A utilização de orofaringe Intratraqueal Administração PAMP e Lavagem Broncoalveolar para avaliar a resposta imune do hospedeiro em camundongos

Summary

A resposta imune do hospedeiro à infecção do agente patogénico é um processo fortemente regulado. Utilizando um modelo de exposição do pulmão lipopolissacarídeo em ratos, é possível realizar avaliações de alta resolução dos complexos mecanismos associados à patogênese da doença.

Abstract

A resposta imune do hospedeiro contra patógenos é um processo biológico complexo. A maioria dos estudos in vivo classicamente utilizada para caracterizar as interações patógeno-hospedeiro tirar proveito de injeções intraperitoneais de selecionar bactérias ou padrões moleculares de patógenos associados (PAMPs) em camundongos. Embora essas técnicas têm rendido dados tremendos associados pathobiology doença infecciosa, os modelos de injeção intraperitoneal nem sempre são adequados para estudos de interação patógeno-hospedeiro no pulmão. Utilizando um modelo de inflamação pulmonar aguda em ratos, é possível realizar uma análise de alta resolução do anfitrião resposta imune inata utilizando lipopolissacarídeo (LPS). Aqui, descrevemos os métodos para administrar LPS usando administração intratraqueal orofaríngea não cirúrgico, monitorar parâmetros clínicos associados com a patogênese da doença, e utilizar lavado broncoalveolar para avaliar a resposta imune do hospedeiro. As técnicas que estão descritassão amplamente aplicáveis ​​para o estudo da resposta imune do hospedeiro inata de uma gama diversificada de PAMPs e patógenos. Da mesma forma, com pequenas modificações, estas técnicas também podem ser aplicados em estudos que avaliam a inflamação alérgica das vias aéreas e em aplicações farmacológicas.

Introduction

As infecções pulmonares associadas com espécies de bactérias patogênicas são uma causa comum de morbidade e mortalidade global. Determinar os mecanismos que impulsionam a resposta imune do hospedeiro para estes patógenos vai promover o desenvolvimento de novas estratégias de prevenção e agentes terapêuticos que atenuam o impacto destas infecções. O objetivo geral do protocolo descrito aqui é fornecer ao usuário um método flexível para avaliar o anfitrião resposta imune inata à infecção do patógeno usando um associado padrão molecular de patógenos (PAMP) como um substituto para bactérias vivas. A maioria dos estudos anteriores que avaliaram a resposta imune do hospedeiro natural para as bactérias têm-se centrado em modelos peritoneal devido à relativa facilidade de execução. Embora estes modelos são muito úteis e têm resultado em avanços significativos no campo das interações patógeno-hospedeiro e inflamação sistêmica, os dados gerados a partir desses modelos nem sempre são adequadas para estudos involving do sistema respiratório. Aqui, um modelo pulmonar de inflamação pulmonar aguda é proposto como uma expansão prático e clinicamente relevante dos intraperitoneal (ip) de injeção de modelos clássicos. A técnica proposta permite a avaliação local da resposta imune inata em um sistema modelo específico do órgão.

Os métodos descritos aqui são projetados para fornecer uma técnica simples e robusta para permitir que os usuários para avaliar a resposta imune do hospedeiro ao LPS, que é um PAMP comum. Os métodos baseiam-se na via intratraqueal (it) instilação de LPS, que induz uma resposta imune inata robusta nos pulmões dos ratos e imita muitas das características fisiopatológicas observadas em pacientes humanos que sofrem de infecções respiratórias e lesão pulmonar aguda ^1. A principal vantagem desta técnica é que ela permite ao usuário avaliar a resposta imune do hospedeiro, sem os fatores de confusão e problemas de segurança associados à realização de estudos in vivoutilizando bactérias vivas. Do mesmo modo, a via de administração que orofaríngea de exposição descrito neste processo tem vantagens significativas sobre outras técnicas geralmente utilizadas, incluindo intranasal (em) a administração e que a administração cirúrgica. Por exemplo, ele permite que a dosagem de administração orofaríngea relativamente preciso e deposição nos pulmões em comparação com a administração, que normalmente sofre de um aumento da variabilidade da deposição nos pulmões, devido à perda de agentes na cavidade nasal e os seios ^2-4. A rota que contorna administração destas cavidades e permite acesso direto à traquéia e vias aéreas. Da mesma forma, a abordagem cirúrgica que é um método de administração significativamente mais mórbida e requer extenso treinamento para dominar. Os protocolos descritos aqui também incluir uma descrição das técnicas comuns e marcadores substitutos utilizados para avaliar a progressão da inflamação e termina com um protocolo descrevendo as técnicas apropriadas para a preparação da lungs para avaliações de histopatologia. Estes protocolos são focados em minimizar o número de ratinhos necessários para cada estudo, maximizando os dados gerados a partir de cada animal.

Os protocolos descritos são altamente flexível e pode ser facilmente modificado para avaliar uma diversificada gama PAMPs e padrões moleculares danos associados (amortece). Além disso, com algumas modificações adicionais, estes protocolos podem também ser aplicadas a estudos de avaliação das vias aéreas alérgica progressão da doença ou interações patógeno-hospedeiro com bactérias vivas, vírus ou fungos ^5-10.

Protocol

Todos os estudos foram realizados no âmbito da aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso (IACUC) para Virginia Tech e de acordo com o National Institutes of Health Guide para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

1. Intratraqueal (IT) A inoculação de LPS usando a administração orofaríngea

1. Certifique-se de que cada animal é identificado exclusivamente usando um soco ouvido, marca auricular, ou outro método aprovado institucionalmente.
2. Registe o peso do corpo de linha de base e da temperatura corporal de cada animal.
3. Prepare o estoque de trabalho de LPS. Cada ratinho recebe uma dose de 50 ul de 1 mg / kg de LPS em 1x tampão fosfato salino (PBS). Animais tratados Mock irá receber uma dose de 50 ul de PBS 1x.
4. Prepara-se uma câmara apropriada para a administração de isoflurano utilizando o seguinte método de gota. Diretrizes institucionais variar em relação ao uso de isoflurano e outros agentes anestésicos e antes deram inícioção a todos os estudos, as pessoas devem entrar em contato Departamento de Animal Care / Bem-estar da sua instituição para garantir as todas as diretrizes são adequadamente atendidas. Se o método queda isoflurano não é uma opção, outros agentes anestésicos são alternativas aceitáveis.
   1. Em um gabinete de segurança apropriado, aplicar cerca de 3 ml de isoflurano para uma toalha de papel absorvente dobrado e coloque no fundo de um copo de 500 ml.
   2. Coloque um pequeno pedaço de uma folha de alumínio na parte superior da toalha de papel e cobrir o recipiente com uma tampa transparente.
5. Preparar as ferramentas e os reagentes que serão utilizadas durante a ele inoculação. Coloque o elástico que irá garantir os animais cabeça no stand intubação. Este procedimento será necessário um par de fórceps em linha reta, um par de pinças angulares ou curvas, e uma pipeta p200 com dicas.
6. Carga 50 mL de LPS na ponta da pipeta e coloque em um local de fácil acesso, ao lado do stand intubação.
7. Anestesiar o mousea colocação do animal na câmara de isoflurano e cobrindo a câmara com uma tampa transparente. Observar os padrões de respiração do animal, que será rápida e superficial quando o primeiro colocado na câmara. O animal será suficientemente anestesiados quando as taxas de respiração aproximar 1 respiração / 2 seg, que normalmente é alcançado dentro de 30 segundos de colocar na câmara. O mouse deve ser anestesiado como indicado no protocolo aprovado animais utilizando o método de queda de isoflurano.
8. Retire o rato anestesiado da câmara e suspender o animal na intubação ficar por seus incisivos. Garantir que o animal está bem contido e da boca e língua são acessíveis.
9. Gentilmente garantir a língua com a pinça retas. Segure a língua com a pinça em ângulo e puxe-o para fora da boca até ligeira resistência é sentida. Esta ação é suficiente para bloquear a epiglote e ter acesso a traquéia.
10. Embora continuando a segurar a língua naposição prolongada, administrar a dose de 50 ul de LPS na parte de trás da garganta e cobrir imediatamente narinas do animal com um dedo de luva. O LPS será visível na parte de trás da garganta até que o mouse inala.
11. Continue a cobrir as narinas e segure a língua estendida para 5-10 respirações adicionais.
12. Retire o mouse do suporte intubação e coloque o animal de volta para uma nova gaiola até que ele se recupera da anestesia.
13. Monitorar marcadores substitutos associados à progressão da doença. O peso corporal ea temperatura do corpo devem ser monitorados a cada 4-8 horas para a duração do estudo. Da mesma forma, avaliar as características comportamentais e sintomas clínicos associados com o aumento da morbidade.
14. Para avaliar progressão da doença, os ratos de colheita no tempo pontos-específicos após a exposição LPS. Pontos de tempo típicos para a colheita, após exposição ao LPS incluem 0, 6, 12, 18, 24, e 48 horas. Para avaliar a recuperação e sobrevivência, avaliar os ratos para 7 days pós-inoculação.

2. Soro e Líquido da Lavagem Broncoalveolar (LBA) Coleção

1. Sacrifique o mouse usando um método aprovado institucionalmente.
2. Colocar o animal em suas costas e prenda-o a uma placa de necropsia, idealmente 0,5 em (1,27 cm) de altura.
3. Molhe todo o rato com etanol 70%.
4. Usando uma seringa de 1 ml com uma agulha de 27 G, realizar uma punção cardíaca antes de fazer qualquer incisões. Deve ser possível retirar 500-800 mL de sangue total a partir de um único rato.
5. Retirar a agulha da seringa e transferir todo o sangue para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml prelabeled. Para a recolha de soro, permitindo que todo o sangue de coagular durante, pelo menos, 30 minutos à temperatura ambiente. Em adição à recolha de soro, este procedimento também pode ser modificado por incorporação de um anti-coagulante, no tubo e na seringa, antes da recolha do sangue total, para o estudo de células imunitárias em circulação.
6. Faça uma incisão horizontalatravessar o comprimento da cavidade peritoneal e feita uma incisão vertical a partir da cavidade peritoneal, para o maxilar inferior do rato.
7. Utilizando uma pinça, segure ambos os lados da incisão e puxe a pele longe das cavidades peritoneais e torácicos subjacentes.
8. Fazer uma grande incisão ao longo do comprimento da cavidade peritoneal dos genitais para o esterno, tendo o cuidado de evitar o corte do diafragma. Suavemente deslocar os intestinos na cavidade peritoneal, para permitir o acesso a um dos rins.
9. Cortar a veia renal que conduz ao rim para servir como um ponto de drenagem para perfusão.
10. Nick o diafragma com uma tesoura, tendo o cuidado de evitar os pulmões e coração, para expor o lado esquerdo do coração.
11. Perfuse manualmente o coração usando uma seringa de 10 ml com uma agulha de 27 G e solução 1x PBS. Evitar a aplicação de força excessiva durante a perfusão para assegurar que a solução salina não é forçado para dentro dos pulmões. O restante sangue é drenada a partir da incisão da veia porta.
12. Corte cuidadosamente a caixa torácica ao longo do esterno com uma tesoura sem corte / sem corte, tendo o cuidado de evitar o corte do coração e pulmões. Acidentalmente cortar os pulmões durante este processo irá reduzir de forma significativa a quantidade de LBA recolhido e irá resultar numa incapacidade para inflar os pulmões adequadamente com fixador.
13. Gentilmente isolar o coração e os pulmões de distância da caixa torácica com fórceps. Corte cuidadosamente cada seção da caixa torácica com uma tesoura sem corte / sem corte o mais próximo à coluna vertebral quanto possível e totalmente remover ambas as seções.
14. Separe as glândulas salivares, usando uma pinça ou removê-los com uma tesoura, para expor a traquéia.
15. Retirar cuidadosamente os músculos que revestem a traquéia com uma tesoura. É essencial que a traqueia não ser cortado durante este processo.
16. Com uma tesoura, separe a clavícula que recobre a traquéia.
17. Gentilmente segure o timo com a pinça e retire o tecido para fora do coração. Retire o timo com uma tesoura, tendo o cuidado deevitar o corte do coração ou os pulmões.
18. Faça uma pequena incisão horizontal na traquéia 1-2 anéis abaixo da laringe com uma tesoura em ângulo (45-90 º ângulo, afiada / afiada). A incisão deve ser grande o suficiente para prender firmemente a cânula.
19. Inserir a cânula de modo a que a extremidade afunilada prolonga-se 2-3 anéis de traqueia abaixo da incisão, e fixar a cânula no lugar utilizando uma sutura de seda. Certifique-se que a sutura passa entre a traquéia eo esôfago e está bem apertada na cânula.
20. Encher uma seringa de 1 ml com 1 ml de solução salina tamponada de Hanks (HBSS) e inserir o luer suavemente para dentro da cânula.
21. Com um movimento lento, mas constante, injetar ~ 900 mL na traquéia, inflando os pulmões, e retirar imediatamente o HBSS. Coloque o LBA recuperado num tubo cónico de 15 ml.
22. Repita esta lavagem duas vezes adicionais para coletar cerca de 3 ml de LBA para análise futura. Armazenar o LBA em gelo ou a 4 º C até que esteja pronto para uso.

1. Insira uma seringa de 10 ml no suporte inflação de pulmão. Montar o tubo para o luer, o luer da torneira, e a torneira de passagem para a seringa. Assegurar a torneira estiver na posição fechada. A seringa de 10 ml irá servir como um reservatório de escoamento por gravidade. O reservatório deve ser ligada ao suporte de inflação 4,75 em cima do animal e da parte superior do reservatório deve estender em 10,5 acima do animal.
2. Encha a seringa com solução neutra de formalina tamponada. Certifique-se de que a seringa está completamente cheio com o fixador.
3. Coloque uma toalha absorvente sob a extremidade aberta do tubo e abrir a torneira para permitir que o fixador para encher o tubo. Uma vez que o fixador começa a fluir a partir da tubulação, imediatamente fechar a torneira e encher a seringa até o topo com fixador. É importante que a seringa estar completamente cheio de fornecer a quantidade apropriada da pressão da inflação do pulmão.
4. Amarre um único nó frouxo na sutura; no entanto, não puxe o apertado nó.
5. Insira o tubo da inflação do mouse ficar na cânula.
6. Abra a torneira e permitir que os pulmões para encher pela inflação gravidade.
7. Uma vez que os pulmões atingem o seu nível máximo inflação, puxe a sutura apertado e dê um segundo nó.
8. Fechar a torneira e remover o tubo a partir da cânula.
9. Remova cuidadosamente a cânula da traqueia, segurando a sutura com um par de fórceps e segurando a cânula com os dedos. Puxe firmemente a sutura para baixo em direção a cavidade torácica ea cânula de volta para o nariz do mouse.
10. Suavemente compreender a traqueia ou as suturas com uma pinça e levantar a traqueia de distância da cavidade do gargalo.
11. Sever do caudal traquéia para a sutura amarrado com uma tesoura sem corte.
12. Uma vez que o tracheum está livre dos tecidos subjacentes, começam a puxar a traqueia longe do rato. Levante cuidadosamente os pulmões para fora da cavidade torácica.
13. Corte cuidadosamente o tecido conjuntivo que prende os pulmões na cavidade torácica. Continue puxando a traquéia longe do corpo do mouse e aplicar a força ascendente constante ao cortar as conexões subjacentes. Tome cuidado para evitar o corte dos pulmões. Note-se que o coração deve ser deixado ligado para os pulmões usando esse método.
14. Uma vez que os pulmões foram retirados, colocá-los em 10 ml de formalina tamponada.
15. Remover uma seção da cauda do rato para genotipagem.
16. Descarte a carcaça do mouse seguindo as diretrizes institucionais adequados.

4. Avaliação de citocinas

1. Centrifugar o sangue total, coletados na etapa 2.5, a 12.000 xg por 5 min para isolar o soro. Transferir o soro para um tubo de 1,5 ml prelabeled microcentrífuga e armazenar a -80 ° C.
2. Avaliar o seruníveis de citocinas por ELISA m ou outro ensaio semelhante. Diluir o soro de 1:05 - 1:20 em tampão de diluição adequado, dependendo do ensaio, seguindo as instruções do fabricante. Estas diluições devem ser determinados empiricamente antes de executar a maior parte das amostras.
3. Devido ao baixo volume de soro recolhido, reduzir o volume da amostra carregada na placa de ELISA para metade. Por exemplo, a maioria dos testes ELISA comerciais utilizam volumes de 100 ul dos padrões e amostras. Para conservar as amostras, carga 50 ul de normas e soro diluído por poço.
4. Centrifugar o LBA numa centrífuga de mesa refrigerada a 200 xg durante 5 min. Transferir o sobrenadante isento de células para dois tubos de 1,5 ml prelabeled e armazenamento de microcentrífuga a -80 ° C.
5. Avaliar citocinas LBA por ELISA ou outro ensaio semelhante, sem diluir.
6. Loja soro não utilizada e LBA a -80 ° C.

5. Coloração Diferencial e celularidade do LBA Avaliação

1. Após centrifugação e remoção do LBA HBSS completa, a lise das células vermelhas do sangue peletizadas usando solução salina hipotónica. Ressuspender as células em 900 ul de água destilada. Imediatamente adicionar 100 ul de PBS 10x.
2. Individualmente lisar cada amostra. Se as amostras contêm uma quantidade excessiva de células vermelhas do sangue, as células podem ser sedimentadas no topo da mesa de centrifugação a 400 xg durante 5 minutos e o sangue protocolo de lise dos glóbulos vermelhos pode ser repetido.
3. Determinar a celularidade total de LBA na suspensão de 1 ml utilizando um hemacitómetro sob 10X ou ampliação de 20 X com coloração de Azul de Tripano. Avaliar e apresentar esses dados como células / ml.
4. Preparar materiais para a cytospin e coloração diferencial. Rotular lâminas de microscópio padrão usando um lápis ou uma caneta resistente a solventes. Fixe os slides em um suporte cytospin e funil. Fixe o conjunto de slides no rotor cytospin.
5. Cytospin 150 uL de BALF a 100 xg durante 5 min. Se a densidade de células é demasiado grande para efectivamenteavaliar a morfologia celular, reduzir o volume centrifugadas nas lâminas. Permitir que as lâminas para o ar durante a noite seca.
6. Diferencial manchar os slides seguindo os protocolos fabrica. Permitir que as lâminas para o ar durante a noite seca. Lamela os slides usando Permount e avaliar os slides usando um microscópio equipado com um objetivo 20X e 40X.
7. Colher as células restantes para análise posterior, como FACS, microscopia eletrônica, microscopia confocal, extração de RNA para avaliação da expressão gênica e / ou extração de proteínas por western blot.

6. Avaliação Histopatologia

1. Prepare os pulmões para avaliação histopatológica. Após 24-48 horas de fixação em formalina, ventrally orientar todo os pulmões inflados e embebidos em parafina. Cortar os blocos resultantes para expor o condutor principal da via aérea.
2. Para melhorar a precisão de pontuação, posicione os pulmões na mesma posição e aparar cada bloco para produzir a visualização máxima longitudinal de tele intrapulmonar principal via aérea axial. A partir deste ponto, corte de 5 mícrons cortes seriados e mancha com hematoxilina e eosina (H & E). Secções adicionais podem ser cortadas e preparadas para hibridação in situ, utilizando protocolos padrão.
3. Avaliar histopatologia usando um sistema de pontuação semi-quantitativo com base nos seguintes parâmetros inflamatórios, que são marcados entre 0 (ausente) e 3 (grave): mononucleares e polimorfonucleares infiltração de células; vias aéreas hiperplasia das células epiteliais e lesões; extravasamento; perivascular e cuffing peribroncheolar; e a percentagem do pulmão envolvido com a inflamação. Histopatologia do pulmão devem ser avaliadas por um patologista experiente.
4. Média de todas as notas de parâmetros para gerar uma pontuação total histopatologia ou utilizar os resultados individuais de quantificar aspectos específicos da progressão da doença. Exercer as pontuação de forma duplo-cego, com revisores cegos para ambos genótipo e tratamento. Este sistema de pontuação foi previously descrito ^6,7,10.

Representative Results

As paredes celulares de bactérias gram-negativas são compostos de LPS, o que é muito abundante no ambiente. A inalação de LPS em populações humanas sensíveis exacerba a reactividade das vias aéreas e que é capaz de desencadear uma response11 imune robusta. LPS é também um PAMP comum utilizado em modelos de ratinho para induzir uma resposta imune inata robusta. No protocolo aqui descrito, os ratos receberam uma dose que de LPS isolado a partir de E. coli (sorotipo 0111: B4) usando-administração orofaríngea. Em modelos de exposição LPS, tanto a temperatura do corpo e peso são marcadores substitutos típicos de morbidade animal e a progressão da doença. O desafio com LPS irá causar uma redução significativa da temperatura do corpo no interior do primeiro 6 h, o que irá aumentar gradualmente de volta à linha de base, ao longo de 24 horas (Figura 1A). No entanto, o peso corporal irá diminuir progressivamente ao longo de 24 horas (Figura 1B), onde se vai pico e, gradualmente, a recuperação de mais do next 48-72 horas. Assim, a temperatura do corpo é um indicador mais apropriado para avaliar os estágios iniciais de inflamação de iniciação; Considerando que o peso corporal é mais confiável durante as fases posteriores da patogênese e recuperação.

Exposição das vias respiratórias de LPS resulta em um grande afluxo de leucócitos aos pulmões. Dentro do primeiro 6 h, as células associadas com a resposta imune inata do hospedeiro pode ser observado no LBA (Figura 1C). A celularidade LBA continua a aumentar ao longo dos próximos 24-48 horas (Figura 1C), onde os picos de resposta imune e, posteriormente, entra em um período de resolução da inflamação. Em 24 horas, um número significativo de neutrófilos estão presentes nos pulmões e pode ser observada em LBA após coloração diferencial (Figuras 1D e 1E). Avaliação da celularidade LBA fornecer uma técnica robusta e quantificável para caracterizar as células associadas com a resposta imunitária do hospedeiro nos pulmões. O incrfacilidade na LBA celularidade é consistente com um afluxo significativo de neutrófilos nas vias aéreas, vasos sanguíneos e no parênquima pulmonar (Figuras 1F e 1G). Histopatologia pulmonar pode ser efetivamente avaliada utilizando um sistema de pontuação semi-quantitativa (Figura 1F). É possível para marcar de forma precisa a histopatologia nos pontos de referência específicos dentro dos pulmões de animais diferentes quando os pulmões são inflados com precisão com o mesmo tamanho e com o fixador secções processadas para revelar a visualização máxima longitudinal do intrapulmonar principal via aérea axial. O protocolo de inflação gravidade baseado, aqui descrito, é projetado para facilitar o sistema de pontuação. LPS induz um aumento significativo em perivascular, peribroncheolar e inflamação do parênquima pulmonar (Figura 1G).

Administração de LPS induz altos níveis de mediadores pró-inflamatórios locais e sistêmicos, incluindo diversas citocinas associadosa resposta imune inata. Níveis de citocinas locais podem ser avaliadas no LBA utilizando técnicas convencionais, tais como ELISA. Citoquinas comuns que são regulados para cima nos pulmões a seguir à administração de LPS incluem TNF-α, IL-1β, e IL-6 (Figura 2A). Os níveis de citocinas sistémicos podem ser avaliados no soro utilizando as mesmas técnicas descritas para as avaliações de LBA (Figura 2B). Não é incomum para alguns mediadores de estar presentes no microambiente local, mas ausente no soro. Por exemplo, o TNF-α é habitualmente encontrado em níveis elevados nos pulmões seguintes LPS, mas não é tipicamente encontrado sistemicamente sob as condições descritas neste protocolo (Figuras 2A e 2B; abaixo do nível de detecção).

Figura 1. Orofaríngea Intratraqueal LPS Administração aumenta a morbidade e inflamação das vias aéreas em ratos. Camundongos machos receberam 1 mg / kg de E. coli LPS (serotipo 0111: B4) que e patogénese da doença foi avaliada ao longo de 24 h AB) LPS induz a uma redução significativa na temperatura do corpo dentro de 6 horas de administração,. enquanto que a perda de peso corporal é mais evidente nos pontos de tempo posteriores. C)   LPS induz um aumento significativo na celularidade total de LBA. DE) Os neutrófilos são o tipo de célula dominam presente nos pulmões 24 horas após a administração de LPS, como revelado pela coloração diferencial de células isoladas a partir da LBA. Estes dados são tipicamente ilustrados como a percentagem de cada tipo de célula presente no LBA. Histopatologia F) pulmonar pode ser avaliada utilizando um sistema de pontuação semi-quantitativo com base em dois avaliação independentes da inflamação em torno do intrapulmonar principal via aérea axial. G) Uma quantidade significativa de infiltrados perivasculares e peribroncheolar, inflamação do parênquima ameno e uma ligeira oclusão alveolar é tipicamente observado 24 horas após a exposição LPS pulmão. Clique aqui para ver a imagem ampliada .

Figura 2. Vias aéreas exposição ao LPS resulta em aumento dos níveis de citocinas locais e sistêmicos. Um)   Após a exposição ao LPS, os níveis locais de um amplo espectro de citocinas pró-inflamatórias pode ser observado na LBA dentro das primeiras 24 horas, incluindo o TNF-α, IL-1β, e IL-6. Estas citocinas podem ser avaliados usandoELISA, como mostrado aqui 24 horas após a exposição LPS. B) Várias citocinas podem também ser detectados no soro sistemicamente. No entanto, existem algumas exceções notáveis, incluindo TNF-α, que são encontrados em níveis elevados no LBA, mas não no soro. As citocinas de interesse no soro deve ser avaliada empiricamente antes da avaliação em larga escala. Clique aqui para ver a imagem ampliada .

Figura 3. Inflação de pulmão usando a gravidade de deslocamento resulta em menor Histopatologia Variabilidade e melhor visualização. Método de deslocamento gravidade da fixação descrito neste protocolo permite ótima compar avaliação histopatológica ed para os pulmões uninflated ou inflação manual. AB Pulmões) fixados pela inflação gravidade demonstrar características uniformes que permitam a pontuação precisa, reduziu dano alveolar, maior visualização e avaliação de alta resolução da inflamação. CD) manual de inflação dos pulmões normalmente resulta em áreas não uniformes de inflação. C) Estas áreas não uniformes são muitas vezes parcialmente inflado, resultando em áreas colapsadas que são comumente confundidos com características patológicas por revisores novatos. D) A inflação manual também resulta em áreas dos pulmões, que são super-inflado, o que resulta em alveolar amplamente danificado espaços. E) pulmões uninflated demonstrar espaços alveolares colapsadas e áreas que são difíceis de resolver e avaliar sem treinamento extensivo. Da mesma forma, devido ao colapso do órgão sendo esta técnica não permite a visualização dos pulmões que aparecem in situ.e.com/files/ftp_upload/51391/51391fig3highres.jpg "target =" _blank "> Clique aqui para ver imagem ampliada.

Discussion

Os passos mais críticos para avaliar com sucesso a resposta imune do hospedeiro no pulmão do rato é a seguinte: 1) escolher a tensão do mouse apropriado e sexo para o modelo que está sendo avaliado; 2) otimizar a entrega PAMP para os pulmões; 3) coletar e processar corretamente o LBA; e 4) devidamente corrigir e preparar os pulmões para avaliações histopatológicas.

A escolha do rato tensão é um fator importante na avaliação da resposta imune do hospedeiro. C57BL / 6 são tipicamente considerado o fundo óptima do rato para o estudo da imunidade inata, devido à sua resposta Th1 inclinação e robusto para a maioria dos PAMPs. Da mesma forma, os camundongos BALB / c são normalmente utilizados para o estudo de modelos de doenças alérgicas, devido à sua inclinação Th2. Uma terceira estirpe vulgarmente utilizado em modelos pulmonares são ratinhos no fundo 129SvEv, devido ao seu uso comum na geração de animais geneticamente modificados. Em todos os casos, o cuidado deve ser tomado durante o projeto experimental e, sempre que possível, a idade eo sexo maanimais controle litro companheiro tched deve ser usado para estudos comparando camundongos geneticamente modificados com animais selvagens. Tipicamente, para o protocolo de LPS aqui descrito, 6-12 semanas de idade do sexo combinados C57BL / 6 deve ser utilizado e deve pesar um mínimo de 20 g. É possível que a exposição ao LPS irá resultar em elevados níveis de morbilidade e mortalidade em estirpes de ratinho sensíveis ou genótipos. Se isto acontece, pode ser necessário ajustar a vários aspectos do presente protocolo, incluindo a redução da dose de LPS, o uso de animais maiores, e comutar o sexo dos animais utilizados na experiência. Experiências de pequena escala, devem ser realizados inicialmente para determinar a sensibilidade dos animais e as condições de cada experiência deve basear-se no genótipo mais susceptíveis ou condição experimental.

Ele administração orofaríngea foi encontrado para ser mais preciso do que outras formas de distribuição de agente para os pulmões ^2. Isto é, em grande parte devido ao acesso direto ao airway e contornar problemas associados à deposição nasal e cavidade nasal. No entanto, como acontece com todos os procedimentos com animais, administração requer extensa destreza e prática manual para atingir a proficiência. Técnica inadequada pode resultar em deposição pulmonar ineficiente e, em alguns casos, resultar em lesão animal. Normalmente, Evans Blue Dye (EBD) pode ser efetivamente utilizado tanto como uma ferramenta de treinamento para este procedimento ou para solucionar problemas potenciais associados com a deposição ^4. EBD pode ser administrada ela e subsequentemente extraído do tecido com formamida. A quantidade de EBD pode ser calculada utilizando os níveis de absorção em comparação com uma curva padrão. Em nossas mãos, a recuperação típico EBD varia entre 90-98%. A maior parte do corante não recuperado está prevista para ser associado com o vazamento para o esófago. Devido à sua precisão, a técnica de que a administração é ideal para o fornecimento de uma grande variedade de agentes sensíveis à dose, para os pulmões, tais como agentes farmacêuticosou organismos infecciosos.

Análise da celularidade do LBA e LBA pode proporcionar uma quantidade significativa de visão da progressão global da resposta imune do hospedeiro. Os mediadores inflamatórios libertados localmente nos pulmões após estimulação pode ser quantificada de forma eficaz no LBA usando técnicas de imunologia comuns, tais como ELISA e Western Blot. Da mesma forma, a composição celular do LBA pode ser avaliada usando coloração diferencial de células ou citometria de fluxo. O desenvolvimento da técnica e manual adequado destreza é a parte mais crítica de realizar o lavado bronco-alveolar (LBA). Um dos problemas mais comuns que ocorrem durante o BAL é a incapacidade de se retirar totalmente o volume máximo de fluido inicialmente colocados nos pulmões. Isto é geralmente associada com uma cânula de forma inadequada ou fixado quando as agulhas são utilizadas em lugar das cânulas reais. Cânulas traqueais especializados estão disponíveis comercialmente. Também é importante que o movimento e forçautilizado para inserir e retirar a solução salina é lisa e consistente durante todo o procedimento. O protocolo descrito aqui foi otimizado para coloração diferencial de células coletadas no LBA. Coloração diferencial é uma mancha de Giemsa de Wright modificado e é uma técnica altamente eficaz para realizar a identificação baseado morfologia celular. Esta técnica de coloração permite a diferenciação de neutrófilos e eosinófilos, com base nas suas propriedades únicas de coloração dos grânulos. Monócitos células derivadas também são fáceis de identificar e são comumente observados no LBA. Estes incluem macrófagos e células dendríticas. Da mesma forma, as células T e células B também são comumente observados. No entanto, estas células monocíticas e linfócitos são muitas vezes difícil para a maioria dos investigadores para diferenciar de forma precisa em função da morfologia sozinho. A utilização da citometria de fluxo pode adicionar uma resolução muito maior para essas avaliações. No entanto, o número de células de baixa recuperados de animais de controle muitas vezes é um fator limitante. Assim, se o fluxo de cytomtria está a ser utilizado, o desenho experimental devem incluir animais adicionais de controlo negativo para aumentar a recuperação das células.

Avaliações histopatológicas pulmonares são outro componente crítico deste protocolo e permitir a visualização direta de progressão da doença (Figuras 3A e 3B). Quando os pulmões estão devidamente preparados, histopatologia podem ser avaliados com precisão, quantificados e caracterizados. O passo mais importante na preparação dos pulmões para histopatologia está inflando-los corretamente com fixador. Os métodos manuais de inflação normalmente resultam em pulmões que são super-inflado, sub-inflado ou parcialmente inflado, o que resulta em visualização de qualidade inferior e avaliações de morfologia (Figuras 3C e 3D, respectivamente). Da mesma forma, os pulmões que não são inflados antes da fixação são muito difíceis de avaliar com precisão e muitas vezes resulta em dezenas de histopatologia altamente variáveis ​​(Figura 3 E). O método de gravidade da inflação discutida aqui fornece um método altamente reprodutível de inflação com variabilidade mínima. Utilizando esta técnica, é possível avaliar a pontos de referência específicos dentro dos pulmões que são consistentes entre animais experimentais. Por outro lado, a inflação da gravidade através de um suporte de inflação foi mostrado para inflar os pulmões a uma pressão de 20 mm de fixador ^12. Esta técnica permite a visualização dos pulmões na sua maioria fisiologicamente relevante de tamanho e forma e tem sido demonstrado ser altamente eficaz para a avaliação de processos patofisiológicos sensíveis ^12. É fundamental que o suporte a inflação ser ajustado na altura apropriada do mouse para gerar a pressão adequada. Se a inflação subóptima é observado, a altura do suporte de inflação deve ser determinada empiricamente. O uso de um suporte de inflação disponível comercialmente pequeno roedor pulmão, o que vai garantir a altura apropriada, é recomendado.

t "> Este procedimento foi otimizado para a entrega de LPS e outros PAMPs para os pulmões de camundongos. Uma vez que estas técnicas são dominados, estudos adicionais também podem ser iniciadas usando protocolos modificados para avaliar efetivamente interações patógeno-hospedeiro utilizando patógenos vivos. Da mesma forma, as técnicas descritas aqui são altamente versátil e pode ser aplicado a qualquer estudo interessado na avaliação da relevância clínica e fisiológica de um agente experimental ou farmacêutica. Devido à precisão no doseamento, esta técnica também é ideal para estudos in vivo, que exigem um elevado nível de precisão na entrega do agente.

Este procedimento foi otimizado para a entrega de LPS e outros PAMPs para os pulmões de camundongos. Uma vez que estas técnicas são dominados, estudos adicionais também podem ser iniciadas usando protocolos modificados para avaliar efetivamente interações patógeno-hospedeiro utilizando patógenos vivos. Do mesmo modo, as técnicas descritas aqui são altamente versátil e pode be aplicado a qualquer estudo interessado em avaliar a relevância clínica e fisiológica de um agente experimental ou farmacêutica. Devido ao rigor no doseamento, esta técnica também é ideal para estudos in vivo, que exigem um elevado nível de precisão na distribuição do agente.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57Bl/6J	The Jackson Laboratory	Stock 000664
Compact Scale	Ohaus Scale Corporation	71142845
Small Animal Rectal Thermometer	Braintree Scientific	TH 5
Rectal Probe for Rodents	Braintree Scientific	RET 3
Ear Punch	Braintree Scientific	EP-S 901
Lipopolysaccharide from E. coli 0111:B4	InvivoGen	LPS-EB
1x Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	10010-023
Isoflurane	Baxter	40032609
Intratrachael Administration and Lung Inflation Stand	ICAP Manufacturing	n/a
Rodent Intubation Stand	Braintree Scientific	RIS 100
Scissors (blunt/sharp)	Fisher Scientific	13-806-2
forceps (straight)	Fisher Scientific	22-327-379
forceps (45º, curved)	Fisher Scientific	10-275
Scissors (blunt/blunt)	Fisher Scientific	08-940
Pipette (200 µl Capacity)	Gilson	F123601
Ethanol	Sigma	459844
1 ml Syringe	BD Medical	301025
10 ml Syringe	BD Medical	301604
27 G x 0.5 in Needle	BD Medical	305109
Refrigerated Microcentrifuge	Fisher Scientific	13-100-676
1.2 mm Tracheal Cannulae with Luer-adapter	Harvard Apparatus	732836
Hank's Balanced Salt Solution	Life Technologies	14025-076
4-0 Silk Braided Surgical Suture	Ethicon	A183
Luer to Tube Connector Kits	Harvard Apparatus	721406
Luer Stopcock Kit	Harvard Apparatus	721664
Tygon formula E-3603 Laboratory Tubing	Sigma	R-3603
Formalin Solution, neutral buffered, 10%	Sigma	HT501128-4L
Mouse IL-1β OptEIA ELISA Kit	BD Biosciences	559603
Mouse IL-6 OptEIA ELISA Kit	BD Biosciences	550950
Mouse TNF-α OptEIA ELISA Kit	BD Biosciences	560478
Hemocytometer	Hausser Scientific	3520
Hemocytometer Cover Glasses	Thermo Scientific	22-021-801
Trypan Blue	Thermo Scientific	SV3008401
Cytology Funnel Clips	Fisher Scientific	10-357
Cytology Funnels	Fisher Scientific	10-354
Filter Cards	Fisher Scientific	22-030-410
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-544-1
Cover Glasses	Fisher Scientific	12-540A
Cytospin Cytocentrifuge	Thermo Scientific	A78300003
Diff Quick Staining Kit	Fisher Scientific	47733150
Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-500