות.
- חותכים את וריד הכליה מוביל לכליה כדי לשמש כנקודת ניקוז לזלוף.
- ניק הסרעפת באמצעות מספריים, לטפל כדי למנוע את הריאות ולב, על מנת לחשוף את הצד השמאלי של הלב.
- ידני ינקב הלב באמצעות מזרק 10 מיליליטר עם מחט 27 G ופתרון 1x PBS. הימנע מהפעלת כוח מופרז במהלך זלוף, כדי להבטיח כי מי מלח לא בכפייה לתוך הריאות. הדם שנותר צריך לנקז מן חתך וריד שער.
- לחתוך בזהירות את בית החזה לאורך עצם החזה באמצעות מספריים קהים / קהים, לטפל כדי למנוע חיתוך הלב וריאות. טעות חיתוך הריאות במהלך הליך זה יהיה להפחית באופן משמעותי את כמות בלף נאספה ויגרום לחוסר יכולת לנפח כראוי הריאות עם מקבע.
- בעדינות לבודד את הלב וריאות מבית החזה באמצעות מלקחיים. לחתוך בזהירות כל חלק של בית החזה באמצעות מספריים קהים / קהים קרובים לשדרה ככל האפשר ובאופן מלא להסיר את שני החלקים.
- הפרד את בלוטות הרוק באמצעות מלקחיים או להסיר אותם באמצעות מספריים, כדי לחשוף את קנה הנשימה.
- לחתוך בזהירות את השרירים שכיסוי קנה הנשימה באמצעות מספריים. זה חיוני כי קנה הנשימה לא תקוצץ במהלך תהליך זה.
- בעזרת מספריים, להפריד את עצם הבריח שמעל קנה הנשימה.
- בעדינות לתפוס את התימוס באמצעות מלקחיים ולהרים את הרקמה מן הלב. הסר את התימוס באמצעות מספריים, תוך הקפדה על להימנע מחיתוך הלב או ריאות.
- לעשות חתך אופקי קטן בקנה הנשימה 1-2 טבעות מתחת לגרון באמצעות מספריים בזווית (זווית 45-90 º, חד / חדה). החתך צריך להיות גדול מספיק כדי לאבטח את הצינורית בתוקף.
- הכנס את הצינורית כך שהקצה מחודד מרחיב 2-3 טבעות קנה הנשימה מתחת לחתך ולאבטח את הצינורית במקום באמצעות תפר משי. ודא שהתפר עובר בין קנה הנשימה והוושט, והוא משך בחוזקה בצינורית.
- ממלאי מזרק 1 מיליליטר עם 1 מיליליטר של הנקס שנאגרו מלוח פתרון (HBSS) ועדינות להכניס luer לתוך הצינורית.
- שימוש בהילוך איטי, אבל קבוע, להזריק ~ 900 μl לתוך קנה הנשימה, מנפח את הריאות, ולסגת באופן מיידי HBSS. הנח את בלף התאושש בצינור חרוטי 15 מיליליטר.
- חזור על שטיפה זה 2 פעמים נוספות כדי לאסוף כ 3 מיליליטר של בלף לניתוח בעתיד. אחסן את בלף על קרח או על 4 מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש.
ass = "jove_title"> 3. Histopathology הכנה
- הכנס מזרק 10 מיליליטר לעמדת האינפלציה הריאות. הרכב את הצינור לluer, luer לברזלים, והברזלים למזרק. להבטיח את ברזלים הוא במצב הסגור. מזרק 10 מיליליטר ישמש כזרימה הכבידה מאגר. המאגר צריך להיות מחובר לאינפלציה יעמוד ב4.75 מעל החיה וחלקו העליון של המאגר צריך להרחיב 10.5 במעל לבעלי החיים.
- מלא את המזרק עם פתרון ניטראלי שנאגרו פורמלין. ודא שהמזרק מלא לחלוטין עם המקבע.
- הנח מגבת סופגת מתחת לקצה הפתוח של הצינור ולפתוח את השסתום כדי לאפשר מקבע כדי למלא את צינורות. ברגע שמקבע מתחיל לזרום מהצינור, סגור מייד את השסתום ולמלא את המזרק לחלק העליון עם מקבע. חשוב שהמזרק יתמלא לחלוטין כדי לספק את הכמות המתאימה של לחץ לאינפלציה ריאות.
- לקשור קשר רופף יחיד בתפר; עם זאת, אל תמשכו חזק קשר.
- הכנס את צינורות מאינפלצית העכבר לעמוד לצינורית.
- פתח את השסתום ולאפשר לריאות כדי למלא על ידי אינפלציה הכבידה.
- ברגע שהריאות מגיעות לרמת האינפלציה המרבית שלהם, למשוך את התפר הדוק ולקשור קשר שני.
- סגור את ברזלים ולהסיר את הצינור מהצינורית.
- להסיר בעדינות את הצינורית מקנה הנשימה על ידי אחיזה בתפר עם זוג המלקחיים ומחזיק את הצינורית עם אצבעות. בתקיפות למשוך את התפר כלפי מטה לכיוון חלל בית החזה ואת הצינורית חזרה לכיוון אפו של העכבר.
- בעדינות לתפוס את קנה הנשימה או תפרים עם מלקחיים ולהרים את קנה הנשימה מחלל הצוואר.
- לנתק את הזנב קנה הנשימה לתפר קשר באמצעות מספריים קהים.
- ברגע שtracheהוא חופשי מהרקמות הבסיסיות, מתחיל למשוך את קנה הנשימה מהעכבר. רם בעדינות את הריאות מחוץ לחלל בית החזה.
- בזהירות לחתוך את רקמת החיבור מחזיקה את הריאות בחלל בית החזה. תמשיך למשוך את קנה הנשימה מגופו של העכבר ולהפעיל כוח כלפי מעלה יציב תוך צמצום הקשרים הבסיסיים. תשמור על עצמך כדי להימנע מחיתוך הריאות. שים לב כי בלב יש להשאיר מצורף לריאות באמצעות שיטה זו.
- ברגע שהריאות הוסרו, למקם אותם ב10 מיליליטר של פורמלין שנאגרו.
- הסר את הקטע של זנב עכבר לגנוטיפ.
- השלך את גופת העכבר פועלים בהתאם להנחיות מוסדיות המתאימות.
4. הערכת ציטוקין
- צנטריפוגה הדם כולו, שנאסף במסגרת שלב 2.5, ב12,000 XG במשך 5 דקות כדי לבודד את הסרום. העבר את הסרום לצינור prelabeled 1.5 מיליליטר microcentrifuge ולאחסן ב -80 ° C.
- להעריך את Seruרמות ציטוקינים מ 'על ידי ELISA או אחר assay הדומה. לדלל את הסרום 1:05-1:20 בחיץ דילול מתאים, בהתאם לassay, בעקבות מייצר הוראות. דילולים אלה צריכים להיקבע באופן אמפירי לפני הפעלת כמות גדולה של הדגימות.
- בשל ההיקף הנמוך של סרום שנאסף, מקטין את המדגם הועמס על צלחת ELISA בחצי הנפח. לדוגמא, רוב ELISAs המסחרי לנצל 100 כרכי μl של סטנדרטים ודגימות. כדי לחסוך בדגימות, עומס 50 μl של תקנים וסרום בדילול מלא בכל טוב.
- צנטריפוגה בלף בצנטריפוגה שולחן בקירור ב XG 200 למשך 5 דקות. מעביר את supernatant התא ללא לשני prelabeled 1.5 מיליליטר microcentrifuge צינורות ולאחסן ב -80 ° C.
- להעריך ציטוקינים בלף ידי ELISA או אחר assay הדומה ללא דילול.
- סרום חנות שאינו בשימוש ובלף ב -80 ° C.
5. ההפרש מכתים וBAL התאי הערכה
- בעקבות צנטריפוגה בלף והסרת HBSS מלאה, lyse תאי הדם האדומים pelleted באמצעות מלוח hypotonic. Resuspend התאים 900 μl של מים מזוקקים. מייד להוסיף של 10x PBS 100 μl.
- בנפרד lyse מדגם זה. אם דגימות מכילות כמויות מופרזות של תאי דם אדומים, ניתן pelleted התאים בצנטריפוגה בראש הטבלה ב XG 400 למשך 5 דקות ופרוטוקול תמוגה תא הדם האדום יכול להיות חוזר ונשנה.
- לקבוע התאי בלף כולל בהשעית מיליליטר 1 באמצעות hemacytometer תחת 10X או 20 הגדלה X עם מכתים Trypan הכחול. להעריך ויציג נתונים אלו כתאים / מיליליטר.
- הכן את החומרים לcytospin ומכתים ההפרש. תווית שקופיות מיקרוסקופ סטנדרטיות באמצעות עיפרון או עט עמיד ממס. אבטח את השקופיות לסוגר cytospin ומשפך. את מכלול השקופיות ברוטור cytospin.
- Cytospin 150 μl של בלף בדקות 5 100 XG. אם צפיפות התאים היא גדולה מדי ליעילותלהעריך את המורפולוגיה של תאים, לצמצם את ההיקף הסתחרר כלפי מטה על השקופיות. אפשר השקופיות לאוויר לילה יבש.
- ההפרש להכתים את השקופיות הבאות הפרוטוקולים מייצר. אפשר השקופיות לאוויר לילה יבש. Coverslip השקופיות באמצעות Permount ולהעריך את השקופיות באמצעות מיקרוסקופ מצויד אובייקטיבי 20X ו40X.
- קציר התאים שנותרו לניתוח שלאחר מכן, כמו FACS, מיקרוסקופיה אלקטרונית, מיקרוסקופיה confocal, מיצוי RNA להערכת ביטוי גנים, ו / או מיצוי חלבון עבור כתם מערבי.
6. הערכת histopathology
- הכן את הריאות להערכת histopathology. לאחר 24-48 שעות של קיבעון פורמלין, ventrally לכוון את הריאות מנופחות כולו ומשובץ בפרפין. חותכים את הבלוקים כתוצאה לחשוף את דרכי הנשימה הניצוח הראשיות.
- כדי לשפר את דיוק ניקוד, מקם את הריאות באותה התנוחה ולקצץ כל בלוק להניב ההדמיה האורך המרבית של tהוא intrapulmonary נתיב אוויר צירי עיקרי. מנקודה זו, לקצץ 5 מיקרון סעיפים סידוריים ואת כתם עם hematoxylin ו eosin (H & E). ניתן לחתוך קטעים נוספים ומוכנים לכלאה באתרו תוך שימוש בפרוטוקולים סטנדרטיים.
- להעריך histopathology באמצעות שיטת ניקוד חצי כמותית המבוססת על הפרמטרים הבאים דלקתיים, אשר קלעו בין 0 (היעדר) ו -3 (חמור): חדירה לתא חד גרעיני וpolymorphonuclear; Airway היפרפלזיה של תאי האפיתל ופציעה; extravasation; perivascular ואיזוק peribroncheolar; והאחוזים מהריאות מעורבות בדלקת. histopathology הריאות צריך להיבדק על ידי פתולוג מנוסה.
- ממוצע כל ציוני הפרמטר ליצור כולל ציון histopathology או להשתמש בעשרות בודדים לכמת היבטים ספציפיים של התקדמות מחלה. לנהל את כל הניקוד באופן כפול סמיות, עם ביקורות של סימאו לשני גנוטיפ וטיפול. שיטת ניקוד זו כבר previously תאר 6,7,10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
דופן התא של חיידקי גרם שלילי מורכבים מLPS, שהוא נרחב ביותר בסביבה. שאיפה של LPS באוכלוסיות אנושיות רגישות מחריפה תגובתיות דרכי הנשימה ומסוגלת להפעיל response11 חיסונית חזק. LPS גם PAMP נפוץ בשימוש במודלים של עכבר כדי לעורר תגובה חיסונית מולדת חזקה. בפרוטוקול מתואר כאן, העכברים קיבלו מינון זה של LPS מבודד מE. coli (סרוטיפ 0111: B4) באמצעות ממשלו הלוע התחתון. במודלים של חשיפת LPS, גם טמפרטורת הגוף ומשקל הם סמנים פונדקאיות אופייניים לתחלואה בעלי חיים והתקדמות מחלה. אתגר LPS יגרום לירידה משמעותית בטמפרטורת גוף תוך 6 שעות הראשונות, אשר תגדיל בחזרה לנקודת התחלה בהדרגה במהלך 24 שעות (איור 1 א). עם זאת, משקל גוף יהיה בעקביות להקטין במהלך 24 שעות (איור 1), שבו הוא יגיע לשיא ובהדרגה להתאושש על nשלוחה 48-72 שעה. כך, טמפרטורת גוף היא סמן מתאים יותר כדי להעריך המוקדמים של ייזום דלקת השלבים; ואילו, במשקל גוף הוא אמין יותר בשלבים מאוחר יותר של הפתוגנזה והתאוששות.
חשיפת Airway LPS תוצאות בזרם משמעותי של לויקוציטים לריאות. בתוך 6 שעות הראשונות, ניתן להבחין בתאים הקשורים לתגובה החיסונית המולדת המארח בבלף (תרשים 1C). תאי בלף ממשיך לעלות מעל 24-48 שעה הבאה (איור 1 ג), שבו פסגות התגובה החיסונית, ולאחר מכן נכנסה לתקופה של רזולוציה דלקת. על ידי 24 שעות, מספר משמעותי של נויטרופילים נמצאים בתוך הריאות וניתן להבחין בבלף הבא מכתים ההפרש (1D דמויות ו1E). הערכות תאיות בלף מספקות טכניקה חזקה וכמותיים כדי לאפיין את התאים הקשורים לתגובה החיסונית המארח בתוך הריאות. Incrלהקל בתאי בלף עולה בקנה אחד עם זרם משמעותי של נויטרופילים לדרך הנשימה, כלי דם ובparenchyma הריאות (1F דמויות ו1G). histopathology הריאות ניתן להעריך בצורה יעילה באמצעות מערכת חצי כמותית ניקוד (איור 1F). זה אפשרי להבקיע במדויק histopathology בציוני דרך ספציפית של הריאות של בעלי חיים שונים, כאשר הריאות במדויק מנופחות לאותו הגודל עם מקבע וחתכים מעובד כדי לחשוף את ההדמיה האורך המרבית של נתיב האוויר הצירי העיקרי intrapulmonary. פרוטוקול האינפלציה הכבידה מבוסס, שתואר כאן, נועד להקל שיטת ניקוד זה. LPS גורם לעלייה משמעותית בperivascular, peribroncheolar ודלקת parenchymal (איור 1G).
ממשל LPS גורם לרמות גבוהות של מתווכים דלקתיים הפרו מערכתיים ומקומיים, ובם כמה ציטוקינים הקשוריםהתגובה החיסונית המולדת. ניתן להעריך את רמות ציטוקינים מקומיות בבלף תוך שימוש בטכניקות קונבנציונליות, כגון ELISA. ציטוקינים נפוצים שמוסדרים מעלה לריאות הבאות ממשל LPS כוללים TNF-α, IL-1β, ו( איור 2 א) IL-6. ניתן להעריך את רמות ציטוקינים מערכתיות בסרום באמצעות אותן טכניקות כפי שתואר להערכות בלף (איור 2). אין זה נדיר עבור חלק מהמתווכים להיות נוכחים בmicroenvironment המקומי, אך נעדרו בסרום. לדוגמא, TNF-α נמצא באופן שיגרתי ברמות גבוהות של הריאות הבאות LPS, אך לא מצא בדרך כלל מערכתי בתנאים שתוארו בפרוטוקול זה (2A דמויות ו2B; מתחת לרמה של זיהוי).
איור 1. הלוע התחתון Intratracheal LPS מנהל מגדיל את התחלואה ודרך נשימת דלקת בעכברים. עכברי זכרים קיבלו 1 מ"ג / קילוגרם של א ' coli LPS (סרוטיפ 0111: B4) פתוגנזה זה ומחלה הוערכה במהלך 24 שעות LPS א.ב.) גורם לירידה משמעותית בטמפרטורת גוף תוך 6 שעות של ממשל;. ואילו ירידה במשקל הגוף ניכר יותר בנקודות הזמן מאוחר יותר. C) LPS גורם לעלייה משמעותית בסך התאי בלף. DE) נויטרופילים הם סוג התא שולט בהווה הריאות 24 שעות לאחר מתן LPS, כפי שנחשפו על ידי מכתים ההפרש מהתאים מבודדים מבלף. נתונים אלה באים לידי ביטוי בדרך כלל כאחוז מכל סוג תא הנמצא בבלף. histopathology F) הריאות ניתן להעריך באמצעות שיטת ניקוד חצי כמותית המבוססת על שתי הערכה עצמאיתים של הדלקת המקיפה את דרכי הנשימה intrapulmonary העיקריות הצירי. G) כמות משמעותית של איזוק perivascular וperibroncheolar, דלקת parenchymal קלה וכמה חסימת מכתשיים קלה היא בדרך כלל נצפתה 24 שעות לאחר חשיפת LPS הריאות. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 2. Airway חשיפה לתוצאות LPS ברמות מוגברות של ציטוקינים מקומיים והמערכתיים. א) בעקבות חשיפת LPS, רמות המקומיות של קשת רחבה של ציטוקינים דלקתיים הפרו ניתן לצפות בבלף בתוך שעה 24 הראשונה, כולל TNF-α, IL-1β, ו-IL-6. ניתן להעריך ציטוקינים אלו באמצעותELISA, כפי שמוצג כאן 24 שעות. B בעקבות חשיפת LPS) יכול גם להתגלות כמה ציטוקינים מערכתיים בסרום. עם זאת, ישנם כמה יוצא מן כלל, כולל TNF-α, אשר נמצאים ברמות גבוהות בבלף אך לא בסרום. ציטוקינים של עניין בסרום יש להעריך באופן אמפירי לפני הערכה בקנה מידה גדולה. לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 3. אינפלציה ריאות באמצעות תוצאות הכבידה תזוזה בהשתנות histopathology מופחתות ויזואליזציה משופרת. שיטת עקירת הכובד של קיבעון שתואר בפרוטוקול זה מאפשרת לcompar הערכת histopathology האופטימלי ריאות ed לריאות או לא תפחו אינפלציה ידנית. א.ב.) קבועות באינפלציה הכבידה להדגים תכונות אחידות המאפשרות לניקוד מדויק, קטינת נזק מכתשיים, הדמיה משופרת, והערכות ברזולוציה גבוהות יותר של אינפלציה ידנית דלקת. CD) של הריאות בדרך כלל תוצאות באזורים לא אחידים של אינפלציה. C) אזורים לא אחידים אלה הם לעתים קרובות באופן חלקי מנופחים, וכתוצאה מכך התמוטטו אזורים שהם טועים בכינוי תכונות פתולוגיים ידי בודקי טירון. ד) אינפלציה ידנית גם תוצאות באזורים של הריאות כי הם מנופחים יתר, שתוצאתה מכתשיים פגומים בהרחבה רווחים. E) ריאות תפחו להפגין חללי מכתשיים התמוטטו ובאזורים שקשה לפתור ולהעריך ללא הכשרה נרחבת. כמו כן, בשל האיבר שהתמוטט בטכניקה זו אינה מאפשר הדמיה של הריאות כפי שהם מופיעים באתרם.e.com/files/ftp_upload/51391/51391fig3highres.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השלבים הקריטיים ביותר להערכת התגובה החיסונית המארחת בריאות עכבר בהצלחה הוא כדלקמן: 1) לבחור את הזן המתאים עכבר ומין עבור הדגם נבדק; 2) לייעל את משלוח PAMP לריאות; 3) בצורה נכונה לאסוף ולעבד את בלף; ו -4) לתקן כראוי ולהכין של הריאות להערכות histopathological.
הבחירה של זן עכבר היא גורם חשוב בהערכת התגובה החיסונית המארחת. C57Bl / 6 עכברים בדרך כלל נחשבים רקע העכבר האופטימלי לחקר חסינות מולדת עקב תגובת העיקום וחזקה שלהם Th1 לרוב PAMPs. כמו כן, עכברי BALB / ג משמשים בדרך כלל ללימוד מודלים מחלות אלרגיות בשל הטית Th2 שלהם. זן שלישי נפוץ במודלים של ריאות הם עכברים על רקע 129SvEv, בשל השימוש הנפוץ שלהם ליצירת בעלי חיים מהונדסים גנטי. בכל המקרים, זהירות יש לנקוט בעת תכנון ניסוי ובכל הפעם ma אפשרי, גיל ומיןיש להשתמש בבעלי החיים שליטת ליטר תאומת tched למחקרים שהשוו בין עכברים מהונדסים גנטי עם בעלי חיים מסוג בר. בדרך כלל, לפרוטוקול LPS שתואר כאן, יש להשתמש C57Bl / 6 עכברים מותאמים מין 6-12 בן שבוע וצריך לשקול מינימום של 20 גרם. יתכן כי חשיפת LPS תגרום לרמות גבוהות של תחלואה ותמותה בזני עכבר רגישים או גנוטיפים. במקרה זה, ייתכן שיהיה צורך להתאים את מספר היבטים של פרוטוקול זה, ובכלל זה הפחתת מינון LPS, תוך שימוש בבעלי חיים גדולים יותר, ומעבר המגדר של בעלי החיים המשמשים בניסוי. ניסויים בקנה מידה קטנים צריכים להתנהל בתחילה כדי לקבוע רגישות לבעלי חיים ואת התנאים לכל ניסוי צריכים להיות מבוססים על הגנוטיפ רגיש ביותר או תנאי ניסוי.
ממשלו הלוע התחתון כבר מצא להיות מדויק יותר מאשר צורות אחרות של משלוח סוכן לריאות 2. זאת במידה רבה בשל הגישה הישירה לairway ועקיפת נושאים הקשורים באף בתצהיר חלל הסינוס. עם זאת, כמו עם כל הנהלים בבעלי החיים, זה ממשל דורש מיומנות ידנית נרחבת ותרגול כדי להשיג את מיומנויות נדרשות. טכניקה לא נכונה יכולה לגרום לתצהיר ריאות לא יעיל ובמקרים מסוימים לגרום לפגיעה בבעלי חיים. בדרך כלל, אוונס הכחול דיי (EBD) יכול להיות מנוצל ביעילות כמו גם כלי אימון להליך זה או כדי לפתור בעיות פוטנציאליות הקשורות בתצהיר 4. EBD זה יכול להיות מנוהל ולאחר מכן חולץ מן הרקמות באמצעות פוראמיד. כמות EBD יכולה להיות מחושבת באמצעות רמות קליטה בהשוואה נגד עקומה סטנדרטית. בידיים שלנו, התאוששות EBD טיפוסית נעה בין 90-98%. התפזורת של הצבע unrecovered צפוי להיות קשורים לדליפה לוושט. בשל הדיוק שלו, טכניקת הממשל הוא אידיאלית לאספקת מגוון רחבה של סוכנים רגישים מינון לריאות, כגון סוכני תרופותאו אורגניזמים זיהומיים.
ניתוח של תאי בלף ובלף יכול לספק כמות משמעותית של תובנה את ההתקדמות הכוללת של התגובה החיסונית המארחת. מתווכים דלקתיים שוחררו באופן מקומי בתוך הריאות בעקבות הגירוי ניתן לכמת ביעילות בבלף תוך שימוש בטכניקות אימונולוגיה נפוצות, כגון ELISA וכתם מערבי. כמו כן, ההרכב התאי של בלף ניתן להעריך או באמצעות מכתים תא ההפרש או cytometry זרימה. פיתוח מיומנות טכניקה וידנית הנכונה הוא החלק הקריטי ביותר של ביצוע שטיפה ברונכואלוואולרית (BAL). אחד הנושאים השכיחים ביותר המתרחשים במהלך BAL הוא כישלון לסגת הנפח המרבי של נוזל להציב במקור לריאות באופן מלא. זה קשור בדרך כלל עם צינורית מאובטחת כהלכה או כאשר מחטים משמשות במקום של קנולה לבפועל. קנולה לקנה נשימה מיוחדת זמין באופן מסחרי. כמו כן, חשוב שהתנועה והכחמשמש להוספה ולסגת המלוחים הוא חלק ועקבי לאורך כל ההליך. הפרוטוקול המתואר כאן כבר מותאם לצביעה מבדלת של תאים שנאספו בבלף. מכתים ההפרש הוא כתם רייט Giemsa שונה והוא טכניקה יעילה מאוד לנהל זיהוי תא מורפולוגיה מבוססת. טכניקת צביעה זו מאפשרת להתמיינות של נויטרופילים ואאוזינופילים מבוססים על המאפיינים מכתים גרגר הייחודי שלהם. תאי שמקורם מונוציטים גם קלים לזהות והם נצפו בדרך כלל בבלף. אלה כוללים מקרופאגים ותאים דנדריטים. כמו כן, תאי T ו-B-תאים נצפו גם בכינויו. עם זאת, תאי monocytic אלה ולימפוציטים הם לעתים קרובות קשים עבור רוב החוקרים להבחין באופן מדויק המבוססים על מורפולוגיה לבד. הניצול של cytometry הזרימה יכול להוסיף רזולוציה גבוהה הרבה יותר להערכות אלה. עם זאת, מספרים סלולריים נמוכים התאוששו מבעלי החיים שליטה הוא לעתים קרובות גורם מגביל. לכן, אם זרימת cytometry הוא לשמש, תכנון הניסוי צריך לכלול חיות בקרה שליליות נוספות להגדיל את התאוששות תא.
הערכות histopathology ריאות הן עוד מרכיב קריטי של פרוטוקול זה ולאפשר להדמיה הישירה של התקדמות מחלה (3A דמויות ו3B). כאשר הריאות ערוכות כראוי, histopathology ניתן להעריך בצורה מדויקת, לכימות, ומאופיין. השלב הקריטי ביותר בהכנת הריאות לhistopathology הוא מנפח אותם כראוי עם מקבע. שיטות ידניות של אינפלציה בדרך כלל לגרום לריאות כי הם מנופחים יתר, תחת מנופח או חלקי מנופח, מה שגורם להדמיה לא טובים והערכות מורפולוגיה (3C דמויות ו3D, בהתאמה). כמו כן, ריאות שאינם מנופחות לפני הקיבוע קשות מאוד להעריך בצורה מדויקת ולעתים קרובות תוצאות ציוני histopathology משתנים מאוד (איור 3 E). שיטת הכובד של אינפלציה שנדונה כאן מספקת שיטה לשחזור מאוד של אינפלציה עם השתנות מינימאלית. באמצעות טכניקה זו, ניתן להעריך את ציוני דרך ספציפיות של הריאות שעולות בקנה אחד בין חיות ניסוי. יתר על כן, אינפלציה הכבידה באמצעות עמדת אינפלציה הוכח לנפח את הריאות בלחץ מקבע של 20 12 מ"מ. טכניקה זו מאפשרת ההדמיה של הריאות ברוב רלוונטי מבחינה פיזיולוגית בגודלם וצורתם והוכחה כיעילים ביותר להערכה של תהליכי pathophysiological רגישים 12. זה קריטי, כי עמדת האינפלציה תיקבע בגובה המתאים מהעכבר כדי ליצור את הלחץ המתאים. אם אינפלציה לא טובים הוא ציין, את הגובה של עמדת האינפלציה צריך להיקבע באופן אמפירי. השימוש בעמדה זמינה מסחרי קטנה ריאות מכרסמים אינפלציה, שתבטיח את הגובה המתאים, מומלץ.
t "> הליך זה עבר אופטימיזציה עבור המשלוח של LPS וPAMPs האחר לריאות של עכברים. ברגע שהטכניקות אלה שולטים, יכולים גם להיות יזם מחקרים נוספים תוך שימוש בפרוטוקולים שונה כדי להעריך את יעילות אינטראקציות בין מאכסן לפתוגן באמצעות פתוגנים חיים. כמו כן, הטכניקות המתוארות כאן הן מגוונות מאוד ויכולות להיות מיושמות על כל מחקר מעוניין בהערכת החשיבות הקלינית ופיזיולוגית סוכן ניסיוני או תרופות מ. בגלל הדיוק במינון, טכניקה זו היא גם אידיאלית עבור במחקרי vivo שדורשים גבוה רמת הדיוק במשלוח הסוכן.הליך זה כבר מותאם עבור המשלוח של LPS וPAMPs האחר לריאות של עכברים. ברגע שטכניקות אלה שולטים, יכולים גם להיות יזם מחקרים נוספים תוך שימוש בפרוטוקולים שונה כדי להעריך את יעילות אינטראקציות בין המאכסן לפתוגן באמצעות פתוגנים חיים. כמו כן, הטכניקות המתוארות כאן הן מגוונות מאוד והוא יכול bדואר מיושם על כל מחקר מעוניין בהערכת החשיבות הקלינית ופיזיולוגית סוכן ניסיוני או תרופות של. בגלל הדיוק במינון, טכניקה זו היא גם אידיאלית עבור במחקרי vivo שדורשים רמה גבוהה של דיוק במסירת הסוכן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
המחברים מודים למכללה האזורית VA-MD ברפואת וטרינרית למתן תמיכת ליבה וטכנית עבור פרויקט זה. עבודה זו נתמכת על פיתוח קריירה פרס NIH (K01DK092355) על ידי.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57Bl/6J | The Jackson Laboratory | Stock 000664 | |
| Compact Scale | Ohaus Scale Corporation | 71142845 | |
| Small Animal Rectal Thermometer | Braintree Scientific | TH 5 | |
| Rectal Probe for Rodents | Braintree Scientific | RET 3 | |
| Ear Punch | Braintree Scientific | EP-S 901 | |
| Lipopolysaccharide from E. coli 0111:B4 | InvivoGen | LPS-EB | |
| 1x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-023 | |
| Isoflurane | Baxter | 40032609 | |
| Intratrachael Administration and Lung Inflation Stand | ICAP Manufacturing | n/a | |
| Rodent Intubation Stand | Braintree Scientific | RIS 100 | |
| Scissors (blunt/sharp) | Fisher Scientific | 13-806-2 | |
| forceps (straight) | Fisher Scientific | 22-327-379 | |
| forceps (45º, curved) | Fisher Scientific | 10-275 | |
| Scissors (blunt/blunt) | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Pipette (200 µl Capacity) | Gilson | F123601 | |
| Ethanol | Sigma | 459844 | |
| 1 ml Syringe | BD Medical | 301025 | |
| 10 ml Syringe | BD Medical | 301604 | |
| 27 G x 0.5 in Needle | BD Medical | 305109 | |
| Refrigerated Microcentrifuge | Fisher Scientific | 13-100-676 | |
| 1.2 mm Tracheal Cannulae with Luer-adapter | Harvard Apparatus | 732836 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-076 | |
| 4-0 Silk Braided Surgical Suture | Ethicon | A183 | |
| Luer to Tube Connector Kits | Harvard Apparatus | 721406 | |
| Luer Stopcock Kit | Harvard Apparatus | 721664 | |
| Tygon formula E-3603 Laboratory Tubing | Sigma | R-3603 | |
| Formalin Solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128-4L | |
| Mouse IL-1β OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 559603 | |
| Mouse IL-6 OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 550950 | |
| Mouse TNF-α OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 560478 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3520 | |
| Hemocytometer Cover Glasses | Thermo Scientific | 22-021-801 | |
| Trypan Blue | Thermo Scientific | SV3008401 | |
| Cytology Funnel Clips | Fisher Scientific | 10-357 | |
| Cytology Funnels | Fisher Scientific | 10-354 | |
| Filter Cards | Fisher Scientific | 22-030-410 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| Cover Glasses | Fisher Scientific | 12-540A | |
| Cytospin Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | |
| Diff Quick Staining Kit | Fisher Scientific | 47733150 | |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 |
References
- Matute-Bello, G., et al. An official American Thoracic Society workshop report: features and measurements of experimental acute lung injury in animals. Am. J. respir. Cell Mol. Biol. 44, 725-738 (2011).
- Egger, C., et al. Administration of bleomycin via the oropharyngeal aspiration route leads to sustained lung fibrosis in mice and rats as quantified by UTE-MRI and histology. PloS one. 8, (2013).
- Rayamajhi, M., et al. Nonsurgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. J. Vis. Exp. , (2011).
- Revelli, D. A., Boylan, J. A., Gherardini, F. C. A non-invasive intratracheal inoculation method for the study of pulmonary melioidosis. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2, 164 (2012).
- Allen, I. C., et al. Analysis of NLRP3 in the development of allergic airway disease in mice. J. Immunol. 188, 2884-2893 (2012).
- Allen, I. C., et al. Characterization of NLRP12 during the in vivo host immune response to Klebsiella pneumoniae and Mycobacterium tuberculosis. PloS one. , (2013).
- Allen, I. C., et al. Expression and function of NPSR1/GPRA in the lung before and after induction of asthma-like disease. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 291, 1005-1017 (2006).
- Kebaier, C., et al. Staphylococcus aureus alpha-hemolysin mediates virulence in a murine model of severe pneumonia through activation of the NLRP3 inflammasome. J. Infect. Dis. 205, 807-817 (2012).
- Roberts, R. A., et al. Analysis of the murine immune response to pulmonary delivery of precisely fabricated nano- and microscale particles. PloS one. 8, (2013).
- Willingham, S. B., et al. NLRP3 (NALP3, Cryopyrin) facilitates in vivo caspase-1 activation, necrosis, and HMGB1 release via inflammasome-dependent and -independent pathways. J. Immunol. 183, 2008-2015 (2009).
- Kline, J. N., et al. Variable airway responsiveness to inhaled lipopolysaccharide. Am. J. Respir. Crit. Med. 160, 297-303 (1999).
- Cressman, V. L., Hicks, E. M., Funkhouser, W. K., Backlund, D. C., Koller, B. H. The relationship of chronic mucin secretion to airway disease in normal and CFTR-deficient mice. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 19, 853-866 (1998).
