وضع العلامات النظائر مستقرة الببتيدات بواسطة dimethylation الاختزالية (وضع العلامات ريدي) هي استراتيجية غير مكلفة السريع لدقيقة الشامل القائم على البروتينات الطيف الكمي. نحن هنا لشرح طريقة قوية لإعداد وتحليل مخاليط البروتين باستخدام نهج ريدي التي يمكن تطبيقها على ما يقرب من أي نوع العينة.
وضع العلامات النظائر مستقرة الببتيدات بواسطة dimethylation الاختزالية (وضع العلامات ريدي) هو وسيلة لقياس بدقة الفروق بين البروتين التعبير العينات باستخدام مطياف الكتلة. يتم تنفيذ وسم ريدي باستخدام إما العادية (الضوء) أو بالديوتيريوم (الثقيلة) أشكال الفورمالديهايد والصوديوم cyanoborohydride إضافة إلى اثنين من مجموعات الميثيل إلى كل أمين الحرة. نحن هنا يبرهن على وجود بروتوكول قوية لوضع العلامات وريدي مقارنة كمية من خليط من البروتين المعقدة. يتم هضمها عينات البروتين للمقارنة في الببتيدات، وصفت لتنفيذ إما خفيفة أو ثقيلة الميثيل به، مختلطة، وشارك في تحليل من قبل LC-MS/MS. وكميا وفرة البروتين النسبية بمقارنة المناطق الذروة ايون اللوني من الإصدارات الثقيلة والخفيفة وصفت من الببتيد المكونة المستخرجة من كامل أطياف MS. الطريقة الموضحة هنا يشمل إعداد عينة من عكس المرحلة استخراج المرحلة الصلبة، ووضع العلامات ريدي على عمود من الببتيدات، الببتيد تجزئة من قبل القس درجة الحموضة الأساسيةersed المرحلة (BPRP) اللوني، وStageTip تنقية الببتيد. نحن نناقش مزايا وقيود وضع العلامات ريدي فيما يتعلق بأساليب أخرى لإدماج النظائر مستقرة. نسلط الضوء تطبيقات جديدة باستخدام الوسم ريدي كوسيلة سريعة وغير مكلفة، ودقيقة للمقارنة بين تركيزات البروتين في أي نوع تقريبا من العينة.
قياس الاختلافات تركيز العديد من البروتينات المعقدة بين العينات هو التحدي الرئيسي في البروتينات. على نحو متزايد، ويجري ذلك عن طريق وضع العلامات البروتينات في كل عينة مع العلامات النظائر المختلفة، والجمع بين العينات، واستخدام مطياف الكتلة لقياس الاختلافات التركيز. توجد عدة طرق لوضع العلامات النظائر مستقرة من البروتينات والببتيدات 15 N وضع العلامات 1 و 2 SILAC إدخال تسميات النظائر عملية الأيض في الجسم الحي، في حين ICAT 3، 4 iTRAQ، والحد من dimethylation 5 إضافة علامات النظائر مستقرة بعد استخراج البروتين والهضم. بين هذه الأساليب، dimethylation الاختزالية (وضع العلامات ريدي) تكتسب شعبية باعتبارها، طريقة استنساخه غير مكلفة لتحديد الاختلافات تركيز البروتين في أي نوع تقريبا من العينة.
ويشمل وضع العلامات ريدي الببتيدات التفاعل مع الفورمالديهايد لتشكيل قاعدة شيف، الذي يتم تخفيض ثمبواسطة cyanoborohydride. رد الفعل هذا dimethylates المجموعات الأمينية الحرة على N-تيرميني والجانب يسين سلاسل وmonomethylates prolines N-محطة. بروتوكول الموصوفة هنا methylates الببتيدات في نموذج 1 مع "النور" التسمية باستخدام الكواشف مع ذرات الهيدروجين في توزيع النظائر الطبيعية وعينة 2 مع تسمية "الثقيل" باستخدام الفورمالدهيد بالديوتيريوم وcyanoborohydride (الشكل 1). كل مجموعة أمينية dimethylated على نتائج الببتيد في الفرق الجماعية لل6.0377 دا بين الضوء والأشكال الثقيلة، والذي يعمل على التمييز بين الشكلين باستخدام مطياف الكتلة. على وجه التحديد، وكميا فرة الببتيد النسبية كنسبة من MS1 استخراج المناطق اللوني ايون (MS1 نسبة المساحة الذروة) من الضوء والنسخة الثقيلة لكل زوج الببتيد أيون. يتم احتساب الوفرة النسبية للبروتين مثل نسبة المساحة الذروة MS1 متوسط بين جميع الببتيدات في البروتين. في هذا التقرير، وصفنا بروتوكول قوية للسلوكجي ريدي التجارب وضع العلامات من قبل LC-MS/MS يتضمن عكس المرحلة الببتيد المرحلة الصلبة استخراج، ووضع العلامات ريدي على العمود، الببتيد تجزئة بواسطة الرقم الهيدروجيني الأساسية المرحلة (BPRP) اللوني عكسه، وتنقية مخاليط الببتيد باستخدام StageTips (الشكل 2) . نحن نناقش مزايا والقيود المفروضة على استخدام الوسم ريدي لالبروتيوميات الكمي.
عدة نقاط تجعل وضع العلامات النظائر مستقرة الببتيدات باستخدام dimethylation الاختزالية (وضع العلامات ريدي) وسيلة جذابة للالبروتيوميات الكمية: الكواشف غير مكلفة وضع العلامات (تكلف الكواشف أقل من 1 دولار لكل عينة)، ومعدل رد فعل سريع (~ 10 دقيقة)، وغياب المنتجات الجانبية، وارتفا…
The authors have nothing to disclose.
We thank SP Gygi and GM Church for help and guidance. This work was supported by a CNRS chaire d’excellence to ACT.
trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T9159 | protein precipitation |
acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | protein precipitation |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 71736 | denature, reduce protein |
sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | denature, reduce protein |
DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43816 | denature, reduce, alkylate protein |
protease Inhibitor Complete Mini Cocktail | Roche | 4693124001 | denature, reduce protein |
iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | alkylate protein |
HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | resuspend, extract, label protein |
calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | resuspend protein |
Lysyl Endoprotease | Wako Chemicals | 129-02541 | protein digestion |
sequencing grade trypsin | Promega | V5111 | protein digestion |
acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | protein digestion |
trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 299537 | Reversed-phase peptide extraction |
tC18 Sep-Pak C18 cartridges | Waters | WAT054960 | Reversed-phase peptide extraction |
extraction manifold | Waters | WAT200609 | Reversed-phase peptide extraction |
acetonitrile | Sigma-Aldrich | 14261 | various |
formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | “light” peptide labeling |
cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 71435 | “light” peptide labeling |
deuterated formaldehyde | Sigma-Aldrich | 492620 | “heavy” peptide labeling |
sodium cyanoborodeuteride | CDN isotopes | D-1797 | “heavy” peptide labeling |
MES | Sigma-Aldrich | M3671 | peptide labeling |
C18-HPLC column (4.6 x 250 mm, 5 µm particle size) | Agilent | 770450-902 | basic pH reversed-phase chromatography |
formic acid | Sigma-Aldrich | 399388 | various |
C18 Empore Disks | 3M | 14-386-3 | STAGE tips |
methanol | Sigma-Aldrich | 494437 | STAGE tips |