Summary
Ориентация мозга резидентом клетки для прямого Lineage-перепрограммирования открывает новые перспективы для ремонта мозга. Здесь мы опишем протокол о том, как подготовить культур, обогащенных для мозга резидентом перицитами от взрослого головного мозга человека и преобразовать их в индуцированные нейронов ретровируса-опосредованной экспрессии факторов транскрипции Sox2 и Ascl1.
Abstract
Прямая линия-перепрограммирование не-нервных клеток в индуцированные нейронов (INS) может дать ответ на молекулярных механизмов, лежащих в основе нейрогенез и включить новые стратегии для моделирования в пробирке или ремонта больной мозг. Определение мозга-нерезидентные нейронные типы клеток, поддающиеся прямого преобразования в INS может позволить для запуска такой подход на месте, то есть в течение поврежденной ткани головного мозга. Здесь мы опишем протокол, разработанный в попытке идентификации клеток, полученных из взрослого человеческого мозга, что выполнить это помещение. Этот протокол включает в себя: (1) культивирование клеток человека из коры головного мозга, полученных из взрослых биопсии головного мозга человека; (2) расширение в пробирке (приблизительно требуя 2-4 недели) и характеристика культуры по иммуноцитохимии и проточной цитометрии; (3) обогащение с помощью флуоресцентной активированный сортировки клеток (FACS) с использованием анти-PDGF рецептор-β и анти-CD146 антитела;(4) ретровирус-опосредованного трансдукции с нейрогенной факторов транскрипции Sox2 и ascl1; (5) и, наконец, характеристика полученных перицитами полученных индуцированных нейронов (PdiNs) по иммуноцитохимии (14 дней до 8 недель после ретровирусную трансдукции). На данном этапе, модули могут быть проверены их электрических свойств по записи патч-зажим. Этот протокол обеспечивает высокую воспроизводимость порядок в пробирке клонов преобразования мозга резидентом перицитами на функциональные человека INS.
Introduction
В отличие от перепрограммирования соматических клеток в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК), которые в свою очередь, наделенных множеством дифференциальным потенциалом, прямой перепрограммирование стремится к прямой конвертации одного конкретного типа клеток в другой. В отношении их применения в контексте моделирования болезней и потенциальных клеточной терапии, оба подхода перепрограммирования имеют свои преимущества и недостатки. Перепрограммирование в ИПСК (I) обеспечивает практически бесконечный источник клеток; (II) позволяет генной инженерии; (III) наделяет почти неограниченным потенциалом дифференцировки. Тем не менее, основные недостатки ИПСК влекут за собой риск туморогенность из недифференцированных клеток (образование тератомы в естественных условиях) и необходимости экс естественных условиях выращивания и последующей трансплантации, если эти клетки будут использоваться для клеточной терапии. С другой стороны, линия прямой-перепрограммирование ограничена нижней выход целевого клетокчто коррелирует непосредственно с количеством целевых клеток исходной популяции, но обладает тем преимуществом, что Lineage-перепрограммировать клетки-видимому, не обладают не онкогенного риска после трансплантации 1,2; Кроме того, прямое перепрограммирование даже может быть достигнуто на месте, то есть внутри органа, где эти клетки потребовалось бы, таким образом избегая необходимости трансплантации.
Имея это в виду, наша лаборатория проводит возможность клон-перепрограммирования мозга резидентом клеток в INS в качестве нового подхода к основе клеток терапии нейродегенеративных заболеваний. Мозг-резидентом клетки, которые потенциально могут быть рассмотрены как клеточных мишеней для Lineage-перепрограммирования включают различные типы макроглии (астроциты, NG2 клеток и олигодендроцитов), микроглии и микрососудов связанных клеток (эндотелиальных клеток и перицитов). Мы всесторонне изучают в пробирке перепрограммирования потенциал астроглии головного кортекс раннего послеродового мышей 3-5. В поисках же подходящих источников клеток для прямого Lineage-перепрограммирования во взрослом мозге человека, мы столкнулись с клеточной популяции, которые могут быть успешно перепрограммировать в входы и выставочных признаков перицитами. Здесь мы описываем протокол, как собрать эти клетки от взрослых биопсии головного мозга человека, расширить и обогатить эти клетки в пробирке, и, наконец, успешно перепрограммировать значительную часть этих расширенных в пробирке клеток (в диапазоне 25-30%) в дюймов Перепрограммирование может быть достигнуто путем одновременного опосредованного ретровирусом совместной экспрессии двух факторов транскрипции, Sox2 и ascl1. Эти PdiNs были найдены приобрести способность повторяющиеся потенциала действия стрельбы и служить синаптические цели для других нейронов с указанием их способность интеграции в нейронных сетях. Наш протокол обеспечивает простой процедуры для изоляции и рода превращения взрослых перицитами мозга человека в INS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Изоляция и культивирование мозг взрослого человека клеток
Опыты с человеческую ткань должна быть выполнена в соответствии со всеми соответствующими правительственными и институциональных правил, касающихся использования человеческого материала для исследовательских целей. Настоящий протокол был разработан в соответствии с одобрения этического комитета медицинского факультета Людвига-Максимилиана Мюнхен и письменного информированного согласия от всех пациентов.
Этот протокол подготовки культур взрослого головного мозга человека была создана с использованием образца пациентов обоих полов, страдающих от височной эпилепсии лепестка или других глубинных нетравматических, доброкачественных поражений. Ткань получена из хирургической комнате, состоящей исключительно канал доступа к поражению мозга и, следовательно, считается здоровым. Возрастной диапазон пациентов составлял 19-70 лет.
- Подготовка среды для выращивания, добавив тепла инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки(FCS) в DMEM с высоким содержанием глюкозы глютамаксом, чтобы получить конечную концентрацию 20% FCS. Добавить 5 мл пенициллина / стрептомицина в общей сложности 500 мл среды роста. Выполните это и все последующие шаги, требующие стерильных условий культивирования в соответствующем ламинаре.
- Хранить взрослого человека биопсию мозга, полученного из хирургической комнате в Хэнкса сбалансированном солевом растворе с CaCl 2 и MgCl 2 (HBSS) среде, включающей HEPES (10 мМ конечная концентрация) на льду до обработки. Начните обработку как можно скорее.
- Для начала диссоциации на отдельные клетки, передавать ткани в 65 мм чашку Петри и пропустить через мясорубку на мелкие кусочки с помощью двух стерильные скальпели одноразовые. Для ферментативного расщепления использовать 3-6 мл TrypLE в 15 мл коническую пробирку и инкубируют в течение 15-30 мин при 37 ° С на водяной бане.
- Добавить 1 объем нагретого ростовой среде для облегчения диссоциации и осторожно растирают раствор, содержащий кусочки ткани вверх и вниз сначала с помощью5 мл одноразовые пипетки, а затем не используя стекло пипетки Пастера до гомогенизации клеточной суспензии. Как правило, некоторые части остаточной ткани, в основном состоящие из белого вещества, останется в суспензии.
- Спин вниз на 157 мкг в течение 5 мин и ресуспендируют осадок в соответствующем количестве ростовой среде (10 мл на одно без покрытия T75 колбу культуры). Используйте одну T75 культуры колбу для биопсии 5-10 мм в диаметре в размере и экстраполировать это в случае больших образцов.
- Поместите клетки в инкубаторе 37 ° C с 5% CO 2 и 5% O 2.
- Заменить половина среды каждые 3-4 дня, пока клетки не достигли слияния. Это обычно занимает до двух недель (именуемые проход 0 [P0]).
В Расширение 2. Пробирке и характеристика мозг взрослого человека клеток
- В расширении пробирке:
- Аспирируйте культуральную среду и промывают фосфатно-солевом буфере (PBS), выдерживали при комнатной тemperature, перед добавлением 3 мл TrypLE.
- Инкубируют при 37 ° С в течение 5-10 мин, пока большинство клеток не отсоединена. Слегка постучите колбы для облегчения снятия клеток; Следующий добавлением 3 объемов ростовой среды, передача клеток в 15 мл коническую пробирку и спин вниз в 157 х г в течение 5 мин и ресуспендирования клеток в соответствующем количестве ростовой среды.
- Прохождение клетки в соотношении 1:3 для оптимального выхода в новые T75 клеточных культур колбах.
Примечание: Мы никогда пассировать эти клетки пока P5 без каких-либо признаков снижения эффективности перепрограммирования. В то время как при Р0 культура содержит значительную долю эндотелиальных клеток (по оценке выражения CD34), на последующих проходах их число становится незначительным.
- Характеристика взрослых культур мозга человека:
- Иммуноцитохимия:
- Для характеризации клеток, семян ~ 60000 клеток на поли-D-лизина покрытием стеклянной крышкой скользит в 500 мкл свежей Mediu ростм тканевой культуры в 24-луночных планшетах и инкубируют при 37 ° С с 5% CO 2 и 5% O 2.
- Для иммуноцитохимического анализа культивированных человеческих клеток мозга удалить среды и промыть 3 раза с 1 мл PBS.
- Исправить клеток путем добавления 500 мкл 4% параформальдегида в PBS в течение 15 мин при комнатной температуре.
- Передача стекло крышка скользит в соответствующей увлажненной камере окрашивания и блок с 80 мкл PBS, содержащем 3% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 0,5% Triton X-100 в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Добавить первичных антител разбавленные в том же растворе (на коэффициенты разбавления см. таблицу конкретных реагентов и оборудования) и инкубируют в течение ночи при 4 ° С или 1 ч при комнатной температуре.
Примечание: Значительная но разной фракции клеток на этом этапе культивирования являются иммунореактивны для тромбоцитарных β рецептора фактора роста (PDGFRβ), кластер дифференциации 146 (CD146), NG2 хондроитин сульфат Proteoгликана, и гладкой актина мышцы (SMA), то есть маркеры, характерные для микрососудов связанных перицитами. Лишь меньшинство (<1%) выражают астроглиальных маркеры глиальных фибриллярный кислый белок (GFAP) и S100β. Кроме того, на этой стадии культура должна быть лишена любых клеток, экспрессирующих нейронов маркер βIII-тубулина. Использование нескольких комбинаций первичных антител для совместного маркировки различных маркеров. Дальнейшее подтверждение экспрессии глиальных, нейронных, эндотелиальных и перицитов маркеров может быть получена путем обратной транскрипции и количественного реального времени полимеразной цепной реакции (не описанной в данном протоколе). - После инкубации с первичными антителами мыть три раза 1 мл PBS и добавить соответствующие вторичные антитела (в соответствующих разведений) к окрашивающим раствором и инкубировать 1 час при комнатной температуре в темноте. Промыть клетки 3x с PBS. Если необходимо, перед установкой включают окрашивание DAPI с в течение 5 мин при комнатнойтемпература.
- Используйте antifading монтажную среду и анализировать покровные стекла с использованием эпифлюорисцентной микроскопа или конфокальной микроскопии.
- Проточной цитометрии:
- Для анализа поверхности маркера экспрессии с помощью проточной цитометрии, роста клеток до слияния в непокрытой T25 или T75 клеточных культур колбах.
- Отделить клетки с помощью TrypLE, как описано выше, и ресуспендируют в окрашивающего раствора, состоящего из PBS + 0,5% БСА. За реакцией окрашивания, ресуспендируйте 100,000-200,000 клеток в 100 мкл красящим раствором. Подготовка одиночные реакции окрашивания на антитела, используемые (CD146-FITC, CD140b-PE, CD34-APC, CD13-FITC, соответствующие антитела контрольного изотипа).
- Добавить флуорохромом-конъюгированного антитела к каждому раствору окрашивания (для разведения см. таблицу конкретных реагентов и оборудования) непосредственно в суспензии клеток и инкубировали при 4 ° С в течение 30 мин в темноте.
- Промыть клетки три раза 500 мкл PBS и спин вниз между каждойстиральная шаг в 157 мкг в течение 5 мин.
- Ресуспендируют осадок клеток в 0,5-1 мл раствора окрашивания и передачи клеток через клеточный фильтр (70 мкм) в FACS труб. Защитите образца от воздействия света.
- Образцы Vortex до размещения их в приборе FACS.
- Для анализа живых клеток и исключить мусора и клеточных агрегатов, ворота для FSC-A и SSC-A. Сотовые Duplets специально закрытый путем FSC-А и FSC-W. Чтобы определить правильные условия литниковые для маркеров клеточной поверхности, установленных ворота с контролем антител изотипу конъюгированного с соответствующей флуорохромом. Тогда определить долю клеток антиген-антитело.
- Иммуноцитохимия:
3. Обогащение перицитов клеток, полученных с помощью флуоресцентной Активированный сортировки клеток
- Очищают перицитов клеточной популяции (ресуспендировали в ростовой среде) до трансдукции через СУИМ сортировки с использованием сопла 70 мкм. Используйте CD34-APC в сочетании с CD140b-PE и CD146-FITC, чтобы выбрать для перицитами. Сортировать по CD34-негативных, CD140b-и CD146-позитивных клеток.
- Сбор отсортированных клеток в среде для роста и пластины на поли-D-лизина, покрытые защитным стеклом скользит в 24-луночных культуральных планшетах и инкубируют при 37 ° С с 5% CO 2 и 5% O 2.
- 48 ч после сортировки заменить среды свежей средой роста и выполнять трансдукции, как описано в Протоколе 4.
4. Ретровирусные трансдукция перицитов клеток, полученных и Перепрограммирование в индуцированные нейронов
Примечание: Обратитесь к местным требованиям биобезопасности при обращении с ретровирусные частицы. В Германии использование ретровирусов, используемых здесь требуют уровень биобезопасности 2. Для производства ретровирусных частиц относятся к протоколу 6. Для ретровирусных конструкций, используемых для перепрограммирования, обратитесь к Karow и соавт. (2012). Ретровирусы были pseudotyped с VSV-G (везикулярного стоматита вирус-гликобелок) 5. Для производства см. Гаврилеску др. 6.
- 24 ч до ретровирусный трансдукции семенных ~ 60000 клеток на поли-D-лизина, покрытые защитным стеклом скользит в 500 мкл свежей среды для роста в 24-луночных культуральных пластинах ткани и инкубируют при 37 ° С с 5% CO 2 и 5% O 2 .
- На следующий день, замените питательную среду с 500 мкл свежей, предварительно нагретой среде роста и добавить 1 мкл соответствующих сосредоточенных надосадочную жидкость, содержащую ретровирусных частиц (pCAG-IRES-DsRed для контроля, особенно во время установления протокол в лаборатории), pCAG-ascl1 -IRES-DsRed, pCAG-Sox2-IRES-GFP.
- Через день, удалить среды в том числе вирусных частиц из клеток и добавляют 1 мл свежих, предварительно нагретой B27-дифференциации среды, состоящий из 49 мл DMEM высоким содержанием глюкозы с Glutamax и 1 мл B27 сыворотки добавки. Поддерживать клетки в культуре при 37 ° С в 5% СО 2 и 5% O 2 в течение 4-8 недель без изменения среды, как повторяющиеся изменения средних стать вредными, как INS созреть.
5. Характеристика индуцированной нейронов по иммуноцитохимии
- Для определения клеточного идентичность трансдуцированных клеток, в частности, чтобы продемонстрировать приобретение фенотипа нейронов, выполнять иммуноцитохимии против антигенов нейронов, таких как BIII-тубулина, МАР2 и NeuN (на антитела и их соответствующих разведений, см. таблицу конкретных реагентов и оборудование; такую же процедуру, как указано в 2.2.1).
- Для улучшения созревание PdiNs, со-культуры этих клеток нейронов, полученных из E14 мыши коры головного мозга. С этой целью, рассекают кору головного мозга и отделить ткань механически с камином-полированного стекла пипетки Пастера. Добавить 10,000-50,000 мышиных нейронов в культурах перицитами клеток, полученных 2-3 недель после трансдукции Sox2 и ascl1-кодирования реtroviruses и продолжают культивирование. Трансдуцированных клеток можно отличить от мышиных нейронов их репортер (GFP) и DsRed экспрессии, либо живой эпифлуоресцентной или после иммуноцитохимии для GFP и DsRed.
- Для оценки формирование синапсов на PdiNs по мышиных нейронов, выполните иммуноцитохимии против везикулярного рецепторов нейромедиаторов, таких как везикулярного глутаматного транспортера 1 (vGluT1).
- Зонд трансдуцированных клеток для их электрических свойств (т.е. способности генерировать потенциалы действия) и установления функциональных синапсов по патч-зажим электрофизиологии. Подробную информацию о процедуре см. Генрих соавт. (2011).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Первым результатом этого протокола после успешного создания культуры от образце человеческой взрослого коры головного мозга состоит в идентификации клеточного состава культуре. Иммуноцитохимия для специфических белков типа клеток показывает значительную степень гетерогенности между культурами, полученных из образца разных пациентов (фиг. 1а). Как количественно с помощью проточной цитометрии всегда существует значительная часть клеток, которые экспрессируют PDGFRβ (в среднем ~ 75%, от 30 до до 99%); другие маркеры перицитов, таких как CD146, CD13 и NG2, как правило, выражается в нижнем диапазоне (рис. 1В). Аналогично SMA выражается в незначительной субпопуляции культивируемых клеток, как определено иммунопреципитация (фиг.1А). При прохождении 0 (P0), там, как правило, <10% CD34-положительных эндотелиальных клеток, и их число снижается ниже обнаружения с последующим пассажей. Кроме того, astrocytэс составляют лишь незначительную загрязнения на ранних пассажей. Кроме того, нет, как правило, без клеток, которые пятно на нервной стволовой клетки, нервных или олигодендроцитов маркеров. Иммуноцитохимическая и проточной цитометрии данных полностью подтверждено количественным RT-PCR 7. В целом, по величине фракция в культуре выражает белков и мРНК характеристику перицитов. Дальнейшее обогащение для перицитов полученных клеток может быть достигнуто путем FACS на данном этапе. Это особенно важно, когда чистота культуры на нижнем конце спектра, как это отражено на уровне экспрессии PDGFRβ. Таким образом, мы использовали антитело против PDGFRβ (CD140b) отдельно или в сочетании с антителом анти-CD146, исключая любые CD34-положительных загрязняющих веществ, в FAC-сортировки в частности перицитов (рис. 1с).
Преобразовательного эти культуры с контроля вирусов, кодирующих ген-репортер только, не изменяет их экспрессия маркеров рrofile (оценивается 3-4 недель после трансдукции), указывая, что эти клетки остаются в перицитов линии. Кроме того, ретровирус-опосредованного выражение Sox2 само по себе не приводит к каким-либо явных изменений в морфологии, ни индуцирует Biii-тубулина выражение предполагая, что в одиночку Sox2 не является достаточным, чтобы вызвать преобразование судьба. Напротив, низкий процент (около 10%) из клеток трансдуцировали ascl1-кодирования ретровируса в одиночку экспонат βIII-тубулина выражения, однако, не приобретая нейронов морфологию. Поразительно, почти 50% всех Sox2-и ascl1-cotransduced клеток показывают βIII-тубулина выражение и что еще более важно, треть этих двойных трансдуцированных клеток (визуализированных их двойного выражения репортера) также отображать нейронные процессы (рис. 2). Наряду с приобретением нейронных функций, выражение PDGFRβ подавляется 7. При дальнейшем созревания в культуре, Sox2-и ascl1-совместной экспрессии клетки также стать иммунoreactive для более зрелых нейронов маркеры МАР2 (окрашивания дендритные процессы) и NeuN (окрашивания преимущественно нейронные тела клетки). Как обсуждается ниже этих изменений в экспрессии маркеров также коррелируют с приобретением электрофизиологических признаков нейронов. В целом, эти данные свидетельствуют для прямого преобразования судьба перицитами клеток, полученных в Ins, именуемой PdiNs. Эти PdiNs обладают компетенцией по созданию функциональных постсинаптические отсеки как выяснилось в сокультивирования экспериментов с нейронах эмбрионального мыши коры головного мозга. Эта компетенция может быть продемонстрирована электрофизиологически в появлении синаптических входов (см. ниже), а также украшения дендритных процессов PdiNs с пресинаптических окончаний, полученных из совместно культивировали нейронов (характеризующихся кластеров везикулярного нейромедиаторов перевозчиков, например vGluT1 иммунореактивности). Эти данные также свидетельствуют о способности PdiNs интегрироваться в нейронной сircuits.
Рисунок 1. Гетерогенных выражение перицитами маркеров в культурах, полученных от взрослого головного мозга человека. А) Флуоресцентные микрофотографии, иллюстрирующие гетерогенную выражение перицитами маркеров (PDGFRb, SMA, CD146) как показали иммуноцитохимии. Шкала бар = 50 мкм. Б) Гистограмма приведены относительные количества клеток положительных для перицитами маркеров PDGFRβ (CD140b), CD13, CD146 и, как это определено с помощью проточной цитометрии различных культур пациентов происхождения. CD34 является маркером эндотелиальных клеток. C) СУИМ точка участки, изображающие изотипа контроль-и CD146 / CD140b окрашенные клетки человека для сортировки двойных-положительных перицитами (выделено красной рамкой) для последующего перепрограммирования. Обратите внимание на высокий уровень экспрессии PDGFRβ игетерогенность в отношении CD146 экспрессии в этой конкретной культуры.
. Рисунок 2 Перепрограммирование взрослого человека перицитами полученных клеток в INS началу. Экспериментальная установка. Внизу: Люминесцентные микрофотографии изображающие клетки трансдуцировали кодирования ретровирус Sox2-IRES-GFP и ascl1-IRES-DsRed. Обратите внимание, что только дважды трансдуцированные клетки (стрелки) выразить Biii-тубулина (правая панель) и проявляют нейронов морфологию.
| деление клеток [%] | гибель клеток [%] | Biii-тубулина + [%] | |
| 36 | 3 | 0 | |
| Sox2 | 46 | 7 | 0 |
| Ascl1 | 26 | 33 | 7 |
| Sox2-Ascl1 | 3 | 36 | 25 |
Таблица 1. Поведение перицитами полученных клеток, подвергающихся преобразование в PdiNs по оценке непрерывного живого изображения. Обратите внимание, что Sox2 и Ascl1 коэкспрессирующей клетки выход клеточный цикл. Кроме того, обратите внимание на высокие темпы гибели клеток следующем Ascl1 или Sox2 и Ascl1-коэкспрессии. С учетом этих различных клеточных событий, примерно 25% всех со-трансдуцированных клеток становятся INS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Настоящий протокол описывает расширение в пробирке и обогащение перицитами клеток, полученных следующий изоляции от взрослого головного мозга человека и последующее преобразование в INS по ретровируса-опосредованной экспрессии нейрогенной транскрипционных факторов Sox2 и Ascl1. Такой протокол обеспечивает экспериментальную в пробирке системы для изучения Lineage-преобразование мозга резидентом клеток в нейроны и потенциально также глии, с целью в виду, чтобы в конечном итоге перевести эту прямой подход преобразования в естественных условиях обстановке в взрослого мозга.
Технические соображения
В нашем исследовании мы использовали человеческую мозговую ткань от пациентов в возрасте от 19 до 70 лет, от обоих полов. Мы не заметили явных различий в эффективности перепрограммирования в зависимости от пола или возраста 7. Вместе с тем рекомендуется документировать эту информацию как более тонкие различия все же могутотметил, что на себя внимание.
Кроме того, рекомендуется, чтобы начать обработку как можно раньше после передачи образца ткани в лабораторию. Там будет обязательно некоторые неизвестные для как долго ткань осталась в хирургической комнате предварительного передать экспериментатора. По нашим оценкам, в нашем исследовании 7 времени между удалением от мозга пациента до начала процедуры культивирования колеблется между 2-6 ч, при этом образцы держат все время на льду. Нет явной разницы в легкости последующей обработки, ни какого-либо неблагоприятного исхода не было замечено в течение этого временного окна.
Критическая оценка для любого протокола касается его простоту, воспроизводимость и эффективность. Настоящий Протокол проста в том, что во время первой фазы клеток расширены в недорогой носитель, который может быть легко получено, за которым следует второй этап перепрограммирования клеток с использованием только двух транскрипции фаctors и культивирование в определенной среде.
Что касается воспроизводимости, мы обнаружили, что качество подготовки ретровирусов имеет первостепенное значение, с низкими титр вируса препаратов, используемых при разведении в соответствии с количеством инфекционных частиц высоких вирусов титром часто приводит к выходу из строя перепрограммирования. На самом деле мы отметили, что то же самое культура перицитов в котором перепрограммирование не удалось ранее могли быть успешно преобразованы в INS при использовании высоких вирусы титра.
Что касается эффективности преобразования, мы оценили количество βIII-тубулина-позитивных клеток, полученных из Sox2-и ascl1-cotransduced клеток с использованием непрерывного живого изображения. Живого изображения позволяет оценить количество клеток, которые подвергаются деления клеток или клеточную гибель в процессе преобразования, в то время как такая информация отсутствует, когда количество генерируемого INS определяется только в конечной точке эксперимента. На самом деле, используя покадровой видео микроскопиикопия (для процедуры см. Ортега е т др.. 8) было отмечено, что untransduced и единственный фактор-трансдуцировали клетки продолжают пролиферирующих, в то время как Sox2-и ascl1-cotransduced клетки быстро выходят из клеточного цикла. Более того, значительная часть населения последнем подвергается гибели клеток. В то время как ретровирус токсичность не может быть формально исключены из полученных в нашем исследовании 7 данных, тот факт, что увеличение гибели клеток наблюдалось только тогда, когда была выражена ascl1 (отдельно или в сочетании с Sox2), мы интерпретируем это как свидетельство для катастрофического конфликта клеточных судеб . Принимая эти два события во внимание, по нашим оценкам, 25% всех Sox2-и ascl1-cotransduced клеток конвертировать в Biii-тубулина положительных INS (табл. 1).
Как со-трансдукции абсолютно необходимо для успешного перепрограммирования, можно рассмотреть вопрос о применении вирусной кодирующий вектор оба гена, чтобы оптимизировать количество клеток, экспрессирующих оба фактора в то жеВремя.
Недавно Ladewig соавт. Разработали протокол для эффективного преобразования фибробластов в INS получение выход 200% ингибирование с помощью малую молекулу на основе гликогена синтазы-киназы-3β и SMAD сигнализации 9. Это будет интересно, чтобы определить эти дополнения к нашему протоколу улучшить ли выход PdiN производства.
Еще один интересный результат живого изображения процесса перепрограммирования идет о том, что превращение взрослого человека перицитов в INS происходит на достаточно медленном темпе по сравнению с аналогичными протоколами перепрограммирования в культурах разных соматических клеток мышиного происхождения 4. Это согласуется с характерным медленного созревания нейронов человека 10.
В то время как мы не систематически проанализировали влияние напряжения кислорода на выход PdiN производства, мы отметили, что инкубационный в условиях низкой кислорода (5%) в целомдал превосходные результаты по сравнению с культивирования клеток в нормоксических условиях (21%). Недавно Давила и др.. Описал подобный эффект усиливающую по сниженной напряжения кислорода для индукции плагины от человеческих фибробластов 11.
Наш протокол основан на ретровирусной доставки Sox2 и ascl1 в то время как другие прямые протоколы преобразования использовали индуцируемые лентивирусов 1, 12, 13. Совсем недавно мы также успешно применяется доксициклин индуцируемого лентивирусные конструкции, кодирующие Sox2 и ascl1, указывая, что относительно короткий импульс (10 дней) от Sox2 и Ascl1 выражения достаточно, чтобы вызвать преобразование перицитов-на-нейрона. Ретровирусы, используемые в нашем исследовании 7 были разработаны для снижена глушителей 5. Соответственно, мы не заметили появление нейронов, лишенных экспрессии генов репортера. Тем не менее, вероятность того, что общий уровень экспрессии обоих трансгенас и репортер изменение с течением времени не может быть исключена. Интеграционные без подходы (использующие Sendai вирусы) были в последнее время используется в случае генерации индуцированных нервных клеток-предшественников 14, но в настоящее время не известно, является ли тот или даже вирус без стратегии перепрограммирование может с успехом применяться для преобразования человека перициты. Наконец, перициты ли полученные из других тканей могут претерпевать превращение в индуцированных нейронных типов клеток остается для тестирования.
Концептуальные соображения
Критический исход перепрограммирования соматических клеток в INS касается их функциональность 15. Мы оценивали электрофизиологические свойства PdiNs в различные моменты времени после начала процесса перепрограммирования. При очень ранних стадиях, то есть 2 недели после ретровирусов трансдукции, PdiNs проявляют едва признаки электрической возбудимости, несмотря βIII-тубулина выражения на данном этапе. Таким образом, большинствоэлектрофизиологические анализы проводились 4-8 недель после трансдукции Sox2 и ascl1. Как описано в Karow соавт., PdiNs характеризуются значительным незрелости, как это отражается высоких входных сопротивлений и низкой частотой потенциала действия стрельбы. Далее созревание может способствовать сокультивирования PdiNs с нейронами, полученных от мыши E14 коры головного мозга. В этих условиях, PdiNs демонстрируют более высокие действий потенциальных частоты и увеличение токов натрия 7. Кроме того, сокультивировани показывает компетенцию PdiNs получить функциональную синаптической вход от нейронов мыши. В общем, PdiNs получать функциональные нейронные свойства, которые могут быть дополнительно повышена на сокультивировани с другими нейронами. Тем не менее, остается показать, может ли PdiNs также установления функциональных пресинаптические отсеков. Дальнейшие исследования пересадке PdiNs в мозг необходимы, чтобы показать свой потенциал, чтобы достичь полной зрелости и функциональность.
Uпеть Sox2 и ascl1 как перепрограммирования факторов мы отметили, что в результате PdiNs приобретать черты ГАМКергических нейронов 7. Интересно, что другие группы разработали протоколы для преобразования фибробластов в Ins с помощью другой фактор транскрипции и / или комбинации микроРНК в результате чего развивается INS приобретенного отличный спецификации нейротрансмиттеров, таких как глутаматэргическую, дофаминергической и холинергической фенотипа 1, 16-18. Это еще предстоит проверить ли комбинации факторов, используемых в фибробластов вызвать тот же идентичность передатчика в PdiNs. Кроме того, недавняя работа расширила преобразования спектр вне нейрогенеза генерировать нервные стволовые клетки 19, 20 или глиальные, в частности олигодендроцитов 21, 22. Если эти перепрограммирования протоколы вызывают подобный результат в мозг взрослого человека перицитами клеток, полученных, это в значительной степени расширить панораму применения этого импортамуравей мозга житель тип клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарны доктору Магдалена Гетц для ее ввода в процессе разработки этого протокола. Мы благодарим доктора Marius Wernig (Стэнфордский университет) за щедрое предоставляя нам последовательности Sox2 кодирования. Мы также очень благодарны доктору Александра Lepier для производства вируса. Эта работа была поддержана грантами Deutsche Forschungsgemeinschaft (BE 4182/2-2) и BMBF (01GN1009A) до BB, и Баварским государственным министерством наук, исследований и искусства в МК и BBCs получил финансирование от двухнационального SYSTHER- INREMOS Виртуальный институт (немецкий и словенский Федеральные министерства образования и научных исследований) и DFG (SFB 824).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-CD140b-PE | BD Biosciences | 558821 | use 1:100 |
| anti-CD146-FITC | AbD Serotec | MCA2141FT | use 1:100 |
| anti-CD13-FITC | AbD Serotec | MVA1270A488T | use 1:100 |
| anti-CD34-APC | BD Biosciences | 560940 | use 1:100 |
| anti-PDGFRβ | Cell Signaling | 3169S | use 1:200 |
| anti-CD146 | Abcam | Ab75769 | use 1:400 |
| anti-NG2 | Millipore | AB5320 | use 1:400 |
| anti-SMA | Sigma-Aldrich | A2547 | use 1:400 |
| anti-βIII-tubulin | Sigma-Aldrich | T8660 | use 1:400 |
| anti-MAP2 | Sigma-Aldrich | M4403 | use 1:200 |
| anti-GFAP | Sigma-Aldrich | G3893 | use 1:600 |
| anti-GFP | Aves Labs | GFP 10-20 | use 1:1,000 |
| anti-RFP | Chromotek | 5F8 | use 1:500 |
| anti-S100β | Sigma-Aldrich | S2532 | use 1:300 |
| anti-NeuN | Millipore | MAB377 | use 1:200 |
| anti-GABA | Sigma-Aldrich | A2052 | use 1:500 |
| anti-Calretinin | Millipore | AB5054 | use 1:500 |
| anti-vGluT1 | SYnaptic SYstems | 135511 | use 1:1,000 |
| Rat IgG1 isotype control FITC | AbD Serotec | 11-4301-81 | use 1:100 |
| Rat IgG1 isotype control PE | AbD Serotec | 12-4301-81 | use 1:100 |
| Rat IgG1 isotype control APC | AbD Serotec | 17-4301-81 | use 1:100 |
| TrypLE | Invitrogen | 12605-010 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Invitrogen | 61965 | |
| B27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10106-169 | perform heat inactivation by incubation at 56 °C for 30 min |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) | Invitrogen | 24020-091 | |
| Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1x) | Invitrogen | 14190 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| PFA (paraformaldehyde) | Sigma-Aldrich | P1648 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| DAPI (4′,6-Diamidin-2-phenylindole) dilactate | Sigma-Aldrich | 042M4005 | |
| Aqua-Poly/Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap | BD Biosciences | 352235 | |
| 24-well plates | Orange Scientific | 5530305 | |
| 75 cm2 culture flasks | Greiner Bio-One | 658175 | |
| 25 cm2 culture flasks | Greiner Bio-One | 690175 | |
| Disposable pipettes 10 ml | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| Glass Pasteur pipettes (150 mm) | Fisherbrand | FB50251 | |
| Glass coverslips 12 mm diameter | Menzel | CB00120RA1 | |
| Surgical disposable scalpels | B. Braun | 5518083 | |
| Tissue culture dishes | Greiner Bio-One | 633180 | |
| Conical tubes 15 ml | BD Biosciences | 352095 | |
| Laminar flow hood | |||
| Centrifuge and swing-out rotor with adapters for 15 ml and 50 ml tubes | Hettich Lab Technology | 1406 | |
| Flow cytometry cell sorter: FACSAria l with FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| Humified cell culture incubator | Eppendorf Galaxy 170R | ||
| Wather bath at 37 °C | |||
| FACSFlow sheath fluid | BD Biosciences | 342003 | |
| Epifluorescence microscope BX61 | Olympus | ||
| Confocal microscope LSM710 | Zeiss |
References
- Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476, 224-227 (2011).
- Kim, J., et al. Functional integration of dopaminergic neurons directly converted from mouse fibroblasts. Cell stem cell. 9, 413-419 (2011).
- Duan, B., et al. Interactions between water deficit, ABA, and provenances in Picea asperata. Journal of experimental botany. 58, 3025-3036 (2007).
- Heinrich, C., et al. Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons. PLoS Biol. 8, (2010).
- Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nat Protoc. 6, 214-228 (2011).
- Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. , (2007).
- Karow, M., et al. Reprogramming of pericyte-derived cells of the adult human brain into induced neuronal cells. Cell stem cell. 11, 471-476 (2012).
- Ortega, F., et al. Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level. Nat Protoc. 6, 1847-1859 (2011).
- Ladewig, J., et al. Small molecules enable highly efficient neuronal conversion of human fibroblasts. Nat Methods. 9, 575-578 (2012).
- Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77, 440-456 (2013).
- Davila, J., Chanda, S., Ang, C. E., Sudhof, T. C., Wernig, M. Acute reduction in oxygen tension enhances the induction of neurons from human fibroblasts. J Neurosci Methods. 216, 104-109 (2013).
- Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463, 1035-1041 (2010).
- Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 10343-10348 (2011).
- Lu, J., et al. Generation of Integration-free and Region-Specific Neural Progenitors from Primate Fibroblasts. Cell Rep. 3, 1580-1591 (2013).
- Yang, N., Ng, Y. H., Pang, Z. P., Sudhof, T. C., Wernig, M. Induced neuronal cells: how to make and define a neuron. Cell Stem Cell. 9, 517-525 (2011).
- Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476, 220-223 (2011).
- Yoo, A. S., et al. MicroRNA-mediated conversion of human fibroblasts to neurons. Nature. 476, 228-231 (2011).
- Son, E. Y., et al. Conversion of mouse and human fibroblasts into functional spinal motor neurons. Cell Stem Cell. 9, 205-218 (2011).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 2527-2532 (2012).
- Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10, 473-479 (2012).
- Yang, N., et al. Generation of oligodendroglial cells by direct lineage conversion. Nat Biotechnol. 31, 434-439 (2013).
- Najm, F. J., et al. Transcription factor-mediated reprogramming of fibroblasts to expandable, myelinogenic oligodendrocyte progenitor cells. Nat Biotechnol. 31, 426-433 (2013).
