Summary
직접 혈통 프로그래밍에 대한 뇌 상주 세포를 표적으로하는 것은 뇌 수리에 대한 새로운 관점을 제공합니다. 여기서 우리는 성인의 대뇌 피질에서 뇌에 상주하는 혈관 주위 세포에 풍부한 문화를 준비하고 SOX2 및 Ascl1 요인 전사의 레트로 바이러스 매개 식에 의해 유도 된 신경 세포로 이러한 변환하는 방법의 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
유도 된 신경 세포 (INS)에 비 신경 세포의 직접 혈통 프로그래밍은 신경의 근간이되는 분자 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하고 체외 모델링하거나 병에 걸린 뇌를 복구하기위한 새로운 전략을 가능하게 할 수있다. INS로 직접 변환 의무 식별 뇌 상주 비 신경 세포 유형은 손상된 뇌 조직 내에서, 즉, 현장에서 이러한 접근 방식을 실행을 허용 할 수 있습니다. 여기에서 우리는이 전제를 충족 성인의 뇌에서 파생 된 세포를 식별하는 시도에서 개발 된 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 수반 : 성인 인간의 뇌 생검 의한 대뇌 피질에서 인간 세포의 (1)를 배양; (2) 시험 관내 (약 2-4주 필요) 확장 및 면역 세포에 의해 문화의 특성 및 유동 세포 계측법; (3) 항 PDGF 수용체 β 및 안티 CD146 항체를 사용하여 (FACS)를 정렬 형광 활성화 된 셀에 의해 농축;(4) 신경성 전사와 레트로 바이러스 매개 전달은 SOX2 및 ascl1 요인; (5) 마지막으로 면역 세포에 의해 생성 된 혈관 주위 세포 유래 유도 된 신경 세포 (PdiNs)의 특성 (8 주 14 일 레트로 바이러스 형질 도입에 따라). 이 단계에서, 인은 패치 클램프 녹음하여 전기적 특성에 대해 탐색 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 기능적인 인간의 기능에 뇌 상주 혈관 주위 세포의 체외 혈통 전환에 대한 높은 재현성 절차를 제공합니다.
Introduction
다시 분화 가능성의 과다 부여하는 유도 만능 줄기 세포로 체세포 (유도 만능), 프로그래밍과 달리, 직접 프로그래밍은 다른에 하나의 특정 세포 유형의 연속 변환을 위해 목표로하고있다. 질병 모델링 및 잠재적 인 세포 기반 치료의 맥락에서 자신의 응용 프로그램에 대해, 모두 프로그래밍 방식은 특정 장점과 단점이 있습니다. 유도 만능 (I)에 프로그램을 다시 만들 것은 세포의 거의 무한한 소스를 제공한다; (II) 유전 공학을 허용한다; (III) 거의 무제한의 분화 가능성에 부여한다. 이러한 세포는 세포 기반 치료에 사용되어야하는 경우에는 유도 만능의 주요 단점은 미분화 세포 (생체 내에서 기형 종 형성)의 발암 및 생체 외 배양과 후속 이식을위한 필요성의 위험을 수반한다. 반대로, 직접 혈통 프로그래밍은 원하는 세포의 낮은 수율에 의해 제한됩니다출발 인구의 표적 세포의 수와 직접 관련이 있지만, 계통 - 리 프로그래밍 세포 이식 1,2에 제공된 발암 위험을 나타내지하지 나타나는 장점을 보유하는; 또한, 직접 프로그래밍도, 즉 이들 세포는 따라서 이식 필요성을 피하고, 필요한 것 장기 내에, 동일계에서 달성 될 수있다.
이 염두에두고, 우리의 실험실은 신경 퇴행성 질환의 세포 기반 치료법을 향한 새로운 접근 방식으로 기능에 혈통 재 프로그래밍 뇌 상주 세포의 가능성을 추구하고있다. 잠재적 혈통 프로그래밍 셀룰러 대상으로 고려 될 수있다 뇌 상주 세포는 다른 macroglia의 유형 (성상 세포, NG2 세포 및 희소 돌기 아교 세포), 미세 아교 세포 및 미세 혈관 관련 세포 (내피 세포와 혈관 주위 세포)를 포함한다. 우리는 광범위하게 대뇌 고전의 아스트로의 체외 프로그램을 다시 만들 가능성을 연구 한출생 초기 마우스 3-5 텍스. 성인의 뇌에 직접 혈통 프로그래밍에 대한 유사 적합한 세포 소스의 검색, 우리는 성공적으로 기능과 혈관 주위 세포의 전시 품질 증명으로 다시 프로그램 할 수있는 세포 인구가 발생했습니다. 여기에서 우리는 확장하고 체외에서이 세포를 풍부하게, 그리고 마지막으로 성공적으로 (25 ~ 30 % 범위)이 체외 확장 된 세포의 상당 부분을 재 프로그램하는, 성인의 뇌 조직 검사에서 이러한 세포를 수확하는 방법에 대한 프로토콜을 설명 기능. 리 프로그래밍은 두 개의 전사 인자, SOX2 및 ascl1 동시에 레트로 바이러스 - 매개의 공동 발현에 의해 달성 될 수있다. 이러한 PdiNs는 반복적 활동 전위 소성 능력을 취득하고 신경망으로 통합 그들의 능력을 나타내는 다른 뉴런뿐만 시냅스 대상 서브 밝혀졌다. 우리의 프로토콜은 기능에 성인의 뇌 혈관 주위 세포의 분리 및 혈통 전환을위한 간단한 절차를 제공합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 분리 및 성인의 뇌 세포의 배양
인체 조직과 관련된 실험은 연구 목적으로 인간 재료의 사용에 관한 모든 관련 정부 기관 및 규정에 따라 수행되어야한다. 본 프로토콜은 LMU 뮌헨의 의료 학부의 윤리위원회와 모든 환자의 서면 동의서의 승인에 따라 개발되었다.
성인의 대뇌 피질의 준비 문화의이 프로토콜은 측두엽 간질 또는 기타 뿌리 깊은 비 외상성, 비 악성 병변으로 고통받는 남녀 환자의 검체를 사용하여 설립되었습니다. 따라서 뇌 병변 액세스 채널에서만 이루어지는 수술 방으로부터 얻은 조직은 건강한 여겨진다. 환자의 연령 범위는 19-70년했다.
- 열 - 불 활성화 소 태아 혈청을 첨가하여 성장 배지를 준비루타 가진 DMEM 고 글루코스 행 (FCS) 20 % FCS의 최종 농도를 얻었다. 500 ㎖의 성장 매체의 총 5 ㎖ 페니실린 / 스트렙토 마이신을 추가합니다. 이것과 적절한 층류 후드에서 무균 배양 조건을 요구하는 모든 후속 단계를 수행한다.
- 염화칼슘 처리 될 때까지 얼음에 HEPES (10 mM의 최종 농도) 등의 MgCl2를 (HBSS) 매체와 행크스 '균형 염 용액의 수술 방에서 얻은 성인의 뇌 생검을 유지합니다. 가능한 한 빨리 처리를 시작합니다.
- 65mm 페트리 접시에 조직을 전송하고 두 멸균 일회용 메스를 사용하여 작은 조각으로 말하다, 단일 세포로 분리를 시작합니다. 소화 효소를 들어 15 ML 원뿔 튜브에 3-6 ML TrypLE를 사용하고 물을 욕조에 37 ° C에서 15 ~ 30 분 동안 품어.
- 해리를 촉진하는 예비 가온 성장 배지의 1 부피를 추가하고 온화 우선하여 상하 조직 조각을 함유하는 용액을 씹다세포 현탁액을 균질화 될 때까지 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 다음 5 ㎖ 일회용 피펫. 일반적으로, 대부분 흰색 물질로 구성된 일부 잔여 조직의 조각, 서스펜션에 남아 있습니다.
- 5 분 157 XG에 스핀 다운 및 성장 매체의 적절한 양 (코팅 T75 문화 플라스크 당 10 ml)에 펠렛을 재현 탁. 크기 5 ~ 10 mm 직경의 조직 검사에 대해 하나의 T75 문화 플라스크를 사용하여 더 큰 표본의 경우이에서 추정.
- 5 % CO 2 5 % O 2와 37 ° C 배양기에 세포를 놓습니다.
- 세포가 포화 상태에 도달 할 때까지 모든 3-4일 매체의 절반을 교체합니다. 이것은 일반적으로 (통로 0 [P0]라고 함) 최대 2 주가 소요됩니다.
성인의 뇌 세포의 2. 체외 확장 및 특성
- 체외 확장의 :
- 문화 매체를 기음과 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)로 세척, 방 t에서 유지온도계 수, 3 ㎖의 TrypLE를 추가하기 전에.
- 세포의 대부분이 분리 될 때까지 5 ~ 10 분 동안 37 ° C에서 알을 품다. 부드럽게 세포의 리프팅을 용이하게하기 위해 플라스크를 살짝; 성장 배지 중에서 볼륨을 첨가 한 다음, 15 ㎖의 원뿔형 튜브에 세포를 전송하고 5 분 동안 157 XG에 스핀 다운 및 성장 배지의 적절한 양으로 세포를 재현 탁.
- 통로 새로운 T75 세포 배양 플라스크에 최적 수율 1:3 세포.
참고 :이 감소 프로그래밍 효율의 흔적없이 P5 때까지이 세포를 계대 배양했다. 문화가 내피 세포의 상당한 부분을 (CD34 발현에 의해 평가)가 포함 P0에있는 동안, 다음 구절에 자신의 번호가 무시됩니다.
- 성인의 뇌 문화의 특성 :
- 면역 세포 화학 :
- 폴리 - D - 라이신 코팅 커버 유리 위에 세포, 씨 ~ 60,000 세포의 특성을 500 ㎕의 신선한 성장 mediu에 미끄러 져24 잘 조직 배양 접시에있는 m와 5 % CO 2 5 % O 2와 37 ° C에서 알을 품다.
- 배양 된 인간의 뇌 세포의 면역 세포 화학 분석 배지를 제거하고 PBS 1 ㎖로 3 회 세척 하였다.
- 실온에서 15 분 동안 PBS 중 4 % 파라 포름 알데히드 500 ㎕를 첨가하여 세포를 고정한다.
- 커버 유리가 적절한 가습 염색 챔버에 미끄러 져 이동하고 80 ㎕의 PBS 실온에서 1 시간 동안 3 % 소 혈청 알부민 (BSA) 및 0.5 % 트리톤 X-100을 함유하는 블록.
- 동일한 솔루션에 희석 차 항체 (희석 요인이 특정 시약 및 장비의 표를 참조하십시오) 추가하고 실온에서 4 ° C에서 또는 1 시간에서 밤새 품어.
주 : 배양이 단계에서 세포의 상당하지만, 다른 부분은 (PDGFRβ) 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β에 대한 면역 반응하고, 차별화 146 (CD146), NG2 콘드로이틴 황산 proteo의 클러스터글리 칸, 평활근 액틴 (SMA), 미세 혈관 관련 혈관 주위 세포의 특성 즉, 마커. 단지 소수 (<1 %)이 astroglial 마커 아교 섬유 성 산성 단백질 (GFAP)과 S100β을 표현한다. 또한,이 단계에서의 문화는 신경 세포 마커 βIII-튜 불린을 표현하는 세포의 결여해야한다. 다른 마커의 공동 표시에 대해 여러 차 항체의 조합을 사용합니다. 아교 세포, 신경 세포, 내피 세포 및 혈관 주위 세포 마커의 발현의 추가의 확인은 역전사 (이 프로토콜에서 설명하지 않음) 정량적 실시간 중합 효소 연쇄 반응에 의해 얻을 수있다. - 함께 배양 한 다음 차 항체는 1 ml의 PBS로 3 회 세척하고 염색 용액에 (적절한 희석에) 해당 보조 항체를 추가하고 어둠 속에서 실온에서 1 시간을 품어. 세포를 PBS로 3 배 씻으십시오. 필요한 경우, 이전 설치에 방에서 5 분 DAPI로 염색을 포함온도.
- 설치 매체를 antifading 사용하여 표면 형광 현미경이나 공 초점 현미경을 사용하여 커버 전표를 분석합니다.
- 유동 세포 계측법 :
- 유동 세포 계측법을 사용하여 표면 마커의 발현 분석을 위해, 코팅 T25이나 T75 세포 배양 플라스크에 포화 상태로 세포를 성장.
- PBS + 0.5 % BSA로 구성된 염색 용액에 전후에 resuspend 바와 같이 TrypLE를 사용하여 세포를 분리. 염색 반응에 대해, 염색 용액 100 μL에 100,000-200,000 세포를 재현 탁. (CD146-FITC, CD140b-PE, CD34-APC, CD13-FITC, 각각의 이소 제어 항체)를 사용 항체 당 하나의 염색 반응을 준비합니다.
- 직접 세포 현탁액에 (희석 특정 시약 및 장비의 표를 참조하십시오) 각 염색 용액에 형광 색소 - 복합 항체를 추가하고 어둠 속에서 30 분 동안 4 ° C에서 알을 품다.
- 500 ㎕의 PBS로 세포를 세 번 세척하고 각각의 사이에 스핀 다운5 분 157 XG에 세척 단계.
- FACS 튜브에 세포 고사 (70 μM)를 통해 0.5 ml의 염색 액에 전사 세포에서 세포 펠렛을 재현 탁. 빛에 노출 샘플을 보호합니다.
- 이전 FACS 악기에 배치에 소용돌이 샘플.
- 살아있는 세포를 분석하고 파편과 세포 집합체, FSC-A에 대한 게이트와 SSC-A를 제외합니다. 휴대 duplets은 특히 FSC-A와 FSC-W에 의해 문이 있습니다. 각각의 형광 색소에 접합 이소 일치 항체 제어 게이트를 설정 세포 표면 마커에 대한 올바른 게이트 조건을 결정합니다. 그런 항체 바인딩 세포의 비율을 결정합니다.
- 면역 세포 화학 :
정렬 형광 활성화 된 세포에 의한 혈관 주위 세포에서 파생 된 세포 3. 심화
- FACS는 70 μm의 노즐을 사용하여 선별을 통해 이전에 형질 도입 (성장 배지에 재현 탁) 주연 세포 세포 집단을 정제. C와 함께 CD34-APC를 사용D140b-PE와 CD146-FITC는 혈관 주위 세포에 선택합니다. CD34 음성, CD140b-, 및 CD146-양성 세포에 대한 정렬.
- 24 잘 조직 배양 플레이트에서 미끄러 져 폴리 - D - 라이신 코팅 유리 덮개에 성장 매체와 플레이트에 정렬 된 세포를 수집하고 5 % CO 2 5 % O 2와 37 ° C에서 알을 품다.
- 정렬 후 48 시간 신선한 성장 매체와 매체를 교체하고 프로토콜 4에 설명 된대로 전달을 수행합니다.
4. 레트로 바이러스 혈관 주위 세포에서 파생 된 세포의 형질 도입 및 유도 신경 세포로 재 프로그램
참고 : 레트로 바이러스 입자를 처리하는 지역 바이오 안전성 지침을 참조하십시오. 독일에서는 여기에 사용되는 레트로 바이러스의 사용은 바이오 안전성 레벨 2가 필요합니다. 레트로 바이러스 입자의 생산이 프로토콜 6을 참조하십시오. 프로그래밍에 사용되는 레트로 바이러스 구조의 경우, Karow 등을 참조하십시오. (2012). 레트로 바이러스는 VSV-G (수 포성 구내염 바이러스-글리코와 pseudotyped했다단백질) 5. 생산 Gavrilescu 외 여러분 6을 참조하십시오.
- 이전의 폴리 - D - 라이신 코팅 커버 유리 위에 레트로 바이러스 전달 씨 ~ 60,000 세포에 24 시간은 24 잘 조직 배양 플레이트에 500 ㎕의 신선한 성장 매체에 미끄러 져와 5 % CO 2 5 % O 2와 37 ° C에서 알을 품다 .
- 다음날, 500 ㎕의 신선한, 데워진 성장 매체로 성장 매체를 교체하고 레트로 바이러스 입자 (제어 pCAG-IRES-DsRed를, 특히 실험실에서 프로토콜을 설정하는 동안), pCAG-ascl1을 포함하는 각각의 집중 상층 액 1 μl를 추가 pCAG-SOX2-IRES-GFP-IRES-DsRed를.
- 어느 날 후, 세포에서 바이러스 입자를 포함하는 매체를 제거하고 신선한 1 ㎖를 추가, 루타 49 ML DMEM 높은 포도당과 1 ㎖의 B27의 혈청 보충으로 구성, B27-분화 매체를 데워진. 5에서 37 ° C에서 문화의 세포를 유지% CO 2와 기능이 성숙 반복 매체의 변화는 유해 해짐에 따라 매체를 변경하지 않고 4-8주 5 %의 O 2.
면역 세포에 의해 유도 된 신경 세포의 5. 특성
- 형질 세포의 세포 신원을 확인하기 위해 신경 세포의 표현형의 인수를 입증 할 특히, 특정 시약의 표를 참조 항체와 각각의 희석을 위해 (예 : 빌 - 튜 불린, MAP2 및 노이 앤 등의 신경 항원에 대한 면역 세포 화학을 수행하고 장비, 2.2.1에 표시된대로) 절차를 따릅니다.
- E14 마우스 대뇌 피질에서 파생 된 신경 세포와 PdiNs, 공동 문화 이들 세포의 성숙을 개선하십시오. 이를 위해, 대뇌 피질을 해부 화재 광택 유리 파스퇴르 피펫으로 기계적으로 조직을 떼어 놓다. SOX2 및 ascl1 인코딩 다시 함께 전달 다음 혈관 주위 세포에서 파생 된 세포 2~3주의 문화에 10,000-50,000 쥐의 뉴런을 추가troviruses 및 배양을 계속합니다. 형질 세포는 살아있는 표면 형광 또는 GFP와 DsRed를 위해 면역 세포를 다음 중 하나를 자신의 기자 (GFP와 DsRed를) 식으로 쥐의 뉴런과 구별 할 수 있습니다.
- , 쥐의 뉴런에 의해 PdiNs에 시냅스의 형성을 평가하는 등의 기공을 갖는 글루타민산 염 트랜스 포터 1 (vGluT1) 등의 기공을 갖는 신경 전달 물질 수용체에 대한 면역 형광 염색법을 수행 할 수 있습니다.
- 자신의 전기적 특성 (활동 전위를 생성 즉, 능력) 및 패치 - 클램프 전기 생리학 기능적인 시냅스의 설립을위한 형질 세포를 조사. 절차에 대한 자세한 내용은을 참조하십시오 하인리히 등. (2011).에게
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
이 프로토콜은 후 성공적으로 성인의 대뇌 피질의 표본에서 문화를 확립의 첫 번째 결과는 문화의 세포 성분의 식별로 구성되어 있습니다. 세포 유형의 특정 단백질에 대한 면역 세포 화학은 다른 환자 (그림 1A)의 표본에서 파생 된 문화 간의 이질성의 상당한 정도를 알 수있다. 흐름에 의해 정량화으로 세포 계측법 (평균 ~ 75 % 할인, 30에서 최대 99 %까지) PDGFRβ을 발현하는 세포의 상당한 부분이 항상있다; 이러한 CD146, NG2 및 CD13과 같은 혈관 주위 세포의 다른 마커는 일반적으로 낮은 범위 (그림 1B)로 표현된다. 면역 세포 (그림 1A)에 의해 결정 마찬가지로 SMA는 배양 된 세포의 작은 부분 모집단으로 표현된다. 통로 0 (P0)에서, <보통 CD34 양성 내피 세포의 10 %가, 그 수는 더 계대로 검출 아래 감소. 마찬가지로, astrocytES는 이전 구절에서만 무시할 오염을 포함한다. 또한, 신경 줄기 세포, 신경 세포, 또는 희소 돌기 아교 세포의 표지에 얼룩 된 셀은 일반적으로 없습니다. 면역 세포 화학 및 유동 세포 계측법 데이터가 완전히 정량적 RT-PCR (7)에 의해 뒷받침된다. 결론적으로, 문화 내에서 가장 큰 분수는 단백질과 혈관 주위 세포의 mRNA가 특성을 표현한다. 주연 세포 유래의 세포에 대한 추가 농축이 단계에서 FACS에 의해 달성 될 수있다. PDGFRβ 발현의 수준에 의해 반영된 바와 같이 배양 순도 스펙트럼의 하단에있는 경우에 특히 적합하다. FAC - 종류 특히 혈관 주위 세포 (그림 1C)에, 어떤 CD34 양성 오염 물질을 제외하는 동안 따라서, 우리는, PDGFRβ에 대한 항체 (CD140b) 단독으로 또는 반대로 CD146 항체와 결합을 활용했다.
만 리포터 유전자를 인코딩 제어 바이러스 이러한 문화를 형질 도입, 자신의 마커의 발현 (P)를 변경하지 않습니다프로이 세포가 혈관 주위 세포의 혈통에 남아 있음을 나타냅니다 (전달 다음 3~4주 평가). 마찬가지로, 혼자 SOX2의 레트로 바이러스 매개로 표현 형태에 어떤 명백한 변화가 발생하거나 혼자 SOX2가 운명의 전환을 유도하기에 충분하지 않습니다 것을 제안 빌 - tubulin의 발현을 유도하지 않습니다. 대조적으로, 세포의 낮은 비율 (약 10 %) 그러나 신경원 형태를 취득하지 않고, ascl1 부호화 레트로 바이러스 단독 전시 βIII-튜 불린 식 형질. 놀랍게도, 모든 SOX2 및 ascl1-cotransduced 세포의 약 50 %는 βIII-tubulin의 표정을 보여 더욱 중요한 것은, (자신의 두 기자의 표현에 의해 시각)이 이중 형질 세포의 세 번째는 (그림 2)의 연결 프로세스를 표시합니다. 신경 기능의 인수와 함께, PDGFRβ의 발현은 7 하향 조절된다. 문화에 더욱 성숙으로, SOX2 및 ascl1-coexpressing 세포는 또한 immun가(주로 신경 세포의 시체를 염색) 더 성숙한 신경 세포 마커 (돌기 프로세스를 염색) MAP2와 노이 앤에 oreactive. 마커의 발현이 변화 아래 논의 된 바와 같이 또한 신경 세포의 전기 생리학 특징 중의 취득과 상관 관계. 결론적으로, 이러한 데이터는 PdiNs이라 기능에 혈관 주위 세포에서 파생 된 세포의 직접적인 운명 변환에 대한 증거를 제공한다. 이 PdiNs는 배아 마우스 대뇌 피질의 신경 세포와 공 배양 실험에서 계시 된 기능 시냅스 구획을 설정하는 능력을 가지고있다. 이 능력은 시냅스 입력의 모습 (아래 설명 참조)뿐만 아니라 (기공 신경 전달 물질의 수송, 예를 들면 vGluT1 면역 반응의 클러스터 특징) 공동 배양 한 신경 세포에서 파생 된 시냅스 터미널 PdiNs의 돌기 프로세스의 장식 electrophysiologically 입증 할 수 있습니다. 이러한 데이터는 상기 뉴런 C에 통합 PdiNs의 능력을 나타낸다ircuits.
그림 1. 성인의 대뇌 피질에서 파생 된 문화 혈관 주위 세포 마커의 유형이 식입니다. A) 면역 세포에 의해 계시 된 혈관 주위 세포 마커 (PDGFRb, SMA, CD146)의 유형이 다른 표정을 보여주는 형광 현미경 사진. 스케일 바 = 50 μm의. B) 히스토그램은 다른 환자 파생 된 문화의 흐름 세포 계측법에 의해 결정되는 혈관 주위 세포 마커 PDGFRβ (CD140b), CD13, 및 CD146에 양성 세포의 상대적인 수를 요약 한 것입니다. CD34는 내피 세포의 마커입니다. 이후의 재 프로그래밍에 빨간색 상자로 강조를 두 번 긍정적 인 혈관 주위 세포 ()의 정렬에 이소 제어 및 CD146 / CD140b 얼룩진 인간의 세포를 묘사 C) FACS 도트 플롯. 높은 PDGFRβ 표현의 속도와 참고이 특정 문화에 CD146의 발현과 관련하여 이질.
. 실험 장치 :. 인 인기로 성인의 혈관 주위 세포에서 파생 된 세포의 그림 2 프로그램을 다시 만들. 아래 : 레트로 바이러스 인코딩 SOX2-IRES-GFP 및 ascl1-IRES-DsRed를 형질 도입 세포를 묘사하는 형광 현미경 사진. 만 두 형질 세포 (화살촉)이 빌 - 튜 블린 (오른쪽 패널)을 표현하고 신경 세포의 형태를 전시합니다.
| 세포 분열 [%] | 세포의 죽음 [%] | 빌 - 튜 불린 + [%] | |
| 36 | 3 | 0 | |
| SOX2 | 46 | 7 | 0 |
| Ascl1 | 26 | 33 | 7 |
| SOX2-Ascl1 | 3 | 36 | 25 |
연속 라이브 영상에 의해 평가 PdiNs로 변환을 겪고 혈관 주위 세포에서 파생 된 세포의 표 1. 행동. SOX2 및 Ascl1 세포 출구 세포주기를 공동으로 표현합니다. 또한, Ascl1 또는 SOX2 및 Ascl1 - 동시 발현 다음 세포 죽음의 높은 비율을 확인합니다. 계정에 이러한 별개의 세포 사건을 가지고, 모든 공동 형질 세포의 약 25 %는 기능이됩니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
본 프로토콜은 체외 확장과 농축 혈관 주위 세포에서 파생 된 세포의 성인 인간의 대뇌 피질에서 분리 다음과 신경성 전사의 레트로 바이러스 매개로 표현하여 기능에 후속 변환 SOX2 및 Ascl1 요인에 대해 설명합니다. 이러한 프로토콜은 궁극적으로 성인 뇌의 생체 설정으로이 직접 변환 방식을 번역하는 마음에서 목표로, 잠재적으로 glia의 신경에 두뇌 상주 세포의 혈통 변환 등을 연구하기 위해 체외 시스템에서 실험을 제공합니다.
기술적 고려 사항
우리의 연구에서 우리는 남녀 모두에서, 19 ~ 70 세 사이의 환자에서 인간의 뇌 조직을 이용했다. 우리는 성별이나 연령 7에 따라 프로그램을 다시 만들 효율의 명백한 차이를 통지하지 않았다. 그럼에도 불구하고 그것은 미묘한 차이가있을 수 있습니다 그럼에도 불구하고이 정보를 문서화하는 것이 좋습니다우리의 관심을 탈출 한 것을 관찰했다.
그것은 더 이상 연구실로 조직 샘플의 전송 다음 가능한 한 빨리 처리를 시작하는 것이 좋습니다. 조직이 실험자로 전송하기 전에 수술 방에 남아있는 얼마 동안 반드시 어떤 미지수가있을 것입니다. 우리는 배양 과정의 시작에 환자의 뇌에서 제거까지의 시간 7 연구에서 샘플을 얼음에 모든 시간을 유지되는, 2-6 사이의 시간을 원거리 것으로 추정된다. 후속 처리도 불리한 결과의 용이성에 명백한 차이는이 시간 창 내에서 발견되지 않았다.
모든 프로토콜에 대한 중요한 평가는 단순, 재현성 및 효율성에 관한 것이다. 본 프로토콜은 제 1 위상 동안 그 셀에 간단 두 전사 FA만을 사용하여 세포 리 프로그래밍의 두 번째 단계 뒤에 용이하게 얻을 수있다 저렴 매체로 확장된다정의 매체 ctors 및 배양.
재현성에 대하여, 우리는 레트로 바이러스 제제의 품질이 종종 프로그래밍의 실패로 인해 높은 역가의 바이러스 감염성 입자의 수가 일치하도록 희석에 사용 된 낮은 역가 바이러스 제제로, 극히 중요하다 것을 관찰했다. 사실 우리는 높은 역가의 바이러스를 사용하는 경우 프로그램을 다시 만들 이전에 실패했다하는 같은 혈관 주위 세포 배양이 성공적으로 기능으로 전환 될 수 있음을 지적했다.
변환 효율에 대하여, 우리는 지속적으로 라이브 영상을 사용하여 SOX2 및 ascl1-cotransduced 세포에서 파생 된 βIII-tubulin의 양성 세포의 수를 평가했다. 라이브 영상 생성 기능의 수가 단지 실험 종료 시점에서 결정될 때 그러한 정보가 부족한 반면, 변환 과정 동안 세포 분열 또는 세포 사망을 겪는 세포의 수를 평가하기 위해 허용한다. 사실 시간 경과 비디오 마이크로를 사용하여복사본이 untransduced 단일 요인 형질 세포가 SOX2 및 ascl1-cotransduced 세포가 빠르게 세포주기를 종료하는 동안, 증식 계속 관찰되었다 (절차는 오르테가 전자 t 알. 8 참조). 또한, 후자의 인구의 상당 부분은 세포 사멸을 겪는다. 레트로 바이러스의 독성이 공식적으로 우리의 연구 7에서 얻은 데이터에서 제외 할 수는 없지만 ascl1이 (단독으로 또는 SOX2와 함께)로 표현 된 경우에만, 세포 죽음을 증가하는 사실이 관찰되었다, 우리는 세포 운명의 치명적인 충돌에 대한 증거로이 해석 . 계정에이 두 가지 이벤트를 가지고, 우리는 모든 SOX2 및 ascl1-cotransduced 세포의 25 %가 빌 - tubulin에 긍정적 인 (표 1)로 변환하는 것이 예상된다.
공동 형질 도입이 절대적 성공적인 프로그래밍을 위해 필요한 경우에, 하나는 동일 양쪽 요소를 발현하는 세포의 양을 최적화하는 바이러스 벡터 부호화 둘 유전자를 이용하는 고려할 수시간.
최근 Ladewig 등은. 글리코겐 신타 제 키나제-3β의 작은 분자 기반의 억제를 사용하고 SMAD 9 신호 200 %의 수익률을 얻는 기능에 섬유 아 세포의 효율적인 변환을위한 프로토콜을 개발했다. 그것은 우리의 프로토콜에 대한 이러한 추가 기능은 PDIN 생산의 수율을 향상 여부를 확인하는 흥미로운 일이 될 것이다.
프로그래밍 프로세스의 라이브 영상의 또 다른 흥미로운 결과는 기능으로 성인의 혈관 주위 세포의 전환 마우스 유래의 4 가지 체세포 배양있는 유사 프로그래밍 프로토콜에 비해 다소 느린 템포로 발생한다는 사실에 관한 것이다. 이것은 인간 뉴런 (10)의 느린 성숙 특성과 일치한다.
우리가 체계적 PDIN 생산의 수율에 대한 산소 분압의 영향을 분석되지 않은 동안, 우리는 일반적으로 언급이 저산소 조건 (5 %)에서 인큐베이션정상 산소 상태 (21 %)에서 세포를 배양에 비해 우수한 결과를 주었다. 최근, 다 빌라 등 알. 인간 섬유 아세포 (11)로부터 기능의 유도에 대한 감소 된 산소 장력에 의해 비슷한 강화 효과를 설명했다.
다른 직접 변환 프로토콜을 유도 렌티 바이러스 벡터 1, 12, 13을 사용 반면 우리의 프로토콜은 SOX2 및 ascl1의 레트로 바이러스 전달을 기반으로합니다. 최근에 우리는 또한 성공적으로 SOX2 및 Ascl1 표현의 상대적으로 짧은 펄스 (10 일) 혈관 주위 세포 간 신경 세포의 변환을 일으키는 원인이 충분하다는 것을 나타내는, SOX2 및 ascl1을 인코딩 독시사이클린 (doxycycline) 유도 렌티 바이러스 구조를 적용했습니다. 우리의 연구 7에 사용되는 레트로 바이러스가 감소 5 입을 위해 설계되었습니다. 따라서, 우리는 리포터 유전자의 발현없는 신경 세포의 모양을 통보하지 않았다. 그러나, 가능성이 유전자 둘 다의 전체적인 발현시간이 지남에 따라의와 기자 변화는 제외 할 수 없습니다. (센다이 바이러스를 이용하는) 통합없는 접근법 요즘 유도 된 신경 전구 세포 (14)의 발생의 경우에 고용되어 있지만 현재이 또는 바이러스가없는 프로그래밍 전략이 성공적으로 인간의 혈관 주위 세포를 변환하기 위해 적용 할 수 있는지 여부를 알 수 없습니다. 마지막으로, 다른 조직에서 파생 된 혈관 주위 세포가 유도 된 신경 세포 유형으로 변환을받을 수 있는지 여부를 검사 할 남아 있습니다.
개념의 고려 사항
기능에 체세포의 재 프로그램의 중요한 결과는 기능 (15)에 관한 것이다. 우리는 프로그래밍 과정의 발병 다음과 같은 서로 다른 시간 지점에서 PdiNs의 전기 생리학 특성을 평가했다. 초기 단계에서, 레트로 바이러스 전달 다음 즉, 1 주,이 단계에서 βIII-tubulin의 발현에도 불구하고 전기 흥분의 PdiNs 전시 거의 표시. 따라서, 대부분전기 생리학 분석은 SOX2 및 ascl1로 전달 다음 4~8주 실시했다. Karow 등.에서 설명한 바와 같이 높은 입력 저항과 행동 가능성 발사의 낮은 주파수에 의해 반영, PdiNs는 상당한 미숙을 특징으로한다. 또한 성숙 마우스 E14 대뇌 피질에서 파생 된 신경 세포와 공동 배양 PdiNs에 의해 촉진 될 수있다. 이러한 조건 하에서, PdiNs 높은 활동 전위의 주파수 증가 나트륨 전류 7을 나타낸다. 또한, 공동 배양 마우스의 뉴런에서 시냅스 기능의 입력을받을 수 PdiNs의 능력을 보여준다. 요컨대, PdiNs 더 다른 신경 세포와 공동 배양에 향상 될 수있다 기능적 신경 세포의 특성을 획득. 그러나 PdiNs 또한 기능적 연접 구획을 확립 할 수 있는지 여부를 나타낸 것으로 남아있다. 뇌에 PdiNs 이식 추가 연구가 전체 성숙과 기능에 도달하는 그들의 잠재력을 나타 내기 위해 필요합니다.
유우리는 결과 PdiNs은 GABA 성 신경 세포 7의 기능을 획득 주목 프로그램을 다시 만들 요인으로 SOX2 및 ascl1 노래. 흥미롭게도, 또 다른 그룹은 현상 INS는 글루타메이트 성, 도파민 성 및 콜린성 표현형 1, 16-18으로 뚜렷한 신경 전달 물질의 사양을 획득, 그 결과 다른 전사 인자 및 / 또는 마이크로 RNA의 조합을 이용하여 기능에 섬유 아세포를 변환하는 프로토콜을 개발했다. 그것은 섬유 아 세포에서 사용되는 요인 조합 PdiNs에서 동일한 송신기 ID를 유도하는지 여부를 테스트 할 남아있다. 더욱이, 최근의 연구는 신경 줄기 세포를 19, 20 또는 신경교, 특히 올리고 덴드로 21, 22을 생성하는 신경 넘어 변환 스펙트럼을 확대하고있다. 이 프로그램을 다시 만들 프로토콜 성인의 뇌 혈관 주위 세포에서 파생 된 세포에서 비슷한 결과를 이끌어내는 경우이 크게이 수입의 응용 프로그램의 파노라마를 확대 할개미의 뇌 상주 세포 유형.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
우리는이 프로토콜을 개발하는 동안 그녀의 입력을위한 박사 막달레나 Götz가에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 관대 SOX2의 코딩 서열을 저희에게 제공하는 박사의 Marius Wernig (스탠포드 대학) 감사합니다. 우리는 또한 바이러스 생산을위한 박사 알렉산드라 Lepier에 매우 감사하고 있습니다. 이 작품은 독일 Forschungsgemeinschaft (4182/2-2 BE)와 BMBF (01GN1009A) BB, 그리고 과학의 바이에른 주 정부, 연구 및 MK와 BBCS에 예술이 양국 SYSTHER-로부터받은 자금의 보조금에 의해 지원되었다 INREMOS 가상 연구소 (교육과 연구의 독일과 슬로베니아어 연방 부처) 및 DFG (SFB 824).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-CD140b-PE | BD Biosciences | 558821 | use 1:100 |
| anti-CD146-FITC | AbD Serotec | MCA2141FT | use 1:100 |
| anti-CD13-FITC | AbD Serotec | MVA1270A488T | use 1:100 |
| anti-CD34-APC | BD Biosciences | 560940 | use 1:100 |
| anti-PDGFRβ | Cell Signaling | 3169S | use 1:200 |
| anti-CD146 | Abcam | Ab75769 | use 1:400 |
| anti-NG2 | Millipore | AB5320 | use 1:400 |
| anti-SMA | Sigma-Aldrich | A2547 | use 1:400 |
| anti-βIII-tubulin | Sigma-Aldrich | T8660 | use 1:400 |
| anti-MAP2 | Sigma-Aldrich | M4403 | use 1:200 |
| anti-GFAP | Sigma-Aldrich | G3893 | use 1:600 |
| anti-GFP | Aves Labs | GFP 10-20 | use 1:1,000 |
| anti-RFP | Chromotek | 5F8 | use 1:500 |
| anti-S100β | Sigma-Aldrich | S2532 | use 1:300 |
| anti-NeuN | Millipore | MAB377 | use 1:200 |
| anti-GABA | Sigma-Aldrich | A2052 | use 1:500 |
| anti-Calretinin | Millipore | AB5054 | use 1:500 |
| anti-vGluT1 | SYnaptic SYstems | 135511 | use 1:1,000 |
| Rat IgG1 isotype control FITC | AbD Serotec | 11-4301-81 | use 1:100 |
| Rat IgG1 isotype control PE | AbD Serotec | 12-4301-81 | use 1:100 |
| Rat IgG1 isotype control APC | AbD Serotec | 17-4301-81 | use 1:100 |
| TrypLE | Invitrogen | 12605-010 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Invitrogen | 61965 | |
| B27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10106-169 | perform heat inactivation by incubation at 56 °C for 30 min |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) | Invitrogen | 24020-091 | |
| Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1x) | Invitrogen | 14190 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| PFA (paraformaldehyde) | Sigma-Aldrich | P1648 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| DAPI (4′,6-Diamidin-2-phenylindole) dilactate | Sigma-Aldrich | 042M4005 | |
| Aqua-Poly/Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap | BD Biosciences | 352235 | |
| 24-well plates | Orange Scientific | 5530305 | |
| 75 cm2 culture flasks | Greiner Bio-One | 658175 | |
| 25 cm2 culture flasks | Greiner Bio-One | 690175 | |
| Disposable pipettes 10 ml | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| Glass Pasteur pipettes (150 mm) | Fisherbrand | FB50251 | |
| Glass coverslips 12 mm diameter | Menzel | CB00120RA1 | |
| Surgical disposable scalpels | B. Braun | 5518083 | |
| Tissue culture dishes | Greiner Bio-One | 633180 | |
| Conical tubes 15 ml | BD Biosciences | 352095 | |
| Laminar flow hood | |||
| Centrifuge and swing-out rotor with adapters for 15 ml and 50 ml tubes | Hettich Lab Technology | 1406 | |
| Flow cytometry cell sorter: FACSAria l with FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| Humified cell culture incubator | Eppendorf Galaxy 170R | ||
| Wather bath at 37 °C | |||
| FACSFlow sheath fluid | BD Biosciences | 342003 | |
| Epifluorescence microscope BX61 | Olympus | ||
| Confocal microscope LSM710 | Zeiss |
References
- Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476, 224-227 (2011).
- Kim, J., et al. Functional integration of dopaminergic neurons directly converted from mouse fibroblasts. Cell stem cell. 9, 413-419 (2011).
- Duan, B., et al. Interactions between water deficit, ABA, and provenances in Picea asperata. Journal of experimental botany. 58, 3025-3036 (2007).
- Heinrich, C., et al. Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons. PLoS Biol. 8, (2010).
- Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nat Protoc. 6, 214-228 (2011).
- Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. , (2007).
- Karow, M., et al. Reprogramming of pericyte-derived cells of the adult human brain into induced neuronal cells. Cell stem cell. 11, 471-476 (2012).
- Ortega, F., et al. Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level. Nat Protoc. 6, 1847-1859 (2011).
- Ladewig, J., et al. Small molecules enable highly efficient neuronal conversion of human fibroblasts. Nat Methods. 9, 575-578 (2012).
- Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77, 440-456 (2013).
- Davila, J., Chanda, S., Ang, C. E., Sudhof, T. C., Wernig, M. Acute reduction in oxygen tension enhances the induction of neurons from human fibroblasts. J Neurosci Methods. 216, 104-109 (2013).
- Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463, 1035-1041 (2010).
- Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 10343-10348 (2011).
- Lu, J., et al. Generation of Integration-free and Region-Specific Neural Progenitors from Primate Fibroblasts. Cell Rep. 3, 1580-1591 (2013).
- Yang, N., Ng, Y. H., Pang, Z. P., Sudhof, T. C., Wernig, M. Induced neuronal cells: how to make and define a neuron. Cell Stem Cell. 9, 517-525 (2011).
- Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476, 220-223 (2011).
- Yoo, A. S., et al. MicroRNA-mediated conversion of human fibroblasts to neurons. Nature. 476, 228-231 (2011).
- Son, E. Y., et al. Conversion of mouse and human fibroblasts into functional spinal motor neurons. Cell Stem Cell. 9, 205-218 (2011).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 2527-2532 (2012).
- Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10, 473-479 (2012).
- Yang, N., et al. Generation of oligodendroglial cells by direct lineage conversion. Nat Biotechnol. 31, 434-439 (2013).
- Najm, F. J., et al. Transcription factor-mediated reprogramming of fibroblasts to expandable, myelinogenic oligodendrocyte progenitor cells. Nat Biotechnol. 31, 426-433 (2013).
