Summary
מיקוד תאי מוח תושב לשושלת תכנות מחדש ישיר מציע נקודות מבט חדשות לתיקון מוח. כאן אנו מתארים פרוטוקול של איך להכין את התרבויות מועשרים עבור pericytes מוח תושב מהמבוגר קליפת המוח האנושית ולהמיר אותם לתאי עצב הנגרמים על ידי ביטוי בתיווך רטרווירוס של שעתוק גורמי Sox2 וAscl1.
Abstract
שושלת תכנות מחדש ישיר של תאים שאינם עצביים לנוירונים מושרה (INS) עשוי לספק תובנות לתוך המנגנונים המולקולריים שבבסיס נוירוגנזה ולאפשר אסטרטגיות חדשות לדוגמנות במבחנה או תיקון המוח החולה. סוגי זיהוי מוח שאינו תושב עצבי תא ניתנים להמרה ישירה לאח"י עשויים לאפשר לשיגור גישה כזו באתרו, כלומר בתוך רקמת המוח הפגועה. כאן אנו מתארים פרוטוקול שפותח בניסיון של זיהוי תאים שמקורם במוח האנושי הבוגר כי למלא את הנחת יסוד זו. פרוטוקול זה כולל: (1) culturing של תאי אדם מקליפת המוח המתקבל מביופסיות מוח אדם בוגרות; (2) ההרחבה במבחנה (כ דורשת 2-4 שבועות) ואפיון של התרבות על ידי immunocytochemistry וזרימת cytometry; (3) להעשרה על ידי תא הקרינה המופעל מיון (FACS) באמצעות קולט-β נגד PDGF ונוגדנים נגד CD146;(4) התמרה בתיווך רטרווירוס עם השעתוק העצבי גורמי Sox2 וascl1; (5) ולבסוף האפיון של תאי העצב כתוצאה נגזרת pericyte המושרית (PdiNs) על ידי immunocytochemistry (14 ימים עד 8 שבועות הבאים התמרה retroviral). בשלב זה, תוספות יכולות להיות נחקר לתכונות חשמליות שלהם על ידי הקלטת התיקון-clamp. פרוטוקול זה מספק הליך שחזור מאוד להמרת שושלת במבחנה של pericytes מוח תושב לאח"י האנושי מתפקד.
Introduction
בניגוד לתכנות מחדש של תאים הסומטיים לתאי גזע pluripotent מושרה (iPSCs), אשר בתורו ניחן בשפע של פוטנציאל התמיינות, תכנות מחדש ישיר נועד להמרה ישרה של סוג תא ספציפי אחד למשנו. עם כל כבוד ליישום שלהם בהקשר של דוגמנות מחלה וטיפולים מבוססי תאים פוטנציאליים, יש שתי גישות תכנות מחדש יתרונות וחסרונות מסוימים. תכנות מחדש לiPSCs (i) מספק מקור כמעט אינסופי של תאים; (Ii) מאפשר להנדסה גנטית; (Iii) מעניק לך את פוטנציאל התמיינות בלתי מוגבל כמעט. עם זאת, חסרונות עיקריים של iPSCs כרוך הסיכון של tumorigenicity של תאים שלא עברו התמיינות (היווצרות תפלצת in vivo) ואת הצורך בטיפוח vivo לשעבר והשתלה שלאחר מכן, אם תאים אלה הם לשמש לטיפולים מבוססי תאים. לעומת זאת, שושלת תכנות מחדש ישיר מוגבל על ידי התשואה נמוכה יותר של התאים הרצוייםאשר עולה בקנה ישירות עם מספר התאים הממוקדים של האוכלוסייה מתחילה, אבל יש לה את היתרון שתאים לתכנות מחדש שושלת מופיעים לתערוכה לא tumorigenic סיכון על ההשתלה 1,2; יתר על כן, תכנות מחדש ישיר יכול גם להיות מושגת באתרו, כלומר בתוך האיבר שבו תאים אלה יהיו צורך, וכך למנוע את הצורך בהשתלה.
עם זאת בחשבון, במעבדה שלנו רדפה את האפשרות של תאי מוח תושב תכנות מחדש שושלת לאח"י כגישה חדשנית כלפי טיפולים מבוססי תאים במחלות ניווניות. תאי מוח תושב שעשוי להיות באופן פוטנציאלי נחשבים כמטרות הסלולר לשושלת תכנות מחדש מהווים סוגים שונים של macroglia (האסטרוציטים, תאי NG2 וoligodendrocytes), מיקרוגליה, ותאים הקשורים דם קטן (תאים וpericytes אנדותל). בהרחבה יש לנו למדנו את פוטנציאל תכנות מחדש במבחנה של astroglia של cor המוחיטקס של עכברים לאחר לידה המוקדם 3-5. בחיפוש אחר מקורות תא דומה המתאימים לשושלת תכנות מחדש ישיר במוח האנושי הבוגר, נתקלנו באוכלוסיית תא שניתן לתכנות מחדש בהצלחה לכל הפרטים סימני ההיכר תערוכה של pericytes. כאן אנו מתארים פרוטוקול של איך לקצור את התאים האלה מביופסיות מוח אנושיות בוגרות, כדי להרחיב ולהעשיר את התאים האלה במבחנה, ובסופו לתכנת מחדש בהצלחה חלק ניכר במבחנת תאים מורחבים אלה (בטווח של 25-30%) לתוך תוספות. תכנות מחדש יכול להיות מושגת על ידי שיתוף ביטוי בתיווך רטרווירוס בו זמנית של שני גורמי שעתוק, Sox2 וascl1. PdiNs אלה נמצאו לרכוש את היכולת של ירי פוטנציאל פעולה חוזר על עצמו ועל מנת לשרת מטרות הסינפטי כלנוירונים אחרים המצביעים על היכולת שלהם להשתלב ברשתות עצביות. הפרוטוקול שלנו מספק הליך פשוט להמרת הבידוד ושושלת של pericytes המוח האנושי הבוגר לתוספות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. בידוד וCulturing של תאים בוגרים מוח האנושי
ניסויים מעורבים רקמה אנושית יש לבצע בהתאם לכל תקנות ממשלתיות ומוסדיות הרלוונטיות בנוגע לשימוש בחומר אנושי למטרות מחקר. הפרוטוקול הנוכחי פותח בהתאם לאישור על ידי ועדת האתיקה של הפקולטה לרפואה במינכן LMU וכתב הסכמה מדעת מכל החולים.
פרוטוקול זה של תרבויות הכנה של האדם בוגר קליפת המוח כבר נקבע באמצעות דגימה של חולים משני המינים הסובלים מאפילפסיה של אונה הרקתית או נגעים אחרים עמוקים לא טראומטיים, שאינם ממאירים. הרקמה המתקבלת מחדר הניתוח המורכב אך ורק את ערוץ הגישה לפגיעה המוחית ולכן נחשבת בריאה. טווח הגילים של המטופלים היה 19-70 שנים.
- הכן את מדיום גידול על ידי הוספה עוברי עגל בסרום חום מומת(FCS) לגלוקוז גבוהה DMEM עם Glutamax להשיג ריכוז סופי של FCS 20%. הוסף 5 מיליליטר פניצילין / סטרפטומיצין לסך של 500 בינוני מיליליטר צמיחה. לבצע את זה וכל הצעדים הבאים דורשים תנאים סטריליים תרבות בזרימה למינרית מתאימה.
- שמור על הביופסיה במוח האנושית הבוגרת שהתקבלה מחדר הניתוח בתמיסת מלח מאוזן "הנקס עם CaCl 2 וMgCl 2 בינוני (HBSS) כוללים HEPES (ריכוז סופי 10 מ"מ) על קרח עד לעיבוד. להתחיל בעיבוד בהקדם האפשרי.
- כדי להתחיל דיסוציאציה לתוך תאים בודדים, להעביר את הרקמה לתוך צלחת פטרי 65 מ"מ וברר לחתיכות קטנות על ידי שימוש בשני סכינים לשימוש יחיד סטרילי. לעיכול אנזימטי להשתמש 3-6 מיליליטר TrypLE בצינור חרוטי 15 מיליליטר ו דגירה של 15-30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
- הוסף 1 נפח של מדיום גידול prewarmed כדי להקל על ניתוק ובעדינות triturate התמיסה המכילה חתיכות רקמה למעלה ולמטה על ידי השימוש הראשון5 מיליליטר פיפטה חד פעמית, ואחריו בעזרת פיפטה פסטר זכוכית עד הומוגניזציה של ההשעיה התא. בדרך כלל, כמה חתיכות רקמת שייר, בעיקר מורכבות מחומר לבן, יישארו בהשעיה.
- ספין למטה ב157 XG במשך 5 דקות וresuspend את הכדור בכמות המתאימה של מדיום גידול (10 מיליליטר לבקבוק תרבות T75 ללא ציפוי). השתמש בבקבוק תרבות T75 אחד לביופסיה של 5-10 מ"מ קוטר בגודל ובלהסיק מכך במקרה של דגימות גדולות יותר.
- הנח תאים לתוך חממת 37 ° C עם 5% CO 2 ו -5% O 2.
- החלף מחצית בינונית בכל 3-4 ימים עד תאים הגיעו confluency. זה בדרך כלל לוקח עד שבועיים (המכונים [P0] מעבר 0).
2. במבחנה התרחבות ואפיון של תאים בוגרים מוח האנושי
- בהרחבת מבחנה:
- לשאוב את מדיום התרבות ולשטוף עם פוספט שנאגרו מלוח (PBS), המשיך בt החדרemperature, לפני הוספת 3 TrypLE מיליליטר.
- לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות עד שרוב התאים מנותקים. לטפוח בעדינות את צלוחיות כדי להקל על הסרת התאים; בעקבות תוספת של 3 כרכים של מדיום גידול, העברת התאים לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר וספין למטה ב157 XG במשך 5 דקות ו resuspend התאים בכמות המתאימה של מדיום גידול.
- מעבר התאים ביחס של 1:3 לתשואה אופטימלית לתוך צלוחיות תרבית תאי T75 חדשות.
הערה: יש לנו passaged תאים אלה עד P5 ללא כל סימנים של יעילות תכנות מחדש מופחתת. בעוד בP0 התרבות מכילה חלק ניכר של תאי האנדותל (כפי שהוערך על ידי ביטוי CD34), בקטעים שלאחר מכן מספרם הופך להיות זניח.
- אפיון של תרבויות מוח אנושיות בוגרות:
- Immunocytochemistry:
- לאפיון של תאים, זרעים ~ 60,000 תאים על פולי-D-ליזין מצופה כיסוי הזכוכית מחליקה ב500 μl mediu גידול הטרימ 'בצלחות תרבית רקמת 24 גם לדגור על 37 ° C עם 5% CO 2 ו -5% O 2.
- לניתוח immunocytochemical של תאי המוח האנושיים בתרבית להסיר את המדיום ולשטוף 3x עם 1 מיליליטר של PBS.
- תקן את התאים על ידי הוספת 500 μl של paraformaldehyde 4% ב-PBS במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר.
- העבר את כיסוי הזכוכית מחליק לתוך תא מכתים humidified מתאים ולחסום עם 80 μl PBS המכיל 3% אלבומין בסרום שור (BSA) ו0.5% טריטון X-100 במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר.
- הוספת נוגדנים עיקריים מדוללים באותו הפתרון (לגורמי דילול ראו טבלה של חומרים כימיים וציוד ספציפיים) ודגירת הלילה בשעה 4 ° C או 1 שעות בטמפרטורת חדר.
הערה: חלק ניכר אבל שונה של התאים בשלב זה של culturing הוא immunoreactive לβ רצפטור נגזר גורם גדילה של טסיות דם (PDGFRβ), מקבץ של בידול 146 (CD146), proteo כונדרואיטין סולפט NG2סוכרים, ויקטין שריר חלק (SMA), סמנים כלומר מאפיין של pericytes הקשורים דם קטן. רק מיעוט (<1%) מבטא את חלבון סמני astroglial גליה fibrillary חומצי (GFAP) וS100β. יתר על כן, בשלב זה את התרבות צריכה להיות נטול כל תאים המבטאים את βIII-טובולין הסמן העצבי. השתמש בשילובי נוגדן ראשוני מרובים לשיתוף תיוג של סמנים שונים. ניתן לקבל אישור נוסף לביטוי של סמני גליה, עצביים, אנדותל וpericyte ידי שעתוק לאחור ותגובה הכמותית זמן אמת שרשרת פולימרז (לא תוארה בפרוטוקול זה). - לאחר דגירה עם הנוגדנים הראשוניים לשטוף שלוש פעמים עם 1 מיליליטר PBS ולהוסיף נוגדנים המתאימים משני (בדילולים המתאימים) לפתרון מכתים ודגירת 1 שעות בטמפרטורת חדר בחושך. לשטוף את התאים 3x עם PBS. במידת צורך, לפני ההרכבה כולל צביעה עם DAPI במשך 5 דקות בחדרטמפרטורה.
- השתמש antifading הרכבה בינונית ולנתח את התלושים לכסות באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence או מיקרוסקופ confocal.
- Cytometry זרימה:
- לניתוח של ביטוי סמן פני השטח באמצעות cytometry זרימה, לגדל תאים לconfluency בT25 ללא ציפוי או צלוחיות תרבית תאי T75.
- ניתוק תאים באמצעות TrypLE כפי שתואר קודם ו resuspend בפתרון מכתים בהיקף של BSA + 0.5% PBS. לכל תגובה מכתים, resuspend תאים ב100,000-200,000 של פתרון מכתים 100 μl. הכן את התגובות מכתים אחד לכל נוגדן משמשות (CD146-FITC, CD140b-PE, CD34-APC, CD13-FITC, נוגדני שליטת אלוטיפ בהתאמה).
- הוספת נוגדני fluorochrome מצומדות לכל פתרון מכתים (לדילולים ראו טבלה של חומרים כימיים וציוד ספציפיים) ישירות לתוך ההשעיה תא דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות בחושך.
- לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 500 μl PBS וספין למטה בין כלשלב כביסה ב157 XG במשך 5 דקות.
- Resuspend התא גלולה ב 0.5-1 מיליליטר פתרון מכתים ותאי העברה דרך מסננת תא (70 מיקרומטר) לצינורות FACS. הגנה על המדגם מחשיפה לאור.
- דגימות ורטקס לפני הצבתם במכשיר FACS.
- כדי לנתח את תאי חיים ואינם כולל אגרגטים פסולת וסלולריים, שער לFSC-SSC ו-. duplets התא מגודרת החוצה במיוחד על ידי FSC-וFSC-W. כדי לקבוע את תנאי gating הנכונים עבור הסמנים פני התא להגדיר את השערים עם שליטת נוגדנים מתאים אלוטיפ מצומדת לfluorochrome בהתאמה. לאחר מכן לקבוע את חלקם של תאים הנכנס נוגדנים.
- Immunocytochemistry:
3. העשרה לתאים שמקורם בpericyte ידי תא הקרינה מיון פעיל
- לטהר את אוכלוסיית תא pericyte (resuspended במדיום גידול) לפני התמרה באמצעות FACS מיון באמצעות זרבובית 70 מיקרומטר. השתמש CD34-APC בשילוב עם CD140b-PE ו-CD146 FITC כדי לבחור עבור pericytes. מיון ל, תאי CD140b, וCD146-CD34 חיוביים שלילי.
- איסוף התאים ממוינים במדיום גידול וצלחת על פולי-D-ליזין מצופה כיסוי הזכוכית מחליק בצלחות תרבית רקמת 24 גם לדגור על 37 ° C עם 5% CO 2 ו -5% O 2.
- 48 שעות לאחר המיון להחליף את המדיום עם מדיום גידול טרי ולבצע התמרה כפי שתוארו בפרוטוקול 4.
4. Retroviral התמרה של תאים שמקורם בpericyte ותכנות מחדש לנוירונים מושרה
הערה: עיין בהנחיות בטיחות ביולוגיות מקומיות בעת טיפול בחלקיקי רטרווירלי. בגרמניה השימוש ברטרווירוסים מועסקים כאן דורשים בטיחות ביולוגית ברמה 2. לייצור של חלקיקי רטרווירלי מתייחס לפרוטוקול 6. לבונת רטרווירלי משמשת לתכנות מחדש, עיין Karow et al. (2012). רטרווירוסים היו pseudotyped עם VSV-G (-glyco וירוס stomatitis שלפוחיחלבון) 5. לייצור עיין אל Gavrilescu et 6.
- 24 שעות לפני זרע התמרה retroviral ~ 60,000 תאים על פולי-D-ליזין מצופה כיסוי הזכוכית מחליקה ב500 μl מדיום גידול טרי ב24 גם צלחות תרבית רקמה ולדגור על 37 ° C עם 5% CO 2 ו -5% O 2 .
- למחרת, להחליף את מצע הגידול עם 500 μl מדיום גידול טרי, prewarmed ולהוסיף 1 μl של supernatants בהתאמה מרוכזת המכיל חלקיקי רטרווירלי (pCAG-IRES-DsRed לשליטה, במיוחד בתקופת הקמת הפרוטוקול במעבדה), pCAG-ascl1 -DsRed IRES, pCAG-Sox2-IRES-GFP.
- יום אחד לאחר מכן, להסיר את המדיום כולל חלקיקים נגיפיים מהתאים ולהוסיף 1 מיליליטר טרי, prewarmed בינוני B27-בידול, מורכב מ49 מיליליטר גלוקוז גבוהה DMEM עם Glutamax ותוספת סרום ללא 1 מיליליטר B27. לשמור על התאים בתרבית על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 ו -5% O 2 במשך 4-8 שבועות מבלי לשנות את המדיום כמדיום שינויים חוזרים ונשנים להיות מזיקים כמו INS להתבגר.
5. אפיון מושרה נוירונים ידי Immunocytochemistry
- כדי לקבוע את הזהות הסלולרית של תאי transduced, בפרט כדי להדגים את רכישת הפנוטיפ עצבי, לבצע immunocytochemistry נגד אנטיגנים עצביים כגון bIII-טובולין, MAP2, וNeuN (לנוגדנים והדילולים שלהם, ראה טבלה של חומרים כימיים מסוימים ו ציוד; בצע את אותו התהליך כפי שצוין ב2.2.1).
- לשיפור ההבשלה של PdiNs, שיתוף תרבות תאים אלה עם תאי עצב שמקורם בקורטקס מוח עכבר E14. לשם כך, לנתח את קליפת המוח ולנתק את הרקמה באופן מכאני עם הזכוכית פיפטה פסטר אש מלוטשת. הוספת 10,000-50,000 נוירונים עכבריים לתרביות של תאים שמקורם בpericyte 2-3 שבועות הבאים התמרה עם Sox2 וascl1 קידוד מחדשtroviruses ולהמשיך culturing. ניתן להבחין בין תאי transduced מתא העצב עכברי על ידי ביטוים כתב (GFP וdsRed), או על ידי epifluorescence החי או הבא immunocytochemistry עבור ה-GFP וdsRed.
- כדי להעריך את היווצרות של סינפסות על PdiNs ידי נוירונים עכבריים, לבצע immunocytochemistry נגד קולטני הנוירוטרנסמיטר ועי כגון טרנספורטר לפוחי גלוטמט 1 (vGluT1).
- בדיקה תאי transduced לתכונותיהם חשמליות (כלומר יכולת לייצר פוטנציאל פעולה) ואת הקמתה של סינפסות הפונקציונלית על ידי אלקטרופיזיולוגיה תיקון מהדק. לפרטים בדבר ההליך לראות היינריך et al. (2011).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התוצאה הראשונה של פרוטוקול זה לאחר הקמת הצלחת תרבות מדגימה של אדם מבוגר קליפת מוח מורכבת בזיהוי ההרכב התאי של התרבות. Immunocytochemistry לחלבונים ספציפיים סוג התא מגלה מידה רבה של הטרוגניות בין התרבויות נובעות מדגימה של חולים שונים (איור 1 א). כלכמת ידי cytometry זרימה תמיד יש אחוז ניכר של תאים המבטאים PDGFRβ (בממוצע ~ 75%, החל 30 לעד 99%); סמנים אחרים של pericytes כגון CD146, NG2 וCD13 באים לידי ביטוי בדרך כלל בטווח תחתון (איור 1). כמו כן SMA בא לידי ביטוי בsubpopulation קטין של התאים בתרבית, כפי שנקבע על ידי (איור 1 א) immunocytochemistry. במעבר 0 (P0), יש בדרך כלל <10% מתאי אנדותל CD34 חיובי, ומספרם יורד מתחת לזיהוי עם passaging נוסף. כמו כן, astrocytes מהווה רק זיהום זניח בקטעים קודמים. יתר על כן, יש בדרך כלל לא תאים שיכתימו לתא גזע עצבי, עצבי, או סמני oligodendrocyte. Immunocytochemical וcytometry זרימת הנתונים אומתו באופן מלא על ידי 7 RT-PCR. לסיכום, את החלק היחסי הגדול ביותר בתרבות מבטא חלבונים ואופייניים mRNAs של pericytes. העשרה נוספת לתאי שמקורם pericyte יכולה להיות מושגת על ידי FACS בשלב זה. זה רלוונטי במיוחד כאשר טוהר של התרבות הוא בקצה התחתון של הקשת כפי שהיא משתקפת מרמת ביטוי PDGFRβ. לפיכך, יש לנו מנוצלים נוגדנים נגד PDGFRβ (CD140b) לבד או בשילוב עם נוגדנים נגד CD146, ואילו בניכוי כל מזהמים CD34 חיובי, לFAC-סוג במיוחד pericytes (תרשים 1C).
Transducing תרבויות אלה עם וירוסי שליטת קידוד גן כתב בלבד, אינו משנה עמ ביטוי הסמן שלהםrofile (העריך 3-4 שבועות הבאים התמרה), מצביע על כך שהתאים אלה יישארו בשושלת pericyte. כמו כן, בתיווך ביטוי רטרווירוס של Sox2 לבד לא יביא לכל שינוי גלוי במורפולוגיה ולא גורם ביטוי bIII-טובולין המצביע על כך Sox2 לבדו אינו מספיק כדי לגרום להמרת גורל. לעומת זאת, אחוז נמוך (כ 10%) של התאים transduced עם רטרווירוס קידוד ascl1 ביטוי βIII-טובולין תערוכה לבד, עם זאת ללא רכישת מורפולוגיה עצבית. באופן מפתיע, כמעט 50% מכל וSox2-תאי cotransduced ascl1 להראות ביטוי βIII-טובולין ואף יותר מכך, שליש מהתאים האלה-transduced הכפול (דמיינו ידי הביטוי העיתונאי הכפול שלהם) גם להציג תהליכים עצביים (איור 2). יחד עם הרכישה של תכונות עצביות, ביטוי של PDGFRβ הוא למטה מוסדר 7. עם התבגרות נוספת בתרבות, וSox2-תאי coexpressing-ascl1 גם להיות immunoreactive לMAP2 הבוגר יותר סמנים עצביים (מכתים את התהליכים דנדריטיים) וNeuN (מכתים את גופי תא בעיקר עצביים). כפי שנראה להלן שינויים אלה בביטוי סמן גם לתאם עם רכישת סימני ההיכר אלקטרו של נוירונים. לסיכום, נתונים אלה מספקים הוכחה להמרה הישירה גורלם של תאי שמקורם pericyte לאח"י, המכונה PdiNs. PdiNs אלה יש היכולת להקים תאי postsynaptic פונקציונליים כפי שנחשף בניסויי coculture עם הנוירונים של העכבר העוברי קליפת המוח. יכולת זו יכולה להיות הפגינה electrophysiologically במראה של תשומות סינפטיים (ראה דיון בהמשך), כמו גם את הקישוט של תהליכים דנדריטים של PdiNs עם מסופי presynaptic נגזרים מהנוירונים שיתוף תרבותי (מאופיינים באשכולות של מובילי ועי נוירוטרנסמיטר, למשל immunoreactivity vGluT1). נתונים אלו מצביעים על יכולתו של PdiNs להשתלב ג העצבי נוספיםircuits.
איור 1. ביטוי הטרוגניות של סמני pericyte בתרבויות הנגזרות מהמבוגרים האנושי קליפת המוח. א) micrographs פלורסנט הממחיש את הביטוי הטרוגנית של סמני pericyte (PDGFRb, SMA, CD146) כפי שנחשף על ידי immunocytochemistry. בקנה מידה בר = 50 מיקרומטר. B) היסטוגרמה מסכמת את המספרים היחסי של תאים חיוביים לסמני pericyte PDGFRβ (CD140b), CD13, וCD146 כפי שנקבע על ידי cytometry זרימה של תרבויות הנגזרים חולים שונות. CD34 הוא סמן לתאי האנדותל. חלקות C) FACS נקודה המתארות את השליטה ואלוטיפ תאים אנושיים צבעוניים CD140b CD146 / למיון של pericytes הכפול חיובי (מודגש על ידי התיבה האדומה) לתכנות מחדש לאחר מכן. שים לב לשיעור הגבוה של ביטוי וPDGFRβההטרוגניות בכל קשור לביטוי CD146 בתרבות המסוימת הזה.
. איור 2 תכנות מחדש של תאי בוגרים אדם נגזר pericyte לINS למעלה:. ניסיוני הגדרה. להלן: micrographs פלורסנט מתאר תאי transduced עם קידוד רטרווירוס Sox2-IRES-GFP וascl1-IRES-DsRed. שים לב שרק תאים כפולים transduced (ראשי חץ) להביע bIII-טובולין (פנל מימין) ולהציג מורפולוגיה עצבית.
| חלוקת תא [%] | מוות של תאים [%] | + BIII-טובולין [%] | |
| 36 | 3 | 0 | |
| Sox2 | 46 | 7 | 0 |
| Ascl1 | 26 | 33 | 7 |
| Sox2-Ascl1 | 3 | 36 | 25 |
טבלת 1. התנהגותם של התאים שמקורם בpericyte עוברים סבה לPdiNs כפי שהוערך על ידי הדמיה לחיות רציפה. שים לב שSox2 וAscl1 שיתוף להביע מחזור תא יציאת תאים. יתר על כן, שים לב לשיעור הגבוה של מוות של התאים הבאים Ascl1 או Sox2 וAscl1-coexpression. אם ניקח בחשבון אירועים הסלולר שונים אלה, כ 25% מכל תאי transduced משותף הפכו ins.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול הנוכחי מתאר את ההתרחבות במבחנה והעשרה של תאי שמקורם pericyte הבאות בידוד מהמבוגרים האנושי קליפת המוח ואת ההמרה שלאחר מכן לאח"י על ידי ביטוי בתיווך רטרווירוס של השעתוק העצבי גורמי Sox2 וAscl1. פרוטוקול כזה מספק ניסיוני במערכת מבחנה כדי לחקור את שושלת ההמרה של תאי מוח תושב לנוירונים ובאופן פוטנציאלי גם גליה, עם המטרה בראש לתרגם סופו של דבר גישת המרה הישירה הזה להגדרת vivo במוח הבוגר.
שיקולים טכניים
במחקר שלנו אנחנו מנוצלים רקמת מוח אנושית מחולים בגילים שבין 19 ו70 שנים, משני המינים. אנחנו לא מבחינים בהבדל גלוי ביעילות תכנות מחדש בהתאם למין או גיל 7. מומלץ בכל זאת לתעד את המידע הזה כהבדלים דקים יותר עשויים להיות בכל זאתציין כי נמלט תשומת לבנו.
מומלץ עוד יותר להתחיל בעיבוד מוקדם ככל האפשר לאחר העברת דגימת הרקמה למעבדה. לא יהיו בהכרח חלק נעלמים לכמה זמן את הרקמה נשארה בחדר הניתוח לפני העברה בניסויים. אנו מעריכים כי במחקר שלנו 7 הזמן בין ההסרה מהמוח של המטופל לתחילתו של הליך culturing נע בין 2-6 שעות, עם הדגימות ששמרו כל הזמן על קרח. אין הבדל גלוי בקלות עיבוד שלאחר מכן ולא כל תוצאת לוואי הבחין בתוך חלון הזמן הזה.
הערכה ביקורתית לכל פרוטוקול נוגעת הפשטות, שחזור, והיעילות שלה. הפרוטוקול הנוכחי הוא פשוט שבזמן תאי שלב ראשון יורחבו במדיום זול ניתן להשיג בקלות שבו, ואחריו שלב שני של תכנות מחדש של תא רק באמצעות שני fa השעתוקctors ותרבית במדיום מוגדר.
לגבי שחזור, אנו ציינו כי האיכות של תכשיר רטרווירוס היא בעל חשיבות עליונה, עם הכנות וירוס כייל נמוכות בשימוש בדילולים כדי להתאים את מספר החלקיקים זיהומיות של וירוסי כייל גבוהים ופעמים רבות תוצאה הכישלון של תכנות מחדש. למעשה אנו ציינו כי אותה תרבות pericyte שבתכנות מחדש נכשל בעבר ניתן הייתה להמיר בהצלחה לאח"י בעת שימוש בוירוסי כייל גבוהים.
לגבי יעילות של המרה, יש לנו להעריך את מספר-טובולין החיובי βIII התאים שמקורם ו- Sox2 תאי cotransduced ascl1 באמצעות הדמיה חיות מתמשכת. הדמיה חיה מאפשרת להעריך את מספרם של תאים העוברים חלוקת תא או מוות של תאים במהלך תהליך ההמרה, בעוד מידע מסוג זה הוא חסר כאשר מספר INS נוצר נקבע רק בנקודת הסיום של הניסוי. למעשה שימוש במייקרו וידאו הזמן לשגותעותק (להליך מתייחס לאורטגה דואר t al. 8) זה היה ציין כי תאי transduced גורם untransduced ואחת להמשיך מתרבים, ואילו וSox2-תאי cotransduced ascl1 במהירות לצאת ממחזור התא. יתר על כן, חלק משמעותי של האוכלוסייה זו האחרונה עובר מוות של תאים. בעוד רעילות רטרווירוס לא ניתן לשלול באופן רשמי מהנתונים שהתקבלו במחקר שלנו 7, העובדה שהגדילה את המוות של תאים נצפתה רק כאשר ascl1 באה לידי הביטוי (לבד או בשילוב עם Sox2), אנו מפרשים את זה כראיה לסכסוך קטסטרופלי של גורל תא . אם ניקח שני האירועים הללו בחשבון, אנו מעריכים כי 25% מכל וSox2-תאי cotransduced ascl1 להמיר INS bIII-טובולין החיובי (טבלת 1).
כמו שיתוף התמרה דרושה לחלוטין לתכנות מחדש מוצלח, אפשר לשקול העסקת קידוד וקטור ויראלי שני גנים כדי לייעל את כמות התאים המבטאים את שני הגורמים באותוזמן.
לאחרונה, Ladewig et al. פיתח פרוטוקול להמרה היעילה של fibroblasts לאח"י קבלת תשואה של 200% באמצעות עיכוב על בסיס מולקולות קטן של קינאז-3β synthase הגליקוגן וSMAD איתות 9. זה יהיה מעניין כדי לקבוע אם תוספות הללו לפרוטוקול שלנו לשפר את התשואה של ייצור PdiN.
תוצאה נוספת מעניינת של ההדמיה החיה של תהליך תכנות מחדש נוגעת לעובדה שההמרה של pericytes אדם הבוגר לאח"י מתרחשת בקצב איטי למדי בהשוואה לפרוטוקולי תכנות מחדש דומים בתרביות של תאים סומטיים שונים של מוצא עכבר 4. זה עולה בקנה אחד עם ההבשלה האיטית האופיינית לתאי עצב אנושיים 10.
למרות שאנו לא באופן שיטתי ניתחנו את ההשפעה של מתח החמצן בתשואה של ייצור PdiN, אנו ציינו כי דגירה בתנאים נמוכים של חמצן (5%), בדרך כללנתן תוצאות טובות יותר בהשוואה לculturing התאים בתנאי normoxic (21%). לאחרונה, Davila et al. תאר אפקט שיפור דומה על ידי מתח חמצן מופחת לאינדוקציה של אח"י מfibroblasts אדם 11.
הפרוטוקול שלנו מבוסס על אספקת רטרווירלי של Sox2 וascl1 תוך פרוטוקולי המרה ישירים אחרים יש מועסקי וקטורים מושרה lentiviral 1, 12, 13. לאחרונה יש לנו גם מיושמים בהצלחה מבני lentiviral דוקסיציקלין המושרה קידוד Sox2 וascl1, המציין כי דופק קצר יחסית (10 ימים) ביטוי Sox2 וAscl1 די בכך כדי לגרום להמרת pericyte לנוירון. רטרווירוסים המשמשים במחקר שלנו 7 נועדו למופחת השתקת 5. בהתאם לכך, אנו לא הבחנו במראה של תאי עצב נטולי ביטוי גן כתב. עם זאת, האפשרות שרמות הביטוי הכוללת של שני transgeneלא ניתן לשלול שינוי של והכתב לאורך זמן. גישות ללא אינטגרציה (ניצול וירוסי Sendai) היו מועסקים בזמן האחרון במקרה של הדור של אבות עצביים הנגרמים 14, אבל זה כרגע לא ידועים אם אסטרטגיות תכנות מחדש אפילו ללא וירוס זה או יכול להיות מיושמים בהצלחה להמיר pericytes האנושי. לבסוף, אם pericytes נגזר מרקמות אחרות יכול לעבור גיור לסוגי תאים עצביים הנגרמים נשאר להיבדק.
שיקולים רעיוניים
תוצאה קריטית של תכנות מחדש של תאים סומטיים לאח"י נוגעת הפונקציונליות שלהם 15. יש לנו להעריך את המאפיינים של אלקטרו PdiNs בנקודות זמן שונים לאחר תחילתו של תהליך תכנות מחדש. בשלבים מוקדמים מאוד, כלומר 2 שבועות הבאים התמרה retroviral, תערוכת PdiNs בקושי סימנים של רגישות חשמלית, למרות ביטוי βIII-טובולין בשלב זה. לפיכך, רובניתוחי אלקטרו נערכו 4-8 שבועות הבא התמרה עם Sox2 וascl1. כפי שתואר בKarow et al., PdiNs מתאפיין בחוסר בגרה רבה כפי שמשתקף בהתנגדויות קלט גבוהות ותדירות נמוכה של ירי פוטנציאל פעולה. הבשלה נוספת יכולה להיות מקודם על ידי PdiNs שיתוף culturing עם הנוירונים נגזרים מעכבר E14 קליפת המוח. בתנאים אלה, PdiNs תערוכת תדרים גבוהים יותר פעולה פוטנציאליים וזרמי נתרן עלו 7. יתר על כן, coculturing מגלה את היכולת של PdiNs לקבל קלט סינפטי פונקציונלי מתא עצב עכבר. לסיכום, PdiNs רכישת נכסים עצביים פונקציונליים שניתן לשפר עוד יותר על coculturing עם נוירונים אחרים. עם זאת, זה עדיין לא הראה אם PdiNs יכול גם להקים תאי presynaptic פונקציונליים. מחקרים נוספים השתלת PdiNs לתוך המוח יש צורך לחשוף את הפוטנציאל שלהם כדי להגיע לבגרות ופונקציונליות מלאים.
Uלשיר Sox2 וascl1 כגורמי תכנות מחדש שציינו שPdiNs וכתוצאה מכך רוכש תכונות של תאי עצב GABAergic 7. מעניין לציין, כי קבוצות אחרות פיתחו פרוטוקולים להמיר fibroblasts לאח"י באמצעות גורם שעתוק שונה ו / או שילוב microRNA וכתוצאה מכך INS פיתוח רכשה מפרט הנוירוטרנסמיטר שונה כגון glutamatergic, דופאמין, והפנוטיפ כולינרגית 1, 16-18. זה עדיין לא בדק האם שילובים גורם בשימוש בfibroblasts לגרום את אותה זהות משדר בPdiNs. יתר על כן, העבודה האחרונה הרחיבה את ספקטרום ההמרה מעבר הנוירוגנזה כדי ליצור תאי גזע עצביים 19, או גליה, בoligodendrocytes מסוימת 21, 22 20. אם פרוטוקולי תכנות מחדש אלה לעורר תוצאה דומה בתאי שמקורם pericyte מבוגר אנושיים במוח, זה יהיה להרחיב את הפנורמה של יישומים ליבוא זה במידה רבהסוג תא נמלת מוח תושב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש מחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לד"ר מגדלנה גץ לקלט שלה במהלך הפיתוח של פרוטוקול זה. אנו מודים לד"ר מריוס Wernig (אוניברסיטת סטנפורד) לנדיבות לתת לנו את רצף קידוד Sox2. אנחנו גם מאוד מודים לד"ר אלכסנדרה Lepier לייצור וירוס. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של דויטשה Forschungsgemeinschaft (BE 4182/2-2) וBMBF (01GN1009A) ל-BB, והמשרד הבווארית הממלכתי למדעים, מחקר והאמנויות לח"כ וBBCs קיבלו מימון מSYSTHER-דו לאומי מכון INREMOS וירטואלי (משרדי חינוך והמחקר הפדרליים גרמנים וסלובניים) וDFG (SFB 824).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-CD140b-PE | BD Biosciences | 558821 | use 1:100 |
| anti-CD146-FITC | AbD Serotec | MCA2141FT | use 1:100 |
| anti-CD13-FITC | AbD Serotec | MVA1270A488T | use 1:100 |
| anti-CD34-APC | BD Biosciences | 560940 | use 1:100 |
| anti-PDGFRβ | Cell Signaling | 3169S | use 1:200 |
| anti-CD146 | Abcam | Ab75769 | use 1:400 |
| anti-NG2 | Millipore | AB5320 | use 1:400 |
| anti-SMA | Sigma-Aldrich | A2547 | use 1:400 |
| anti-βIII-tubulin | Sigma-Aldrich | T8660 | use 1:400 |
| anti-MAP2 | Sigma-Aldrich | M4403 | use 1:200 |
| anti-GFAP | Sigma-Aldrich | G3893 | use 1:600 |
| anti-GFP | Aves Labs | GFP 10-20 | use 1:1,000 |
| anti-RFP | Chromotek | 5F8 | use 1:500 |
| anti-S100β | Sigma-Aldrich | S2532 | use 1:300 |
| anti-NeuN | Millipore | MAB377 | use 1:200 |
| anti-GABA | Sigma-Aldrich | A2052 | use 1:500 |
| anti-Calretinin | Millipore | AB5054 | use 1:500 |
| anti-vGluT1 | SYnaptic SYstems | 135511 | use 1:1,000 |
| Rat IgG1 isotype control FITC | AbD Serotec | 11-4301-81 | use 1:100 |
| Rat IgG1 isotype control PE | AbD Serotec | 12-4301-81 | use 1:100 |
| Rat IgG1 isotype control APC | AbD Serotec | 17-4301-81 | use 1:100 |
| TrypLE | Invitrogen | 12605-010 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Invitrogen | 61965 | |
| B27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10106-169 | perform heat inactivation by incubation at 56 °C for 30 min |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) | Invitrogen | 24020-091 | |
| Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1x) | Invitrogen | 14190 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| PFA (paraformaldehyde) | Sigma-Aldrich | P1648 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| DAPI (4′,6-Diamidin-2-phenylindole) dilactate | Sigma-Aldrich | 042M4005 | |
| Aqua-Poly/Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap | BD Biosciences | 352235 | |
| 24-well plates | Orange Scientific | 5530305 | |
| 75 cm2 culture flasks | Greiner Bio-One | 658175 | |
| 25 cm2 culture flasks | Greiner Bio-One | 690175 | |
| Disposable pipettes 10 ml | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| Glass Pasteur pipettes (150 mm) | Fisherbrand | FB50251 | |
| Glass coverslips 12 mm diameter | Menzel | CB00120RA1 | |
| Surgical disposable scalpels | B. Braun | 5518083 | |
| Tissue culture dishes | Greiner Bio-One | 633180 | |
| Conical tubes 15 ml | BD Biosciences | 352095 | |
| Laminar flow hood | |||
| Centrifuge and swing-out rotor with adapters for 15 ml and 50 ml tubes | Hettich Lab Technology | 1406 | |
| Flow cytometry cell sorter: FACSAria l with FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| Humified cell culture incubator | Eppendorf Galaxy 170R | ||
| Wather bath at 37 °C | |||
| FACSFlow sheath fluid | BD Biosciences | 342003 | |
| Epifluorescence microscope BX61 | Olympus | ||
| Confocal microscope LSM710 | Zeiss |
References
- Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476, 224-227 (2011).
- Kim, J., et al. Functional integration of dopaminergic neurons directly converted from mouse fibroblasts. Cell stem cell. 9, 413-419 (2011).
- Duan, B., et al. Interactions between water deficit, ABA, and provenances in Picea asperata. Journal of experimental botany. 58, 3025-3036 (2007).
- Heinrich, C., et al. Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons. PLoS Biol. 8, (2010).
- Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nat Protoc. 6, 214-228 (2011).
- Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. , (2007).
- Karow, M., et al. Reprogramming of pericyte-derived cells of the adult human brain into induced neuronal cells. Cell stem cell. 11, 471-476 (2012).
- Ortega, F., et al. Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level. Nat Protoc. 6, 1847-1859 (2011).
- Ladewig, J., et al. Small molecules enable highly efficient neuronal conversion of human fibroblasts. Nat Methods. 9, 575-578 (2012).
- Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77, 440-456 (2013).
- Davila, J., Chanda, S., Ang, C. E., Sudhof, T. C., Wernig, M. Acute reduction in oxygen tension enhances the induction of neurons from human fibroblasts. J Neurosci Methods. 216, 104-109 (2013).
- Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463, 1035-1041 (2010).
- Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 10343-10348 (2011).
- Lu, J., et al. Generation of Integration-free and Region-Specific Neural Progenitors from Primate Fibroblasts. Cell Rep. 3, 1580-1591 (2013).
- Yang, N., Ng, Y. H., Pang, Z. P., Sudhof, T. C., Wernig, M. Induced neuronal cells: how to make and define a neuron. Cell Stem Cell. 9, 517-525 (2011).
- Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476, 220-223 (2011).
- Yoo, A. S., et al. MicroRNA-mediated conversion of human fibroblasts to neurons. Nature. 476, 228-231 (2011).
- Son, E. Y., et al. Conversion of mouse and human fibroblasts into functional spinal motor neurons. Cell Stem Cell. 9, 205-218 (2011).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 2527-2532 (2012).
- Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10, 473-479 (2012).
- Yang, N., et al. Generation of oligodendroglial cells by direct lineage conversion. Nat Biotechnol. 31, 434-439 (2013).
- Najm, F. J., et al. Transcription factor-mediated reprogramming of fibroblasts to expandable, myelinogenic oligodendrocyte progenitor cells. Nat Biotechnol. 31, 426-433 (2013).
