Summary
Atacar a las células cerebrales residente por linaje reprogramación directa ofrece nuevas perspectivas para la reparación del cerebro. Aquí se describe un protocolo de cómo preparar cultivos enriquecidos por pericitos cerebrales residente del adulto corteza cerebral humana y convertirlas en neuronas inducida por la expresión mediada por retrovirus de los factores de transcripción Sox2 y Ascl1.
Abstract
Linaje reprogramación directa de las células no neuronales en neuronas inducidas (INS) puede proporcionar conocimientos sobre los mecanismos moleculares que subyacen a la neurogénesis y permitir nuevas estrategias para el modelado in vitro o reparar el cerebro enfermo. La identificación de los tipos de células no neuronales del cerebro residente susceptibles de conversión directa en iNs podrían permitir el lanzamiento de un enfoque de este tipo in situ, es decir, dentro del tejido cerebral dañado. Aquí se describe un protocolo desarrollado en el intento de identificar las células derivadas de cerebro humano adulto que cumplen esta premisa. Este protocolo implica: (1) el cultivo de células humanas a partir de la corteza cerebral obtenidos a partir de biopsias de cerebro humano adulto; (2) la expansión in vitro (que requiere aproximadamente 2-4 semanas) y caracterización de la cultura por inmunocitoquímica y citometría de flujo; (3) el enriquecimiento por células activadas por fluorescencia (FACS) utilizando anticuerpos anti-receptor de PDGF-β y los anticuerpos anti-CD146;(4) la transducción mediada por retrovirus con la transcripción neurogénica factores de Sox2 y Ascl1; (5) y, finalmente, la caracterización de las neuronas resultantes derivadas de pericitos inducidas (PdiNs) por inmunocitoquímica (14 días a 8 semanas después de la transducción retroviral). En esta etapa, el INS se puede probar por sus propiedades eléctricas mediante la grabación de patch-clamp. Este protocolo proporciona un procedimiento altamente reproducible para la conversión linaje in vitro de los pericitos cerebrales residente en iNs humanos funcionales.
Introduction
A diferencia de la reprogramación de células somáticas en células madre pluripotentes inducidas (iPSCs), que a su vez están dotados de una gran cantidad de potenciales de diferenciación, la reprogramación directa tiene como objetivo para la conversión recta de un tipo específico de célula a otro. Con respecto a su aplicación en el contexto de la modelización de enfermedades y terapias basadas en células potenciales, ambos enfoques de reprogramación tienen ventajas y desventajas específicas. Reprogramación en iPSCs (i) ofrece una fuente casi infinita de células; (Ii) permite la ingeniería genética; (Iii) dota de un potencial de diferenciación casi ilimitada. Sin embargo, las principales desventajas de CMPI conllevan el riesgo de tumorigenicidad de las células no diferenciadas (la formación de teratomas in vivo) y la necesidad para el cultivo ex vivo y posterior trasplante si estas células se van a utilizar para las terapias basadas en células. Por el contrario, el linaje-reprogramación directa está limitado por el menor rendimiento de las células deseadasque se correlaciona directamente con el número de las células diana de la población de partida, sino que posee la ventaja de que las células de linaje-reprogramado parecen exhibir ningún riesgo tumorigénico en el trasplante 1,2; además, la reprogramación directa, incluso se puede lograr in situ, es decir, en el órgano donde se requerirían estas células, evitando así la necesidad de un trasplante.
Con esto en mente, nuestro laboratorio ha perseguido la posibilidad de las células cerebrales residente linaje reprogramación en iNs como un nuevo enfoque hacia las terapias basadas en las células de las enfermedades neurodegenerativas. Células cerebrales-residente que pueden ser considerados como potencialmente dianas celulares para el linaje-reprogramación comprenden diferentes tipos de macroglía (astrocitos, células NG2 y oligodendrocitos), microglia y células microvasculares asociadas (células endoteliales y los pericitos). Hemos estudiado ampliamente el potencial reprogramación in vitro de astroglia del cor cerebraltex de principios de ratones postnatales 3-5. En la búsqueda de fuentes de células de manera similar adecuadas para linaje reprogramación directa en el cerebro humano adulto, nos encontramos con una población de células que se pueden reprogramar con éxito en ins y características de exhibición de los pericitos. Aquí se describe un protocolo de cómo cosechar estas células de biopsias de cerebro humano adulto, para expandir y enriquecer estas células in vitro, y finalmente reprogramar con éxito una fracción sustancial de estas células in vitro en expandido (en el rango de 25-30%) en Ins. La reprogramación se puede lograr por mediada por retrovirus co-expresión simultánea de dos factores de transcripción, Sox2 y Ascl1. Se encontró que estas PdiNs para adquirir la capacidad de acción repetitiva potencial de fuego y para servir como dianas sinápticas de otras neuronas que indican su capacidad de integrarse en las redes neuronales. Nuestro protocolo proporciona un mecanismo sencillo para que el aislamiento y el linaje de conversión de pericitos cerebro humano adulto en Complementos.
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Protocol
1. Aislamiento y cultivo de células cerebro humano adulto
Los experimentos con el tejido humano se deben realizar de acuerdo con todas las regulaciones gubernamentales e institucionales pertinentes en relación con la utilización de material humano para fines de investigación. El presente protocolo fue desarrollado de acuerdo con la aprobación del comité de ética de la Facultad de Medicina de la LMU Munich y el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes.
Este protocolo de culturas que se preparan de la corteza cerebral humano adulto se ha establecido el uso de muestras de pacientes de ambos sexos que sufren de epilepsia del lóbulo temporal u otras lesiones no traumáticas, no malignas profundas. El tejido obtenido de la sala quirúrgica que comprende exclusivamente el canal de acceso a la lesión del cerebro y por lo tanto se considera saludable. El rango de edad de los pacientes fue de 19 a 70 años.
- Preparar medio de crecimiento mediante la adición de suero de ternera fetal inactivado por calor(FCS) a DMEM de alta glucosa con GlutaMAX para obtener una concentración final de 20% de FCS. Añadir 5 ml de penicilina / estreptomicina a un total de 500 ml de medio de crecimiento. Realice este y todos los pasos posteriores que requieren condiciones de cultivo estériles en una campana de flujo laminar adecuado.
- Mantener la biopsia de cerebro humano adulto obtenida de la habitación quirúrgica en solución salina equilibrada de Hanks con CaCl2 y MgCl2 (HBSS) medio que incluye HEPES (10 mM de concentración final) en hielo hasta el procesamiento. Inicie el procesamiento tan pronto como sea posible.
- Para iniciar la disociación en células individuales, transferir el tejido en una placa de Petri de 65 mm y picar en trozos pequeños usando dos escalpelos estériles de uso único. Para la digestión enzimática utilizar 3-6 ml TrypLE en un tubo cónico de 15 ml y se incuba durante 15-30 min a 37 ° C en un baño de agua.
- Añadir 1 volumen de medio de crecimiento precalentado para facilitar la disociación y se tritura suavemente la solución que contiene piezas de tejido arriba y hacia abajo por primera utilizandouna pipeta desechable de 5 ml, seguido por el uso de una pipeta Pasteur de vidrio hasta la homogeneización de la suspensión celular. Normalmente, algunos trozos de tejido residual, en su mayoría consisten en la sustancia blanca, permanecerán en la suspensión.
- Centrifugar a 157 xg durante 5 min y resuspender el precipitado en la cantidad apropiada de medio de crecimiento (10 ml por matraz de cultivo T75 no recubierto). Utilice un frasco de cultivo T75 para una biopsia de 5-10 mm de diámetro de tamaño y extrapolar a partir de esto en el caso de los especímenes más grandes.
- Colocar las células en una incubadora a 37 ° C con 5% de CO 2 y 5% de O 2.
- Reemplazar la mitad del medio cada 3-4 días hasta que las células han alcanzado la confluencia. Esto suele tardar hasta dos semanas (denominados pasaje 0 [P0]).
2. Expansión in vitro y caracterización de células adultas del cerebro humano
- En la expansión in vitro:
- Aspirar el medio de cultivo y se lava con solución salina tamponada con fosfato (PBS), se mantuvo en la sala de temperatura, antes de añadir 3 ml TrypLE.
- Se incuba a 37 ° C durante 5-10 minutos hasta que la mayoría de las células separadas. Golpee suavemente los frascos para facilitar la eliminación de las células; después de la adición de 3 volúmenes de medio de crecimiento, transferir las células a un tubo cónico de 15 ml y centrifugar a 157 xg durante 5 min y resuspender las células en la cantidad apropiada de medio de crecimiento.
- Pasaje de las células en una proporción de 1:3 para un rendimiento óptimo en frascos nuevos de cultivo de células T75.
Nota: Hemos pases estas células hasta P5, sin signos de reducción de la eficiencia de reprogramación. Mientras que en P0 el cultivo contiene una fracción considerable de células endoteliales (como se evaluó por la expresión de CD34), en pasajes posteriores su número se convierte en insignificante.
- Caracterización de las culturas del cerebro humano adulto:
- La inmunocitoquímica:
- Para la caracterización de las células, ~ 60.000 células de semillas en D-lisina recubierto con poli-cubierta de cristal se desliza en 500 l fresca mediu crecimientom en placas de 24 pocillos de cultivo de tejidos y se incuba a 37 ° C con 5% de CO 2 y 5% de O 2.
- Para el análisis inmunocitoquímico de las células cerebrales humanas cultivadas eliminar el medio y lavar 3 veces con 1 ml de PBS.
- Fijar las células mediante la adición de 500 l de paraformaldehído al 4% en PBS durante 15 min a temperatura ambiente.
- Transferencia de la cubierta de vidrio se desliza en una cámara humidificada tinción apropiado y bloquear con 80 l de PBS que contiene 3% de albúmina de suero bovino (BSA) y 0,5% de Triton X-100 durante 1 hora a temperatura ambiente.
- Añadir anticuerpos primarios diluidos en la misma solución (para factores de dilución véase la tabla de reactivos y equipos específicos) y se incuba durante la noche a 4 ° C o 1 hora a temperatura ambiente.
Nota: Una fracción sustancial pero variando de las células en esta fase de cultivo son inmunorreactivas para β del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR), grupo de diferenciación 146 (CD146), Proteo condroitina sulfato de NG2glicanos y actina de músculo liso (SMA), es decir, marcadores característicos de pericitos microvasos asociada. Sólo una minoría (<1%) expresan la proteína glial fibrilar ácida marcadores astrogliales (GFAP) y S100β. Además, en esta etapa el cultivo debe ser desprovisto de cualquier células que expresan el marcador neuronal βIII-tubulina. Utilice múltiples combinaciones de anticuerpos primarios para la co-etiquetado de los diferentes marcadores. La confirmación adicional de la expresión de marcadores gliales, neuronales, endoteliales y pericitos puede obtenerse por transcripción inversa y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (no descrito en este protocolo). - Después de la incubación con los anticuerpos primarios se lavan tres veces con 1 ml de PBS y añadir los anticuerpos secundarios correspondientes (en las diluciones apropiadas) a la solución de tinción y se incuban 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad. Se lavan las células 3 veces con PBS. Si es necesario, antes de montar incluir tinción con DAPI durante 5 min a la habitacióntemperatura.
- Utilice antifading medio de montaje y analizar los cubreobjetos utilizando un microscopio de epifluorescencia o un microscopio confocal.
- La citometría de flujo:
- Para el análisis de expresión de marcadores de superficie utilizando citometría de flujo, crecer las células hasta la confluencia en T25 sin recubrir o frascos de cultivo celular T75.
- Separar las células mediante el uso de TrypLE como se ha descrito antes y volver a suspender en solución de tinción que consiste en PBS + 0,5% de BSA. Por reacción de tinción, resuspender 100.000-200.000 células en 100 l de solución de tinción. Preparar reacciones de tinción individuales por anticuerpos utilizados (CD146-FITC, CD140b-PE, CD34-APC, CD13-FITC, anticuerpos de control de isotipo respectivos).
- Añadir anticuerpos conjugados con fluorocromo a cada solución de tinción (véase la tabla para diluciones de reactivos y equipos específicos) directamente en la suspensión celular y se incuba a 4 ° C durante 30 minutos en la oscuridad.
- Se lavan las células tres veces con 500 l de PBS y centrifugar entre cadaetapa de lavado a 157 xg durante 5 min.
- Resuspender el sedimento celular en 0,5-1 ml de solución de tinción y las células de transferencia a través de un filtro de células (70 micras) a tubos de FACS. Evita que la muestra de la exposición a la luz.
- Muestras Vortex antes de colocarlos en el instrumento FACS.
- Para el análisis de las células vivas y excluir a los desechos celulares y los agregados, portón para FSC-A y SSC-A. Dosillos celulares se gated específicamente por FSC-A y FSC-W. Para determinar las condiciones de activación periódica adecuadas para los marcadores de superficie celular que figuran las puertas con control de isotipo conjugado con el fluorocromo respectiva. A continuación, determinar la proporción de células productoras de anticuerpos de ruedas.
- La inmunocitoquímica:
3. Enriquecimiento de células derivadas de pericitos por fluorescencia de células activadas por la clasificación
- Se purifica la población de células de pericitos (se resuspendieron en medio de crecimiento) antes de la transducción a través de clasificación por FACS utilizando una boquilla de 70 micras. Utilice CD34-APC en combinación con CD140b-PE y CD146-FITC para seleccionar a los pericitos. Ordenar por, células CD140b-y CD146 positivas CD34 negativas.
- Recoger las células clasificadas en medio de crecimiento y placa sobre D-lisina recubierto con poli-cubierta de cristal se desliza en placas de cultivo tisular de 24 pocillos y se incuba a 37 ° C con 5% de CO 2 y el 5% de O 2.
- 48 h después de su clasificación sustituir el medio con medio de crecimiento fresco y llevar a cabo la transducción tal como se describe en el Protocolo 4.
4. Transducción retroviral de células derivadas de pericitos y Reprogramación en neuronas inducidas
Nota: Consulte las normas de bioseguridad locales al manipular partículas retrovirales. En Alemania, el uso de los retrovirus utilizados aquí requiere de bioseguridad de nivel 2. Para la producción de partículas retrovirales se refiere el protocolo 6. Para construcciones retrovirales utilizados para la reprogramación, consulte Karow et al. (2012). Los retrovirus fueron pseudotyped con VSV-G (virus de la estomatitis vesicular-glicoproteína) 5. Para la producción consulte Gavrilescu et al 6.
- 24 horas antes de la semilla de la transducción retroviral ~ 60.000 células en D-lisina recubierto con poli-cubierta de cristal se desliza en 500 l medio de cultivo fresco en placas de 24 pocillos de cultivo de tejidos y se incuba a 37 ° C con 5% de CO 2 y el 5% de O2 .
- Al día siguiente, reemplazar el medio de cultivo con 500 l medio de cultivo fresco, precalentado y añadir 1 l de los sobrenadantes concentrados respectivos que contienen partículas retrovirales (pCAG-IRES dsRed-para el control, sobre todo durante el establecimiento del protocolo en el laboratorio), pCAG-Ascl1 -dsRed IRES, pCAG-sox2-IRES-GFP.
- Un día después, extraiga el soporte incluyendo las partículas virales de las células y se añade 1 ml fresco, precalentado medio B27-diferenciación, compuesta de 49 ml de DMEM rico en glucosa con GlutaMAX y 1 suplemento libre de suero B27 ml. Mantener las células en cultivo a 37 ° C en 5% De CO 2 y el 5% de O 2 durante 4-8 semanas sin cambiar el medio como cambios de medio repetitivas se vuelven dañinos como iNs maduran.
5. Caracterización de neuronas inducida por inmunocitoquímica
- Para determinar la identidad celular de las células transducidas, en particular, para demostrar la adquisición de un fenotipo neuronal, realizar inmunocitoquímica contra antígenos neuronales tales como bIII-tubulina, MAP2, y NeuN (para los anticuerpos y las diluciones respectivas, ver tabla de reactivos específicos y equipo; seguir el mismo procedimiento como se indica en 2.2.1).
- Para mejorar la maduración de PdiNs, co-cultivo de estas células con las neuronas derivadas de ratón E14 cortezas cerebrales. Para este fin, diseccionar la corteza cerebral y disociar el tejido mecánicamente con una pipeta Pasteur de vidrio pulida al fuego. Añadir 10.000-50.000 neuronas murinas a cultivos de células derivadas de pericitos 2-3 semanas después de la transducción con re-Sox2 y Ascl1-codificacióntroviruses y continuar el cultivo. Las células transducidas se pueden distinguir de las neuronas murinas por su reportero (GFP y dsRed) la expresión, ya sea por epifluorescencia vivo o después de inmunocitoquímica para GFP y dsRed.
- Para evaluar la formación de sinapsis en PdiNs por neuronas murinas, realizar inmunocitoquímica contra receptores de neurotransmisores vesiculares tales como transportador vesicular de glutamato 1 (VGLUT1).
- Sonda células transducidas para sus propiedades eléctricas (es decir, la capacidad de generar potenciales de acción) y el establecimiento de las sinapsis funcionales por electrofisiología de patch-clamp. Para más detalles sobre el procedimiento de ver Heinrich et al. (2011).
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Representative Results
El primer resultado de este protocolo después de establecer con éxito una cultura de un espécimen de ser humano adulto corteza cerebral consiste en la identificación de la composición celular de la cultura. La inmunocitoquímica de proteínas específicas de tipo celular revela un grado considerable de heterogeneidad entre los cultivos derivados de muestras de diferentes pacientes (Figura 1A). Tal como se cuantifica por citometría de flujo no es siempre una fracción sustancial de las células que expresan PDGFR (en promedio ~ 75%, que van desde 30 a hasta 99%); otros marcadores de pericitos tales como CD146, CD13 y NG2 se expresan típicamente en un rango más bajo (Figura 1B). Asimismo SMA se expresa en una subpoblación de menor importancia de las células cultivadas, como se determina por inmunocitoquímica (Figura 1A). En el paso 0 (P0), hay por lo general <10% de células endoteliales CD34-positivo, y su número desciende por debajo de la detección con más pases. Del mismo modo, astrocytes sólo representan una contaminación insignificante en los pasajes anteriores. Además, generalmente no hay células que se tiñen de células neurales madre, neuronal, o marcadores de oligodendrocitos. Inmunocitoquímica y citometría de flujo de datos están totalmente corroborado por cuantitativos RT-PCR 7. En suma, la fracción más grande dentro de la cultura expresa las proteínas y mRNAs característico de pericitos. Un enriquecimiento adicional para las células derivadas de pericitos se puede lograr mediante FACS en esta etapa. Esto es particularmente relevante cuando la pureza del cultivo está en el extremo inferior del espectro tal como se refleja por el nivel de expresión de PDGFR. Por lo tanto, hemos utilizado un anticuerpo contra PDGFRß (CD140b) solo o en combinación con un anticuerpo anti-CD146, mientras que excluye cualquier tipo de contaminante CD34-positivas, a FAC-ordenar específicamente pericitos (Figura 1C).
Transducción de estas culturas con los virus de control que codifican sólo un gen reportero, no altera su expresión de marcadores de pERFIL (evaluados 3-4 semanas después de la transducción), lo que indica que estas células permanecen en el linaje de pericitos. Del mismo modo, la expresión mediada por retrovirus de Sox2 por sí sola no produjo cambios evidentes en la morfología ni induce la expresión bIII-tubulina lo que sugiere que solo Sox2 no es suficiente para inducir una conversión destino. En contraste, un bajo porcentaje (aproximadamente el 10%) de las células transducidas con un retrovirus que codifica Ascl1-exhibición sola expresión βIII-tubulina, sin embargo, sin la adquisición de una morfología neuronal. Sorprendentemente, casi el 50% de todos los y Sox2 células Ascl1-cotransduced mostrar expresión βIII-tubulina y, más importante aún, un tercio de estas células doble transducidas (visualizados por su doble expresión del indicador) también muestran procesos neuronales (Figura 2). Junto con la adquisición de funciones neuronales, la expresión del PDGFR es el regulado 7. Con una mayor madurez en la cultura, y Sox2 células Ascl1-coexpressing también se vuelven immunoreactive de los marcadores neuronales más maduros MAP2 (tinción procesos dendríticas) y NeuN (tinción cuerpos celulares neuronales predominantemente). Como se discute a continuación estos cambios en la expresión de marcador también se correlacionan con la adquisición de características electrofisiológicas de las neuronas. En resumen, estos datos proporcionan evidencia de la conversión suerte directa de las células derivadas de pericitos en iNs, denominado PdiNs. Estos PdiNs tengan la competencia para establecer compartimentos postsinápticos funcionales tal como se revela en los experimentos de cocultivo con las neuronas de la corteza cerebral de ratón embrionario. Esta competencia se puede demostrar electrofisiológicamente en la aparición de entradas sinápticas (véase la discusión más adelante), así como la decoración de los procesos dendríticos de PdiNs con terminales presinápticas derivados de co-cultivaron neuronas (caracterizadas por grupos de transportadores de neurotransmisores vesiculares, por ejemplo, la inmunorreactividad de VGLUT1). Estos datos indican además la capacidad de PdiNs de integrar en C neuronalircuits.
Figura 1. Expresión heterogénea de marcadores de pericitos en cultivos derivados de la corteza cerebral humano adulto. A) micrografías fluorescentes que ilustran la expresión heterogénea de marcadores pericitos (PDGFRB, SMA, CD146) según lo revelado por inmunocitoquímica. Barra de escala = 50 m. B) El histograma resume el número relativo de células positivas para los marcadores de pericitos PDGFRß (CD140b), CD13, CD146 y como se determina por citometría de flujo de diferentes cultivos derivados del paciente. CD34 es un marcador para las células endoteliales. Parcelas C) FACS de puntos que representa el control de isotipo y las células humanas teñidas con CD140b CD146 / para la clasificación de los pericitos doble positivas (resaltados por el cuadro rojo) para la posterior reprogramación. Tenga en cuenta la alta tasa de expresión y PDGFRßla heterogeneidad en cuanto a la expresión de CD146 en esta cultura particular.
. Figura 2 La reprogramación de células humanas adultas derivadas de pericitos en iNs Top:. Experimental set-up. Abajo: micrografías fluorescentes representan células transducidas con retrovirus que codifica sox2-IRES-GFP y Ascl1-IRES-DsRed. Tenga en cuenta que sólo las células transducidas doble (puntas de flecha) expresan bIII-tubulina (panel derecho) y muestran la morfología neuronal.
| la división celular [%] | la muerte celular [%] | bIII-tubulina + [%] | |
| 36 | 3 | 0 | |
| Sox2 | 46 | 7 | 0 |
| Ascl1 | 26 | 33 | 7 |
| Sox2-Ascl1 | 3 | 36 | 25 |
Tabla 1. Comportamiento de las células derivadas de pericitos en reconversión en PdiNs según la evaluación de imágenes en vivo continua. Tenga en cuenta que Sox2 y Ascl1 co-expresión de las células del ciclo celular salida. Además, tenga en cuenta la alta tasa de muerte celular después Ascl1 o Sox2 y Ascl1-co-expresión. Teniendo en cuenta estos eventos celulares distintos, aproximadamente el 25% de todas las células co-transduced convertirse iNs.
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Discussion
El presente protocolo describe la expansión in vitro y el enriquecimiento de las células derivadas de pericitos después del aislamiento por parte del adulto corteza cerebral humana y la posterior conversión en iNs por la expresión mediada por retrovirus de la transcripción neurogénica factores Sox2 y Ascl1. Tal protocolo experimental proporciona un sistema in vitro para estudiar el linaje de conversión de las células cerebrales-residente en neuronas y glía, potencialmente, también, con el objetivo en mente para traducir en última instancia, este enfoque de conversión directa en el entorno in vivo del cerebro adulto.
Consideraciones técnicas
En nuestro estudio hemos utilizado el tejido cerebral humano de pacientes de edades comprendidas entre 19 y 70 años, de ambos sexos. No notamos una diferencia evidente en la eficiencia de la reprogramación en función del sexo o la edad de 7 años. No obstante, se recomienda para documentar esta información como diferencias más sutiles pueden ser, no obstanteobservado que escapaba a nuestra atención.
Además, se recomienda iniciar el procesamiento tan pronto como sea posible después de la transferencia de la muestra de tejido al laboratorio. No habrá necesariamente algunas incógnitas para el tiempo que el tejido ha permanecido en la sala de operaciones antes de la transferencia al experimentador. Estimamos que en nuestro estudio 7 el tiempo entre la extracción del cerebro del paciente al inicio del procedimiento de cultivo varió entre 2-6 h, con las muestras que se mantienen todos los tiempos en hielo. No hay diferencia manifiesta en la facilidad de procesamiento posterior ni cualquier resultado adverso se notó dentro de esta ventana de tiempo.
Una evaluación crítica de cualquier protocolo se refiere a su sencillez, reproducibilidad y eficiencia. El presente protocolo es sencillo en que durante una primera fase las células se expanden en un medio de bajo costo que se puede obtener fácilmente, seguido por una segunda fase de reprogramación celular usando sólo dos FA transcripciónctors y cultivo en un medio definido.
En cuanto a la reproducibilidad, se observó que la calidad de la preparación de retrovirus es de suma importancia, con preparaciones bajas de virus título utilizados en diluciones para que coincida con el número de partículas infecciosas de virus de alto título a menudo resulta en un fracaso de la reprogramación. De hecho hemos observado que la misma cultura de pericitos en los que había fallado previamente reprogramación podría convertirse con éxito en iNs cuando el uso de virus de alto título.
En cuanto a la eficiencia de la conversión, hemos evaluado el número de células βIII-tubulina-positivos derivados de y Sox2 células Ascl1-cotransduced utilizando imágenes en vivo continua. Formación de imágenes en vivo permite la evaluación del número de células que se someten a la división celular o la muerte celular durante el proceso de conversión, mientras que falta tal información cuando el número de iNs generada se determina sólo en el punto final del experimento. De hecho el uso de micros de vídeo time-lapsecopia (para el procedimiento se refiere a Ortega e t al. 8), se observó que las células de factores transducidas untransduced e individuales continúan proliferando, mientras y Sox2 células Ascl1-cotransduced salir rápidamente en el ciclo celular. Por otra parte, una fracción significativa de la última población se somete a la muerte celular. Si bien la toxicidad de retrovirus no se puede excluir formalmente partir de los datos obtenidos en nuestro estudio 7, se observó el hecho de que el aumento de la muerte celular sólo cuando se expresó Ascl1 (solo o en combinación con Sox2), interpretamos esto como evidencia de un conflicto catastrófico de destinos celulares . A partir de estos dos hechos en cuenta, se estima que el 25% de todas y Sox2 células Ascl1-cotransduced convertir en iNs positivos bIII-tubulina (Tabla 1).
Como co-transducción es absolutamente necesario para la reprogramación éxito, se puede considerar el empleo de un vector viral que codifica ambos genes para optimizar la cantidad de células que expresan ambos factores al mismotiempo.
Recientemente, Ladewig et al. Desarrollaron un protocolo para la conversión eficiente de los fibroblastos en iNs la obtención de un rendimiento de 200% mediante el uso de pequeña inhibición basada en moléculas de glucógeno sintasa quinasa-3β y Smad señalización 9. Será interesante para determinar si estos complementos a nuestro protocolo de mejorar el rendimiento de la producción PDIN.
Otro resultado interesante de la formación de imágenes en vivo de el proceso de reprogramación refiere al hecho de que la conversión de los pericitos humanos adultos en iNs se produce a un ritmo más lento en comparación con los protocolos de reprogramación similares en cultivos de diferentes células somáticas de origen de ratón 4. Esto es coherente con la característica de la maduración lenta de las neuronas humanos 10.
Si bien no hemos analizado sistemáticamente el impacto de la tensión de oxígeno en el rendimiento de la producción PDIN, hemos observado que la incubación en condiciones de bajo oxígeno (5%) en generaldio resultados superiores en comparación con el cultivo de las células en condiciones de normoxia (21%). Recientemente, Davila et al. Describe un efecto similares para mejorar por la reducción de la tensión de oxígeno para la inducción de Ins a partir de fibroblastos humanos 11.
El protocolo se basa en la entrega retroviral de Sox2 y Ascl1 mientras que otros protocolos de conversión directa han empleado vectores inducibles lentivirales 1, 12, 13. Más recientemente también hemos aplicado con éxito construcciones lentivirales inducible por doxiciclina que codifican Sox2 y Ascl1, lo que indica que un relativamente corto pulso (10 días) de Sox2 y Ascl1 expresión es suficiente para causar la conversión de pericitos-a-neurona. Los retrovirus utilizados en nuestro estudio 7 fueron diseñados para reducir el silenciamiento 5. En consecuencia, no nos dimos cuenta de la aparición de las neuronas que carecen de la expresión del gen reportero. Sin embargo, la posibilidad de que los niveles globales de expresión de transgén tantos y el reportero cambian con el tiempo no se puede excluir. Los enfoques de integración libre (que utilizan los virus Sendai) se han empleado últimamente en el caso de la generación de los progenitores neuronales inducidas 14, pero en este momento no se sabe si esto o estrategias de reprogramación incluso virus libre se puede aplicar con éxito para convertir pericitos humanos. Por último, si los pericitos derivadas de otros tejidos pueden sufrir conversión en tipos de células neuronales inducidas permanece para ser probado.
Consideraciones conceptuales
Un resultado fundamental de la reprogramación de células somáticas en iNs refiere a su funcionalidad 15. Hemos evaluado las propiedades electrofisiológicas de PdiNs en diferentes puntos de tiempo tras el inicio del proceso de reprogramación. En etapas muy tempranas, es decir, 2 semanas después de la transducción retroviral, PdiNs exhiben apenas signos de excitabilidad eléctrica, a pesar de la expresión βIII-tubulina en esta etapa. Por lo tanto, la mayor parte de laanálisis electrofisiológicos se llevaron a cabo de 4-8 semanas después de la transducción con Sox2 y Ascl1. Como se describe en Karow y col., PdiNs se caracterizan por una considerable falta de madurez como se refleja por las altas resistencias de entrada y una baja frecuencia de potencial de acción disparando. Además de maduración puede ser promovida por PdiNs co-cultivo con las neuronas derivadas de ratón E14 corteza cerebral. En estas condiciones, PdiNs exhiben un mayor potencial de acción y el aumento de frecuencias de las corrientes de sodio 7. Por otra parte, el cocultivo revela la competencia de PdiNs para recibir la entrada sináptica funcional de las neuronas de ratón. En suma, PdiNs adquieren propiedades neuronales funcionales que se pueden mejorar aún más en el cocultivo con otras neuronas. Sin embargo, queda por demostrar si PdiNs también pueden establecer compartimentos presináptica funcionales. Se necesitan más estudios transplante PdiNs en el cerebro para revelar su potencial para alcanzar la plena madurez y funcionalidad.
Ucantar sox2 y Ascl1 como factores de reprogramación que señalar que el PdiNs resultantes adquieren características de las neuronas GABAérgicas 7. Curiosamente, otros grupos han desarrollado protocolos para convertir fibroblastos en complementos con diferente factor de transcripción y / o combinaciones de microARN con el resultado de que el INS desarrollo adquirió especificación neurotransmisor distinto, tal como un glutamatérgica, dopaminérgicos, y el fenotipo colinérgico 1, 16-18. Queda probado si las combinaciones de factores utilizados en fibroblastos inducen la misma identidad del transmisor en PdiNs. Por otra parte, el trabajo reciente ha ampliado el espectro de conversión más allá de la neurogénesis para generar células madre neuronales 19, 20 o gliales, en oligodendrocitos particulares 21, 22. Si estos protocolos reprogramación provocan un resultado similar en las células derivadas de pericitos cerebro humano adulto, esto se ampliaría en gran medida el panorama de las aplicaciones de esta importaciónhormiga tipo de célula cerebral residente.
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Disclosures
Los autores tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Estamos muy agradecidos a la Dra. Magdalena Götz por su aportación durante el desarrollo de este protocolo. Agradecemos al Dr. Marius Wernig (Universidad de Stanford) por su generoso que nos proporciona la secuencia de codificación sox2. También estamos muy agradecidos a la Dra. Alexandra Lepier para la producción de virus. Este trabajo fue apoyado por becas de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (BE 4182/2-2) y el BMBF (01GN1009A) a BB, y el Ministerio de Ciencias del Estado de Baviera, Investigación y las Artes a MK y BBCS recibieron financiación de la SYSTHER-binacional INREMOS Instituto Virtual (Ministerios Federal alemán y esloveno de Educación e Investigación) y la DFG (SFB 824).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-CD140b-PE | BD Biosciences | 558821 | use 1:100 |
| anti-CD146-FITC | AbD Serotec | MCA2141FT | use 1:100 |
| anti-CD13-FITC | AbD Serotec | MVA1270A488T | use 1:100 |
| anti-CD34-APC | BD Biosciences | 560940 | use 1:100 |
| anti-PDGFRβ | Cell Signaling | 3169S | use 1:200 |
| anti-CD146 | Abcam | Ab75769 | use 1:400 |
| anti-NG2 | Millipore | AB5320 | use 1:400 |
| anti-SMA | Sigma-Aldrich | A2547 | use 1:400 |
| anti-βIII-tubulin | Sigma-Aldrich | T8660 | use 1:400 |
| anti-MAP2 | Sigma-Aldrich | M4403 | use 1:200 |
| anti-GFAP | Sigma-Aldrich | G3893 | use 1:600 |
| anti-GFP | Aves Labs | GFP 10-20 | use 1:1,000 |
| anti-RFP | Chromotek | 5F8 | use 1:500 |
| anti-S100β | Sigma-Aldrich | S2532 | use 1:300 |
| anti-NeuN | Millipore | MAB377 | use 1:200 |
| anti-GABA | Sigma-Aldrich | A2052 | use 1:500 |
| anti-Calretinin | Millipore | AB5054 | use 1:500 |
| anti-vGluT1 | SYnaptic SYstems | 135511 | use 1:1,000 |
| Rat IgG1 isotype control FITC | AbD Serotec | 11-4301-81 | use 1:100 |
| Rat IgG1 isotype control PE | AbD Serotec | 12-4301-81 | use 1:100 |
| Rat IgG1 isotype control APC | AbD Serotec | 17-4301-81 | use 1:100 |
| TrypLE | Invitrogen | 12605-010 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Invitrogen | 61965 | |
| B27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10106-169 | perform heat inactivation by incubation at 56 °C for 30 min |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) | Invitrogen | 24020-091 | |
| Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1x) | Invitrogen | 14190 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| PFA (paraformaldehyde) | Sigma-Aldrich | P1648 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| DAPI (4′,6-Diamidin-2-phenylindole) dilactate | Sigma-Aldrich | 042M4005 | |
| Aqua-Poly/Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap | BD Biosciences | 352235 | |
| 24-well plates | Orange Scientific | 5530305 | |
| 75 cm2 culture flasks | Greiner Bio-One | 658175 | |
| 25 cm2 culture flasks | Greiner Bio-One | 690175 | |
| Disposable pipettes 10 ml | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| Glass Pasteur pipettes (150 mm) | Fisherbrand | FB50251 | |
| Glass coverslips 12 mm diameter | Menzel | CB00120RA1 | |
| Surgical disposable scalpels | B. Braun | 5518083 | |
| Tissue culture dishes | Greiner Bio-One | 633180 | |
| Conical tubes 15 ml | BD Biosciences | 352095 | |
| Laminar flow hood | |||
| Centrifuge and swing-out rotor with adapters for 15 ml and 50 ml tubes | Hettich Lab Technology | 1406 | |
| Flow cytometry cell sorter: FACSAria l with FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| Humified cell culture incubator | Eppendorf Galaxy 170R | ||
| Wather bath at 37 °C | |||
| FACSFlow sheath fluid | BD Biosciences | 342003 | |
| Epifluorescence microscope BX61 | Olympus | ||
| Confocal microscope LSM710 | Zeiss |
References
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