Summary

Farelerde Host immün yanıtı değerlendirmek için Orofarengeal intratrakeal PAMP İdaresi ve Bronchoalveolar Lavage Kullanımı

Published: April 02, 2014
doi:

Summary

Patojen enfeksiyonuna karşı konak bağışıklık tepkisi sıkı bir şekilde düzenlenmiş bir süreçtir. Farelerde bir lipopolisakarit akciğer maruz modeli kullanarak, bu hastalığın patojenezi ile ilgili kompleks mekanizmalar yüksek çözünürlüklü değerlendirme yapmak mümkündür.

Abstract

Patojenlere karşı konak bağışıklık tepkisi karmaşık biyolojik süreçtir. In vivo çalışmaların çoğunluğu klasik konak-patojen ilişkileri farelerde seçin bakteri veya patojen ilişkili moleküler desenleri (PAMPs) intraperitoneal yararlanmak karakterize edilmesi için kullanılır. Bu teknikler, bulaşıcı hastalık patobiyolojisi ilişkili verileri vermiştir büyük olsa da, periton içine enjeksiyon modelleri her zaman akciğerde konukçu-patojen etkileşim çalışmalar için uygun değildir. Farelerde akut akciğer enflamasyonu kullanarak, bu doğuştan gelen bağışıklık tepkisi lipopolisakkarid (LPS) kullanılarak ana bir yüksek çözünürlüklü analizi yapmak mümkündür. Burada, biz, cerrahi olmayan orofaringeal İntratrakeal yönetimini kullanarak LPS yönetmek hastalığı patogenezi ile ilişkili klinik parametrelerini izlemek ve konak immün yanıtı değerlendirmek için, BAL sıvısında kullanmak için yöntemler açıklanmaktadır. Açıklanan tekniklerPAMPs ve patojenlerin çok çeşitli konakçı doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin incelenmesi için yaygın olarak uygulanabilir. Aynı şekilde, minör modifikasyonlarla, bu teknikler, aynı zamanda, alerjik nefes yolu iltihap değerlendiren çalışmalar ve farmakolojik uygulamalarda uygulanabilir.

Introduction

Patojenik bakteri türleri ile ilişkili pulmoner enfeksiyonlar küresel morbidite ve mortalite ortak bir nedenidir. Bu patojenlere karşı bağışıklık tepkisini tahrik mekanizmaları belirlenmesi bu enfeksiyonların etkisini hafifletecektir yeni önleme stratejilerinin ve terapötik ajanların geliştirilmesini teşvik edecektir. Burada açıklanan protokol genel amacı, canlı bakteriler için bir vekil olarak bir patojen ilişkili moleküler deseni (PAMP) kullanarak patojen enfeksiyona konak doğuştan gelen bağışıklık yanıtı değerlendirmek için esnek bir yöntem ile kullanıcıya sunmaktır. Bakteri konakçı doğuştan gelen bağışıklık tepkisini değerlendirmek önceki çalışmaların büyük çoğunluğu nedeniyle yürütme göreli kolaylığı için peritoneal modeller üzerinde odaklanmıştır. Bu modeller son derece yararlıdır ve evsahibi-patojen etkileşimlerinin ve sistemik inflamasyon alanında önemli gelişmelere yol olsa da, bu modeller üretilen veriler her zaman çalışmaları için uygun değildir involvisolunum sistemi ng. Burada, akut akciğer iltihabı bir akciğer modeli klasik intraperitoneal (ip) enjeksiyonu model bir pratik ve klinik olarak anlamlı bir genişleme olarak önerilmiştir. Önerilen teknik, bir organ spesifik model sistemde doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin değerlendirilmesi için yerel sağlar.

Burada açıklanan yöntemler kullanıcıların ortak PAMP olan LPS, konakçı bağışıklık tepkisini değerlendirmek için izin vermek için basit ve sağlam bir teknik sağlamak için tasarlanmıştır. Yöntem farelerde nefes borusu ve solunum yolu enfeksiyonları ve akut akciğer hasarı 1 geçiren insan hastalarda görülen patofizyolojik özellikleri birçok taklit akciğerlerinde sağlam bir doğuştan gelen bağışıklık tepkisi oluşturan LPS, (it) damlatma dayanmaktadır. Bu tekniğin bir avantajı, birinci kullanım in vivo çalışmalar yapılması ile ilişkili karıştırıcı faktörler ve güvenlik kaygıları olmayan bağışıklık tepkisini değerlendirmek için izin vermesidirCanlı bakteri kullanılmıştır. Aynı şekilde, bu protokolde tarif maruziyetin orofaringeal bu uygulama yolu, parenteral (in) burun ve cerrahi de dahil olmak üzere bu uygulama için diğer yaygın olarak kullanılan tekniklere göre önemli avantajları vardır. Örneğin, orofaringeal bu uygulama tipik olarak, burun boşluğunda ajanlar kaybına akciğer birikim artan değişiklere maruz kalır ve 2-4 sinüsler yönetim bölgesi ile karşılaştırıldığında nispeten doğru olan dozajlanmasını ve akciğer birikmesini sağlar. Bu uygulama yolu bu boşlukları circumvents ve trakea ve solunum doğrudan erişim sağlar. Aynı şekilde, cerrahi bu yaklaşımın bir ölçüde daha marazi uygulama yöntemidir ve master için kapsamlı bir eğitim gerektirir. Burada açıklanan protokolleri de ortak teknikleri ve inflamasyon ilerlemesini değerlendirmek ve lu hazırlanması için uygun teknikleri açıklayan bir protokol ile bitirmek için kullanılan vekil işaretçileri bir açıklama içerirhistopatolojik değerlendirmeler için NGS. Bu protokoller, her bir hayvandan elde edilen verileri maksimize her çalışma için gerekli olan farelerin sayısını en aza indirerek odaklandık.

Anlatılan protokoller oldukça esnek ve hali hazırda, bir dizi çeşitli PAMPs hasar ve ilişkili moleküler modelleri (DAMPS) değerlendirmek için modifiye edilebilir. Bundan başka, bir kaç ilave değişiklik ile, bu protokol, aynı zamanda, alerjik nefes yolu, hastalığın ilerlemesini ya da canlı bakteri, virüs veya mantar 5-10 ile konukçu-patojen etkileşimlerine değerlendiren çalışmalar uygulanabilir.

Protocol

Tüm çalışmalar Virginia Tech için Kurumsal Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) onayı altında ve Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Sağlık Rehberi, National Institutes göre yapılmıştır. 1.. Orofarengeal Yönetimi'ni kullanarak LPS intratrakeal (it) Aşılama Her hayvan benzersiz bir kulak yumruk, kulak etiketi veya diğer kurumsal olarak onaylanmış bir yöntem kullanılarak tespit emin olun. Bazal vücut ağırlığı ve her bir hayvan …

Representative Results

Gram-negatif bakterilerin hücre duvarları ortamında çok bol LPS, oluşmaktadır. Hassas insan popülasyonlarında LPS solunumu solunum yolu reaktivitesi arttırır ve güçlü bir bağışıklık response11 tetikleme yeteneğine sahiptir. LPS aynı zamanda sağlam bir doğuştan gelen bağışıklık tepkisi ortaya çıkarmak için, fare modellerinde kullanılan bir PAMP olduğunu. Burada açıklanan protokol olarak, fareler, E izole LPS'nin bir o dozunu almıştır coli: orofarengeal bu yönet…

Discussion

Aşağıdaki gibi başarılı bir şekilde, farenin akciğerlerinde bulunan konakçı bağışıklık tepkisini değerlendirmek için en kritik adım: 1) değerlendirilen modeli için uygun fare suşu ve cinsiyet seçin; 2) akciğerlere PAMP teslim optimize edilmesi; 3) doğru toplamak ve Balf işlemek; ve 4) düzgün düzeltmek ve histopatolojik değerlendirmeler için akciğerlerin hazırlamak.

Fare soyunun seçimi konakçı bağışıklık tepkisini değerlendirmek için önemli bir fakt?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar bu proje için temel ve teknik destek sağlamak için veteriner tıp VA-MD Regional College teşekkür ederim. Bu çalışma NIH Kariyer Geliştirme Ödülü (K01DK092355) tarafından desteklenmektedir.

Materials

C57Bl/6J The Jackson Laboratory Stock 000664
Compact Scale Ohaus Scale Corporation 71142845
Small Animal Rectal Thermometer Braintree Scientific TH 5
Rectal Probe for Rodents Braintree Scientific RET 3
Ear Punch Braintree Scientific EP-S 901
Lipopolysaccharide from E. coli 0111:B4 InvivoGen LPS-EB
1x Phosphate Buffered Saline Life Technologies 10010-023
Isoflurane Baxter 40032609
Intratrachael Administration and Lung Inflation Stand ICAP Manufacturing n/a
Rodent Intubation Stand Braintree Scientific RIS 100
Scissors (blunt/sharp) Fisher Scientific 13-806-2
forceps (straight) Fisher Scientific 22-327-379
forceps (45º, curved) Fisher Scientific 10-275
Scissors (blunt/blunt) Fisher Scientific 08-940
Pipette (200 µl Capacity) Gilson F123601
Ethanol Sigma 459844
 1 ml Syringe BD Medical 301025
10 ml Syringe BD Medical 301604
27 G x 0.5 in. needle BD Medical 305109
Refrigerated Microcentrifuge Fisher Scientific 13-100-676
1.2 mm Tracheal Cannulae with Luer-adapter Harvard Apparatus 732836
Hank's Balanced Salt Solution Life Technologies 14025-076
4-0 Silk Braided Surgical Suture Ethicon A183
Luer to Tube Connector Kits Harvard Apparatus 721406
Luer Stopcock Kit Harvard Apparatus 721664
Tygon formula E-3603 laboratory tubing Sigma R-3603
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma HT501128-4L
Mouse IL-1β OptEIA ELISA Kit BD Biosciences 559603
Mouse IL-6 OptEIA ELISA Kit BD Biosciences 550950
Mouse TNF-α OptEIA ELISA Kit BD Biosciences 560478
Hemacytometer Hausser Scientific 3520
Hemacytometer Cover Glasses Thermo Scientific 22-021-801 
Trypan Blue Thermo Scientific SV3008401
Cytology Funel Clips Fisher Scientific 10-357
Cytology Funels Fisher Scientific 10-354
Filter Cards Fisher Scientific 22-030-410
Microscope Slides Fisher Scientific 12-544-1
Cover Glasses Fisher Scientific 12-540A
Cytospin Cytocentrifuge Thermo Scientific A78300003 
Diff Quick Staining Kit Fisher Scientific 47733150
Permount Mounting Medium Fisher Scientific SP15-500

References

  1. Matute-Bello, G., et al. An official American Thoracic Society workshop report: features and measurements of experimental acute lung injury in animals. Am. J. respir. Cell Mol. Biol. 44, 725-738 (2011).
  2. Egger, C., et al. Administration of bleomycin via the oropharyngeal aspiration route leads to sustained lung fibrosis in mice and rats as quantified by UTE-MRI and histology. PloS one. 8, (2013).
  3. Rayamajhi, M., et al. Nonsurgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. J. Vis. Exp. , (2011).
  4. Revelli, D. A., Boylan, J. A., Gherardini, F. C. A non-invasive intratracheal inoculation method for the study of pulmonary melioidosis. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2, 164 (2012).
  5. Allen, I. C., et al. Analysis of NLRP3 in the development of allergic airway disease in mice. J. Immunol. 188, 2884-2893 (2012).
  6. Allen, I. C., et al. Characterization of NLRP12 during the in vivo host immune response to Klebsiella pneumoniae and Mycobacterium tuberculosis. PloS one. , (2013).
  7. Allen, I. C., et al. Expression and function of NPSR1/GPRA in the lung before and after induction of asthma-like disease. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 291, 1005-1017 (2006).
  8. Kebaier, C., et al. Staphylococcus aureus alpha-hemolysin mediates virulence in a murine model of severe pneumonia through activation of the NLRP3 inflammasome. J. Infect. Dis. 205, 807-817 (2012).
  9. Roberts, R. A., et al. Analysis of the murine immune response to pulmonary delivery of precisely fabricated nano- and microscale particles. PloS one. 8, (2013).
  10. Willingham, S. B., et al. NLRP3 (NALP3, Cryopyrin) facilitates in vivo caspase-1 activation, necrosis, and HMGB1 release via inflammasome-dependent and -independent pathways. J. Immunol. 183, 2008-2015 (2009).
  11. Kline, J. N., et al. Variable airway responsiveness to inhaled lipopolysaccharide. Am. J. Respir. Crit. Med. 160, 297-303 (1999).
  12. Cressman, V. L., Hicks, E. M., Funkhouser, W. K., Backlund, D. C., Koller, B. H. The relationship of chronic mucin secretion to airway disease in normal and CFTR-deficient mice. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 19, 853-866 (1998).

Play Video

Cite This Article
Allen, I. C. The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice. J. Vis. Exp. (86), e51391, doi:10.3791/51391 (2014).

View Video