Summary
Targeting cellule cerebrali residente per discendenza diretta-riprogrammazione offre nuove prospettive per la riparazione del cervello. Qui si descrive un protocollo di come preparare le culture arricchito da pericytes cervello residente da adulto corteccia cerebrale umana e convertirli in neuroni indotti dall'espressione retrovirus-mediata dei fattori di trascrizione Sox2 e Ascl1.
Abstract
Diretto lignaggio riprogrammazione di cellule non neuronali nei neuroni indotti (INS) può fornire approfondimenti sui meccanismi molecolari alla base neurogenesi e attivare nuove strategie per la modellazione in vitro o la riparazione del cervello malato. Identificazione dei tipi di cellule non neuronali cerebrali residente suscettibili di conversione diretta in Ins potrebbe consentire per il lancio di un tale approccio in situ, cioè all'interno del tessuto cerebrale danneggiato. Qui si descrive un protocollo sviluppato nel tentativo di identificare cellule derivate dal cervello umano adulto che soddisfano questa premessa. Questo protocollo prevede: (1) la coltura di cellule umane dalla corteccia cerebrale ottenuto da biopsie cerebrali adulte umane; (2) l'espansione in vitro (approssimativamente richiede 2-4 settimane) e caratterizzazione di coltura mediante immunocitochimica e citofluorimetria; (3) l'arricchimento da cellule fluorescenza-attivato (FACS) usando anti-recettore PDGF-β e anticorpi anti-CD146;(4) il retrovirus trasduzione mediata con la trascrizione neurogenica fattori Sox2 e ascl1; (5) e, infine, la caratterizzazione della risultante neuroni indotti periciti-derivato (PdiNs) mediante immunocitochimica (14 giorni a 8 settimane dopo trasduzione retrovirale). In questa fase, in possono essere sondato per le loro proprietà elettriche mediante registrazione patch-clamp. Questo protocollo prevede una procedura altamente riproducibile per la conversione in vitro stirpe di pericytes cervello residente in Ins umane funzionali.
Introduction
Al contrario di riprogrammazione di cellule somatiche in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs), che a loro volta sono dotati di una pletora di potenziali di differenziazione, riprogrammare diretto mira per conversione diretta di uno specifico tipo cellulare in un altro. Per quanto riguarda la loro applicazione nel contesto della modellazione malattie e potenziali terapie a base di cellule, entrambi gli approcci di riprogrammazione hanno vantaggi e svantaggi specifici. Riprogrammazione in iPSCs (i) fornisce una fonte pressoché infinita di cellule; (Ii) consente di ingegneria genetica; (Iii) conferisce con un potenziale di differenziazione quasi illimitate. Tuttavia, principali svantaggi di iPSCs comportano il rischio di tumorigenicità delle cellule indifferenziate (formazione teratoma in vivo) e la necessità di coltura ex vivo e successivo trapianto se queste cellule devono essere utilizzati per terapie cellulari. Viceversa, diretto lignaggio riprogrammazione è limitata dalla minore resa delle cellule desiderateche correla direttamente con il numero di cellule bersaglio della popolazione di partenza, ma possiede il vantaggio che cellule della linea-riprogrammato sembrano mostrare alcun rischio oncogeno dopo trapianto 1,2; Inoltre, riprogrammazione diretta può anche essere realizzato in situ, cioè all'interno dell'organo dove sarebbero necessarie queste cellule, evitando così la necessità di trapianto.
Con questo in mente, il nostro laboratorio ha perseguito la possibilità delle cellule cerebrali residente-lignaggio riprogrammazione in Ins come un nuovo approccio verso terapie cellulari delle malattie neurodegenerative. Le cellule cerebrali residente che possono essere potenzialmente considerati bersagli cellulari per lignaggio riprogrammazione comprendono diversi tipi di macroglia (astrociti, cellule NG2 e oligodendrociti), microglia e cellule dei microvasi associate (cellule endoteliali e periciti). Abbiamo ampiamente studiato il potenziale riprogrammazione in vitro della astroglia del cor cerebraletex dei primi topi postnatale 3-5. Alla ricerca di fonti di cellule simile adatti per lignaggio riprogrammazione diretta nel cervello umano adulto, abbiamo incontrato una popolazione di cellule che può essere riprogrammato con successo in Ins e caratteristiche espositive di periciti. Qui si descrive un protocollo di come raccogliere queste cellule adulte da biopsie del cervello umano, per espandere e arricchire queste cellule in vitro, e infine riprogrammare successo una frazione sostanziale di queste cellule espanse in vitro (nell'intervallo 25-30%) in Ins. Riprogrammazione può essere ottenuto mediante simultanea retrovirus-mediata co-espressione di due fattori di trascrizione, Sox2 e ascl1. Questi PdiNs sono stati trovati per acquisire la capacità di azione ripetitiva potenziale di cottura e servire bersagli sinaptici per altri neuroni che indicano la loro capacità di integrare nelle reti neurali. Il nostro protocollo prevede una procedura semplice per l'isolamento e lignaggio conversione di adulti pericytes cervello umano in Ins.
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Protocol
1. Isolamento e Coltura di cellule adulte cervello umano
Gli esperimenti che coinvolgono il tessuto umano devono essere eseguite in conformità a tutte le normative governative e istituzionali pertinenti riguardanti l'uso di materiale umano per scopi di ricerca. Il presente protocollo è stato sviluppato in conformità con l'approvazione da parte del comitato etico della Facoltà di Medicina della LMU di Monaco di Baviera e il consenso informato per iscritto da tutti i pazienti.
Questo protocollo di culture preparazione dell'adulto corteccia cerebrale umana è stata stabilita utilizzando campioni di pazienti di entrambi i sessi affetti da epilessia del lobo temporale o di altre lesioni profonde non traumatiche, non maligne. Il tessuto ottenuto dalla sala chirurgica composto esclusivamente il canale di accesso alla lesione cerebrale e quindi è considerato sano. La fascia d'età dei pazienti era di 19-70 anni.
- Preparare mezzo di crescita aggiungendo siero di vitello fetale inattivato al calore(FCS) ad alto glucosio DMEM con GlutaMAX per ottenere una concentrazione finale di 20% FCS. Aggiungere 5 ml di penicillina / streptomicina per un totale di 500 ml mezzo di crescita. Eseguire questa e di tutte le fasi successive che richiedono condizioni di coltura sterile in una cappa a flusso laminare adeguata.
- Mantenere la biopsia del cervello umano adulto ottenuto dalla sala operatoria in soluzione salina bilanciata Hanks 'con CaCl 2 e MgCl 2 (HBSS) medio compreso HEPES (10 mM concentrazione finale) sul ghiaccio fino al trattamento. Avviare l'elaborazione il più presto possibile.
- Per avviare la dissociazione in celle singole, trasferire il tessuto in una capsula di Petri 65 millimetri e tritare a pezzetti utilizzando due sterili monouso bisturi. Per digestione enzimatica usare 3-6 ml TrypLE in un tubo da 15 ml ed incubare per 15-30 minuti a 37 ° C in un bagno d'acqua.
- Aggiungere 1 volume di mezzo di crescita preriscaldato ad agevolare dissociazione e triturare lentamente la soluzione contenente pezzi di tessuto su e giù utilizzando primauna pipetta monouso 5 ml, seguita utilizzando una pipetta Pasteur di vetro fino omogeneizzazione della sospensione cellulare. Tipicamente, alcuni pezzi di tessuto residui, per lo più costituiti da materia bianca, rimarranno in sospensione.
- Centrifugare a 157 xg per 5 min e risospendere il pellet in quantità appropriata di mezzo di crescita (10 ml per non rivestito pallone di coltura T75). Utilizzare un pallone di coltura T75 per una biopsia di 5-10 mm di diametro dimensioni e estrapolare da questo nel caso di campioni più grandi.
- Posizionare cellule in un incubatore a 37 ° C con 5% di CO 2 e 5% O 2.
- Sostituire metà del mezzo ogni 3-4 giorni finché le cellule hanno raggiunto la confluenza. Questo richiede di solito fino a due settimane (di seguito il passaggio 0 [P0]).
2. Espansione in vitro e caratterizzazione di cellule cervello umano adulto
- Espansione in vitro:
- Aspirare il terreno di coltura e lavare con tampone fosfato salino (PBS), conservato a temperatura ambiente temperatura, prima di aggiungere 3 ml TrypLE.
- Incubare a 37 ° C per 5-10 minuti finché la maggior parte delle cellule staccate. Battere delicatamente i palloni per facilitare il sollevamento delle cellule; dopo l'aggiunta di 3 volumi di mezzo di crescita, trasferire le cellule in una provetta conica da 15 ml e centrifugare a 157 xg per 5 min e risospendere le cellule in quantità appropriata di terreno di crescita.
- Passaggio le celle in un rapporto di 1:3 per la resa ottimale in nuove fiasche di coltura cellulare T75.
Nota: Abbiamo diversi passaggi queste cellule fino a P5, senza alcun segno di ridotta efficienza riprogrammazione. Mentre a P0 la coltura contiene una considerevole frazione di cellule endoteliali (valutata mediante espressione CD34), a passaggi successivi il loro numero diventa trascurabile.
- Caratterizzazione delle culture cervello umano adulto:
- Immunocytochemistry:
- Per la caratterizzazione delle cellule, seme ~ 60.000 cellule su poli-D-lisina rivestite con copertura in vetro scivola in 500 microlitri fresca Mediu crescitam in 24 pozzetti piastre di coltura tissutale e incubare a 37 ° C con 5% di CO 2 e 5% O 2.
- Per l'analisi immunocitochimica delle cellule coltivate cervello umano rimuovere il supporto e lavare 3x con 1 ml di PBS.
- Fix cellule aggiungendo 500 ml di paraformaldeide al 4% in PBS per 15 minuti a temperatura ambiente.
- Trasferire la copertura in vetro scivola in un apposito camera di colorazione umidificata e bloccare con 80 microlitri di PBS contenente il 3% di albumina di siero bovino (BSA) e 0,5% Triton X-100 per 1 ora a temperatura ambiente.
- Aggiungere anticorpi primari diluiti nella stessa soluzione (per fattori di diluizione vedi tabella di reagenti e attrezzature specifiche) e incubare una notte a 4 ° C o 1 ora a temperatura ambiente.
Nota: Una frazione sostanziale ma variabile delle cellule in questa fase della coltura sono immunoreattivi per β del recettore del fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGFRβ), cluster di differenziazione 146 (CD146), NG2 condroitin solfato proteoglicani, e actina muscolo liscio (SMA), vale a dire i marcatori caratteristici pericytes microvasali associati. Solo una minoranza (<1%) esprimono il marker gliale fibrillare astrogliali proteina acida (GFAP) e S100β. Inoltre, in questa fase la coltura deve essere privo di cellule che esprimono il marcatore neuronale βIII-tubulina. Utilizzare più combinazioni di anticorpi primario per co-etichettatura dei diversi marcatori. Un'ulteriore conferma dell'espressione di gliali, neuronali, endoteliali e periciti marcatori può essere ottenuto mediante trascrizione inversa e tempo reale PCR quantitativa (non descritto in questo protocollo). - Dopo l'incubazione con l'anticorpo primario lavata tre volte con 1 ml di PBS e aggiungere i corrispondenti anticorpi secondari (nelle opportune diluizioni) alla soluzione colorante e incubare 1 ora a temperatura ambiente al buio. Lavare le cellule 3 volte con PBS. Se necessario, prima del montaggio includono colorazione con DAPI per 5 min a temperatura ambientetemperatura.
- Utilizzare antifading mezzo di montaggio e analizzare i vetrini coprioggetto utilizzando un microscopio a epifluorescenza o un microscopio confocale.
- Citometria a flusso:
- Per l'analisi di espressione marcatore di superficie con citometria a flusso, crescere le cellule a confluenza in T25 non rivestito o T75 fiasche di coltura cellulare.
- Staccare celle utilizzando TrypLE come descritto prima e risospendere in soluzione colorante costituito da PBS + 0,5% BSA. Per reazione a colorazione, risospendere 100.000-200.000 cellule in 100 ml di soluzione colorante. Preparare le reazioni di colorazione singoli per anticorpi utilizzati (CD146-FITC, CD140b-PE, CD34-APC, CD13-FITC, rispettivi anticorpi di controllo isotipo).
- Aggiungere anticorpi coniugati con fluorocromi per ogni soluzione colorante (per diluizioni vedi tabella di reagenti e attrezzature specifiche) direttamente nella sospensione cellulare e incubare a 4 ° C per 30 minuti al buio.
- Lavare le cellule tre volte con 500 microlitri di PBS e spin giù tra ognifase di lavaggio a 157 xg per 5 min.
- Risospendere il pellet di cellule in 0,5-1 ml di soluzione di colorazione e le cellule di trasferimento attraverso un colino cella (70 micron) per tubi FACS. Proteggere il campione dall'esposizione alla luce.
- Campioni Vortex prima di metterli in strumento FACS.
- Per analizzare le cellule viventi ed escludere detriti e di cella aggregati, cancello per FSC-A e SSC-A. Duine cellulari sono specificamente gated da FSC-A e FSC-W. Per determinare le condizioni gating giuste per i marcatori di superficie cellulare impostare le porte con il controllo isotipo-abbinato coniugato al rispettivo fluorocromo. Quindi determinare la proporzione di cellule anticorpo-bound.
- Immunocytochemistry:
3. Arricchimento per le celle pericyte-derivate da cellule Fluorescence Activated Ordinamento
- Purificare la popolazione di cellule periciti (risospese in terreno di crescita) prima trasduzione tramite FACS classificare usando un ugello di 70 micron. Utilizzare CD34-APC in combinazione con la CD140b-PE e CD146-FITC per selezionare per pericytes. Ordina per, cellule CD140b-e CD146-CD34 positivi-negativi.
- Raccogliere le cellule filtrate in mezzo di crescita e piastra su poli-D-lisina rivestite con copertura in vetro scivola in piastre di coltura tissutale a 24 pozzetti e incubare a 37 ° C con 5% di CO 2 e 5% O 2.
- 48 ore dopo l'ordinamento sostituire il supporto con mezzo di crescita fresco ed eseguono trasduzione come descritto nel protocollo 4.
4. Retrovirale trasduzione delle cellule pericyte-derivati e Riprogrammazione in neuroni indotti
Nota: Fare riferimento alle linee guida di biosicurezza locali durante la manipolazione di particelle retrovirali. In Germania l'uso dei retrovirus impiegati qui richiede livello di biosicurezza 2. Per la produzione di particelle retrovirali riferimento al protocollo 6. Per costrutti retrovirali usati per la riprogrammazione, fare riferimento a Karow et al. (2012). I retrovirus sono stati pseudotyped con VSV-G (stomatite vescicolare virus-glicoproteina) 5. Per la produzione di consultare Gavrilescu et al 6.
- 24 ore prima della trasduzione retrovirale seme ~ 60.000 cellule su poli-D-lisina rivestite con copertura in vetro scivola in 500 microlitri terreno di coltura fresco in piastre da 24 pozzetti di coltura tissutale e incubare a 37 ° C con 5% di CO 2 e 5% O 2 .
- Il giorno seguente, sostituire il mezzo di crescita con 500 microlitri fresco mezzo di crescita preriscaldata, e aggiungere 1 ml di rispettivi surnatanti concentrati contenenti particelle retrovirali (pCAG-IRES-DsRed per il controllo, specialmente durante stabilisce il protocollo in laboratorio), pCAG-ascl1 -IRES-DsRed, pCAG-Sox2-IRES-GFP.
- Un giorno dopo, rimuovere il mezzo comprese le particelle virali dalle cellule e aggiunge 1 ml freschi, preriscaldata medio B27-differenziazione, composto da 49 ml DMEM con elevato glucosio GlutaMAX e 1 ml integratore privo di siero B27. Mantenere le cellule in coltura a 37 ° C in 5% CO 2 e 5% O 2 per 4-8 settimane senza cambiare il mezzo come variazioni medie ripetitive diventano dannose come INS maturare.
5. Caratterizzazione dei neuroni indotta da Immunocytochemistry
- Per determinare l'identità cellulare delle cellule trasdotte, in particolare per dimostrare l'acquisizione di un fenotipo neuronale, effettuare immunocitochimica contro antigeni neuronali come bIII-tubulina, MAP2, e NeuN (per gli anticorpi e le loro rispettive diluizioni, vedere tabella di reagenti specifici e attrezzature; seguire la stessa procedura indicata al punto 2.2.1).
- Per migliorare la maturazione di PdiNs, co-coltura queste cellule con neuroni derivati da E14 topo cortecce cerebrali. A tal fine, sezionare la corteccia cerebrale e dissociare il tessuto meccanicamente con una pipetta Pasteur di vetro lucidati a fuoco. Aggiungi 10,000-50,000 neuroni murini di colture di cellule pericyte derivate da 2-3 settimane dopo trasduzione con re-Sox2 e ascl1 di codificatroviruses e continuare la coltura. Cellule trasdotte possono essere distinte dai neuroni murini per la loro reporter (GFP e DsRed) espressione, sia per epifluorescenza dal vivo o in seguito immunocitochimica per la GFP e DsRed.
- Per valutare la formazione di sinapsi su PdiNs di neuroni murini, eseguire immunocitochimica contro recettori per i neurotrasmettitori vescicolari come vescicolare del glutammato trasportatore 1 (VGLUT1).
- Sonda cellule trasdotte per le loro proprietà elettriche (cioè la capacità di generare potenziali d'azione) e la creazione di sinapsi funzionali da patch-clamp elettrofisiologia. Per i dettagli della procedura vedi Heinrich et al. (2011).
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Representative Results
Il primo risultato di questo protocollo dopo aver stabilito con successo una cultura da un esemplare di umano adulto corteccia cerebrale consiste nell'identificazione della composizione cellulare della cultura. Immunocitochimica di proteine specifiche di tipo cellulare rivela un notevole grado di eterogeneità tra culture derivati da esemplari di diversi pazienti (Figura 1A). Quantificata mediante citometria di flusso vi è sempre una frazione sostanziale di cellule che esprimono PDGFRβ (in media ~ 75%, da 30 fino a 99%); altri marcatori di pericytes come CD146, NG2 e CD13 sono tipicamente espressi in una serie inferiore (Figura 1B). Analogamente SMA è espresso in una sottopopolazione minore delle cellule in coltura, come determinato mediante immunocitochimica (Figura 1A). Al passaggio 0 (P0), ci sono solitamente <10% delle cellule endoteliali CD34-positive, e il loro numero scende sotto rilevamento ulteriori passaging. Allo stesso modo, astrocytes prevedono solo una contaminazione trascurabile a passaggi precedenti. Inoltre, ci sono in genere presenti cellule che macchiano di cellule neurali staminali, neuronale, o marcatori oligodendrociti. Immunocitochimico e citometria a flusso dati sono completamente corroborata dal RT-PCR quantitativa 7. In sintesi, la frazione più grande all'interno della cultura esprime proteine e mRNA caratteristici di periciti. Un ulteriore arricchimento per cellule periciti derivato può essere ottenuto mediante FACS in questa fase. Questo è particolarmente importante quando la purezza della cultura è all'estremità inferiore dello spettro che si traduce nel livello di espressione PDGFRβ. Così, abbiamo utilizzato un anticorpo contro PDGFRβ (CD140b) da solo o in combinazione con un anticorpo anti-CD146, escludendo qualsiasi contaminante CD34-positive, per FAC-sort particolare periciti (Figura 1C).
Trasduzione di queste culture con virus di controllo che codificano solo un gene reporter, non altera il loro marcatore espressione profile (valutato 3-4 settimane dopo trasduzione), indicando che queste cellule restano nel lignaggio pericyte. Allo stesso modo, l'espressione retrovirus-mediata di Sox2 da sola non comporta alcuna modifica evidenti nella morfologia né induce l'espressione bIII-tubulina suggerendo che solo Sox2 non è sufficiente per indurre una conversione destino. Al contrario, una bassa percentuale (circa il 10%) di cellule trasdotte con un retrovirus codificante ascl1-alone mostre espressione βIII-tubulina, tuttavia senza acquisire una morfologia neuronale. Sorprendentemente, quasi il 50% di tutte le e-Sox2 cellule ascl1-cotransduced mostrano espressione βIII-tubulina e ancora più importante, un terzo di queste cellule a doppia trasdotte (visualizzati da loro espressione doppia giornalista) visualizzare anche i processi neuronali (Figura 2). Insieme con l'acquisizione di funzioni neuronali, espressione di PDGFRβ è down-regolato 7. Con ulteriore maturazione nella cultura,-e Sox2 cellule ascl1 coexpressing diventano anche immunoreactive per i più maturi marcatori neuronali MAP2 (colorazione processi dendritiche) e NeuN (colorazione corpi cellulari neuronali prevalentemente). Come discusso sotto di questi cambiamenti nell'espressione di servirlo anche in correlazione con l'acquisizione di caratteristiche elettrofisiologiche dei neuroni. In sintesi, questi dati forniscono la prova per la conversione diretta destino delle cellule pericyte di derivazione in INS, denominato PdiNs. Questi PdiNs possiedono la competenza di stabilire compartimenti post-sinaptici funzionali come rivelato in esperimenti di co-coltura con neuroni di topo embrionale corteccia cerebrale. Questa competenza può essere dimostrata elettrofisiologicamente nella comparsa di ingressi sinaptici (vedi discussione sotto) nonché la decorazione dei processi dendritiche di PdiNs con terminali presinaptici derivate da neuroni co-coltivate (caratterizzati da raggruppamenti di trasportatori di neurotrasmettitori vescicolari ps VGLUT1 immunoreattività). Questi dati indicano ulteriormente la capacità di PdiNs di integrarsi nella neuronale circuits.
Figura 1. Espressione eterogenea di marcatori periciti in colture derivate dalla adulto corteccia cerebrale umana. A) microscopio a fluorescenza che illustrano l'espressione eterogenea di marcatori pericyte (PDGFRB, SMA, CD146), come rivelato da immunocitochimica. Scale bar = 50 pm. B) L'istogramma riassume i relativi numero di cellule positive per i marcatori pericyte PDGFRβ (CD140b), CD13 e CD146 come determinato mediante citometria di flusso delle diverse culture di derivazione paziente. CD34 è un marcatore per le cellule endoteliali. Trame C) FACS dot raffiguranti-controllo e isotipo cellule umane CD146 / CD140b-macchiati per l'ordinamento delle pericytes doppio-positive (evidenziate dal riquadro rosso) per la successiva riprogrammazione. Nota: l'alto tasso di espressione PDGFRβ el'eterogeneità per quanto riguarda l'espressione CD146 in questa particolare cultura.
. Figura 2 riprogrammazione di cellule pericyte di derivazione umani adulti in Ins Top:. Set-up sperimentale. Sotto: microscopio a fluorescenza raffiguranti cellule trasdotte con la codifica retrovirus Sox2-IRES-GFP e ascl1-IRES-DsRed. Si noti che solo le cellule doppio trasdotte (frecce) esprimono bIII-tubulina (pannello di destra) e mostrano la morfologia neuronale.
| divisione cellulare [%] | morte cellulare [%] | bIII-tubulina + [%] | |
| 36 | 3 | 0 | |
| Sox2 | 46 | 7 | 0 |
| Ascl1 | 26 | 33 | 7 |
| Sox2-Ascl1 | 3 | 36 | 25 |
Tabella 1. Comportamento delle cellule pericyte di derivazione in fase di conversione in PdiNs come valutato dal continuo imaging dal vivo. Notare che Sox2 e Ascl1 co-esprimono ciclo cellulare delle cellule uscita. Inoltre, nota l'alto tasso di morte cellulare in seguito Ascl1 o Sox2 e Ascl1-coexpression. Tenendo conto di questi eventi cellulari distinti, circa il 25% di tutte le cellule co-trasdotte diventa in.
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Discussion
Il presente protocollo descrive l'espansione in vitro e l'arricchimento di cellule pericyte-derivate a seguito isolamento dal adulta corteccia cerebrale umana e la successiva conversione in Ins dall'espressione retrovirus-mediata della trascrizione neurogena fattori Sox2 e Ascl1. Tale protocollo prevede un sistema sperimentale in vitro per studiare la stirpe di conversione delle cellule cerebrali residente in neuroni e potenzialmente anche glia, con l'obiettivo in mente di tradurre in ultima analisi, questo approccio conversione diretta nel vivo della impostazione nel cervello adulto.
Considerazioni tecniche
Nel nostro studio abbiamo utilizzato tessuto cerebrale umano da pazienti di età compresa tra i 19 ei 70 anni, di entrambi i sessi. Non abbiamo notato una differenza evidente in termini di efficienza riprogrammazione a seconda del sesso o 7 anni. Si raccomanda tuttavia di documentare queste informazioni come le differenze più sottili possono essere comunqueosservato che sfuggiva la nostra attenzione.
Si raccomanda inoltre di iniziare la lavorazione il più presto possibile a seguito del trasferimento del campione di tessuto al laboratorio. Ci saranno necessariamente alcune incognite per quanto tempo il tessuto è rimasto in sala chirurgica prima di trasferire al sperimentalista. Si stima che nel nostro studio 7 il tempo tra la rimozione dal cervello del paziente per l'inizio della procedura di coltura varia tra 2-6 ore, con i campioni devono essere mantenuti sempre in ghiaccio. Nessuna differenza evidente nella facilità di successivo trattamento né alcun esito avverso sono stati notati all'interno di questa finestra temporale.
Una valutazione critica per qualsiasi protocollo riguarda la sua semplicità, riproducibilità ed efficienza. Il presente Protocollo è semplice dal fatto che in una prima fase le cellule vengono espanse in un mezzo economico che può essere facilmente ottenuta, seguita da una seconda fase di riprogrammazione cellulare utilizzando solo due trascrizione factors e coltura in un terreno definito.
Per quanto riguarda la riproducibilità, abbiamo osservato che la qualità della preparazione retrovirus è di estrema importanza, con preparazioni a bassa virus titolo utilizzati a diluizioni in base al numero di particelle infettive del virus alto titolo spesso conseguente fallimento della riprogrammazione. In effetti abbiamo notato che la stessa cultura pericyte in cui riprogrammazione aveva fallito in precedenza potrebbe essere convertito con successo in Ins quando si utilizzano virus ad alta titolazione.
Per quanto riguarda l'efficienza di conversione, abbiamo valutato il numero di cellule βIII-tubulina-positivi derivati da cellule Sox2-e ascl1-cotransduced utilizzando continuo immagini dal vivo. Imaging dal vivo permette di valutare il numero di cellule che subiscono la divisione cellulare o morte cellulare durante il processo di conversione, mentre tali informazioni è assente quando il numero di generato INS è determinato solo nel punto fine dell'esperimento. Infatti utilizzando micros di video time-lapsecopia (per la procedura si riferiscono a Ortega e t al. 8) è stato osservato che le cellule non trasdotte fattore-trasdotte e singole continuano a proliferare, mentre-Sox2 e cellule ascl1-cotransduced rapidamente uscire dal ciclo cellulare. Inoltre, una parte significativa della popolazione quest'ultimo subisce la morte cellulare. Mentre tossicità retrovirus non può essere formalmente esclusa dai dati ottenuti nel nostro studio 7, il fatto che l'aumento della morte cellulare è stata osservata solo quando è stato espresso ascl1 (da solo o in combinazione con Sox2), interpretiamo questo come prova di un conflitto catastrofico destino cellulari . Prendendo questi due eventi in considerazione, si stima che il 25% di tutte le e-Sox2 cellule ascl1-cotransduced convertire in INS positivi bIII-tubulina (Tabella 1).
Come co-trasduzione è assolutamente necessaria per la riprogrammazione successo, si può considerare che impiegano una codifica vettore virale entrambi i geni di ottimizzare la quantità di cellule che esprimono entrambi i fattori Allo stessotempo.
Recentemente, Ladewig et al. Hanno sviluppato un protocollo per la conversione efficiente di fibroblasti in Ins ottenendo un rendimento del 200% utilizzando piccola inibizione basato molecola di glicogeno sintasi chinasi-3β e SMAD segnalazione 9. Sarà interessante verificare se questi add-on per il nostro protocollo di migliorare il rendimento della produzione pdIn.
Un altro risultato interessante della imaging dal vivo del processo di riprogrammazione riguarda il fatto che la conversione di periciti umani adulti in Ins avviene in un tempo piuttosto lento rispetto a protocolli di riprogrammazione simili in culture di diverse cellule somatiche di origine murina 4. Questo è coerente con la caratteristica lenta maturazione dei neuroni umani 10.
Mentre non abbiamo sistematicamente analizzato l'impatto della tensione di ossigeno sul rendimento della produzione pdIn, abbiamo notato che l'incubazione in condizioni di ossigeno basso (5%) in generaledato risultati superiori rispetto ai coltivando le cellule in condizioni di normossia (21%). Recentemente, Davila et al. Ha descritto un simile effetto di valorizzazione dalla tensione di ossigeno ridotta per l'induzione di INS da fibroblasti umani 11.
Il nostro protocollo si basa sulla consegna retrovirale di Sox2 e ascl1 mentre altri protocolli di conversione diretta hanno utilizzato vettori lentivirali inducibili 1, 12, 13. Più di recente abbiamo anche applicato con successo doxiciclina inducibile costrutti lentivirali codificanti Sox2 e ascl1, indicando che un tempo relativamente breve impulso (10 giorni) di espressione Sox2 e Ascl1 è sufficiente a causare la conversione pericyte-to-neurone. I retrovirus utilizzati nel nostro studio 7 sono stati progettati per ridurre tacere 5. Di conseguenza, non abbiamo notato la comparsa di neuroni privi di espressione del gene reporter. Tuttavia, la possibilità che i livelli di espressione complessivo di entrambe transgeneNon si può escludere s e giornalista cambiano nel tempo. Approcci privi di integrazione (che utilizzano virus Sendai) sono stati recentemente impiegati in caso di generazione di indotto progenitori neurali 14, ma non è al momento noto se questo o strategie di riprogrammazione addirittura gratis-virus può essere applicato con successo per convertire periciti umani. Infine, se periciti derivate da altri tessuti possono subire conversione in tipi di cellule neuronali indotte rimane da testare.
Considerazioni concettuali
Un risultato critico di riprogrammazione di cellule somatiche nel Ins riguarda la loro funzionalità 15. Abbiamo valutato le proprietà elettrofisiologiche di PdiNs in diversi momenti dopo l'inizio del processo di riprogrammazione. Nelle fasi molto precoci, cioè 2 settimane successive trasduzione retrovirale, PdiNs mostrano appena segni di eccitabilità elettrica, nonostante l'espressione βIII-tubulina in questa fase. Così, la maggior parte delanalisi elettrofisiologiche sono state condotte 4-8 settimane dopo trasduzione con Sox2 e ascl1. Come descritto in Karow et al., PdiNs sono caratterizzati da una notevole immaturità come risulta dalle elevate resistenze di ingresso e una bassa frequenza di potenziali di azione di tiro. Ulteriore maturazione può essere promosso da PdiNs co-coltura con neuroni derivati dal mouse E14 corteccia cerebrale. In queste condizioni, PdiNs presentano alti potenziali di azione e frequenze elevate correnti di sodio 7. Inoltre, coculturing rivela la competenza del PdiNs di ricevere input sinaptico funzionale da neuroni di topo. In somma, PdiNs acquisiscono proprietà funzionali neuronali che possono essere ulteriormente migliorati su coculturing con altri neuroni. Tuttavia, rimane da dimostrare se PdiNs possono anche stabilire compartimenti presinaptici funzionali. Sono necessari ulteriori studi trapianto PdiNs nel cervello di rivelare il loro potenziale per raggiungere la piena maturità e funzionalità.
Ucantare Sox2 e ascl1 come fattori di riprogrammazione abbiamo notato che i PdiNs risultanti acquisiscono le caratteristiche di neuroni GABAergici 7. È interessante notare che altri gruppi hanno sviluppato protocolli per convertire i fibroblasti in Ins utilizzando il fattore di trascrizione diverso e / o combinazioni di microRNA con il risultato che l'INS sviluppo acquisito specifica neurotrasmettitore distinto come un glutamatergico, dopaminergici, colinergici e fenotipo 1, 16-18. Rimane da esaminare se le combinazioni di fattori utilizzati nei fibroblasti inducono la stessa identità trasmettitore in PdiNs. Inoltre, un recente lavoro ha ampliato lo spettro di conversione al di là neurogenesi per generare cellule staminali neurali 19, 20 o gliali, in particolare gli oligodendrociti 21, 22. Se questi protocolli riprogrammazione suscitano un risultato simile in cellule derivate da pericyte cervello umano adulto, questo sarebbe notevolmente ampliare il panorama delle applicazioni di questa importazioneformica tipo di cellula cerebrale residente.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Siamo grati al Dr. Magdalena Götz per il suo ingresso durante lo sviluppo di questo protocollo. Ringraziamo il Dr. Marius Wernig (Stanford University) per generosamente ci fornisce la sequenza codificante Sox2. Siamo anche molto grati al Dr. Alexandra Lepier per la produzione di virus. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Deutsche Forschungsgemeinschaft (BE 4182/2-2) e il BMBF (01GN1009A) a BB e il Ministero bavarese delle Scienze, la Ricerca e le Arti a MK e BBCS ricevuto finanziamenti dal SYSTHER-binazionale INREMOS virtuale Institute (Ministeri federale tedesco e sloveno dell'Istruzione e della Ricerca) e il DFG (SFB 824).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-CD140b-PE | BD Biosciences | 558821 | use 1:100 |
| anti-CD146-FITC | AbD Serotec | MCA2141FT | use 1:100 |
| anti-CD13-FITC | AbD Serotec | MVA1270A488T | use 1:100 |
| anti-CD34-APC | BD Biosciences | 560940 | use 1:100 |
| anti-PDGFRβ | Cell Signaling | 3169S | use 1:200 |
| anti-CD146 | Abcam | Ab75769 | use 1:400 |
| anti-NG2 | Millipore | AB5320 | use 1:400 |
| anti-SMA | Sigma-Aldrich | A2547 | use 1:400 |
| anti-βIII-tubulin | Sigma-Aldrich | T8660 | use 1:400 |
| anti-MAP2 | Sigma-Aldrich | M4403 | use 1:200 |
| anti-GFAP | Sigma-Aldrich | G3893 | use 1:600 |
| anti-GFP | Aves Labs | GFP 10-20 | use 1:1,000 |
| anti-RFP | Chromotek | 5F8 | use 1:500 |
| anti-S100β | Sigma-Aldrich | S2532 | use 1:300 |
| anti-NeuN | Millipore | MAB377 | use 1:200 |
| anti-GABA | Sigma-Aldrich | A2052 | use 1:500 |
| anti-Calretinin | Millipore | AB5054 | use 1:500 |
| anti-vGluT1 | SYnaptic SYstems | 135511 | use 1:1,000 |
| Rat IgG1 isotype control FITC | AbD Serotec | 11-4301-81 | use 1:100 |
| Rat IgG1 isotype control PE | AbD Serotec | 12-4301-81 | use 1:100 |
| Rat IgG1 isotype control APC | AbD Serotec | 17-4301-81 | use 1:100 |
| TrypLE | Invitrogen | 12605-010 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Invitrogen | 61965 | |
| B27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10106-169 | perform heat inactivation by incubation at 56 °C for 30 min |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) | Invitrogen | 24020-091 | |
| Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1x) | Invitrogen | 14190 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| PFA (paraformaldehyde) | Sigma-Aldrich | P1648 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| DAPI (4′,6-Diamidin-2-phenylindole) dilactate | Sigma-Aldrich | 042M4005 | |
| Aqua-Poly/Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap | BD Biosciences | 352235 | |
| 24-well plates | Orange Scientific | 5530305 | |
| 75 cm2 culture flasks | Greiner Bio-One | 658175 | |
| 25 cm2 culture flasks | Greiner Bio-One | 690175 | |
| Disposable pipettes 10 ml | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| Glass Pasteur pipettes (150 mm) | Fisherbrand | FB50251 | |
| Glass coverslips 12 mm diameter | Menzel | CB00120RA1 | |
| Surgical disposable scalpels | B. Braun | 5518083 | |
| Tissue culture dishes | Greiner Bio-One | 633180 | |
| Conical tubes 15 ml | BD Biosciences | 352095 | |
| Laminar flow hood | |||
| Centrifuge and swing-out rotor with adapters for 15 ml and 50 ml tubes | Hettich Lab Technology | 1406 | |
| Flow cytometry cell sorter: FACSAria l with FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| Humified cell culture incubator | Eppendorf Galaxy 170R | ||
| Wather bath at 37 °C | |||
| FACSFlow sheath fluid | BD Biosciences | 342003 | |
| Epifluorescence microscope BX61 | Olympus | ||
| Confocal microscope LSM710 | Zeiss |
References
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