Summary
Inriktning hjärn bosatt celler för direkt härstamning-omprogrammering ger nya perspektiv för hjärnans reparation. Här beskriver vi ett protokoll för hur man förbereder kulturer anrikade för hjärn bosatt pericyter från den vuxna människans hjärnbark och omvandla dessa till inducerade nervceller genom retrovirus-medierad uttryck av transkriptionsfaktorer Sox2 och Ascl1.
Abstract
Direkt härstamning-omprogrammering av icke-neuronala celler in inducerade nervceller (INS) kan ge insikter i de molekylära mekanismerna bakom neurogenes och möjliggöra nya strategier för in vitro-modellering eller reparera den sjuka hjärnan. Identifiera hjärnan bosatt icke-neuronala celltyper kan bli föremål för direkt omvandling till Ins kan medge att lansera en sådan strategi på plats, dvs inom den skadad hjärnvävnad. Här beskriver vi ett protokoll som utvecklats i ett försök att identifiera celler som härrör från den vuxna mänskliga hjärnan att uppfylla denna förutsättning. Detta protokoll omfattar: (1) odling av humana celler från hjärnbarken erhållet från adulta humana hjärnan biopsier; (2) expansion in vitro (cirka kräver 2-4 veckor) och karakterisering av kulturen genom immuncytokemi och flödescytometri; (3) anrikning av fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) med användning av anti-PDGF-receptor-β-och anti-CD146-antikroppar;(4) retrovirus-medierad transduktion med neurogen transkriptionsfaktorer Sox2 och ascl1; (5) och slutligen karakterisering av de resulterande pericyte-derived inducerade nervceller (PdiNs) genom immunocytokemi (14 dagar till 8 veckor efter retroviral transduktion). I detta skede kan Ins sonderas för sina elektriska egenskaper av patch-clamp inspelning. Protokollet ger en mycket reproducerbar förfarande för härstamning omvandling av hjärn hemvist pericyter i funktionella mänskliga ins in vitro.
Introduction
I motsats till omprogrammering av somatiska celler in i inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs), som i sin tur är utrustade med en uppsjö av differentieringspotentialer syftar direkt omprogrammering för rak omvandling av en specifik celltyp till en annan. När det gäller deras tillämpning i samband med sjukdomsmodellering och potentiella cellbaserade terapier, både omprogrammering tillvägagångssätt har specifika fördelar och nackdelar. Omprogrammering in iPSCs (i) ger en nästan oändlig källa av celler; (Ii) gör det möjligt för genteknik; (Iii) förser med en nästan obegränsad differentieringspotential. Emellertid stora olägenheter med iPSCs medföra risk för tumorigenicitet av de odifferentierade cellerna (teratom formation in vivo) och behovet av ex vivo-odling och för senare utplantering om dessa celler som skall användas för cellbaserade terapier. Omvänt är direkt härstamning-omprogrammering begränsas av lägre utbyte av de önskade cellernasom korrelerar direkt med antalet målceller i start befolkningen, men har den fördelen att härstamning-omprogrammerade celler, tycks uppvisa ingen tumörframkallande risk vid transplantation 1,2; dessutom kan direkt omprogrammering även uppnås på plats, det vill säga inom det organ där skulle behövas dessa celler och därmed undvika behovet av transplantation.
Med detta i åtanke, har vårt labb eftersträvas möjligheten till härstamning-omprogrammering hjärn bosatt celler i Ins som en ny strategi för cellbaserade terapier för neurodegenerativa sjukdomar. Hjärn bosatt celler som kan potentiellt betraktas som cellulära mål för härstamning-omprogrammering omfattar olika typer av macroglia (astrocyter NG2 celler och oligodendrocyter), mikroglia och mikrokärlsassocierade celler (endotelceller och pericyter). Vi har utförligt studerat omprogrammering potential astroglia av cerebral cor in vitrotex för tidig postnatal möss 3-5. På jakt efter samma sätt lämpliga cellkällor för direkt släktlinje-omprogrammering i den vuxna mänskliga hjärnan, vi stött på en cellpopulation som framgångsrikt kan programmeras in i ins och uppvisar kännetecken pericyter. Här beskriver vi ett protokoll för hur man skörda dessa celler från vuxna mänskliga hjärnan biopsier, för att utöka och berika dessa celler in vitro, och slutligen lyckats programmera om en betydande del av dessa in vitro-expanderade celler (i storleksordningen 25-30%) i ins. Omprogrammering kan uppnås genom samtidig retrovirus-medierad samexpression av två transkriptionsfaktorer, Sox2 och ascl1. Dessa PdiNs befanns förvärva förmågan av repetitiva aktionspotential bränning och att fungera som synaptiska mål för andra nervceller som anger deras förmåga att integreras i neurala nätverk. Vår protokoll ger en enkel procedur för isolering och härstamning konvertering av vuxna mänskliga hjärnan pericyter i ins.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Isolering och odling av vuxen människa hjärnceller
Försök med mänsklig vävnad bör utföras i enlighet med alla relevanta statliga och institutionella föreskrifter om användning av mänskligt material för forskningsändamål. Den nuvarande protokollet har utvecklats i enlighet med godkännande av den etiska kommittén vid medicinska fakulteten vid LMU München och skriftligt informerat samtycke från alla patienter.
Detta protokoll för att förbereda kulturer i mänskliga vuxna hjärnbarken har fastställts med hjälp av exemplar av patienter av båda könen lider av tinningloben epilepsi eller andra djupt rotade icke-traumatiska, icke-maligna lesioner. Vävnaden som erhålls från den kirurgiska rummet bestod uteslutande accesskanal till hjärnskada och därför anses vara hälsosamt. Åldersintervallet för patienterna var 19 till 70 år.
- Förbered tillväxtmedium genom att tillsätta värme-inaktiverat fetalt kalvserum(FCS) till DMEM med hög glukoshalt med GlutaMAX för erhållande av en slutkoncentration av 20% FCS. Tillsätt 5 ml penicillin / streptomycin till totalt 500 ml tillväxtmedium. Utför denna och alla efterföljande steg som kräver sterila odlingsbetingelser i en lämplig laminärt flöde huva.
- Håll den vuxna humana hjärnbiopsi erhållen från kirurgisk rum i Hanks balanserade saltlösning med CaCl2 och MgCl2 (HBSS) medium inklusive HEPES (10 mM slutlig koncentration) på is till dess bearbetning. Börja behandla så fort som möjligt.
- För att starta dissociation i enstaka celler, överför vävnaden i en 65 mm petriskål och finhacka i små bitar med hjälp av två sterila engångsskalpeller. För enzymatisk spjälkning använda 3-6 ml TrypLE i ett 15 ml koniskt rör och inkubera under 15-30 minuter vid 37 ° C i ett vattenbad.
- Lägg till en volym av förvärmt tillväxtmedium för att underlätta dissociation och försiktigt mal sönder lösning innehållande vävnadsbitar upp och ned genom att först användaen 5 ml engångspipett, följt av användning av en glas pasteurpipett tills homogenisering av cellsuspension. Vanligtvis några kvarvarande vävnadsbitar, mestadels bestående av vit substans, kommer att finnas kvar i suspensionen.
- Centrifugera ner vid 157 x g under 5 min och återsuspendera pelleten i en lämplig mängd tillväxtmedium (10 ml per obelagt T75 odlingskolv). Använd en T75 odlingskolv för en biopsi på 5-10 mm diameter i storlek och extrapolera från detta i händelse av större exemplar.
- Placera celler till en 37 ° C inkubator med 5% CO2 och 5% O2.
- Byt ut hälften av mediet var 3-4 dagar tills cellerna har nått sammanflytning. Det brukar ta upp till två veckor (kallad passage 0 [P0]).
2. In vitro Expansion och karakterisering av vuxen människa hjärnceller
- In vitro-expansionen:
- Aspirera odlingsmediet och tvätta med fosfatbuffrad saltlösning (PBS), som hölls vid rums-temperatur, innan du lägger 3 ml TrypLE.
- Inkubera vid 37 ° C under 5-10 min tills de flesta cellerna lossnat. Knacka försiktigt på kolvarna för att underlätta lyft av cellerna; efter tillsats av 3 volymer av odlingsmediet, överföra cellerna till ett 15 ml koniskt rör och spinn ner vid 157 x g under 5 min och resuspendera cellerna i lämplig mängd tillväxtmedium.
- Passage cellerna vid ett förhållande på 1:3 för optimal avkastning i nya T75 cellodlingsflaskor.
OBS: Vi har passe dessa celler till P5 utan några tecken på minskad effektivitet omprogrammering. Även på P0 kulturen innehåller en avsevärd andel av endotelceller (som bedöms av CD34 uttryck), vid efterföljande passager deras antal blir försumbar.
- Karakterisering av vuxna mänskliga hjärnan kulturer:
- Immuncytokemi:
- För karakterisering av celler, frö ~ 60.000 celler på poly-D-lysin-belagda täckglas i 500 l färska tillväxt medium i 24-brunnars vävnadsodlingsplattor och inkubera vid 37 ° C med 5% CO2 och 5% O2.
- För immunocytokemisk analys av odlade humana hjärnceller avlägsna mediet och tvätta 3x med 1 ml PBS.
- Fix-celler genom att tillsätta 500 pl av 4% paraformaldehyd i PBS under 15 min vid rumstemperatur.
- Överför glastäckglas i en lämplig befuktad färgningskammaren och blocket med 80 | il PBS innehållande 3% bovint serumalbumin (BSA) och 0,5% Triton X-100 under 1 timme vid rumstemperatur.
- Lägg primära antikroppar utspädda i samma lösning (för utspädningsfaktorer se tabell av specifika reagens och utrustning) och inkubera över natten vid 4 ° C eller 1 timme vid rumstemperatur.
OBS: En betydande men varierande andel av cellerna i detta skede av odling är immunoreaktiva för trombocytrelaterade tillväxtfaktorreceptor β (PDGFRβ), kluster av differentiering 146 (CD146), NG2 kondroitinsulfat Proteoglykanen, och glatt muskulatur aktin (SMA), dvs markörer karaktäristiska av mikrokärlsassocierade pericyter. Endast en minoritet (<1%) uttrycker astrogliala markörer gliafibrillärt surt protein (GFAP) och S100β. Dessutom, i detta skede kulturen ska sakna några celler som uttrycker neuronal markör βIII-tubulin. Använd flera kombinationer primära antikroppar för co-märkning av olika markörer. Ytterligare bekräftelse av uttrycket av gliaceller, neuronala, endotelceller och pericyte markörer kan erhållas genom omvänd transkription och kvantitativ realtid polymeraskedjereaktion (som inte beskrivs i detta protokoll). - Efter inkubation med de primära antikropparna tvätta tre gånger med 1 ml PBS och tillsätt de motsvarande sekundära antikroppar (i lämpliga utspädningar) till färglösningen och inkubera 1 timme vid rumstemperatur i mörker. Tvätta cellerna 3x med PBS. Om så krävs, före montering innefattar färgning med DAPI under 5 min vid rums-temperatur.
- Använd antifading monteringsmedium och analysera täckglas med användning av ett epifluorescensmikroskop eller ett konfokalmikroskop.
- Flödescytometri:
- För analys av ytan markör uttryck med hjälp av flödescytometri, odla celler till sammanflytning i obestruket T25 eller T75 cellodlingsflaskor.
- Drag av celler med hjälp av TrypLE såsom beskrivits tidigare och återsuspendera i färgningslösning bestående av PBS + 0,5% BSA. Per färgningsreaktion, resuspendera 100,000-200,000 celler i 100 l av färglösningen. Förbered enstaka färgreaktioner per antikropp som används (CD146-FITC, CD140b-PE, CD34-APC, CD13-FITC, respektive isotypkontroll antikroppar).
- Lägg fluorokromkonjugerade antikroppar till varje färgningslösning (för späd se tabell av specifika reagens och utrustning) direkt in cellsuspensionen och inkubera vid 4 ° C under 30 minuter i mörker.
- Tvätta cellerna tre gånger med 500 | il PBS och centrifugera ner mellan varjetvättsteg vid 157 xg under 5 min.
- Resuspendera cellpelleten i 0,5-1 ml färglösningen och överföra celler till en cell sil (70 mikrometer) till FACS rör. Skydda provet från exponering för ljus.
- Vortex prover innan de placeras i FACS instrumentet.
- För att analysera de levande celler och omfattar alla skräp och cellaggregat, grind för FSC-A och SSC-A. Cell duplets specifikt gated av FSC-A-och FSC-W. För att bestämma rätt grind villkoren för cellytemarkörer som grindarna med isotypmatchad antikroppskontroll konjugerad till respektive fluorokrom. Sedan bestämma andelen antikroppsbundna celler.
- Immuncytokemi:
3. Anrikning för Pericyte-härledda celler genom fluorescensaktiverad cellsortering
- Rena pericyte cellpopulation (suspenderade i tillväxtmedium) före transduktion via FACS sortering med hjälp av en 70 ìm munstycke. Använd CD34-APC i kombination med CD140b-PE och CD146-FITC att välja för pericyter. Sortera efter CD34-negativa, CD140b-och CD146-positiva celler.
- Samla de sorterade cellerna i tillväxtmedium och plattan på poly-D-lysin-belagda glastäckglas i 24-brunnars vävnadsodlingsplattor och inkubera vid 37 ° C med 5% CO2 och 5% O2.
- 48 timmar efter sortering ersätta mediet med färskt odlingsmedium och utföra transduktion som beskrivs i protokoll nr 4.
4. Retroviral Transduction av Pericyte-härledda celler och Omprogrammering in inducerade Nervceller
OBS: Se lokala biosäkerhet riktlinjer vid hantering av retroviruspartiklar. I Tyskland användningen av retrovirus som används här kräver skyddsnivå 2. För produktion av retroviruspartiklar hänvisar till protokoll 6. För retrovirala konstruktioner som används för omprogrammering, se Karow et al. (2012). Retrovirus var pseudotyped med VSV-G (vesikulär stomatit virus-glycoprotein) 5. För framställning se Gavrilescu m.fl. 6.
- 24 h före retroviral transduktion utsädes ~ 60.000 celler på poly-D-lysin-belagda glastäckglas i 500 | il färskt tillväxtmedium i 24-brunnars vävnadsodlingsplattor och inkubera vid 37 ° C med 5% CO2 och 5% O2 .
- Nästa dag byter tillväxtmediet med 500 l färska, förvärmt tillväxtmedium och tillsätt 1 l av respektive koncentrerade supernatanterna innehållande retroviruspartiklar (pCAG-IRES-DsRed för kontroll, särskilt under upprättande av protokollet i labbet), pCAG-ascl1 -IRES-DsRed, pCAG-Sox2-IRES-GFP.
- En dag senare, avlägsna mediet inklusive viruspartiklarna från cellerna och tillsätt 1 ml färsk, förvärmt B27-differentieringsmedium, som består av 49 ml DMEM höga glukos med GlutaMAX och 1 ml B27 serumfritt tillägg. Behåll cellerna i odling vid 37 ° C i 5% CO2 och 5% O2 för 4-8 veckor utan att ändra det medium som repetitiva medium ändras bli skadliga som ins mogna.
5. Karakterisering av inducerade Neuroner genom immuncytokemi
- För att bestämma den cellulära identiteten av de omvandlade celler, i synnerhet för att påvisa att förvärva en neuronal fenotyp, utföra immuncytokemi mot neuronala antigener såsom BIII-tubulin, MAP2, och Neun (för antikroppar och deras respektive utspädningar, se tabell över specifika reagenser och utrustning, följ samma förfarande som anges i 2.2.1).
- För att förbättra mognaden av PdiNs, co-kultur dessa celler med neuroner härledda från E14 mus hjärnbarken. För detta ändamål, dissekera hjärnbarken och dissociera vävnaden mekaniskt med en brand-polerat glas pasteurpipett. Lägg 10,000-50,000 murina nervceller att kulturer av pericyte-härledda celler 2-3 veckor efter transduktion med Sox2-och ascl1-kodning retroviruses och fortsatt odling. Omvandlade celler kan skiljas från murina nervceller genom sin reporter (GFP och dsRed) uttryck, antingen levande epifluorescence eller efter immuncytokemi för GFP och dsRed.
- För att bedöma bildandet av synapser på PdiNs av murina neuroner, utföra immuncytokemi mot vesikulär neurotransmittorreceptorer, t.ex. vesikulär glutamat transportör 1 (vGluT1).
- Probe omvandlade celler för deras elektriska egenskaper (dvs. förmåga att generera aktionspotentialer) och inrättandet av funktionella synapser med patch-clamp elektrofysiologi. För uppgifter om förfarandet se Heinrich et al. (2011).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det första resultatet av detta protokoll efter att framgångsrikt inrättande av en kultur från ett prov av vuxen människa hjärnbarken består i att identifiera de cellulära sammansättning av kulturen. Immuncytokemi för celltyp specifika proteiner avslöjar en betydande grad av heterogenitet mellan kulturer som härrör från exemplar av olika patienter (Figur 1A). Såsom kvantifieras genom flödescytometri finns det alltid en väsentlig fraktion av celler som uttrycker PDGFRβ (i genomsnitt ~ 75%, från 30 till upp till 99%); andra markörer för pericyter såsom CD146, NG2 och CD13 vanligen uttrycks i ett lägre intervall (Figur 1B). Likaså SMA är uttryckt i en mindre subpopulation av de odlade cellerna, såsom bestäms genom immuncytokemi (Figur 1A). Vid passage 0 (P0), finns det vanligtvis <10% av CD34-positiva endotelceller, och deras antal avtar under detektions med ytterligare passage. Likaså astrocytes omfattar endast en obetydlig förorening vid tidigare passager. Vidare finns det typiskt inga celler som färgas för neural stamcell, neuronal eller oligodendrocyt-markörer. Immunocytokemisk och flödescytometri uppgifterna är fullständigt bekräftas genom kvantitativ RT-PCR 7. I summa, den största fraktionen inom kulturen uttrycker proteiner och mRNA karakteristiska för pericyter. En ytterligare anrikning för pericyte härledda celler kan uppnås genom FACS på detta stadium. Detta är särskilt relevant när renheten av kulturen är vid den nedre änden av spektrumet som reflekteras av nivån av PDGFRβ expression. Sålunda har vi använt en antikropp mot PDGFRβ (CD140b) enbart eller i kombination med en anti-CD146-antikropp, medan exklusive alla CD34-positiva föroreningar, till FAC-sorterings specifikt pericyter (Figur 1C).
Transduktion dessa kulturer med kontroll virus som kodar en reporter bara gen, inte förändrar sin markör uttryck profile (bedöms 3-4 veckor efter transduktion), vilket indikerar att dessa celler kvar i pericyte härstamning. Likaså gör retrovirus-medierad uttryck för Sox2 ensamt inte leda till några uppenbara förändringar i morfologi eller inducerar BIII-tubulin uttryck antyder att Sox2 ensam inte är tillräcklig för att framkalla en öde konvertering. Däremot en låg andel (cirka 10%) av cellerna omvandlas med en ascl1-kodning retrovirus enbart utställning βIII-tubulin uttryck, dock utan att förvärva en neuronal morfologi. Påfallande, nästan 50% av alla Sox2-och ascl1-cotransduced celler visar βIII-tubulin uttryck och ännu viktigare, en tredjedel av dessa dubbel-omvandlade celler (visualiseras genom sin dubbla reporter uttryck) visar också neuronala processer (Figur 2). Tillsammans med förvärvet av neuronala funktioner, är uttryck för PDGFRβ nedregleras 7. Med ytterligare mognad i kultur, Sox2-och ascl1-samuttrycker celler blir också immunoreactive för de mer mogna neuronala markörer MAP2 (färgning dendritiska processer) och Neun (färgning övervägande neuronal cell organ). Som diskuteras nedan dessa förändringar i markör uttryck också korrelerar med förvärvet av elektrofysiologiska kännetecken av nervceller. Sammanfattningsvis visar dessa data tillhandahåller bevis för direkt ödet omvandling av pericyte härledda celler in i ins, kallad PdiNs. Dessa PdiNs besitter kompetens att inrätta funktionella postsynaptiska fack som avslöjas i samodling experiment med nervceller i embryonala musen hjärnbarken. Denna kompetens kan påvisas elektrofysiologiskt i uppkomsten av synaptiska ingångar (se nedan) samt utsmyckning av dendritiska processer PdiNs med presynaptiska terminaler som härrör från co-odlade nervceller (kännetecknas av kluster av vesikulär signalsubstanstransportörer, t.ex. vGluT1 immunreaktivitet). Dessa data indikerar förmåga PdiNs att integrera i neuronal c vidareircuits.
Figur 1. Heterogena expression av pericyte markörer i kulturer härledda från vuxen human cerebral cortex. A) Fluorescerande mikrofotografier som illustrerar den heterogena uttryck för pericyte markörer (PDGFRb, SMA, CD146) vilket framgår av immunocytokemi. Scale bar = 50 | im. B) Histogrammet sammanfattas de relativa antalet celler positiva för pericyte markörer PDGFRβ (CD140b), CD13 och CD146 som bestäms genom flödescytometri av olika patienthärledda kulturerna. CD34 är en markör för endotelceller. C) FACS punktdiagram som visar isotypkontroll-och CD146 / CD140b-färgade humana celler för sortering av de dubbel positiva pericyter (markerade med röda rutan) för efterföljande omprogrammering. Notera den höga hastigheten av PDGFRβ uttryck ochheterogenitet med avseende på CD146-uttryck i denna särskilda kultur.
. Figur 2 Omprogrammering av vuxna humana pericyte härledda celler in ins Topp:. Försöksuppställningen. Nedan: Fluorescerande mikrofotografier föreställande celler omvandlade med retrovirus kodning Sox2-IRES-GFP och ascl1-IRES-DsRed. Observera att endast dubbel omvandlade celler (pilspetsar) uttrycker BIII-tubulin (högra panelen) och uppvisar neuronal morfologi.
| celldelning [%] | celldöd [%] | BIII-tubulin + [%] | |
| 36 | 3 | 0 | |
| Sox2 | 46 | 7 | 0 |
| Ascl1 | 26 | 33 | 7 |
| Sox2-Ascl1 | 3 | 36 | 25 |
Tabell 1. Beteende av pericyte-härledda celler som genomgår omvandling till PdiNs enligt bedömning av kontinuerlig live-avbildning. Observera att Sox2-och Ascl1 co-uttryckande celler exit cellcykeln. Dessutom, notera den höga celldöd efter Ascl1 eller Sox2 och Ascl1-samuttryck. Med hänsyn till dessa olika cellulära händelser, ungefär 25% av alla sam-transducerade celler bli ins.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nuvarande protokollet beskriver expansionen in vitro och anrikning av pericyte-härledda celler efter isolering från den vuxna mänskliga hjärnbarken och den efterföljande omvandling till INS genom retrovirus-medierad uttryck för neurogen transkriptionsfaktorer Sox2 och Ascl1. Ett sådant protokoll ger en experimentell in vitro-system för att studera släktlinje-konvertering av hjärn bosatt celler i nervceller och potentiellt även glia, med målet i åtanke att slutligen översätta denna direkt omvandling strategi i vivo inställningen i den vuxna hjärnan.
Tekniska överväganden
I vår studie utnyttjade vi mänsklig hjärnvävnad från patienter i åldrarna mellan 19 och 70 år, från båda könen. Vi märkte inte en uppenbar skillnad i omprogrammering effektivitet beroende på kön eller 7 års ålder. Det är dock rekommenderat att dokumentera denna information som mer subtila skillnader kan ändå varaobserverat att undgått vår uppmärksamhet.
Det rekommenderas vidare att börja behandla så tidigt som möjligt efter överlåtelse av vävnadsprovet till labbet. Det blir nödvändigtvis vissa okända för hur länge vävnaden har varit i den kirurgiska rummet före överföring till experimentalist. Vi bedömer att det i vår studie 7 tiden mellan avlägsnande från patientens hjärna till början av odlingsförfarandet varierade mellan 2-6 timmar, med proverna hålls hela tiden på isen. Ingen uppenbar skillnad i hur lätt det efterföljande behandling inte heller några negativa utfall noterades inom detta tidsfönster.
En kritisk bedömning för alla protokoll gäller dess enkelhet, reproducerbarhet, och effektivitet. Det nuvarande protokollet är enkelt i att under en första fas cellerna expanderas i en billig medium som lätt kan erhållas, följt av en andra fas av cell omprogrammering med hjälp av endast två transkriptions factors och odling i ett definierat medium.
Beträffande reproducerbarhet, konstaterade vi att kvaliteten på den retrovirus förberedelse är av yttersta vikt, med låg titer viruspreparat som används vid spädningar för att matcha antalet infektiösa partiklar av hög titer virus ofta resulterar i fel på omprogrammering. I själva verket konstaterade vi att samma pericyte kultur där omprogrammering hade misslyckats tidigare kunde framgångsrikt omvandlas till program när du använder höga titer virus.
När det gäller effektiviteten i omvandlingen, har vi bedömt att antalet βIII-tubulin-positiva celler från Sox2-och ascl1-cotransduced celler med hjälp av kontinuerlig live-avbildning. Live avbildning möjliggör för bedömning av antalet celler som genomgår celldelning och celldöd under konverteringen, medan sådan information saknas, om antalet genererade Ins bestäms endast vid slutpunkten av experimentet. Faktum är att med hjälp av time-lapse video microsexemplar (för förfarandet avser Ortega e t al. 8) konstaterades att otransducerade och enskild faktor-omvandlade celler fortsätter föröka, medan Sox2-och ascl1-cotransduced celler avsluta snabbt cellcykeln. Dessutom är en större del av den senare populationen undergår celldöd. Även retrovirus toxicitet inte formellt kan uteslutas från de data som erhållits i vår studie 7, var det faktum att ökad celldöd observerats endast vid ascl1 uttrycktes (enbart eller i kombination med Sox2), vi tolkar detta som bevis för en katastrofal konflikt cellöden . Med dessa två händelser i beaktande, uppskattar vi att 25% av alla Sox2-och ascl1-cotransduced celler omvandlas till BIII-tubulin positiva ins (tabell 1).
Som co-transduktion är absolut krävs för framgångsrik omprogrammering, kan man överväga användning av ett virusvektor som kodar båda generna för att optimera mängden av celler som uttrycker båda faktorer vid sammatid.
Nyligen, Ladewig et al. Utvecklat ett protokoll för effektiv omvandling av fibroblaster i ins erhåller en avkastning på 200% med hjälp av små molekyler baserad hämning av glykogensyntaskinas-3β och SMAD signalering 9. Det ska bli intressant att avgöra huruvida dessa tillägg till våra protokoll förbättra utbytet av PdiN produktion.
Ett annat intressant resultat av levande avbildning av omprogrammering processen gäller det faktum att omvandlingen av vuxna humana pericyter i INS sker vid en ganska långsamt tempo jämfört med liknande omprogrammering protokoll i kulturer av olika somatiska celler av musursprung 4. Detta överensstämmer med den karakteristiska långsam mognad av humana neuroner 10.
Även om vi inte har systematiskt analyserat effekterna av syrespänning på avkastningen av PdiN produktion, noterade vi att inkubation i låga syreförhållanden (5%) i allmänhetgav överlägsna resultat jämfört med odling av cellerna i normoxiska förhållanden (21%). Nyligen Davila et al. Beskrev en liknande ökad påverkan av minskad syrespänning för induktionen av INS från humana fibroblaster 11.
Vår protokoll bygger på retroviral leverans av Sox2 och ascl1 medan andra direkta omvandlingsprotokoll har anställt inducerbara lentivirusvektorer 1, 12, 13. På senare tid har vi också framgångsrikt tillämpats doxycyklin-inducible Lentiviral konstruktioner som kodar Sox2 och ascl1, vilket tyder på att en relativt kort puls (10 dagar) i Sox2 och Ascl1 uttryck är tillräcklig för att orsaka pericyte-till-neuron konvertering. De retrovirus som användes i vår studie 7 utformades för minskad tysta 5. Därför har vi inte märker det utseendemässigt av nervceller saknar reporter genuttryck. Möjligheten att de totala uttrycksnivåer av både transgens och reporter förändring över tid kan inte uteslutas. Integration fria metoder (som använder Sendai virus) har nyligen anställd vid generering av inducerade neurala stamceller 14, men det är för närvarande inte känt om detta eller ens virusfria omprogrammering strategier kan med framgång användas för att omvandla mänskliga pericyter. Slutligen, om pericyter som härrör från andra vävnader kan undergå omvandling till inducerade nervcelltyper återstår att testas.
Begrepps Överväganden
En kritisk resultatet av omprogrammering av somatiska celler i Ins rör deras funktion 15. Vi har utvärderat de elektrofysiologiska egenskaperna hos PdiNs vid olika tidpunkter efter starten av omprogrammering processen. Vid mycket tidigt stadium, det vill säga 2 veckor efter retroviral transduktion, PdiNs uppvisar knappt tecken på elektriska retbarhet, trots βIII-tubulin uttryck i det här skedet. Således är de flesta av deelektrofysiologiska analyser utfördes 4-8 veckor efter transduktion med Sox2 och ascl1. Såsom beskrivs i Karow et al. Är PdiNs kännetecknas av avse omognad såsom återspeglas av en hög ingångsmotstånd och en låg frekvens av aktionspotentialens bränning. Ytterligare mognad kan främjas genom samodling PdiNs med neuron härledda från musen E14 hjärnbarken. Under dessa förhållanden, PdiNs uppvisar högre action möjliga frekvenser och ökad natriumströmmar 7. Dessutom avslöjar samodling kompetens PdiNs att få funktionell synaptisk input från mus nervceller. Sammanfattningsvis PdiNs förvärva funktionella neuronala egenskaper som kan förbättras ytterligare vid samodling med andra nervceller. Det återstår dock att visas om PdiNs också kan skapa funktionella presynaptiska fack. Ytterligare studier omplantering PdiNs in i hjärnan behövs för att avslöja deras potential att nå full mognad och funktionalitet.
Usjunga Sox2 och ascl1 som omprogrammering faktorer vi noterade att de resulterande PdiNs förvärva funktioner i GABAergic nervceller 7. Intressant nog har andra grupper utvecklat protokoll för att omvandla fibroblaster till INS genom att använda olika transkriptionsfaktor och / eller mikro-RNA i ett med det resultatet att utveckla ins förvärvat distinkt signalsubstans specifikation såsom en glutamaterg, dopaminerga och kolinerga fenotyp 1, 16-18. Det återstår att testas om de faktorkombinationer som används i fibroblaster inducerar samma sändare identiteten i PdiNs. Dessutom har senaste arbete expand omvandlingen spektrum bortom neurogenes att generera neurala stamceller 19, 20 eller gliaceller, i synnerhet oligodendrocyter 21, 22. Om dessa omprogrammering protokoll framkalla ett liknande resultat i vuxen mänskliga hjärn pericyte-härledda celler, skulle detta i hög grad vidga panorama av tillämpningar av denna important hjärna bosatt celltyp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi är tacksamma till Dr Magdalena Götz för hennes insatser under utvecklingen av detta protokoll. Vi tackar Dr Marius Wernig (Stanford University) för generöst ger oss den Sox2 kodande sekvensen. Vi är också mycket tacksamma till Dr Alexandra Lepier för virusproduktion. Detta arbete har finansierats med bidrag från Deutsche Forschungsgemeinschaft (BE 4182/2-2) och BMBF (01GN1009A) till BB, och den bayerska statliga ministeriet för Vetenskap, forskning och konst till MK och BBCS fått medel från den binationellt SYSTHER- INREMOS Virtual Institute (tyska och slovenska federala ministerierna för utbildning och forskning) och DFG (SFB 824).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-CD140b-PE | BD Biosciences | 558821 | use 1:100 |
| anti-CD146-FITC | AbD Serotec | MCA2141FT | use 1:100 |
| anti-CD13-FITC | AbD Serotec | MVA1270A488T | use 1:100 |
| anti-CD34-APC | BD Biosciences | 560940 | use 1:100 |
| anti-PDGFRβ | Cell Signaling | 3169S | use 1:200 |
| anti-CD146 | Abcam | Ab75769 | use 1:400 |
| anti-NG2 | Millipore | AB5320 | use 1:400 |
| anti-SMA | Sigma-Aldrich | A2547 | use 1:400 |
| anti-βIII-tubulin | Sigma-Aldrich | T8660 | use 1:400 |
| anti-MAP2 | Sigma-Aldrich | M4403 | use 1:200 |
| anti-GFAP | Sigma-Aldrich | G3893 | use 1:600 |
| anti-GFP | Aves Labs | GFP 10-20 | use 1:1,000 |
| anti-RFP | Chromotek | 5F8 | use 1:500 |
| anti-S100β | Sigma-Aldrich | S2532 | use 1:300 |
| anti-NeuN | Millipore | MAB377 | use 1:200 |
| anti-GABA | Sigma-Aldrich | A2052 | use 1:500 |
| anti-Calretinin | Millipore | AB5054 | use 1:500 |
| anti-vGluT1 | SYnaptic SYstems | 135511 | use 1:1,000 |
| Rat IgG1 isotype control FITC | AbD Serotec | 11-4301-81 | use 1:100 |
| Rat IgG1 isotype control PE | AbD Serotec | 12-4301-81 | use 1:100 |
| Rat IgG1 isotype control APC | AbD Serotec | 17-4301-81 | use 1:100 |
| TrypLE | Invitrogen | 12605-010 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Invitrogen | 61965 | |
| B27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10106-169 | perform heat inactivation by incubation at 56 °C for 30 min |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) | Invitrogen | 24020-091 | |
| Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1x) | Invitrogen | 14190 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| PFA (paraformaldehyde) | Sigma-Aldrich | P1648 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| DAPI (4′,6-Diamidin-2-phenylindole) dilactate | Sigma-Aldrich | 042M4005 | |
| Aqua-Poly/Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap | BD Biosciences | 352235 | |
| 24-well plates | Orange Scientific | 5530305 | |
| 75 cm2 culture flasks | Greiner Bio-One | 658175 | |
| 25 cm2 culture flasks | Greiner Bio-One | 690175 | |
| Disposable pipettes 10 ml | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| Glass Pasteur pipettes (150 mm) | Fisherbrand | FB50251 | |
| Glass coverslips 12 mm diameter | Menzel | CB00120RA1 | |
| Surgical disposable scalpels | B. Braun | 5518083 | |
| Tissue culture dishes | Greiner Bio-One | 633180 | |
| Conical tubes 15 ml | BD Biosciences | 352095 | |
| Laminar flow hood | |||
| Centrifuge and swing-out rotor with adapters for 15 ml and 50 ml tubes | Hettich Lab Technology | 1406 | |
| Flow cytometry cell sorter: FACSAria l with FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| Humified cell culture incubator | Eppendorf Galaxy 170R | ||
| Wather bath at 37 °C | |||
| FACSFlow sheath fluid | BD Biosciences | 342003 | |
| Epifluorescence microscope BX61 | Olympus | ||
| Confocal microscope LSM710 | Zeiss |
References
- Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476, 224-227 (2011).
- Kim, J., et al. Functional integration of dopaminergic neurons directly converted from mouse fibroblasts. Cell stem cell. 9, 413-419 (2011).
- Duan, B., et al. Interactions between water deficit, ABA, and provenances in Picea asperata. Journal of experimental botany. 58, 3025-3036 (2007).
- Heinrich, C., et al. Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons. PLoS Biol. 8, (2010).
- Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nat Protoc. 6, 214-228 (2011).
- Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. , (2007).
- Karow, M., et al. Reprogramming of pericyte-derived cells of the adult human brain into induced neuronal cells. Cell stem cell. 11, 471-476 (2012).
- Ortega, F., et al. Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level. Nat Protoc. 6, 1847-1859 (2011).
- Ladewig, J., et al. Small molecules enable highly efficient neuronal conversion of human fibroblasts. Nat Methods. 9, 575-578 (2012).
- Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77, 440-456 (2013).
- Davila, J., Chanda, S., Ang, C. E., Sudhof, T. C., Wernig, M. Acute reduction in oxygen tension enhances the induction of neurons from human fibroblasts. J Neurosci Methods. 216, 104-109 (2013).
- Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463, 1035-1041 (2010).
- Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 10343-10348 (2011).
- Lu, J., et al. Generation of Integration-free and Region-Specific Neural Progenitors from Primate Fibroblasts. Cell Rep. 3, 1580-1591 (2013).
- Yang, N., Ng, Y. H., Pang, Z. P., Sudhof, T. C., Wernig, M. Induced neuronal cells: how to make and define a neuron. Cell Stem Cell. 9, 517-525 (2011).
- Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476, 220-223 (2011).
- Yoo, A. S., et al. MicroRNA-mediated conversion of human fibroblasts to neurons. Nature. 476, 228-231 (2011).
- Son, E. Y., et al. Conversion of mouse and human fibroblasts into functional spinal motor neurons. Cell Stem Cell. 9, 205-218 (2011).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 2527-2532 (2012).
- Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10, 473-479 (2012).
- Yang, N., et al. Generation of oligodendroglial cells by direct lineage conversion. Nat Biotechnol. 31, 434-439 (2013).
- Najm, F. J., et al. Transcription factor-mediated reprogramming of fibroblasts to expandable, myelinogenic oligodendrocyte progenitor cells. Nat Biotechnol. 31, 426-433 (2013).
