Profilage individuel embryonnaires humaines Cellules souches par RT-PCR quantitative
Summary
Un seul dosage de l'expression du gène cellulaire est nécessaire pour la compréhension des hétérogénéités de cellules souches.
Abstract
L'hétérogénéité de la population des cellules souches entrave compréhension détaillée de la biologie des cellules souches, telles que leur propension de différenciation vers les différentes lignées. Une analyse du transcriptome d'une cellule unique peut être une nouvelle approche pour disséquer la variation individuelle. Nous avons développé la méthode qRT-PCR seule cellule, et a confirmé que cette méthode fonctionne bien dans plusieurs profils d'expression génique. En niveau de la cellule unique, chaque cellule souche embryonnaire humaine, triées par OCT4 :: cellules positives à l'EGFP, a une forte expression dans OCT4, mais un niveau d'expression de NANOG différente. Notre analyse de l'expression des gènes de la cellule unique devrait être utile pour interroger des hétérogénéités de la population.
Introduction
Populations eucaryotes plus élevés sont hétérogènes donc à l'analyse de la population mis en commun, il est souvent difficile d'interpréter leurs fonctions cellulaires. Les cellules individuelles au sein d'une population peut être légèrement différente, et ces différences peuvent avoir des conséquences importantes pour la propriété et la fonction de l'ensemble de la population 1, 2. Surtout, les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) sont connus pour être hétérogène, ce qui entraîne différents niveaux de la pluripotence et potentiels divers aux spécifications de la lignée dans délicatement façons distinctes 3, 4. Par exemple, les différents antigènes de surface cellulaire peuvent être utilisées pour classer les cellules souches pluripotentes indifférenciées, 5 et le groupe Austin Smith a proposé différents niveaux de la pluripotence des cellules souches embryonnaires de souris, en fonction de leur morphologie, la différenciation propension et la dépendance de la voie 6 de signalisation. Ce phénomène a émis l'hypothèse d'un embryon humaincellules souches nic 7. Considérant que les études globales ont été effectuées entre les différentes lignées de cellules souches, et non pas des cellules souches simples particuliers, il pourrait être très intéressant d'analyser les différents niveaux de la pluripotence au niveau d'une seule cellule, ce qui affecte potentiellement leurs capacités de différenciation vers toutes les lignées de cellules somatiques.
Hétérogénéité cellulaire et moléculaire pourrait être dicté par profilage de transcription, qui est appelé le «transcriptome d'une cellule unique» et met l'accent sur de nouvelles approches pour quantifier les niveaux d'expression des gènes 8-10. Pour l'analyse des niveaux d'expression de gènes dans des cellules individuelles, nous avons développé un protocole simple mais robuste de la cellule unique de RT-PCR quantitative. Nous avons confirmé l'efficacité et la faisabilité de notre protocole en comparant chaque moitié de lysats de cellules individuelles ainsi que ARN totaux dilués en série de CSEh, résultant des variations techniques minimales et les différences. En outre, nous avons utilisé une ligne de reporter génétique pour isoler p homogèneopulation de CSEh à l'aide de système de ciblage de gène. Le vecteur donneur pour cibler OCT4 locus (OCT4-2A-EGFP-PGK-Puro construire) et une paire de plasmides ont été utilisés Talen 11. Le vecteur donneur et une paire de plasmides Talen ont été introduits dans les CSEh (H9, WA09) à l'aide de notre nucléofection et protocole de sélection clonale et l'entretien des CSEh a été réalisée sur la base de notre protocole de routine 12. Nous avons confirmé cette ligne de reporter génétique exprimer EGFP pour l'expression de OCT4 dans OCT4 :: EGFP CSEh.
Notre résultat démontre que les CSEh individuelles (classés par OCT4 :: cellules fortement positives à l'EGFP) détiennent des niveaux élevés d'expression de OCT4, mais différents niveaux d'expression de NANOG. Ainsi, notre analyse de l'expression des gènes de la cellule unique devrait être utile d'étudier les hétérogénéités de la population de cellules souches pluripotentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Seul gène cellulaire profilage pourrait être un outil important pour prédire la fonctionnalité d'une seule cellule ou une population entière. En raison de limitations techniques, toute l'analyse de profilage génétique a été limitée aux moyennes de la population. Variations dans les modes et les niveaux entre les cellules individuelles et les sous-populations expression génique ont été proposés pour entraîner une interprétation erronée. Ces aspects cellulaires diverses peuvent être trouvés dans…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier les membres du laboratoire Lee pour des discussions utiles sur le manuscrit. Le travail dans le laboratoire Lee a été soutenue par des subventions de Robertson Investigator Award de New York Fondation des cellules souches et du Maryland souches Fonds de recherche sur les cellules (TEDCO).
Materials
| 96 wll PCR Plate | USA scientific | 1402-8900 | |
| Ambion Cell Lysis Kit | Life Technologies | 4458235 | |
| SMARTScribe Reverse Transcriptase | Clonetech | 639536 | |
| ExoSAP-IT | USB | 78200 | |
| Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304 | |
| 10mM dNTP Mix, PCR Grade | Invitrogen | 18427 | |
| SYBR Universal 2X Master Mix | Kapa biosystem | KR0389 | |
| Accutase | Innovative Cell Tech | S-1100-1 | |
| FACS buffer | 45 ml PBS, 5 ml a-MEM, 100 ul DNase, filter sterilized | ||
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 |
References
- Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog. Nature. 483, 470-473 (2012).
- Leitch, H. G., et al. Embryonic germ cells from mice and rats exhibit properties consistent with a generic pluripotent ground state. Development. 137, 2279-2287 (2010).
- Ramskold, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30, 777-782 (2012).
- Stewart, M. H., et al. Clonal isolation of hESCs reveals heterogeneity within the pluripotent stem cell compartment. Nat Methods. 3, 807-815 (2006).
- O’Malley, J., et al. High-resolution analysis with novel cell-surface markers identifies routes to iPS cells. Nature. 499, 88-91 (2013).
- Nichols, J., Smith, A. Naive and primed pluripotent states. Cell Stem Cell. 4, 487-492 (2009).
- Kim, H., et al. miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).
- Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat Methods. 5, 621-628 (2008).
- Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).
- Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).
- Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).
- Zhu, Y. Y., Machleder, E. M., Chenchik, A., Li, R., Siebert, P. D. Reverse transcriptase template switching: A SMART (TM) approach for full-length cDNA library construction. Biotechniques. 30, 892-897 (2001).
- Pan, X. H., et al. Two methods for full-length RNA sequencing for low quantities of cells and single cells. P Natl Acad Sci USA. 110, 594-599 (2013).
- Tang, F. C., et al. RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell. Nat Protoc. 5, 516-535 (2010).
