Summary
Gehirn-Targeting-residente Zellen für die direkte Abstammungslinie Neuprogrammierung bietet neue Perspektiven für die Gehirn-Reparatur. Hier beschreiben wir ein Protokoll, wie die Kulturen für Gehirn-Resident Perizyten aus erwachsenen menschlichen Gehirnrinde angereichert vorzubereiten und wandeln diese in induzierten Neuronen durch Retrovirus-vermittelte Expression der Transkriptionsfaktoren und Sox2 ASCL1.
Abstract
Direkte Linie-Reprogrammierung von nicht-neuronalen Zellen in Neuronen induziert (INS) kann Einblicke in die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der Neurogenese bieten und ermöglichen neue Strategien für In-vitro-Modellierung oder die Reparatur des kranken Gehirns. Identifizieren Gehirn-Resident nicht-neuronalen Zelltypen zugänglich direkte Umwandlung in iNs könnte für die Einführung eines solchen Ansatzes in situ, dh innerhalb des geschädigten Hirngewebe zu ermöglichen. Hier beschreiben wir eine in dem Versuch der Identifikation von Zellen aus erwachsenen menschlichen Gehirn, die diese Prämisse zu erfüllen abgeleitet entwickeltes Protokoll. Dieses Protokoll umfasst: (1) die Kultivierung von menschlichen Zellen aus der Hirnrinde von erwachsenen menschlichen Gehirn Biopsien erhalten; (2) die in vitro-Vermehrung (etwa 2-4 Wochen erforderlich) und die Charakterisierung der Kultur durch Immunzytochemie und Durchflusszytometrie; (3) die Anreicherung durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) unter Verwendung von Anti-PDGF-β-Rezeptor-und Anti-CD146-Antikörper;(4) die Retrovirus-vermittelte Transduktion mit dem neurogene Transkriptionsfaktoren Sox2 und ASCL1; (5) und schließlich die Charakterisierung der resultierenden pericyte abgeleiteten induzierten Neuronen (PdiNs) durch Immunzytochemie (14 Tage bis 8 Wochen nach retroviraler Transduktion). In diesem Stadium kann ins für ihre elektrischen Eigenschaften von Patch-Clamp-Aufnahme untersucht werden. Dieses Protokoll stellt eine hoch reproduzierbares Verfahren für die in vitro-Umwandlung der Linie Gehirnfremden Perizyten in funktionelle menschliche INS.
Introduction
Um eine Anpassung an somatischen Zellen zu induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS), die wiederum mit einer Vielzahl von Differenzierungspotentiale gegen ausgestattet zielt direkte Anpassung für gerade Umwandlung eines spezifischen Zelltyp in einen anderen. Mit Bezug auf ihre Anwendung im Rahmen der Seuchenmodellierung und potenzielle zellbasierte Therapien, haben beide Ansätze Umprogrammierung spezifischen Vor-und Nachteile. Umprogrammieren in iPS-Zellen (i) bietet eine nahezu unendliche Quelle von Zellen; (Ii) können für die Gentechnik; (Iii) verleiht mit einer nahezu unbegrenzten Differenzierungspotenzial. , Hauptnachteile iPSCs bringen jedoch die Gefahr der Tumorigenität von undifferenzierten Zellen (Teratombildung in vivo) und die Notwendigkeit für die ex vivo Kultivierung und nachfolgende Transplantation, wenn diese Zellen bei Zelltherapien verwendet werden. Umgekehrt wird eine direkte Abstammungslinie Umprogrammierung durch die geringere Ausbeute an den gewünschten Zellen beschränktdie direkt korreliert mit der Anzahl der Zielzellen von der Ausgangspopulation, besitzt den Vorteil, dass linien umgewandelten Zellen scheinen keine tumorerzeugende Risiko bei Transplantation 1,2 aufweisen, aber; Weiterhin direkte Anpassung kann auch in situ, dh innerhalb des Organs, wo würden diese Zellen benötigt werden, wodurch die Notwendigkeit der Transplantation erreicht werden.
In diesem Sinne, unser Labor hat die Möglichkeit der Umprogrammierung-Linie Gehirn-residente Zellen in iNs als neuartiges Konzept für zellbasierte Therapien von neurodegenerativen Erkrankungen verfolgt. Brain-residenten Zellen, die potenziell als zelluläre Ziele für linien Umprogrammierung angesehen werden können, umfassen verschiedene Arten von Makroglia (Astrozyten, Oligodendrozyten und NG2 Zellen), Mikroglia und Mikrogefäß-assoziierten Zellen (Endothelzellen und Perizyten). Wir haben ausführlich die in vitro-Umprogrammierung Potenzial der Astroglia der Hirnrinde untersuchttex der frühen postnatalen Mäusen 3-5. Auf der Suche nach ähnlich geeigneten Zellquellen für die direkte Abstammungslinie Umprogrammierung im erwachsenen menschlichen Gehirn, stießen wir auf eine Zellpopulation, die erfolgreich in Ins und Ausstellungs Markenzeichen der Perizyten neu programmiert werden kann. Hier wir ein Protokoll, wie diese Zellen aus erwachsenen menschlichen Gehirn Biopsien geerntet, zu erweitern und zu bereichern, diese Zellen in vitro und schließlich erfolgreich einen wesentlichen Anteil dieser in vitro expandierten Zellen (im Bereich von 25-30%) in umprogrammieren beschreiben Ins. Umprogrammierung durch gleichzeitige Retrovirus-vermittelte Co-Expression von zwei Transkriptionsfaktoren, Sox2 und ASCL1 erreicht werden. Diese PdiNs wurden gefunden, um die Fähigkeit von sich wiederholenden Aktionspotential Brand zu erwerben und als Ziele für die synaptische anderen Neuronen Angabe ihrer Fähigkeit, die Integration in neuronalen Netzwerken dienen. Unser Protokoll stellt eine einfache Methode zur Isolierung und Abstammung Umwandlung von erwachsenen menschlichen Gehirn Perizyten in Ins.
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Protocol
1. Isolierung und Kultivierung von adulten menschlichen Gehirn-Zellen
Experimente mit menschlichem Gewebe sollte in Übereinstimmung mit allen relevanten staatlichen und institutionellen Regelungen bezüglich der Verwendung von Menschenmaterial zu Forschungszwecken durchgeführt werden. Die vorliegende Protokoll wurde in Übereinstimmung mit der Genehmigung durch die Ethikkommission der Medizinischen Fakultät der LMU München und eine schriftliche Einverständniserklärung von allen Patienten entwickelt.
Dieses Protokoll der Vorbereitung Kulturen der erwachsenen Menschen Hirnrinde wurde mit Proben von Patienten beider Geschlechter leidet Temporallappen-Epilepsie oder andere tiefsitzende nicht-traumatische, nicht-malignen Läsionen etabliert. Das aus dem Operationssaal ausschließlich der Zugangskanal zum Gehirn Läsion umfasste erhalten und damit Gewebe gilt als gesund. Die Altersspanne der Patienten betrug 19 bis 70 Jahren.
- Vorbereitung Wachstumsmedium durch Zugabe hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum(FCS) zu DMEM mit hohem Glucose Glutamax, um eine Endkonzentration von 20% FCS zu erhalten. 5 ml Penicillin / Streptomycin, auf insgesamt 500 ml Wachstumsmedium. Führen Sie diese und alle folgenden Schritte erfordern sterile Kulturbedingungen in einem geeigneten Steril.
- Halten erwachsenen menschlichen Gehirn-Biopsie aus dem Operationsraum in Hanks 'ausgeglichener Salzlösung mit CaCl 2 und MgCl 2 (HBSS) Medium mit HEPES (10 mM Endkonzentration) auf Eis bis zur Verarbeitung erhalten. Startet die Bearbeitung so schnell wie möglich.
- Um die Dissoziation in Einzelzellen beginnen, das Gewebe übertragen in eine 65 mm Petrischale und Hackfleisch in kleine Stücke mit Hilfe von zwei sterilen Einweg-Skalpelle. Für die enzymatische Verdauung verwendet TrypLE 3-6 ml in einem 15 ml konischen Röhrchen und Inkubation für 15-30 Minuten bei 37 ° C in einem Wasserbad.
- 1 Volumen der vorgewärmten Nährmedium, um die Dissoziation zu ermöglichen und sanft verreiben der Lösung, die Gewebestücke auf und ab, indem zuerst5 ml Einwegpipette, gefolgt durch die Verwendung einer Glaspasteurpipette bis zur Homogenisierung der Zellsuspension. Typischerweise einige restliche Gewebestücke, die meist aus der weißen Substanz, in Suspension bleiben.
- Spin-down bei 157 × g für 5 min und das Pellet in der entsprechenden Menge an Wachstumsmedium (10 ml pro unbeschichtete T75-Kulturkolben). Verwenden Sie eine T75 Kulturflasche für eine Biopsie von 5-10 mm Durchmesser in Größe und extrapolieren diese bei größeren Proben.
- Platzieren Zellen in einem 37 ° C Inkubator mit 5% CO 2 und 5% O 2.
- Ersetzen Sie die Hälfte des Mediums alle 3-4 Tage, bis die Zellen Konfluenz erreicht haben. Dies dauert in der Regel bis zu zwei Wochen (als Durchgang 0 [P0] bezeichnet).
2. In-vitro-Expansion und Charakterisierung von Adult Human Brain Cells
- In-vitro-Expansion:
- Absaugen Kulturmedium und Waschen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), gehalten bei Raum temperatur, vor Zugabe von 3 ml TrypLE.
- Inkubieren bei 37 ° C für 5-10 min, bis die meisten Zellen abgelöst. Klopfen Sie die Flaschen, um das Anheben der Zellen zu erleichtern; nach Zugabe von 3 Volumen Wachstumsmedium, übertragen Sie die Zellen in eine 15 ml konischen Röhrchen und Spin bei 157 xg für 5 min nach unten und die Zellen resuspendieren in der entsprechenden Menge des Wachstumsmediums.
- Passage der Zellen in einem Verhältnis von 1:3 für optimale Ausbeute zu neuen T75-Zellkulturflaschen.
Hinweis: Wir haben diese Zellen bis P5 agiert, ohne irgendwelche Anzeichen von reduzierten Umprogrammierung Effizienz. Während an P0 die Kultur enthält einen erheblichen Anteil der Endothelzellen (wie von CD34-Expression zu beurteilen), in den nachfolgenden Passagen ihre Zahl vernachlässigbar.
- Charakterisierung von adulten menschlichen Gehirn Kulturen:
- Immunocytochemistry:
- Zur Charakterisierung der Zellen, Samen ~ 60.000 Zellen auf Poly-D-Lysin beschichteten Glasdeckgläschen in 500 ul frisches Wachstums medium in 24-Well-Gewebekulturplatten, und bei 37 ° C mit 5% CO 2 und 5% O 2.
- Für immunzytochemische Analyse der kultivierten menschlichen Gehirnzellen entfernen Sie das Medium und waschen 3x mit 1 ml PBS.
- Fix Zellen durch Zugabe von 500 ul 4% Paraformaldehyd in PBS für 15 min bei Raumtemperatur.
- Übertragen der Glasdeckgläschen in eine geeignete Färbung befeuchteten Kammer und der Block mit 80 ul PBS, enthaltend 3% Rinderserumalbumin (BSA) und 0,5% Triton X-100 für 1 h bei Raumtemperatur.
- Hinzufügen Primärantikörper in derselben Lösung verdünnt (Verdünnungsfaktoren siehe Tabelle spezifischer Reagenzien und Ausrüstung) und Inkubation über Nacht bei 4 ° C oder 1 h bei Raumtemperatur.
Hinweis: Ein wesentlicher aber unterschiedlichem Anteil der Zellen in diesem Stadium der Kultivierung sind immunreaktiv für Blutplättchen abgeleiteten Wachstumsfaktor-Rezeptor β (PDGFRβ) cluster of differentiation 146 (CD146), NG2 Chondroitinsulfat Proteoglycan und Glattmuskelaktin (SMA), dh charakteristische Marker der Mikrogefäß-assoziierten Perizyten. Nur eine Minderheit (<1%) drücken die Astroglia-Marker saure Gliafaserprotein (GFAP) und S100β. Außerdem in dieser Phase die Kultur sollte frei von jeglichen Zellen, die den neuronalen Marker βIII-Tubulin exprimieren. Verwenden Sie mehrere primäre Antikörper-Kombinationen für die Co-Kennzeichnung von verschiedenen Markern. Eine weitere Bestätigung der Expression von Gliazellen, neuronale, Endothelzellen und Perizyten Marker können durch reverse Transkription und quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (in diesem Protokoll beschrieben) erhalten werden. - Nach der Inkubation mit dem primären Antikörper, wasche dreimal mit 1 ml PBS hinzugefügt und die entsprechenden Sekundärantikörper (in den geeigneten Verdünnungen) in die Farblösung und Inkubation 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln. Waschen Sie die Zellen 3x mit PBS. Falls erforderlich, vor der Montage umfassen Färbung mit DAPI für 5 min bei RaumTemperatur.
- Verwenden Antifading Montagemedium und analysieren die Deckgläser mit einem Epifluoreszenzmikroskop oder einem konfokalen Mikroskop.
- Durchflusszytometrie:
- Für die Analyse der Oberflächenmarker-Expression mittels Durchflusszytometrie, wachsen Zellen bis zur Konfluenz in T25-oder T75 unbeschichteten Zellkulturflaschen.
- Trennen von Zellen mithilfe TrypLE wie vorher und resuspendieren in Farblösung, bestehend aus PBS + 0,5% BSA beschrieben. Per Farbreaktion, resuspendieren 100.000-200.000 Zellen in 100 ul Farblösung. Bereiten Einzel Färbereaktionen pro Antikörper verwendet (CD146-FITC, CD140b-PE, CD34-APC, CD13-FITC, Isotypenkontrolle jeweiligen Antikörper).
- Hinzufügen Fluorochrom-konjugierten Antikörper zu jeder Färbelösung (siehe Tabelle für Verdünnungen spezifischer Reagenzien und Ausrüstung) direkt in der Zellsuspension und Inkubieren bei 4 ° C für 30 min im Dunkeln.
- Mit 500 ul PBS Waschen Sie die Zellen dreimal und Spin-down zwischen den einzelnenWaschschritt bei 157 × g für 5 min.
- Zellpellet in 0,5-1 ml Färbelösung und Übertragungszellen über einen Zellenfilter (70 um) FACS-Röhrchen. Schützen Sie die Probe vor Lichteinwirkung.
- Vortex Proben vor, indem sie in der FACS-Gerät.
- Um die lebenden Zellen zu analysieren und verstehen Schutt und Zellaggregate, Tor für FSC und SSC-A-A. Handy Duolen sind speziell von FSC-A-und FSC-W verknüpft. Um die richtigen Gating-Bedingungen für die Zelloberflächenmarker setzen Sie die Tore mit Isotyp-Antikörper-Kontrolle an die jeweilige Fluorochrom konjugiert zu bestimmen. Dann bestimmen den Anteil der Antikörper-gebundenen Zellen.
- Immunocytochemistry:
3. Bereicherung Perizyten abgeleiteten Zellen durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung
- Reinige den pericyte Zellpopulation (in Wachstumsmedium resuspendiert) vor Übertragung durch FACS-Sortierung mit einer 70 um Düse. Verwenden CD34-APC in Kombination mit CD140b-PE und CD146-FITC für Perizyten auswählen. Sortieren für CD34-negative, CD140b-und CD146-positiven Zellen.
- Sammeln der sortierten Zellen in Wachstumsmedium und der Platte auf Poly-D-Lysin-beschichtete Glasdeckgläschen in 24-Well-Gewebekulturplatten, und bei 37 ° C mit 5% CO 2 und 5% O 2.
- 48 h nach der Sortierung ersetzen das Medium mit frischem Wachstumsmedium und führen Übertragung in Protokoll 4 beschrieben.
4. Retrovirale Transduktion von Perizyten-abgeleiteten Zellen und Reprogrammierung in induzierte Neurone
Hinweis: Lesen Sie lokale Richtlinien der biologischen Sicherheit beim Umgang mit retroviralen Partikeln. In Deutschland ist die Verwendung der hier verwendeten Retroviren benötigen Biosicherheitsstufe 2. Für die Produktion von retroviralen Partikeln siehe Protokoll 6. Für retroviralen Konstrukte zur Umprogrammierung benutzt, um Karow et al verweisen. (2012). Retroviren waren pseudotypisierte mit VSV-G (VSV-GlycoProtein) 5. Für die Produktion entnehmen Sie bitte Gavrilescu et al 6 verweisen.
- 24 Stunden vor der retroviralen Transduktion Samen ~ 60.000 Zellen auf Poly-D-Lysin beschichteten Glasdeckgläschen in 500 ul frischem Wachstumsmedium in 24-Well-Gewebekulturplatten, und bei 37 ° C mit 5% CO 2 und 5% O 2 .
- Am nächsten Tag, ersetzen Sie das Wachstumsmedium mit 500 ul frisch, vorgewärmten Wachstumsmedium und fügen 1 ul der jeweiligen Überstände konzentriert retrovirale Partikel (für Steuer pCAG-IRES-DsRed, besonders während der Erstellung des Protokolls im Labor), pCAG-ASCL1 enthalten -IRES-DsRed pCAG-Sox2-IRES-GFP.
- Einen Tag später, entfernen Sie das Medium mit der Viruspartikel aus den Zellen und 1 ml frisches, vorgewärmtes B27-Differenzierungsmedium, von 49 ml DMEM mit hohem Glucose Glutamax und 1 ml Serum-B27 kostenlose Beilage zusammen. Aufrechterhaltung der Zellen in der Kultur bei 37 ° C in 5% CO 2 und 5% O 2 für 4-8 Wochen, ohne dass das Medium als Medium ändert sich wiederholende schädlich wie iNs reifen.
5. Charakterisierung der induzierten Neuronen durch Immunzytochemie
- Um die zelluläre Identität der transduzierten Zellen zu bestimmen, insbesondere um den Erwerb eines neuronalen Phänotyp zeigen, führen Immunzytochemie gegen neuronale Antigene wie bIII-Tubulin, MAP2 und NeuN (für Antikörper und deren Verdünnungen, siehe Tabelle von spezifischen Reagenzien und Ausrüstung, folgen dem gleichen Verfahren wie in 2.2.1 angegeben).
- Zur Verbesserung der Reifung von PdiNs, Co-Kultur dieser Zellen mit Nervenzellen aus der Maus E14 Hirnrinden abgeleitet. Zu diesem Zweck sezieren die Großhirnrinde und distanzieren sich ausdrücklich das Gewebe mechanisch mit einer feuerpolierten Pasteur-Glaspipette. In 10.000-50.000 murinen Neuronen zu Kulturen von pericyte-abgeleiteten Zellen 2-3 Wochen nach Transduktion mit Sox2-und ASCL1 re-encodingtroviruses und weiter Kultivierung. Transduzierte Zellen aus Maus-Neuronen durch ihre Reporter (GFP und dsRed) Ausdruck entweder durch Live-Epi-Fluoreszenz oder nach Immunzytochemie für GFP und dsRed unterschieden werden.
- Um die Bildung von Synapsen auf PdiNs von murinen Neuronen zu beurteilen, führen Immunzytochemie gegen vesikulären Neurotransmitter-Rezeptoren, wie vesikulären Glutamattransporter 1 (VGLUT1).
- Sonde transduzierten Zellen auf ihre elektrischen Eigenschaften (dh die Fähigkeit zur Erzeugung von Aktionspotentialen) und die Einrichtung von funktionellen Synapsen durch Patch-Clamp-Elektrophysiologie. Einzelheiten des Verfahrens siehe Heinrich et al. (2011).
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Representative Results
Das erste Ergebnis dieses Protokoll nach dem erfolgreichen Aufbau einer Kultur aus einer Probe des erwachsenen Menschen Hirnrinde besteht in der Identifizierung der zellulären Zusammensetzung des Kultur. Immunzytochemie für die Zelltyp-spezifische Proteine offenbart eine beträchtliche Heterogenität zwischen den Kulturen Probe verschiedener Patienten (1A) abgeleitet ist. Wie durch die Strömungs Durchflusszytometrie quantifiziert gibt es immer eine wesentliche Fraktion von Zellen, PDGFRβ exprimieren (durchschnittlich ~ 75%, von 30 bis zu 99%); andere Marker von Perizyten wie CD146, CD13 und NG2 werden typischerweise in einem niedrigeren Bereich (Abbildung 1B) ausgedrückt. Ebenso SMA ist in einem kleineren Unterpopulation von den kultivierten Zellen exprimiert wird, wie durch Immunzytochemie (Fig. 1A) bestimmt. Bei Passage 0 (P0), gibt es in der Regel <10% CD34-positive Endothelzellen und ihre Anzahl abnimmt unter der Nachweis mit weiteren Durchgang. Ebenso astrocytes umfasst nur eine vernachlässigbare Verunreinigungen in früheren Passagen. Außerdem gibt es typischerweise keine Zellen, die für neuronale Stammzellen, neuronale oder Oligodendrozyten-Marker zu färben. Immunzytochemische und Durchflusszytometrie Daten vollständig durch quantitative RT-PCR-7 bestätigt. In der Summe, die größte Fraktion innerhalb der Kultur ausdrückt Proteinen und mRNAs Merkmal der Perizyten. Eine weitere Anreicherung pericyte abgeleiteten Zellen durch FACS zu diesem Zeitpunkt erreicht werden. Dies ist besonders relevant, wenn die Reinheit der Kultur ist am unteren Ende des Spektrums, wie durch die Höhe der Expression PDGFRβ reflektiert. Somit haben wir einen Antikörper gegen PDGFRβ (CD140b) allein oder in Kombination mit einem anti-CD146-Antikörper verwendet, während ohne irgendwelche CD34-positiven Verunreinigungen zu FAC-Sortieren speziell Perizyten (Abbildung 1C).
Wandler diese Kulturen mit Steuer Viren nur ein Reporter-Gen kodiert, ist ihre Marker Ausdruck p nicht ändernrofile (beurteilt 3-4 Wochen nach der Transduktion), was anzeigt, dass diese Zellen in der Perizyten Linie bleiben. Ebenso hat Retrovirus-vermittelte Expression von Sox2 allein nicht in irgend offene Veränderungen in der Morphologie führen noch induziert bIII-Tubulin-Expression hindeutet, dass allein Sox2 nicht ausreicht, um ein Schicksal Umwandlung induzieren. Im Gegensatz dazu wird ein geringer Anteil (etwa 10%) der Zellen transduziert mit einem ASCL1 kodierenden Retrovirus allein zeigen βIII-Tubulin-Expression, jedoch ohne den Erwerb einer neuronale Morphologie. Auffallend ist, dass fast 50% aller Sox2-und ASCL1 cotransduced-Zellen zeigen βIII-Tubulin-Expression und noch wichtiger ist, ein Drittel dieser Doppel transduzierten Zellen (durch ihre Doppel Reporter Ausdruck sichtbar) auch anzeigen neuronalen Prozesse (Abbildung 2). Zusammen mit dem Erwerb der neuronalen Funktionen, ist Ausdruck der PDGFRβ herunterreguliert 7. Mit weiteren Reifung in Kultur, Sox2-und ASCL1-Koexpression Zellen auch immun gewordenoreactive für den reiferen neuronalen Marker MAP2 (Färbung dendritischen Prozesse) und NeuN (Färbung überwiegend Nervenzellkörper). Wie unter diesen Veränderungen in Markerexpression diskutierte auch mit dem Erwerb von elektrophysiologischen Markenzeichen von Neuronen zu korrelieren. Zusammengefasst zeigen diese Daten belegen, für die direkte Umwandlung von Perizyten Schicksal abgeleiteten Zellen in Ins, wie PdiNs bezeichnet. Diese PdiNs besitzen die Kompetenz, Funktions postsynaptischen Kompartimente wie in Co-Kultur-Experimente mit embryonalen Neuronen der Großhirnrinde der Maus zeigte etablieren. Diese Kompetenz kann elektrophysiologisch in das Erscheinungsbild der synaptischen Eingänge (siehe Diskussion unten) sowie die Dekoration von dendritischen Prozesse der PdiNs mit präsynaptischen Terminals von co-kultivierten Neuronen (gekennzeichnet durch Cluster von vesikulären Neurotransmitter-Transporter, wie zB VGLUT1 Immunreaktivität) abgeleitet nachgewiesen werden. Diese Daten zeigen weiter, die Fähigkeit der PdiNs in neuronalen c integrierenircuits.
Abbildung 1. Heterogene Expression von pericyte Marker in Kulturen aus erwachsenen menschlichen Hirnrinde abgeleitet. A) Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen, die die heterogene Expression von pericyte Marker (PDGFRB, SMA, CD146), wie Immunzytochemie enthüllt. Maßstabsbalken = 50 um. B) Das Histogramm fasst die relative Anzahl der Zellen, die positiv für die Marker pericyte PDGFRβ (CD140b), CD13 und CD146 als mittels Durchflusszytometrie von verschiedenen Patienten stammenden Kulturen bestimmt. CD34 ist ein Marker für Endothelzellen. C) FACS-Dot-Plots darstellen Isotypenkontrolle-und CD146 / CD140b-gefärbten menschlichen Zellen für die Sortierung der doppelt positiven Perizyten (von der roten Kasten hervorgehoben) für spätere Neuprogrammierung. Beachten Sie die hohe Rate der PDGFRβ Expression unddie Heterogenität in Bezug auf CD146-Expression in dieser besonderen Kultur.
. Abbildung 2 Reprogrammierung von adulten menschlichen pericyte-abgeleiteten Zellen in iNs Top:. Versuchsaufbau. Unten: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen der Darstellung Zellen mit Retrovirus-Codierung Sox2-IRES-GFP und ASCL1-IRES-DsRed transduziert. Beachten Sie, dass nur Doppel transduzierten Zellen (Pfeilspitzen) ausdrücken bIII-Tubulin (rechts) und weisen neuronale Morphologie.
| Zellteilung [%] | Zelltod [%] | bIII-Tubulin + [%] | |
| 36 | 3 | 0 | |
| Sox2 | 46 | 7 | 0 |
| ASCL1 | 26 | 33 | 7 |
| Sox2-ASCL1 | 3 | 36 | 25 |
Tabelle 1. Verhalten pericyte-abgeleiteten Zellen, die eine Umwandlung in PdiNs als durch kontinuierliche Live-Aufnahmen beurteilt. Beachten Sie, dass Sox2-und ASCL1 co-exprimierenden Zellen Ausfahrt Zellzyklus. Darüber hinaus stellen die hohe Rate der Zelltod nach ASCL1 oder Sox2 und ASCL1-Co-Expression. Wenn man diese unterschiedlichen zellulären Ereignisse zu berücksichtigen, etwa 25% aller Co-transduzierten Zellen werden ins.
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Discussion
Das vorliegende Protokoll beschreibt die in-vitro-Erweiterung und Bereicherung des pericyte-abgeleiteten Zellen nach der Isolierung von adulten menschlichen Großhirnrinde und die anschließende Umwandlung in Ins, die von Retrovirus-vermittelte Expression von Transkriptionsfaktoren der neurogenen Sox2 und ASCL1. Solche Protokoll bietet eine experimentelle in vitro-System, die Linie-Umwandlung von Gehirn-residente Zellen in Neuronen und Glia potenziell auch zu untersuchen, mit dem Ziel vor Augen, um schließlich übersetzen diese direkte Umwandlung Ansatz in die in-vivo-Einstellung des erwachsenen Gehirns.
Technische Überlegungen
In unserer Studie verwendeten wir menschliche Hirngewebe von Patienten, die zwischen 19 und 70 Jahren, von beiden Geschlechtern. Wir haben nicht bemerkt, eine offenkundige Unterschied in Umprogrammierung Effizienz je nach Geschlecht oder Alter 7. Es wird jedoch empfohlen, diese Informationen dokumentieren mehr als feinen Unterschiede können dennoch seinbeobachtet, die unsere Aufmerksamkeit entgangen.
Es wird ferner empfohlen, die mit der Verarbeitung von so früh wie möglich nach dem Transfer der Gewebe-Probe an das Labor. Es wird zwangsläufig einige Unbekannte, wie lange das Gewebe im Operationssaal vor blieb, um zu der Experimentator zu übertragen. Wir schätzen, dass in unserer Studie 7 der Zeit zwischen der Entnahme aus dem Gehirn des Patienten zu Beginn der Kultivierung Verfahren lag zwischen 2-6 Stunden, wobei die Proben, die alle Zeit auf Eis gehalten. Keine offensichtliche Unterschied in der Leichtigkeit der anschließenden Verarbeitung oder jeder negativen Ergebnis wurden innerhalb dieses Zeitfensters bemerkt.
Eine kritische Beurteilung für jedes Protokoll bezieht seine Einfachheit, Reproduzierbarkeit und Effizienz. Dieses Protokoll ist einfach, dass während einer ersten Phase-Zellen werden in einem Medium, das kostengünstig, leicht erhalten werden kann, gefolgt von einer zweiten Phase des Zell Umprogrammierung mit nur zwei Transkriptions fa erweitertenctors und Kultivierung in einem definierten Medium.
Hinsichtlich Reproduzierbarkeit, beobachteten wir, dass die Qualität des Retrovirus Herstellung von größter Bedeutung ist, mit niedrigem Titer Viruspräparate in Verdünnungen verwendet, um die Anzahl der infektiösen Partikel mit hohem Titer Viren häufig zu einem Versagen der Anpassung entspricht. In der Tat haben wir festgestellt, dass die gleiche pericyte Kultur, in der Umprogrammierung hatte zuvor nicht konnte erfolgreich in iNs wenn hohe Titer Viren umgewandelt werden.
Bezüglich Effizienz der Umwandlung haben wir die Anzahl der βIII-Tubulin-positiven Zellen von Sox2-und ASCL1 cotransduced-Zellen durch kontinuierliche Live-Bildgebung abgeleitet bewertet. Echtzeit-Bildgebung ermöglicht die Ermittlung der Anzahl von Zellen, die Zellteilung oder Zelltod während des Umwandlungsprozesses, wobei eine solche Information fehlt, wenn die Anzahl der erzeugten ins ist nur am Endpunkt des Experiments bestimmt. In der Tat mit Zeitraffer-Video microsKopie (für das Verfahren beziehen sich auf Ortega e t al. 8) wurde beobachtet, dass untransduzierten und Einzelfaktor-transduzierten Zellen weiter vermehren, während Sox2-und ASCL1 cotransduced-Zellen, die den Zellzyklus verlassen schnell. Darüber hinaus wird ein signifikanter Anteil des letzteren Population erfährt Zelltod. Während Retro Toxizität nicht formal von den in unserer Studie 7 erhaltenen Daten ausgeschlossen werden, die Tatsache, dass Zelltod erhöht nur beobachtet, wenn ASCL1 exprimiert wurde (allein oder in Kombination mit Sox2) interpretieren wir dies als Beweis für eine katastrophale Kollisionszelle Schicksal . Wenn man diese beiden Ereignisse zu berücksichtigen, schätzen wir, dass 25% aller Sox2-und ASCL1 cotransduced-Zellen wandeln in bIII-Tubulin-positive Ins (Tabelle 1).
Als Co-Transduktion absolut erfolgreichen Anpassung erforderlich ist, kann man erwägen, einen viralen Vektor Codierung beide Gene, die Menge der Zellen zu optimieren exprimieren beide Faktoren gleichzeitigZeit.
Kürzlich Ladewig et al. In iNs Erhalt einer Ausbeute von 200% unter Verwendung von niedermolekulare Hemmung der Glykogen-Synthase-Kinase-3β und SMAD Signalisierungs 9 entwickelt ein Protokoll für die effiziente Umwandlung von Fibroblasten. Es wird interessant sein, zu bestimmen, ob diese Add-ons zu unserem Protokoll Verbesserung der Ausbeute von PDIN Produktion.
Ein weiteres interessantes Ergebnis der Echtzeit-Bildgebung des Umprogrammierung betrifft die Tatsache, daß die Umwandlung von erwachsenen Menschen Perizyten in iNs tritt in einem ziemlich langsamen Tempo im Vergleich zu ähnlichen Umprogrammierung Protokolle in Kulturen von verschiedenen somatischen Zellen der Maus stammen 4. Dies steht im Einklang mit der charakteristischen langsamen Reifung von menschlichen Neuronen 10.
Obwohl wir nicht systematisch die Auswirkungen der Sauerstoffspannung auf die Ausbeute an PDIN Produktion analysiert, haben wir festgestellt, dass die Inkubation bei niedrigen Sauerstoffbedingungen (5%) in der Regelgaben im Vergleich zu Kultivierung der Zellen in normoxischen Bedingungen (21%) überlegene Ergebnisse. Kürzlich Davila et al. Beschrieben eine ähnliche verstärkende Wirkung durch verminderte Sauerstoffspannung für die Induktion von Ins von menschlichen Fibroblasten 11.
Unser Protokoll basiert auf dem retrovirale Abgabe Sox2 und ASCL1 basiert, während andere direkte Umwandlung Protokolle induzierbaren lentiviralen Vektoren 1, 12, 13 verwendet. Vor kurzem haben wir auch erfolgreich angewendet Doxycyclin-induzierbaren lentiviralen Konstrukte Sox2 und ASCL1 codiert, die anzeigt, dass ein relativ kurzer Impuls (10 Tage) von Sox2 und ASCL1 Ausdruck ist ausreichend, um pericyte-zu-Neuron-Umwandlung führen. Die in unserer Studie 7 verwendeten Retroviren wurden reduziert Silencing-5 konzipiert. Dementsprechend haben wir nicht feststellen, das Aussehen der Nervenzellen frei von Reporter-Gen-Expression. Aber die Möglichkeit, dass die Gesamtexpressionsniveaus von sowohl Transgens-und Reporter-Änderung über die Zeit kann nicht ausgeschlossen werden. Integration freie Ansätze (unter Verwendung von Sendai-Viren) wurden in letzter Zeit bei der Erzeugung von induzierten neuralen Vorläuferzellen 14 verwendet, aber es ist bis jetzt nicht bekannt, ob dieses oder sogar virenfrei Umprogrammierung Strategien können erfolgreich eingesetzt, um Menschen Perizyten konvertieren. Schließlich ob Perizyten aus anderen Geweben abgeleitete Umwandlung in induzierten neuronalen Zelltypen unterzogen werden, bleibt zu prüfen.
Konzeptionelle Überlegungen
Eine kritische Ergebnis der Reprogrammierung von Körperzellen in ihrer Funktionalität iNs betrifft 15. Wir haben die elektrophysiologischen Eigenschaften PdiNs zu verschiedenen Zeitpunkten nach dem Beginn der Umprogrammierung bewertet. Bei sehr frühen Stadium, dh 2 Wochen nach der retroviralen Transduktion, PdiNs zeigen kaum Anzeichen von elektrischen Erregbarkeit trotz βIII-Tubulin-Expression in diesem Stadium. So sind die meisten derelektrophysiologische Analysen wurden durchgeführt, 4-8 Wochen nach Transduktion mit Sox2 und ASCL1. Wie in Karow et al. Beschrieben, werden PdiNs erhebliche Unreife durch hohe Eingangswiderstände und einer niedrigen Frequenz von Aktionspotential Brenn reflektiert wird. Weitere Reifung kann durch Co-Kultivierung mit PdiNs Neuronen aus der Maus E14 Hirnrinde abgeleitet gefördert werden. Unter diesen Bedingungen weisen höhere PdiNs Aktionspotentialfrequenz und erhöhte Natriumströme 7. Darüber hinaus Co-Kultur zeigt die Kompetenz der PdiNs zu funktionellen synaptischen Input von Maus Neuronen empfangen. In der Summe PdiNs erwerben funktionellen neuronalen Eigenschaften, die weiter auf Co-Kultivierung mit anderen Neuronen verstärkt werden kann. Es bleibt jedoch gezeigt werden, ob PdiNs können auch funktionelle präsynaptischen Fächern etablieren. Weitere Studien PdiNs Transplantation in das Gehirn sind nötig, um ihr Potenzial zu zeigen, zur vollen Reife und Funktionalität zu erreichen.
Usingen und Sox2 ASCL1 als Reprogrammierungsfaktoren wir festgestellt, dass die resultierenden PdiNs erwerben Merkmale der GABAergen Neuronen 7. Interessanterweise haben andere Gruppen Protokolle entwickelt, um Fibroblasten durch unterschiedliche Transkriptionsfaktor und / oder MikroRNA Kombinationen mit dem Ergebnis, daß die Entwicklungs iNs erworben verschiedene Neurotransmitter Spezifikation wie einer glutamatergen, dopaminergen und cholinergen Phänotyp 1, 16-18 in iNs konvertieren. Es bleibt zu prüfen, ob die Faktorkombinationen in Fibroblasten verwendet induzieren die gleichen Sender Identität in PdiNs. Darüber hinaus hat die jüngsten Arbeit über die Umwandlung Spektrum der Neurogenese erweitert, um neurale Stammzellen 19, 20 oder Gliazellen, insbesondere Oligodendrozyten 21, 22 zu generieren. Wenn diese Umprogrammierung Protokolle entlocken ein ähnliches Ergebnis bei erwachsenen menschlichen Gehirn pericyte-abgeleiteten Zellen, wäre dies erheblich das Panorama der Anwendungen dieser Import erweiternant Gehirn-Resident Zelltyp.
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Disclosures
Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Magdalena Götz für ihre Eingabe während der Entwicklung dieses Protokolls. Wir danken Dr. Marius Wernig (Stanford University) für die großzügige Bereitstellung von uns mit der Sox2 kodierenden Sequenz. Wir sind auch sehr dankbar, dass Dr. Alexandra Lepier für die Virusproduktion. Diese Arbeit wurde durch Fördermittel der Deutschen Forschungsgemeinschaft (BE 4182/2-2) und dem BMBF (01GN1009A) an BB, und dem Bayerischen Staatsministerium für Wissenschaft, Forschung und Kunst zu MK und BBCS erhielt Mittel aus dem binationalen SYSTHER unterstützten INREMOS Virtuelle Institute (Deutsch und Slowenisch Bundesministerien für Bildung und Forschung) und der DFG (SFB 824).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-CD140b-PE | BD Biosciences | 558821 | use 1:100 |
| anti-CD146-FITC | AbD Serotec | MCA2141FT | use 1:100 |
| anti-CD13-FITC | AbD Serotec | MVA1270A488T | use 1:100 |
| anti-CD34-APC | BD Biosciences | 560940 | use 1:100 |
| anti-PDGFRβ | Cell Signaling | 3169S | use 1:200 |
| anti-CD146 | Abcam | Ab75769 | use 1:400 |
| anti-NG2 | Millipore | AB5320 | use 1:400 |
| anti-SMA | Sigma-Aldrich | A2547 | use 1:400 |
| anti-βIII-tubulin | Sigma-Aldrich | T8660 | use 1:400 |
| anti-MAP2 | Sigma-Aldrich | M4403 | use 1:200 |
| anti-GFAP | Sigma-Aldrich | G3893 | use 1:600 |
| anti-GFP | Aves Labs | GFP 10-20 | use 1:1,000 |
| anti-RFP | Chromotek | 5F8 | use 1:500 |
| anti-S100β | Sigma-Aldrich | S2532 | use 1:300 |
| anti-NeuN | Millipore | MAB377 | use 1:200 |
| anti-GABA | Sigma-Aldrich | A2052 | use 1:500 |
| anti-Calretinin | Millipore | AB5054 | use 1:500 |
| anti-vGluT1 | SYnaptic SYstems | 135511 | use 1:1,000 |
| Rat IgG1 isotype control FITC | AbD Serotec | 11-4301-81 | use 1:100 |
| Rat IgG1 isotype control PE | AbD Serotec | 12-4301-81 | use 1:100 |
| Rat IgG1 isotype control APC | AbD Serotec | 17-4301-81 | use 1:100 |
| TrypLE | Invitrogen | 12605-010 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Invitrogen | 61965 | |
| B27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10106-169 | perform heat inactivation by incubation at 56 °C for 30 min |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) | Invitrogen | 24020-091 | |
| Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1x) | Invitrogen | 14190 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| PFA (paraformaldehyde) | Sigma-Aldrich | P1648 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| DAPI (4′,6-Diamidin-2-phenylindole) dilactate | Sigma-Aldrich | 042M4005 | |
| Aqua-Poly/Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap | BD Biosciences | 352235 | |
| 24-well plates | Orange Scientific | 5530305 | |
| 75 cm2 culture flasks | Greiner Bio-One | 658175 | |
| 25 cm2 culture flasks | Greiner Bio-One | 690175 | |
| Disposable pipettes 10 ml | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| Glass Pasteur pipettes (150 mm) | Fisherbrand | FB50251 | |
| Glass coverslips 12 mm diameter | Menzel | CB00120RA1 | |
| Surgical disposable scalpels | B. Braun | 5518083 | |
| Tissue culture dishes | Greiner Bio-One | 633180 | |
| Conical tubes 15 ml | BD Biosciences | 352095 | |
| Laminar flow hood | |||
| Centrifuge and swing-out rotor with adapters for 15 ml and 50 ml tubes | Hettich Lab Technology | 1406 | |
| Flow cytometry cell sorter: FACSAria l with FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| Humified cell culture incubator | Eppendorf Galaxy 170R | ||
| Wather bath at 37 °C | |||
| FACSFlow sheath fluid | BD Biosciences | 342003 | |
| Epifluorescence microscope BX61 | Olympus | ||
| Confocal microscope LSM710 | Zeiss |
References
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