استهداف الخلايا المقيمين في الدماغ لإعادة برمجة المباشر النسب-يقدم آفاقا جديدة للإصلاح الدماغ. نحن هنا وصف بروتوكول لكيفية إعداد الثقافات المخصب لpericytes المقيمين في الدماغ من الكبار قشرة الدماغ البشري وتحويل هذه الخلايا العصبية إلى الناجمة عن الفيروس الارتجاعي بوساطة تعبير عن عوامل النسخ Sox2 وAscl1.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
النسب-إعادة برمجة الخلايا المشتقة من خلية حوطية الدماغ البشري الكبار في الخلايا العصبية المستحثة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
مباشر النسب-إعادة برمجة الخلايا غير العصبية إلى الخلايا العصبية التي يسببها (INS) قد توفر نظرة ثاقبة لآليات الجزيئية الكامنة وراء تكوين الخلايا العصبية وتمكين استراتيجيات جديدة لنمذجة في المختبر أو إصلاح الدماغ المريضة. تحديد أنواع الخلايا غير العصبية المقيمين في الدماغ قابلة للتحويل المباشر في دائرة الهجرة والتجنيس قد تسمح لإطلاق مثل هذا النهج في الموقع، أي داخل أنسجة المخ التالفة. نحن هنا وصف بروتوكول وضعت في محاولة لتحديد الخلايا المشتقة من الدماغ البشري الكبار التي تلبي هذه الفرضية. هذا البروتوكول ينطوي على: (1) زراعة الخلايا البشرية من القشرة المخية التي تم الحصول عليها من الخزعات الدماغ البشري الكبار؛ (2) التوسع في المختبر (التي تتطلب حوالي 2-4 أسابيع) وتوصيف الثقافة التي كتبها كيمياء سيتولوجية مناعية والتدفق الخلوي؛ (3) إثراء من قبل الخلية مضان تنشيط الفرز (FACS) استخدام الألغام المضادة للPDGF مستقبلات β والأجسام المضادة للCD146؛(4) تنبيغ بوساطة الارتجاعي مع النسخ العصبية عوامل sox2 وascl1؛ (5) وأخيرا توصيف الخلايا العصبية الناتجة المشتقة من خلية حوطية يسببها (PdiNs) من قبل كيمياء سيتولوجية مناعية (14 يوما إلى 8 أسابيع بعد تنبيغ فيروسات). في هذه المرحلة، يمكن أن دائرة الهجرة والتجنيس سيتم بحثها لخصائصها الكهربائية عن طريق تسجيل التصحيح، المشبك. يوفر هذا البروتوكول إجراء تكرار للغاية لفي المختبر النسب تحويل pericytes المقيمين في الدماغ الإضافية الإنسان الوظيفية.
المقدمة
بدلا من إعادة برمجة الخلايا الجسدية إلى خلايا الجذعية المحفزة (iPSCs)، والتي بدورها وهبوا مع مجموعة كبيرة من إمكانات التمايز، وتهدف إعادة برمجة المباشر للتحويل مباشرة من نوع واحد خلية معينة إلى أخرى. فيما يتعلق تطبيقها في سياق النمذجة المرض والعلاجات المستندة إلى الخلايا المحتملة، كلا النهجين إعادة برمجة لديها مزايا وعيوب محددة. إعادة برمجة في iPSCs (ط) يوفر مصدرا غير محدود تقريبا من الخلايا؛ (ب) يسمح للهندسة الوراثية؛ (ج) يمنح مع احتمال التمايز غير محدودة تقريبا. ومع ذلك، العيوب الرئيسية لiPSCs تنطوي على خطر tumorigenicity من خلايا غير متمايزة (تشكيل مسخي في الجسم الحي) والحاجة إلى فيفو السابقين زراعة وزرع ال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. عزل والتثقيف من خلايا الدماغ البشري الكبار
يجب أن يتم تنفيذ التجارب التي تنطوي على الأنسجة البشرية وفقا لجميع الأنظمة الحكومية والمؤسسية ذات الصلة فيما يتعلق باستخدام المواد البشرية لأغراض البحث. وقد تم تطوير هذا البروتوكول وفقا لموافقة اللجنة الأخلاقية لكلية الطب في جامعة ميونيخ ميونيخ وموافقة خطية أبلغ من جميع المرضى.
وقد أنشئ هذا البروتوكول الثقافات إعداد من الكبار قشرة الدماغ البشري باستخدام عينة من المرضى من كلا الجنسين يعانون من الصرع الفص الصدغي أو غير مؤلمة الآفات الأخرى عميقة الجذور....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
والنتيجة الأولى لهذا البروتوكول بعد بنجاح إرساء ثقافة من عينة من الكبار الإنسان قشرة الدماغ يتكون في تحديد تركيبة الخلوية للثقافة. كيمياء سيتولوجية مناعية لبروتينات معينة نوع من الخلايا يكشف عن درجة كبيرة من التجانس بين الثقافات المستمدة من عينة من المرضى مختلفة (الشكل 1A). كما كميا بواسطة التدفق الخلوي هناك دائما جزء كبير من الخلايا التي تعبر عن PDGFRβ (في المتوسط ~ 75٪، وتتراوح بين 30 إلى ما يصل إلى 99٪)؛ وعادة ما يتم التعبير عن علامات أخرى من pericytes مثل CD.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يصف هذا البروتوكول التوسع في المختبر وإثراء الخلايا المشتقة من خلية حوطية التالية بمعزل عن الكبار قشرة الدماغ البشري وتحويل اللاحقة في دائرة الهجرة والتجنيس من قبل بوساطة التعبير الارتجاعي من النسخ العصبية عوامل Sox2 وAscl1. يوفر هذا البروتوكول تجريبية في نظام المختبر لدراسة نسب التحويل للخلايا المقيمين في الدماغ في الخلايا العصبية، وربما أيضا الدبقية، مع الهدف في الاعتبار أن تترجم في نهاية المطاف هذا النهج التحويل المباشر في الجسم الحي في وضع ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
نحن ممتنون للدكتور ماغدالينا غوتس لإدخال لها خلال تطوير هذا البروتوكول. نشكر الدكتور ماريوس Wernig (جامعة ستانفورد) لتزويدنا بسخاء مع تسلسل sox2 الترميز. ونحن أيضا ممتنون جدا للدكتور الكسندرا Lepier لإنتاج الفيروس. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من تلقى الفنون إلى MK [بكس] وبتمويل من SYSTHER-ثنائية القومية جمعية الألمانية للبحوث (BE 4182/2-2) وBMBF (01GN1009A) إلى BB، وزارة ولاية بافاريا للعلوم والبحوث و INREMOS المعهد الافتراضي (الألمانية والسلوفينية الوزارات الاتحادية للتعليم والبحوث) وDFG (SFB 824).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 558821 استخدام مضاد CD140b-PE | BD Biosciences | 1: 100 | |
| مضاد CD146-FITC | ABD Serotec | MCA2141FT | استخدام 1: 100 |
| مضاد CD13-FITC | AbD Serotec | MVA1270A488T | استخدام 1:100 |
| مضاد ل CD34-APC | BD Biosciences | 560940 | استخدام 1: 100 |
| مضاد PDGFR & beta ؛ | استخدام إشارات الخلية | 3169S | 1: 200 |
| مضاد ل CD146 | Abcam | Ab75769 | استخدام 1: 400 |
| مضاد ل NG2 | Millipore | AB5320 | استخدام 1: 400 |
| مضاد ل SMA | Sigma-Aldrich | A2547 | استخدام 1: 400 |
| مضاد للبيتا ؛ III-tubulin | Sigma-Aldrich | T8660 | استخدام 1: 400 |
| مضاد ل MAP2 | Sigma-Aldrich | M4403 | استخدام 1: 200 |
| مضاد ل GFAP | Sigma-Aldrich | G3893 | استخدام 1: 600 |
| مضاد ل GFP | Aves Labs | GFP 10-20 | استخدام 1: 1،000 |
| مضاد لطلب تقديم | Chromotek | 5F8 | استخدام 1: 500 |
| مضاد ل S100 & بيتا ؛ | يستخدم Sigma-Aldrich | S2532 | 1: 300 |
| مضاد ل NeuN | Millipore | MAB377 | يستخدم 1: 200 |
| مضاد ل GABA | Sigma-Aldrich | A2052 | يستخدم 1: 500 |
| مضاد لكالريتينين | Millipore | AB5054 | يستخدم 1: 500 |
| مضاد ل vGluT1 | SYnaptic SYstems | 135511 | استخدام 1: 1,000 |
| النمط المتشاوي Rat IgG1 FITC | AbD Serotec | 11-4301-81 | استخدم 1: 100 |
| النمط المتشاوي للجرذ IgG1 PE | AbD Serotec | 12-4301-81 | استخدم 1: 100 |
| التحكم في النمط النظيري للفأر IgG1 APC | AbD Serotec | 17-4301-81 | استخدام 1: 100 |
| TrypLE | Invitrogen | 12605-010 | |
| DMEM ، نسبة عالية من الجلوكوز ، GlutaMAX | Invitrogen | 61965 | |
| B27 مكمل خال من المصل | Invitrogen | 17504044 | |
| مصل ربلة الساق الجنينية | Invitrogen | 10106-169 | إجراء تعطيل الحرارة عن طريق الحضانة عند 56 درجة ؛ C لمدة 30 دقيقة |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| HBSS (محلول الملح المتوازن Hanks) | Invitrogen | 24020-091 | |
| Dulbecco's PBS بدون CaCl2< / sub> و MgCl2< / sub> (D-PBS ، 1x) | Invitrogen | 14190 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Poly-D-lysine هيدروبروميد (PDL) | سيجما ألدريتش | P0899 | |
| PFA (بارافورمالدهايد) | سيجما ألدريتش | P1648 | |
| ألبومين مصل الأبقار | سيجما ألدريتش | A9418 | |
| تريتون X-100 | سيجما ألدريتش | T9284 | |
| DAPI (4 & prime ؛ ، 6-Diamidin-2-phenylindole) ثنائي اللاكتات | Sigma-Aldrich | 042M4005 | |
| Aqua-Poly / جبل | بوليساينس | 18606-20 | |
| أنابيب البولي بروبيلين المستديرة القاع | BD Biosciences | 352063 | |
| أنابيب البوليسترين المستديرة القاع مع غطاء مصفاة الخلية ؛ | بي دي بيوساينسز | 352235 | |
| 24 بئر ألواح | أورانج ساينتفيك | 5530305 | |
| 75 سم < سوب > 2 < / سوپ > قوارير ثقافة | جرينر بيو ون | 658175 | |
| 25 سم < سوب > 2 < / سوپ > قوارير ثقافة | جرينر بيو ون | 690175 | |
| ماصات يمكن التخلص منها 10 مل | سارستيدت | 86.1254.001 | |
| باستور زجاجي ماصات (150 مم) | أغطية زجاجية | FB50251 | |
| بقطر 12 مم | Menzel | CB00120RA1 | |
| مشارط جراحية يمكن التخلص منها | أطباق | الأنسجة 5518083 | |
| براون | Greiner Bio-One | 633180 | |
| أنابيب مخروطية 15 مل | BD Biosciences | 352095 | |
| مركزي لغطاء التدفق | |||
| الصفحي ودوار متأرجح مع محولات لأنابيب 15 مل و 50 مل | Hettich Lab Technology | 1406 | |
| فارز خلايا قياس التدفق: FACSAria l مع برنامج FACSDiva | BD Biosciences | ||
| حاضنة زراعة الخلايا المرطبة | Eppendorf Galaxy 170R | ||
| Wather حمام عند 37 درجة ؛ C | |||
| FACSFسائل غمد منخفض | BD Biosciences | 342003 | |
| مجهر التألق BX61 | مجهر أوليمبوس | ||
| متحد البؤر LSM710 | زايس |
المراجع
- Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476, 224-227 (2011).
- Kim, J., et al. Functional integration of dopaminergic neurons directly converted from mouse f....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
