Summary
استهداف الخلايا المقيمين في الدماغ لإعادة برمجة المباشر النسب-يقدم آفاقا جديدة للإصلاح الدماغ. نحن هنا وصف بروتوكول لكيفية إعداد الثقافات المخصب لpericytes المقيمين في الدماغ من الكبار قشرة الدماغ البشري وتحويل هذه الخلايا العصبية إلى الناجمة عن الفيروس الارتجاعي بوساطة تعبير عن عوامل النسخ Sox2 وAscl1.
Abstract
مباشر النسب-إعادة برمجة الخلايا غير العصبية إلى الخلايا العصبية التي يسببها (INS) قد توفر نظرة ثاقبة لآليات الجزيئية الكامنة وراء تكوين الخلايا العصبية وتمكين استراتيجيات جديدة لنمذجة في المختبر أو إصلاح الدماغ المريضة. تحديد أنواع الخلايا غير العصبية المقيمين في الدماغ قابلة للتحويل المباشر في دائرة الهجرة والتجنيس قد تسمح لإطلاق مثل هذا النهج في الموقع، أي داخل أنسجة المخ التالفة. نحن هنا وصف بروتوكول وضعت في محاولة لتحديد الخلايا المشتقة من الدماغ البشري الكبار التي تلبي هذه الفرضية. هذا البروتوكول ينطوي على: (1) زراعة الخلايا البشرية من القشرة المخية التي تم الحصول عليها من الخزعات الدماغ البشري الكبار؛ (2) التوسع في المختبر (التي تتطلب حوالي 2-4 أسابيع) وتوصيف الثقافة التي كتبها كيمياء سيتولوجية مناعية والتدفق الخلوي؛ (3) إثراء من قبل الخلية مضان تنشيط الفرز (FACS) استخدام الألغام المضادة للPDGF مستقبلات β والأجسام المضادة للCD146؛(4) تنبيغ بوساطة الارتجاعي مع النسخ العصبية عوامل sox2 وascl1؛ (5) وأخيرا توصيف الخلايا العصبية الناتجة المشتقة من خلية حوطية يسببها (PdiNs) من قبل كيمياء سيتولوجية مناعية (14 يوما إلى 8 أسابيع بعد تنبيغ فيروسات). في هذه المرحلة، يمكن أن دائرة الهجرة والتجنيس سيتم بحثها لخصائصها الكهربائية عن طريق تسجيل التصحيح، المشبك. يوفر هذا البروتوكول إجراء تكرار للغاية لفي المختبر النسب تحويل pericytes المقيمين في الدماغ الإضافية الإنسان الوظيفية.
Introduction
بدلا من إعادة برمجة الخلايا الجسدية إلى خلايا الجذعية المحفزة (iPSCs)، والتي بدورها وهبوا مع مجموعة كبيرة من إمكانات التمايز، وتهدف إعادة برمجة المباشر للتحويل مباشرة من نوع واحد خلية معينة إلى أخرى. فيما يتعلق تطبيقها في سياق النمذجة المرض والعلاجات المستندة إلى الخلايا المحتملة، كلا النهجين إعادة برمجة لديها مزايا وعيوب محددة. إعادة برمجة في iPSCs (ط) يوفر مصدرا غير محدود تقريبا من الخلايا؛ (ب) يسمح للهندسة الوراثية؛ (ج) يمنح مع احتمال التمايز غير محدودة تقريبا. ومع ذلك، العيوب الرئيسية لiPSCs تنطوي على خطر tumorigenicity من خلايا غير متمايزة (تشكيل مسخي في الجسم الحي) والحاجة إلى فيفو السابقين زراعة وزرع اللاحقة إذا كانت هذه الخلايا هي لاستخدامها في العلاجات المستندة إلى الخلايا. على العكس، يقتصر المباشر النسب-إعادة برمجة من العائد أقل من الخلايا المطلوبوالذي يرتبط مباشرة مع عدد من الخلايا المستهدفة من السكان بدءا، ولكن تمتلك ميزة أن تظهر الخلايا التي أعيدت برمجتها النسب لعرض أي خطر على مكون للأورام زرع 1،2؛ علاوة على ذلك، يمكن حتى يتحقق إعادة برمجة مباشرة في الموقع، أي داخل الجهاز حيث ستلزم هذه الخلايا، وبالتالي تجنب الحاجة إلى الزرع.
مع هذا في الاعتبار، مختبرنا اتبعت إمكانية خلايا الدماغ مقيم إعادة برمجة النسب في دائرة الهجرة والتجنيس كما نهجا جديدا نحو العلاجات المستندة إلى الخلايا من أمراض الاعصاب. تتكون خلايا الدماغ المقيمين التي قد يحتمل اعتباره أهداف الخلوية لإعادة برمجة النسب-أنواع مختلفة من الدبق الكبروي (الخلايا النجمية، وخلايا NG2 و oligodendrocytes)، الخلايا الدبقية الصغيرة، وخلايا المرتبطة microvessel (الخلايا البطانية وpericytes). درسنا على نطاق واسع لإعادة برمجة المحتملة في المختبر من دبق نجمي الخلايا الدماغية من مجلس النوابتكس في وقت مبكر بعد الولادة الفئران 3-5. بحثا عن مصادر خلية مناسبة مماثلة لمباشرة النسب-إعادة برمجة الدماغ في الإنسان البالغ، ونحن اجه السكان الخلية التي يمكن برمجتها بنجاح في دائرة الهجرة والتجنيس والدمغات المعرض من pericytes. نحن هنا وصف بروتوكول لكيفية جني هذه الخلايا من الخزعات الدماغ البشري الكبار، لتوسيع وإثراء هذه الخلايا في المختبر، وأخيرا إعادة برمجة بنجاح جزء كبير من هذه الخلايا في المختبر الموسعة (في حدود 25-30٪) في دائرة الهجرة والتجنيس. لا يمكن أن يتحقق عن طريق إعادة برمجة وقت واحد بوساطة الارتجاعي شارك في التعبير عن اثنين من عوامل النسخ، sox2 وascl1. تم العثور على هذه PdiNs لاكتساب قدرة العمل المتكررة إطلاق إمكانات لخدمة أهداف ومتشابك أما الخلايا العصبية الأخرى مما يدل قدرتها على الاندماج في الشبكات العصبية. يوفر بروتوكول لدينا إجراءات واضحة لعزل ونسب التحويل من pericytes الدماغ البشري الكبار في دائرة الهجرة والتجنيس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. عزل والتثقيف من خلايا الدماغ البشري الكبار
يجب أن يتم تنفيذ التجارب التي تنطوي على الأنسجة البشرية وفقا لجميع الأنظمة الحكومية والمؤسسية ذات الصلة فيما يتعلق باستخدام المواد البشرية لأغراض البحث. وقد تم تطوير هذا البروتوكول وفقا لموافقة اللجنة الأخلاقية لكلية الطب في جامعة ميونيخ ميونيخ وموافقة خطية أبلغ من جميع المرضى.
وقد أنشئ هذا البروتوكول الثقافات إعداد من الكبار قشرة الدماغ البشري باستخدام عينة من المرضى من كلا الجنسين يعانون من الصرع الفص الصدغي أو غير مؤلمة الآفات الأخرى عميقة الجذور، غير الخبيثة. ويعتبر النسيج التي تم الحصول عليها من غرفة العمليات الجراحية تتألف حصرا القناة الوصول إلى آفة الدماغ وبالتالي صحية. كانت الفئة العمرية من المرضى 19-70 سنة.
- إعداد النمو المتوسطة بإضافة الحرارة المعطل مصل العجل الجنين(FCS) لDMEM الجلوكوز عالية مع GlutaMAX للحصول على تركيز النهائي من 20٪ FCS. إضافة 5 مل البنسلين / الستربتوميسين إلى ما مجموعه 500 مل متوسطة النمو. تنفيذ هذه الخطوات اللاحقة وجميع الظروف التي تتطلب ثقافة عقيمة في غطاء تدفق الصفحي المناسبة.
- الحفاظ على خزعة الدماغ البشري الكبار الحصول عليها من غرفة العمليات الجراحية في هانكس "محلول ملحي متوازن مع و CaCl 2 و MgCl 2 (HBSS) المتوسطة بما في ذلك HEPES (10 ملي تركيز النهائي) على الجليد حتى المعالجة. بدء معالجة في أقرب وقت ممكن.
- لبدء التفكك إلى خلايا واحدة، ونقل الأنسجة في طبق بتري 65 مم واللحم المفروم إلى قطع صغيرة باستخدام المشارط اثنين معقمة تستخدم مرة واحدة. لاستخدام الهضم الأنزيمي 3-6 مل TrypLE في أنبوب 15 مل المخروطية واحتضان لمدة 15-30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حمام مائي.
- إضافة 1 حجم prewarmed المتوسطة النمو لتسهيل التفكك ويسحن بلطف محلول يحتوي على قطعة نسيج صعودا وهبوطا باستخدام الأولى5 مل ماصة للتصرف، تليها باستخدام ماصة باستير الزجاج حتى تجانس تعليق الخلية. عادة، وبعض القطع الأنسجة المتبقية، والتي تتكون في معظمها من المادة البيضاء، سوف تبقى في التعليق.
- تدور باستمرار في 157 x ج لمدة 5 دقائق و resuspend بيليه في كمية مناسبة من النمو المتوسط (10 مل لكل ثقافة غير المصقول T75 القارورة). استخدام أحد T75 قارورة الثقافة لخزعة من 5-10 مم في الحجم واستقراء من هذا في حالة العينات الكبيرة.
- وضع الخلايا في الحاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 و 5٪ O 2.
- استبدال نصف المتوسط كل 3-4 أيام حتى وصلت الخلايا confluency. هذا عادة ما يستغرق فترة تصل إلى أسبوعين (المشار إليها باسم مرور 0 [P0]).
2. في المختبر التوسع وتوصيف خلايا الدماغ البشري الكبار
- في التوسع المختبر:
- نضح مستنبت ويغسل مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، وأبقى في غرفة رemperature، قبل أن يضيف 3 مل TrypLE.
- احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق حتى معظم خلايا منفصلة. بلطف الاستفادة من القوارير لتسهيل رفع الخلايا؛ بعد إضافة 3 مجلدات متوسطة النمو، ونقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 مل وتدور باستمرار في 157 x ج لمدة 5 دقائق و resuspend الخلايا في كمية مناسبة من النمو المتوسط.
- مرور الخلايا في نسبة 1:3 لمحصول الأمثل في قوارير جديدة خلية ثقافة T75.
ملاحظة: لقد passaged هذه الخلايا حتى P5 دون أي علامات على انخفاض الكفاءة إعادة برمجة. بينما في P0 ثقافة يحتوي على جزء كبير من الخلايا البطانية (وفقا لتقييم CD34 التعبير)، في المقاطع اللاحقة يصبح عددهم لا يذكر.
- توصيف الثقافات الدماغ البشري الكبار:
- كيمياء سيتولوجية مناعية:
- لتوصيف الخلايا، وبذور ~ 60،000 الخلايا على بولي-D-يسين المغلفة غطاء زجاجي ينزلق في 500 ميكرولتر واسطة نمو جديدةم في 24 جيدا لوحات زراعة الأنسجة واحتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 و 5٪ O 2.
- لتحليل immunocytochemical من خلايا الدماغ البشري مثقف إزالة المتوسطة وغسل 3X مع 1 مل من برنامج تلفزيوني.
- إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- نقل غطاء زجاجي ينزلق الى غرفة تلطيخ مرطب مناسب ومنع مع 80 ميكرولتر PBS تحتوي على 3٪ ألبومين المصل البقري (BSA) و 0.5٪ تريتون X-100 لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة الأجسام المضادة الأولية مخففة في نفس الحل (للعوامل التخفيف انظر الجدول من الكواشف والمعدات محددة)، واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية أو 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: A جزء كبير ولكن متفاوتة من الخلايا في هذه المرحلة من زراعة هي مناعيا للنمو β مستقبلات عامل المستمدة من الصفائح الدموية (PDGFRβ)، مجموعة من التمايز 146 (CD146)، NG2 كبريتات شوندروتن PROTEOغليكان، وأكتين العضلات الملساء (SMA)، أي علامات مميزة للpericytes المرتبطة microvessel. أقلية فقط (<1٪) عن علامات astroglial الدبقية ييفي الحمضية البروتين (GFAP) وS100β. علاوة على ذلك، في هذه المرحلة يجب أن تكون ثقافة خالية من أي خلايا معربا عن العصبية علامة βIII-تويولين. استخدام عدة تركيبات الأجسام المضادة الأولية لاشتراكهما في وضع العلامات من علامات مختلفة. مزيد من التأكيد للتعبير عن الدبقية، الخلايا العصبية، والبطانية خلية حوطية علامات يمكن الحصول على النسخ العكسي والكمي في الوقت الحقيقي تفاعل البلمرة المتسلسل (وليس وصفها في هذا البروتوكول). - بعد الحضانة مع الأجسام المضادة الأولية يغسل ثلاث مرات مع 1 مل PBS وإضافة الأجسام المضادة الثانوية المقابلة (في التخفيفات المناسبة) إلى حل تلطيخ واحتضان 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. غسل الخلايا 3X مع برنامج تلفزيوني. إذا لزم الأمر، وذلك قبل التركيب تشمل تلطيخ مع دابي لمدة 5 دقائق في غرفةدرجة الحرارة.
- استخدام antifading تصاعد المتوسطة وتحليل زلات الغطاء باستخدام المجهر epifluorescence أو المجهر متحد البؤر.
- التدفق الخلوي:
- لتحليل السطح علامة التعبير باستخدام التدفق الخلوي، وتنمو الخلايا لconfluency في T25 T75 غير المصقول أو قوارير خلية ثقافة.
- فصل الخلايا باستخدام TrypLE كما هو موضح من قبل وresuspend في حل تلطيخ تتكون من برنامج تلفزيوني + 0.5٪ BSA. في رد فعل تلطيخ، في resuspend 100،000-200،000 الخلايا في 100 ميكرولتر من الحل تلطيخ. إعداد ردود الفعل تلطيخ واحد لكل الأجسام المضادة المستخدمة (CD146-FITC، CD140b-PE، CD34-APC، CD13-FITC، والأجسام المضادة isotype السيطرة منهما).
- إضافة الأجسام المضادة تألقي مترافق إلى كل حل تلطيخ (لالتخفيفات انظر الجدول من الكواشف والمعدات الخاصة) مباشرة في تعليق خلية واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في الظلام.
- غسل الخلايا ثلاث مرات مع 500 ميكرولتر برنامج تلفزيوني وتدور باستمرار بين كلخطوة الغسيل في 157 x ج لمدة 5 دقائق.
- resuspend الكرية خلية في حل 0.5-1 مل تلطيخ الخلايا ونقل من خلال مصفاة الخلية (70 ميكرومتر) إلى أنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية. حماية عينة من التعرض للضوء.
- عينات دوامة قبل وضعها في الصك نظام مراقبة الأصول الميدانية.
- لتحليل الخلايا الحية واستبعاد الحطام والركام الخلية، بوابة FSC-A وSSC-A. هي بوابات duplets الخلايا على وجه التحديد من قبل FSC-A وFSC-W. لتحديد الظروف النابضة الصحيح للعلامات سطح الخلية تعيين البوابات مع التحكم الضد مطابقة نمط إسوي مترافق إلى تألقي منها. ثم تحديد نسبة الخلايا محددة الأجسام المضادة.
- كيمياء سيتولوجية مناعية:
3. إثراء للخلايا خلية حوطية المستمدة من قبل خلية الإسفار المنشط الفرز
- تنقية السكان الخلية خلية حوطية (معلق في النمو متوسطة) قبل تنبيغ عبر نظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز باستخدام فوهة 70 ميكرون. استخدام CD34-APC بالاشتراك مع CD140b-PE-CD146 وFITC لتحديد لpericytes. الفرز لل-CD34 السلبية، خلايا CD140b، وCD146 إيجابية.
- جمع الخلايا فرزها في متوسطة النمو وعلى لوحة بولي-D-يسين المغلفة غطاء زجاجي ينزلق في 24 جيدا لوحات زراعة الأنسجة واحتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 و 5٪ O 2.
- 48 ساعة بعد فرز استبدال المتوسطة مع المتوسطة النمو الطازجة وأداء تنبيغ كما هو موضح في البروتوكول 4.
4. فيروسات الرجعية تنبيغ من الخلايا المشتقة من خلية حوطية وإعادة برمجة الخلايا العصبية في المستحثة
ملاحظة: يرجى الرجوع إلى المبادئ التوجيهية للسلامة الأحيائية المحلية عند التعامل مع جسيمات فيروس. في ألمانيا استخدام الفيروسات القهقرية المستخدمة هنا تتطلب مستوى السلامة الحيوية 2. لإنتاج جزيئات فيروس الرجوع إلى بروتوكول 6. ليبني فيروسات المستخدمة لإعادة البرمجة، راجع Karow وآخرون (2012). وكانت الفيروسات القهقرية pseudotyped مع VSV-G (التهاب الفم الحويصلي الفيروسات غليكوالبروتين) 5. لإنتاج يرجى الرجوع إلى غافريلسكو وآخرون 6.
- 24 ساعة قبل البذور تنبيغ فيروسات ~ 60،000 الخلايا على بولي-D-يسين المغلفة غطاء زجاجي ينزلق في 500 ميكرولتر المتوسطة النمو الطازجة في لوحات جيدا 24 زراعة الأنسجة واحتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 و 5٪ O 2 .
- في اليوم التالي، استبدال المتوسطة النمو مع 500 ميكرولتر الطازجة والمتوسطة النمو prewarmed وإضافة 1 ميكرولتر من supernatants تتركز منها تحتوي على جزيئات فيروس (pCAG-IRES dsred للسيطرة، وخصوصا خلال إنشاء البروتوكول في المختبر)، pCAG-ascl1 -IRES dsred، pCAG-sox2-IRES-GFP.
- في وقت لاحق يوم واحد، وإزالة المتوسطة بما في ذلك الجزيئات الفيروسية من الخلايا وإضافة 1 مل الطازجة، prewarmed B27-التمايز المتوسطة، ويتألف من 49 مل DMEM الجلوكوز عالية مع GlutaMAX و 1 مل B27 المصل خالية الملحق. الحفاظ على الخلايا في الثقافة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 و 5٪ O 2 لمدة 4-8 أسابيع دون تغيير المتوسطة وتصبح التغييرات المتكررة المتوسطة الضارة كما INS تنضج.
5. توصيف الخلايا العصبية المستحثة بواسطة كيمياء سيتولوجية مناعية
- لتحديد هوية الخلوية للخلايا transduced، ولا سيما للتدليل على الاستحواذ على النمط الظاهري العصبية، نفذ مناعية ضد مستضدات الخلايا العصبية مثل bIII-تويولين، MAP2، وNeuN (عن الأجسام المضادة والتخفيفات كل منها، انظر الجدول الكواشف محددة و المعدات؛ اتباع نفس الإجراء كما هو مبين في 2.2.1).
- لتحسين نضوج PdiNs، وشارك في ثقافة هذه الخلايا مع الخلايا العصبية المشتقة من E14 الماوس القشور الدماغي. تحقيقا لهذه الغاية، تشريح قشرة الدماغ وفصل الأنسجة ميكانيكيا مع كوب باستور ماصة مصقول النار. إضافة 10،000-50،000 الخلايا العصبية الفئران على الثقافات من الخلايا المشتقة من خلية حوطية 2-3 أسابيع التالية تنبيغ مع sox2 وascl1 إعادة ترميزtroviruses ومواصلة زراعة. خلايا Transduced يمكن تمييزها عن الخلايا العصبية الفئران بحكم مراسل (GFP وdsRed) التعبير، إما عن طريق epifluorescence حية أو التالية للكيمياء سيتولوجية مناعية GFP وdsRed.
- لتقييم تكوين نقاط الاشتباك العصبي على PdiNs بواسطة الخلايا العصبية الفئران، نفذ مناعية ضد مستقبلات الناقل العصبي الحويصلي مثل نقل الغلوتامات الحويصلي 1 (vGluT1).
- بحث الخلايا transduced لخصائصها الكهربائية (أي القدرة على توليد إمكانات العمل) وإنشاء نقاط الاشتباك العصبي وظيفية من قبل التصحيح، المشبك الكهربية. للاطلاع على تفاصيل الإجراء نرى هاينريش آخرون (2011).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
والنتيجة الأولى لهذا البروتوكول بعد بنجاح إرساء ثقافة من عينة من الكبار الإنسان قشرة الدماغ يتكون في تحديد تركيبة الخلوية للثقافة. كيمياء سيتولوجية مناعية لبروتينات معينة نوع من الخلايا يكشف عن درجة كبيرة من التجانس بين الثقافات المستمدة من عينة من المرضى مختلفة (الشكل 1A). كما كميا بواسطة التدفق الخلوي هناك دائما جزء كبير من الخلايا التي تعبر عن PDGFRβ (في المتوسط ~ 75٪، وتتراوح بين 30 إلى ما يصل إلى 99٪)؛ وعادة ما يتم التعبير عن علامات أخرى من pericytes مثل CD146، NG2 وCD13 في مجموعة أقل (الشكل 1B). وبالمثل يتم التعبير SMA في جزء من السكان طفيفة من الخلايا المستزرعة، على النحو الذي يحدده مناعية (الشكل 1A). في مرور 0 (P0)، وهناك عادة <10٪ من الخلايا البطانية-CD34 إيجابي، وانخفاض عددهم أدناه الكشف مع مزيد من الركض. وبالمثل، astrocytوفاق تضم سوى تلوث ضئيلة في المقاطع السابقة. وعلاوة على ذلك، هناك عادة أي الخلايا التي صمة عار للخلايا الجذعية العصبية، الخلايا العصبية، أو علامات دبقية قليلة التغصن. Immunocytochemical والتدفق الخلوي البيانات يتم تدعيم بالكامل من قبل الكمي RT-PCR 7. وباختصار، فإن أكبر جزء داخل الثقافة عن البروتينات وmRNAs وسمة من pericytes. ويمكن تحقيق مزيد من التخصيب لخلايا المستمدة من خلية حوطية بواسطة نظام مراقبة الأصول الميدانية في هذه المرحلة. وهذا هو ذات الصلة ولا سيما عندما نقاء الثقافة هي في الطرف الأدنى من الطيف كما يتضح من مستوى PDGFRβ التعبير. وبالتالي، فإننا قد تستخدم الأجسام المضادة ضد PDGFRβ (CD140b) وحدها أو بالاشتراك مع الأضداد المضادة للCD146، مع استبعاد أي ملوثات-CD34 إيجابي، لFAC-نوع تحديدا pericytes (الشكل 1C).
Transducing هذه الثقافات مع الفيروسات السيطرة ترميز الجين المراسل فقط، لا يغير على علامة التعبير عROFILE (تقييم 3-4 أسابيع التالية تنبيغ)، مشيرا إلى أن هذه الخلايا تبقى في سلالته خلية حوطية. وبالمثل، لا ينتج بوساطة الارتجاعي التعبير عن Sox2 وحدها في أي تغييرات في التشكل العلني ولا يدفع التعبير bIII-تويولين مما يوحي بأن Sox2 وحدها ليست كافية للحث على تحويل مصير. في المقابل، وهي نسبة منخفضة (حوالي 10٪) من الخلايا transduced مع ترميز ascl1 الارتجاعي وحده المعرض التعبير βIII-تويولين، ولكن دون الحصول على مورفولوجيا الخلايا العصبية. لافت للنظر، ما يقرب من 50٪ من جميع وsox2 الخلايا cotransduced ascl1 إظهار التعبير βIII-تويولين والأهم من ذلك، ثلث هذه الخلايا المزدوج transduced (تصور بحكم ضعف مراسل التعبير) عرض أيضا العمليات العصبية (الشكل 2). جنبا إلى جنب مع اكتساب ميزات العصبية والتعبير عن PDGFRβ هو تنظيم أسفل 7. مع مزيد من النضج في الثقافة، وتصبح وsox2 الخلايا coexpressing ascl1 أيضا إمانoreactive للعلامات العصبية أكثر نضجا MAP2 (تلطيخ العمليات شجيري) وNeuN (تلطيخ أجسام الخلايا العصبية في الغالب). كما هو مبين أدناه هذه التغييرات في علامة التعبير ترتبط أيضا مع اكتساب بصمات الكهربية للخلايا العصبية. باختصار، توفر هذه البيانات دليلا لتحويل مصير المباشر من الخلايا المشتقة من خلية حوطية في دائرة الهجرة والتجنيس، ويشار إلى PdiNs. هذه PdiNs الصلاحية لإنشاء مقصورات بعد المشبكي وظيفية كما كشفت في التجارب coculture مع الخلايا العصبية من الماوس الجنينية القشرة الدماغية. يمكن البرهنة هذا الاختصاص electrophysiologically في مظهر من المدخلات متشابك (انظر المناقشة أدناه)، وكذلك زخرفة العمليات شجيري من PdiNs مع محطات قبل المشبكي المستمدة من الخلايا العصبية شارك في تربيتها (تتميز مجموعات من النقل العصبي الحويصلي، مثل vGluT1 مناعية). هذه البيانات تشير إلى مزيد من قدرة على الاندماج في PdiNs العصبية جircuits.
الشكل 1. التعبير غير المتجانسة من علامات خلية حوطية في الثقافات المستمدة من الكبار قشرة الدماغ البشري. A) الميكروسكوب نيون توضح التعبير غير متجانسة من علامات خلية حوطية (PDGFRb، SMA، CD146) كما يتضح من مناعية. مقياس بار = 50 ميكرون. ب) الرسم البياني يلخص الأعداد النسبية للخلايا إيجابية بالنسبة للعلامات خلية حوطية PDGFRβ (CD140b)، CD13، CD146 وعلى النحو الذي يحدده التدفق الخلوي الثقافات المستمدة من المريض مختلفة. CD34 هي علامة للحصول على الخلايا البطانية. C) FACS نقطة المؤامرات التي تصور نمط إسوي ضبط والخلايا البشرية CD146 / CD140b الملون للفرز من pericytes المزدوج الايجابية (التي أبرزها مربع أحمر) لإعادة برمجة لاحقة. نلاحظ ارتفاع معدل PDGFRβ التعبير وعدم التجانس فيما يتعلق CD146 التعبير في هذه الثقافة خاصة.
. الشكل 2 إعادة برمجة الخلايا المشتقة من خلية حوطية الإنسان البالغ إلى INS الأعلى: التجريبية مجموعة المتابعة. أدناه: الميكروسكوب نيون تصور الخلايا transduced مع ترميز الارتجاعي sox2-IRES-GFP وascl1-IRES-DsRed. لاحظ أن الخلايا فقط transduced مزدوجة (النصال) التعبير عن bIII-تويولين (اللوحة اليمنى) ويحمل مورفولوجيا الخلايا العصبية.
| انقسام الخلايا [٪] | موت الخلايا [٪] | bIII-تويولين + [٪] | |
| 36 | 3 | 0 | |
| Sox2 | 46 | 7 | 0 |
| Ascl1 | 26 | 33 | 7 |
| Sox2-Ascl1 | 3 | 36 | 25 |
الجدول 1. سلوك الخلايا المشتقة من خلية حوطية تمر تحويلها إلى PdiNs وفقا لتقييم التصوير الحي المستمر. لاحظ أن Sox2 وAscl1 المشترك، معربا عن دورة الخلايا خلية الخروج. وعلاوة على ذلك، لاحظ ارتفاع معدل موت الخلايا التالية Ascl1 أو Sox2 وAscl1-coexpression. مع الأخذ بعين الاعتبار هذه الأحداث الخلوية متميزة، ما يقرب من 25٪ من جميع الخلايا transduced المشارك تصبح دائرة الهجرة والتجنيس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف هذا البروتوكول التوسع في المختبر وإثراء الخلايا المشتقة من خلية حوطية التالية بمعزل عن الكبار قشرة الدماغ البشري وتحويل اللاحقة في دائرة الهجرة والتجنيس من قبل بوساطة التعبير الارتجاعي من النسخ العصبية عوامل Sox2 وAscl1. يوفر هذا البروتوكول تجريبية في نظام المختبر لدراسة نسب التحويل للخلايا المقيمين في الدماغ في الخلايا العصبية، وربما أيضا الدبقية، مع الهدف في الاعتبار أن تترجم في نهاية المطاف هذا النهج التحويل المباشر في الجسم الحي في وضع الدماغ الكبار.
الاعتبارات التقنية
في دراستنا نحن تستخدم أنسجة المخ البشري من المرضى الذين تتراوح أعمارهم بين 19 و 70 عاما، من كلا الجنسين. نحن لم يلاحظوا فرقا العلني في كفاءة إعادة برمجة اعتمادا على نوع الجنس أو العمر 7. ومع ذلك فمن المستحسن لتوثيق هذه المعلومات عن الاختلافات أكثر دهاء قد يكون مع ذلكلاحظ أن هرب اهتمامنا.
ويوصى كذلك لبدء معالجة في أقرب وقت ممكن بعد نقل العينة إلى مختبر الأنسجة. سيكون هناك بالضرورة بعض المجاهيل إلى متى ظلت الأنسجة في غرفة العمليات الجراحية قبل نقلها إلى التجريبي. نحن نقدر أن في دراستنا 7 الوقت بين إزالة من دماغ المريض لبدء إجراء زراعة تراوحت بين 2-6 ساعة، مع العينات يتم الاحتفاظ كل وقت على الجليد. وقد لاحظت أي اختلاف علني في سهولة المعالجة اللاحقة ولا أي نتائج سلبية في هذا الإطار الوقت.
تقييم نقدي لأي بروتوكول يتعلق بساطتها، استنساخ، والكفاءة. هذا البروتوكول واضح وصريح في أنه خلال خلايا المرحلة الأولى يتم توسيع في وسيلة غير مكلفة والتي يمكن الحصول عليها بسهولة، تليها مرحلة ثانية من إعادة برمجة الخلية باستخدام اثنين فقط من النسخ كرة القدمctors وزراعة في وسط محددة.
بشأن استنساخ، لاحظنا أن نوعية إعداد الارتجاعي أمر في غاية الأهمية، مع انخفاض الاستعدادات فيروس عيار المستخدمة في التخفيفات لتتناسب مع عدد الجسيمات المعدية من الفيروسات عيار عالية مما أدى إلى فشل إعادة برمجة كثير من الأحيان. في واقع الأمر لاحظنا أن نفس الثقافة خلية حوطية التي فشلت سابقا إعادة برمجة يمكن تحويلها بنجاح في دائرة الهجرة والتجنيس عند استخدام الفيروسات عيار عالية.
بشأن كفاءة التحويل، قمنا بتقييم عدد من-تويولين إيجابية βIII الخلايا المشتقة من الخلايا وsox2-cotransduced ascl1 باستخدام التصوير الحي المستمر. تصوير حي يسمح لتقييم عدد من الخلايا التي تخضع لانقسام الخلايا أو موت الخلية أثناء عملية التحويل، في حين تفتقر هذه المعلومات عندما يتم تحديد عدد من ولدت الإضافية فقط عند نقطة نهاية التجربة. في الواقع باستخدام الوقت الفاصل بين صغار الفيديونسخة (لإجراء الرجوع إلى أورتيغا ه ر آل 8) لوحظ أن الخلايا transduced عامل untransduced واحد يستمر تكاثر، في حين وsox2 الخلايا cotransduced ascl1 الخروج بسرعة دورة الخلية. علاوة على ذلك، جزءا كبيرا من السكان الأخير يخضع لموت الخلايا. بينما سمية الارتجاعي لا يمكن استبعاد رسميا من البيانات التي تم الحصول عليها في دراستنا 7، لوحظ أن زيادة موت الخلايا فقط عندما أعرب عن ascl1 (وحدها أو بالاشتراك مع sox2)، ونحن نفسر هذا كدليل لصراع كارثي من مصائر خلية . أخذ هذين الحدثين في الاعتبار، ونحن نقدر أن 25٪ من جميع وsox2 الخلايا cotransduced ascl1 تحويلها الى دائرة الهجرة والتجنيس إيجابية bIII-تويولين (الجدول 1).
كما هو مطلوب على الاطلاق شارك في تنبيغ لإعادة برمجة ناجحة، يمكن للمرء أن ينظر في استخدام ترميز ناقلات فيروسية كلا الجينات لتحسين كمية الخلايا معربا عن عوامل في نفسالوقت.
في الآونة الأخيرة، Ladewig وآخرون. وضع بروتوكول لتحويل بكفاءة الخلايا الليفية إلى INS الحصول على العائد من 200٪ باستخدام الصغيرة القائمة على تثبيط جزيء من الجليكوجين كيناز سينسيز-3β وصماد إشارة 9. سيكون من المثير للاهتمام أن تحديد ما إذا كانت هذه الوظائف الإضافية لبروتوكول لدينا تحسين العائد من إنتاج PdiN.
آخر نتائج مثيرة للاهتمام من تصوير حي لعملية إعادة برمجة يتعلق حقيقة أن تحويل pericytes الإنسان البالغ إلى INS يحدث في وتيرة بطيئة نوعا ما مقارنة مع بروتوكولات مماثلة في إعادة برمجة الخلايا الجسدية ثقافات مختلفة من الماوس أصل 4. وهذا يتفق مع نضوج بطيئة مميزة من الخلايا العصبية البشرية 10.
في حين أننا لم تحليل منهجي لتأثير التوتر على الأكسجين العائد من إنتاج PdiN، لاحظنا أن الحضانة في ظروف انخفاض الأكسجين (5٪) عموماأعطى نتائج متفوقة بالمقارنة مع زراعة الخلايا في ظروف normoxic (21٪). في الآونة الأخيرة، دافيلا وآخرون وصفت تأثير تعزيز مماثلة انخفاض توتر الأوكسجين للتحريض الإضافية من الخلايا الليفية الإنسان 11.
ويستند بروتوكول لدينا على تسليم فيروسات من sox2 وascl1 بينما استخدمت الأخرى بروتوكولات التحويل المباشر ناقلات محرض lentiviral 1، 12، 13. في الآونة الأخيرة قمنا أيضا تطبيقها بنجاح الدوكسيسيكلين محرض يبني lentiviral ترميز sox2 وascl1، مما يدل على أن نبضة قصيرة نسبيا (10 يوما) من Sox2 وAscl1 التعبير هي كافية للتسبب تحويل خلية حوطية إلى الخلايا العصبية. تم تصميم الفيروسات القهقرية المستخدمة في دراستنا 7 لخفض إسكات 5. وفقا لذلك، لم نلاحظ ظهور الخلايا العصبية تخلو من مراسل التعبير الجيني. ومع ذلك، فإن احتمال أن مستويات التعبير عموما على حد سواء التحويرق ومراسل التغيير مع مرور الوقت لا يمكن استبعادها. النهج خالية من التكامل (باستخدام الفيروسات سينداي) وقد استخدمت في الآونة الأخيرة في حالة من جيل الأسلاف العصبية التي يسببها 14، ولكن حاليا ليس من المعروف ما إذا كان هذا أو استراتيجيات إعادة برمجة حتى خالية من الفيروسات يمكن تطبيقه بنجاح لتحويل pericytes الإنسان. أخيرا، ما إذا كان يمكن pericytes المستمدة من الأنسجة الأخرى الخضوع لتحويلها إلى أنواع الخلايا العصبية التي يسببها يبقى لفحصها.
الاعتبارات المفاهيمية
والنتيجة الحاسمة لإعادة برمجة الخلايا الجسدية إلى دائرة الهجرة والتجنيس يتعلق ظائفها 15. قمنا بتقييم الخصائص الكهربية من PdiNs في نقاط زمنية مختلفة بعد بداية عملية إعادة برمجة. في المراحل المبكرة جدا، أي 2 أسابيع التالية تنبيغ فيروسات، PdiNs المعرض بالكاد علامات استثارة الكهربائية، وعلى الرغم من التعبير βIII-تويولين في هذه المرحلة. وبالتالي، فإن معظموأجريت التحليلات الكهربية 4-8 أسابيع التالية تنبيغ مع sox2 وascl1. كما هو موضح في Karow وآخرون، وتتميز PdiNs قبل النضج كبيرا كما يتجلى في المقاومة مدخلات عالية ومنخفضة التردد من اطلاق العمل المحتملين. ويمكن تعزيز مزيد من النضج من قبل PdiNs شارك في زراعة الخلايا العصبية مع المستمدة من الماوس E14 القشرة الدماغية. في ظل هذه الظروف، PdiNs يحمل إمكانات العمل ترددات أعلى وزيادة التيارات الصوديوم 7. علاوة على ذلك، يكشف coculturing اختصاص PdiNs لتلقي مدخلات متشابك وظيفية من الخلايا العصبية الماوس. في خلاصة القول، PdiNs اكتساب خصائص الخلايا العصبية الوظيفية التي يمكن أن يتعزز على coculturing مع الخلايا العصبية الأخرى. ومع ذلك، فإنه يبقى أن يظهر ما إذا كان يمكن أيضا إنشاء PdiNs المقصورات قبل المشبكي وظيفية. وهناك حاجة إلى المزيد من الدراسات زرع PdiNs في الدماغ للكشف عن إمكاناتهم للوصول إلى مرحلة النضج الكامل والأداء الوظيفي.
Uالغناء sox2 وascl1 كعوامل إعادة برمجة لاحظنا أن PdiNs الناتجة اكتساب ميزات الخلايا العصبية GABAergic 7. ومن المثير للاهتمام، وضعت مجموعة بروتوكولات أخرى لتحويل الخلايا الليفية إلى INS باستخدام عامل النسخ المختلفة و / أو مجموعات الرنا الميكروي ونتيجة لذلك خصوصيات النامية اكتسبت مواصفات العصبي متميزة مثل الجلوتامين، الدوبامين، والنمط الظاهري كوليني 1، 16-18. يبقى أن اختبار ما إذا كانت التركيبات عامل المستخدمة في الخلايا الليفية لحث على هوية المرسل نفسه في PdiNs. علاوة على ذلك، عمل مؤخرا توسعت الطيف تحويل راء تكوين الخلايا العصبية لتوليد الخلايا الجذعية العصبية 19، 20 أو الدبقية، في قليلة التغصن خاصة 21 و 22. إذا كانت هذه البروتوكولات إعادة برمجة انتزاع نتيجة مماثلة في الخلايا المشتقة من خلية حوطية الدماغ البشري الكبار، وهذا من شأنه توسيع كبير بانوراما من تطبيقات هذا الاستيرادالنمل المقيمين في الدماغ نوع من الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
نحن ممتنون للدكتور ماغدالينا غوتس لإدخال لها خلال تطوير هذا البروتوكول. نشكر الدكتور ماريوس Wernig (جامعة ستانفورد) لتزويدنا بسخاء مع تسلسل sox2 الترميز. ونحن أيضا ممتنون جدا للدكتور الكسندرا Lepier لإنتاج الفيروس. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من تلقى الفنون إلى MK [بكس] وبتمويل من SYSTHER-ثنائية القومية جمعية الألمانية للبحوث (BE 4182/2-2) وBMBF (01GN1009A) إلى BB، وزارة ولاية بافاريا للعلوم والبحوث و INREMOS المعهد الافتراضي (الألمانية والسلوفينية الوزارات الاتحادية للتعليم والبحوث) وDFG (SFB 824).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-CD140b-PE | BD Biosciences | 558821 | use 1:100 |
| anti-CD146-FITC | AbD Serotec | MCA2141FT | use 1:100 |
| anti-CD13-FITC | AbD Serotec | MVA1270A488T | use 1:100 |
| anti-CD34-APC | BD Biosciences | 560940 | use 1:100 |
| anti-PDGFRβ | Cell Signaling | 3169S | use 1:200 |
| anti-CD146 | Abcam | Ab75769 | use 1:400 |
| anti-NG2 | Millipore | AB5320 | use 1:400 |
| anti-SMA | Sigma-Aldrich | A2547 | use 1:400 |
| anti-βIII-tubulin | Sigma-Aldrich | T8660 | use 1:400 |
| anti-MAP2 | Sigma-Aldrich | M4403 | use 1:200 |
| anti-GFAP | Sigma-Aldrich | G3893 | use 1:600 |
| anti-GFP | Aves Labs | GFP 10-20 | use 1:1,000 |
| anti-RFP | Chromotek | 5F8 | use 1:500 |
| anti-S100β | Sigma-Aldrich | S2532 | use 1:300 |
| anti-NeuN | Millipore | MAB377 | use 1:200 |
| anti-GABA | Sigma-Aldrich | A2052 | use 1:500 |
| anti-Calretinin | Millipore | AB5054 | use 1:500 |
| anti-vGluT1 | SYnaptic SYstems | 135511 | use 1:1,000 |
| Rat IgG1 isotype control FITC | AbD Serotec | 11-4301-81 | use 1:100 |
| Rat IgG1 isotype control PE | AbD Serotec | 12-4301-81 | use 1:100 |
| Rat IgG1 isotype control APC | AbD Serotec | 17-4301-81 | use 1:100 |
| TrypLE | Invitrogen | 12605-010 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Invitrogen | 61965 | |
| B27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10106-169 | perform heat inactivation by incubation at 56 °C for 30 min |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) | Invitrogen | 24020-091 | |
| Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1x) | Invitrogen | 14190 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| PFA (paraformaldehyde) | Sigma-Aldrich | P1648 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| DAPI (4′,6-Diamidin-2-phenylindole) dilactate | Sigma-Aldrich | 042M4005 | |
| Aqua-Poly/Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap | BD Biosciences | 352235 | |
| 24-well plates | Orange Scientific | 5530305 | |
| 75 cm2 culture flasks | Greiner Bio-One | 658175 | |
| 25 cm2 culture flasks | Greiner Bio-One | 690175 | |
| Disposable pipettes 10 ml | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| Glass Pasteur pipettes (150 mm) | Fisherbrand | FB50251 | |
| Glass coverslips 12 mm diameter | Menzel | CB00120RA1 | |
| Surgical disposable scalpels | B. Braun | 5518083 | |
| Tissue culture dishes | Greiner Bio-One | 633180 | |
| Conical tubes 15 ml | BD Biosciences | 352095 | |
| Laminar flow hood | |||
| Centrifuge and swing-out rotor with adapters for 15 ml and 50 ml tubes | Hettich Lab Technology | 1406 | |
| Flow cytometry cell sorter: FACSAria l with FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| Humified cell culture incubator | Eppendorf Galaxy 170R | ||
| Wather bath at 37 °C | |||
| FACSFlow sheath fluid | BD Biosciences | 342003 | |
| Epifluorescence microscope BX61 | Olympus | ||
| Confocal microscope LSM710 | Zeiss |
References
- Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476, 224-227 (2011).
- Kim, J., et al. Functional integration of dopaminergic neurons directly converted from mouse fibroblasts. Cell stem cell. 9, 413-419 (2011).
- Duan, B., et al. Interactions between water deficit, ABA, and provenances in Picea asperata. Journal of experimental botany. 58, 3025-3036 (2007).
- Heinrich, C., et al. Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons. PLoS Biol. 8, (2010).
- Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nat Protoc. 6, 214-228 (2011).
- Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. , (2007).
- Karow, M., et al. Reprogramming of pericyte-derived cells of the adult human brain into induced neuronal cells. Cell stem cell. 11, 471-476 (2012).
- Ortega, F., et al. Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level. Nat Protoc. 6, 1847-1859 (2011).
- Ladewig, J., et al. Small molecules enable highly efficient neuronal conversion of human fibroblasts. Nat Methods. 9, 575-578 (2012).
- Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77, 440-456 (2013).
- Davila, J., Chanda, S., Ang, C. E., Sudhof, T. C., Wernig, M. Acute reduction in oxygen tension enhances the induction of neurons from human fibroblasts. J Neurosci Methods. 216, 104-109 (2013).
- Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463, 1035-1041 (2010).
- Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 10343-10348 (2011).
- Lu, J., et al. Generation of Integration-free and Region-Specific Neural Progenitors from Primate Fibroblasts. Cell Rep. 3, 1580-1591 (2013).
- Yang, N., Ng, Y. H., Pang, Z. P., Sudhof, T. C., Wernig, M. Induced neuronal cells: how to make and define a neuron. Cell Stem Cell. 9, 517-525 (2011).
- Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476, 220-223 (2011).
- Yoo, A. S., et al. MicroRNA-mediated conversion of human fibroblasts to neurons. Nature. 476, 228-231 (2011).
- Son, E. Y., et al. Conversion of mouse and human fibroblasts into functional spinal motor neurons. Cell Stem Cell. 9, 205-218 (2011).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 2527-2532 (2012).
- Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10, 473-479 (2012).
- Yang, N., et al. Generation of oligodendroglial cells by direct lineage conversion. Nat Biotechnol. 31, 434-439 (2013).
- Najm, F. J., et al. Transcription factor-mediated reprogramming of fibroblasts to expandable, myelinogenic oligodendrocyte progenitor cells. Nat Biotechnol. 31, 426-433 (2013).
