Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

חוקר חלבונים אינטראקציות בתאים חיים באמצעות העברת פליטת אור התהודה אנרגיה

doi: 10.3791/51438 Published: May 26, 2014
* These authors contributed equally

Summary

אינטראקציות בין החלבונים הן יסוד לכל התהליכים התאיים. באמצעות העברת פליטת אור התהודה אנרגיה, את האינטראקציה בין זוג החלבונים יכולה להיות במעקב בתאים חיים ובזמן אמת. יתר על כן, ההשפעות של מוטציות שעלולים להיות פתוגניים ניתן להעריך.

Abstract

מבחני מבוססים על פליטת אור התהודה העברת אנרגיה (ברט) לספק אמצעי רגיש ואמין כדי לפקח על אינטראקציות בין חלבונים בתאים חיים. ברט הוא ההעברה לא מקרינה אנרגיה מאנזים לוציפראז 'תורם' לחלבון פלואורסצנטי 'acceptor'. בתצורה הנפוצה ביותר של assay זה, התורם הוא לוציפראז reniformis Renilla וacceptor הוא חלבון צהוב פלורסנט (YFP). בגלל היעילות של העברת אנרגיה היא מאוד מרחק תלוי, התבוננות בתופעת ברט דורשת שהתורם acceptor להיות בקרבת מקום. לבדיקת אינטראקציה בין שני חלבונים של עניין בתאי יונקים בתרבית, חלבון אחד מתבטא כהתמזגות עם לוציפראז והשני כהתמזגות עם YFP. אינטראקציה בין שני החלבונים של עניין עשויה להביא תורם acceptor מספיק קרוב ללהתרחש העברת אנרגיה. לעומת טכניקות אחרות לחקירת חלבונים בteractions, assay ברט הוא רגיש, דורש ידיים על קצת זמן וכמה חומרים כימיים, והוא מסוגל לזהות אינטראקציות שהם חלשים, ארעיים, או תלויים בסביבה ביוכימית נמצאת בתוך תא חי. לכן גישה אידיאלית למאשרים אינטראקציות המשוערות שהוצעו על ידי שמרי שני היברידיים או ספקטרומטריית מסת מחקרי פרוטאומיקה, ובנוסף הוא מותאם היטב לאזורי מיפוי אינטראקציה, בוחן את ההשפעה של שינויים שלאחר translational על אינטראקציות בין חלבונים, ו בוחן את ההשפעה של מוטציות שזוהו ב-DNA מטופל.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

גם הצמדה קלאסית והדור הבא רצף ניתוחים של הפרעות אדם מגלים את הרלוונטיות הקלינית של חלבונים מעורבים במגוון רחב של מסלולים ביולוגיים. זה קורה לעתים קרובות כי, לפני זיהוי שלהם במחקרים מסוג זה, יש כבר חקירה מועטת או ללא התפקיד הביולוגי של החלבונים האלה. השדרה פורה אחד להתחיל לחקור את התפקוד הביולוגי של חלבון של עניין היא לזהות אילו חלבונים אחרים הוא מקיים אינטראקציה עם בהקשר הפיזיולוגי שלו. אפיון רשתות מולקולריות באופן זה מספק תובנות לגבי המסלולים הביולוגיים העומדים בבסיס הפנוטיפ האנושי.

ההקרנה בקנה מידה גדולה ביותר בשימוש לעתים קרובות גישות לזיהוי שותפי אינטראקציה מועמד לחלבונים של עניין הן שמרי הקרנת שתי היברידית 1 ופרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסת 2. שיטות אלו יכולות להיות מוצלחות מאוד שבמרמזות חלבוני אינטראקציה פוטנציאל, אבל arדואר חשוף לתוצאות חיוביות כוזבות. לפיכך, אישור של אינטראקציה זוהתה על ידי שמרי שני היברידיים או הקרנת ספקטרומטריית מסה דורש אימות של האינטראקציה באמצעות טכניקה שנייה. בדרך כלל שיתוף immunoprecipitation או assay הנפתח משמש למטרה זו 3. אחד חסרונות של שימוש בטכניקות כגון לאימות הוא הדרישה לתמוגה תא, שהורסת את התנאים תאיים שעשויה להיות חיוני לשמירה על אינטראקציות חלבון מסוימות. חסרון שני הוא שאינטראקציות חלבון חלשות או חולפות עשויות להיות מופרים במהלך שלבי כביסה. יתר על כן, מבחני אלה דורשים ידיים על זמן משמעותיים, מוגבלים במספר הדגימות שניתן לעבד בו זמנית, ולעתים קרובות דורשים אופטימיזציה זמן רב של חומרים כימיים ופרוטוקולים.

כדי להתגבר על חלק מהבעיות הקשורות לשיתוף immunoprecipitation ניסויים, כמה מבחני שפותחו על בסיס ניאון וbiolumחלבוני inescent שניתן להשתמש בתאים חיים. מבחני הראשונים מסוג זה היו מבוססים על הקרינה (או פורסטר) העברת התהודה אנרגיה (סריג), ההעברה לא מקרינה אנרגיה בין שני חלבוני ניאון עם פליטה חופפות וספקטרום עירור 4. היעילות של העברת אנרגיה היא מאוד מרחק תלוי, ולכן התבוננות בתופעת סריג דורשת כי fluorophores תורם acceptor להיות בקרבת מקום. לבדיקת אינטראקציה בין שני חלבונים של עניין, חלבון אחד מתבטא כהתמזגות עם fluorophore התורם (החלבון פלואורסצנטי נפוץ ציאן; CFP), והשני כהתמזגות עם fluorophore acceptor (החלבון פלואורסצנטי נפוץ צהוב; YFP). אינטראקציה בין שני החלבונים של עניין עשויה להביא fluorophores תורם acceptor מספיק הקרוב ללהתרחש העברת אנרגיה, מה שיגרום לעלייה במדידת הפליטה של ​​אור מביחס acceptor YFP לתורם CFP. FRET היה מוצלח באיתור אינטראקציות בין חלבונים בתאים חיים 4. החסרון העיקרי של שימוש בסריג לאיתור חלבונים אינטראקציות הוא הדרישה לתאורה חיצונית לעירור של fluorophore התורם. תוצאות תאורה חיצוניות ברקע גבוה באות הפליטה, עירור לא רצוי של acceptor, וphotobleaching של שניהם תורמים וfluorophores acceptor. השפעות אלה מפחיתים את הרגישות של assay לאיתור חלבונים אינטראקציות.

שינוי של assay סריג שמתגבר על הבעיה של רקע גבוה מתאורה חיצונית הוא העברת פליטת אור התהודה האנרגיה 5,6 assay (ברט). במערכת ברט fluorophore התורם הוא הוחלף על ידי אנזים בלוציפראז. לכן האנרגיה לעירור של fluorophore acceptor נוצרה בתוך המערכת על ידי החמצון של מצע לוציפראז, עיבוד תאורה חיצונית מיותרת. ברובתצורה נפוצה של assay זה, התורם הוא Renilla reniformis לוציפראז וacceptor הוא YFP (לדיון של תורם חלופי וחלבונים acceptor לראות Pfleger et al. 5). בהתאם לכך, במערכת זו, חלבון של עניין הוא קבע את לוציפראז וחלבון באופן פוטנציאלי, באינטראקציה לYFP, או להיפך. Assay ברט דורש תוספת של coelenterazine כמצע ללוציפראז. בגלל coelenterazine הוא תא חדיר, ניתן לבצע מבחני ברט בתאים חיים. עם זאת, coelenterazine ילידים אינם יציב בתמיסה מימית, ואת פירוט האנזים עצמאי של coelenterazine הן מפחית את ריכוז המצע זמין עבור assay ומייצר autoluminescence, אשר מפחיתה את הרגישות של מדידות של פעילות לוציפראז. השימוש בברט בתאים חיים כבר בהנחייתם של פיתוח coelenterazines המוגן, שהם יציבים בתמיסה מימית אבל הם ביקע ידי esterase cytosolicים לאחר דיפוזיה על פני קרום התא כדי לייצר coelenterazine הפעיל בתוך התא 7.

בעקבות תוספת של מצע לתאים לבטא לוציפראז וחלבוני YFP-Fusion, העברת אנרגיה וכתוצאה מאינטראקציות בין חלבונים היא לכמת על ידי ניטור פליטה מלוציפראז וYFP. מכיוון שניתן לנטר אינטראקציות חלבון ישירות בתאים חיים בצלחות רב גם, assay ברט מהווה שיטה פשוטה, ניתן להרחבה לאימות אינטראקציות המשוערות שהיא עלות והזמן יעיל.

בנוסף לאימות interactors המשוער שזוהה במחקרי הקרנת proteomic, מערכת ברט יכולה לשמש גם לinteractors מועמד מבחן הנובע ממחקרים ביוכימיים ומבניים מוקדמים בחלבון של עניין. ברגע שהקיום של אינטראקציה בין חלבונים כבר נקבע (בין אם באמצעות assay ברט או בטכניקות אחרות), קיימת פוטנציאל לassay ברט להיות EMPloyed נוסף כדי לאפיין את האינטראקציה. לדוגמא, ניתן למפות אזורי האינטראקציה על ידי יצירת גרסאות מקוצצות של החלבונים, ואת מעורבותם של שאריות ספציפיות באינטראקציה ניתן להדגים על ידי יצירת מוטציות נקודתיות. יתר על כן, השפעת הוויסות של שינויי posttranslational או מולקולות קטנות (כגון סמים או ligands) על אינטראקציות בין חלבונים יכולה להיחקר 8-10.

Assay ברט יש גם פוטנציאל גדול לחקר מוטציות שזוהו ב-DNA מטופל. במקרים בהם תפקיד סיבתי מוטציה כבר נקבע, שחקר את ההשפעה של המוטציה על אינטראקציות בין חלבונים באמצעות ברט עשוי לחשוף עוד על אטיולוגיה המולקולרית של פנוטיפ 11. מאז כניסתו של מתודולוגיות הדור הבא של רצף, זה נפוץ יותר ויותר במשך כמה מוטציות שעלולים להיות מזיקות להיות מזוהות בתוך פרט, ובמקרה זה ברור שהם releVant לפנוטיפ 12. במצב זה assay ברט עשוי להיות בעל ערך בהערכת ההשפעה של מוטציות על תפקוד חלבון ומכאן את הרלוונטיות שלהם להפרעה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. יצירת פלסמידים

  1. Subclone cDNAs עבור כל חלבון של עניין לשני וקטורי pLuc וpYFP, ​​תוך שימוש בטכניקות ביולוגיה מולקולרית סטנדרטיות (איור 1). לפרוטוקולים מפורטים רואה הירוק ואח' 13.
  2. רצף כל הבונה כדי לוודא שהחלבונים של עניין נמצאים במסגרת עם רצף לוק / YFP ללא קודונים להפסיק להתערב.
  3. לבצע מבחני פונקציונליים כמו רצוי כדי לאשר שחלבוני ההיתוך לשמור על פעילות ביולוגית. במקרה שהוצג כאן לוקליזציה subcellular של חלבוני היתוך YFP הובררה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
  4. הפוך פלסמידים ביטוי לחלבוני בקרה מתאימים לוק וYFP על ידי הנדסת אותות מיקוד הרלוונטיים לוקטורי ביטוי pLuc וpYFP. במקרה שהוצג כאן, ליצור מבני לוק וYFP ממוקדים גרעיניים על ידי הוספת אות לוקליזציה גרעינית לוקטורי pLuc וpYFP.
  5. לעשותמבנה שליטה חיובי שבו לוק וYFP הם התמזגו לתוך פוליפפטיד אחד. במקרה שהוצג כאן, לייצר שליטה חיובית שבו רצף קידוד YFP מוכנס לתוך וקטור pLuc.
  6. בחר פלסמיד מילוי ניטראלי לשמש כדי להשוות את המסה של ה-DNA בתערובות transfection. השתמש פלסמיד שאין לו אמרגן אוקריוטים ועל כן יהיה תעתיק לא פעיל בתאי יונקים, כגון וקטור שיבוט חיידקים.

2. הכנה של ה-DNA תערובות

  1. להעריך את הריכוז של כל פלסמידים שתוארו בסעיף 1 המבוסס על הספיגה ב 260 ננומטר (יחידת ספיגת 1 היא שווה ערך ל50 מיקרוגרם / מיליליטר של ה-DNA). לקבוע את המסה המולקולרית של כל פלסמיד על ידי הכפלת מספר זוגות בסיסים ידי 650 דא. השתמש בריכוז ומסה מולקולרית כדי לחשב את הריכוז טוחנת של כל הכנת פלסמיד. לדלל את הכנות פלסמיד דנ"א לריכוז של 36 ננומטר. אלה יהיו המניות עובדותשישמש להכנת תערובות DNA עבור transfection.
  2. להכין תערובת המכילה DNA שליטת 1,800 ננוגרם של פלסמיד מילוי בנפח סופי של μl 20 של מים.
  3. להכין תערובת DNA שליטה המכילה 5 μl של מבנה pLuc השליטה. הוספת פלסמיד המילוי להביא הכולל המוני DNA ל1,800 ננוגרם. מוסיף מים כדי להביא את הנפח הסופי 20 μl.
  4. להכין תערובת DNA שליטה המכילה 5 μl של מבנה pLuc שליטה ו5 μl של מבנה pYFP שליטה. הוספת פלסמיד המילוי להביא הכולל המוני DNA ל1,800 ננוגרם. מוסיף מים כדי להביא את הנפח הסופי 20 μl.
  5. להכין תערובת DNA שליטה המכילה 5 μl של מבנה שליטה חיובי. הוספת פלסמיד המילוי להביא הכולל המוני DNA ל1,800 ננוגרם. מוסיף מים כדי להביא את הנפח הסופי 20 μl.
  6. הכן את ה-DNA הבא מתערבבת לבדיקת homodimerization של חלבון של העניין, X. לכל ערבוב של ה-DNA לשלב 5 μl של pLuc הרלוונטי לבנות ו5 μl של pyFP לבנות. הוספת פלסמיד המילוי להביא הכולל המוני DNA ל1,800 ננוגרם. מוסיף מים כדי להביא את הנפח הסופי 20 μl.
    א) pLuc שליטה וpYFP-X
    B) pLuc-X וpYFP בקרה
    ג) pLuc-X ו-X pYFP
  7. הכינו את ה-DNA הבא מתערבבת לבדיקת אינטראקציה בין זוג החלבונים של עניין, X וי 'לכל תערובת DNA לשלב 5 μl של pLuc הרלוונטי לבנות ו5 μl של pYFP לבנות. הוספת פלסמיד המילוי להביא הכולל המוני DNA ל1,800 ננוגרם. מוסיף מים כדי להביא את הנפח הסופי 20 μl.
    א) pLuc שליטה וpYFP-X
    B) pLuc-X וpYFP בקרה
    ג) pLuc שליטה וpYFP-Y
    D) pLuc-Y וpYFP בקרה
    E) pLuc-X ו-Y pYFP
    F) pLuc-Y ו-X pYFP

3. Transfection

  1. קציר subconfluent HEK293 תאים מבקבוק 75 2 סנטימטר. לדלל 10% מהתאים בסך הכל ל13 מיליליטר של מדיום התרבות. לוותר 130 μl של השעיה תא לתוך באר כל לבןברור תחתית צלחת תרבית רקמת 96 היטב. תרבות תאים ל24 שעות.
  2. לחשב את מספר הבארות להיות transfected על ידי הכפלת מספר תערובות-DNA על ידי 3. תביא מדיום סרום ללא תרבות לטמפרטורת חדר. הכן תערובת אב המכילה 6.3 μl של מדיום סרום ללא ו0.18 מגיב transfection μl לכל טוב. מערבבים על ידי vortexing ו דגירה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות.
  3. הכן תערובת transfection על ידי הוספת 2 μl תמהיל ה-DNA כדי 20 μl של תמהיל אב סרום ללא בינוני / transfection מגיב. לא מערבולת. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות.
  4. Transfect שלוש בארות עם כל תערובת transfection מחלק 6.5 μl של תערובת transfection לכל טוב. תרבות התאים לשעה 36-48 נוספת.

4. מדידה של ברט איתותים

  1. לפזר מצע לוציפראז לחיות תאים ב34 מ"ג / מיליליטר בDMSO ידי vortexing.
  2. לדלל מצע לוציפראז לחיות תאים מחדש ב1:1,000 בעמ הבינוני דילול המצעמחדש לחמם 37 ° C. לאפשר 50 μl של מדיום דילול מצע לכל טוב. מערבולת לערבב. משקע עלול להיווצר, אבל לא יפריע לassay.
  3. לשאוב את מדיום התרבות מצלחת 96 היטב. לוותר 50 μl של מצע לוציפראז לחיות תאים מדולל היטב כל אחד. תרבות תאים לפחות 2 שעה (עד 24hr).
  4. הסר את המכסה מצלחת 96 היטב דגירה את הצלחת ל10 דקות בטמפרטורת חדר בתוך luminometer.
  5. למדוד פליטה מלוק וYFP אחד טובה בכל פעם. למדוד פליטה מלוק באמצעות מסנן חוסם אורכי גל ארוכים יותר מאשר 470 ננומטר. למדוד פליטה מYFP באמצעות מסנן להקה עובר 500-600 ננומטר. שלב את אותות פליטה מעל 10 שניות.

5. ניתוח נתונים

  1. ממוצע קריאות פליטת לוק מ3 הבארות שקיבלו רק את הפלסמיד המילוי. לחסר ערך זה מכל קריאות פליטת לוק האחרות כדי לייצר ערכי פליטה מופחת רקע לוק.
  2. ממוצע קריאות פליטת YFP מ3 הבארות שקיבלו רק את הפלסמיד המילוי. לחסר ערך זה מכל קריאות פליטת YFP האחרות כדי לייצר ערכי פליטה מופחת רקע YFP.
  3. עבור כל טוב, יש לחלק את ערך הפליטה מופחת רקע YFP ידי ערך הפליטה מופחת רקע לוק לתת יחס ברט שלא תוקן.
  4. ממוצע יחסי ברט שלא תוקנו משלוש הבארות שהיו transfected עם רק פלסמיד pLuc השליטה. לחסר ערך זה מכל יחסי ברט לא מתוקנים האחרים כדי לתת את יחס ברט המתוקן.
  5. לכל אחת מהקבוצות שנותרו ביחסי ברט מתוקנים, ממוצע הערכים משלוש בארות transfected לקבל יחס ברט סופי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

העיקרון של assay ברט המתואר באיור 2. התקנת assay בשימוש בכל הניסויים שהוצגו כאן מתוארת באיור 3. זיהוי של אות ברט חזקה מתאי transfected עם חלבון היתוך לוציפראז-YFP אישר כי העברת אנרגיה הייתה ניתן לצפייה בהתקנה ניסיונית זה (איור 4).

המחקר שלנו מתמקד בתפקידה של משפחת FOXP של repressors תעתיק בהתפתחות המוח. מוטציות הטרוזיגוטיים משפיעות להוביל FOXP2 לצורה נדירה של דיבור והפרעה בשפה, שהמאפיין הבולט ביותר הוא דיספרקסיה, קשיים התפתחותיים מילוליים עם הפקת הרצפים המורכבים של תנועות שרירים orofocial נדרשות לדיבור 14-16. מוטציות FOXP1 דווחו בחולים עם הפרעות ספקטרום האוטיסטי ופיגור שכלי מלווים בחמור בדיבור ובעיות שפת 17-20. האינטראקציה של FOXPs עם חלבונים אחרים נחקרת כדי לקבל תובנות לתוך המנגנונים המולקולריים רלוונטיים לתפקידם של חלבונים אלה בהתפתחות המוח.

FOXP2 ידוע כדי ליצור הומו או heterodimers עם בני משפחה אחרים FOXP 21, לכן homodimerization FOXP2 שימש כדי לאמת את assay ברט (איור 4). כדי לשלול את האפשרות שהאינטראקציה של חלבוני היתוך FOXP2 בassay זה נבעה פשוט לביטוי יתר של חלבון, את הספציפיות של האינטראקציה הודגמה על ידי החדרת מוטציה לרשות dimerization הרוכסן לאוצין של FOXP2 (מחיקה במסגרת של שאריות E400), אשר ידוע לשבש הומו וheterodimerization (איור 5 א) 21. כאשר חלבוני היתוך לוק-FOXP2.DE400 וYFP-FOXP2 היו שיתוף ביטא, ירידה באות ברט נצפתה לעומת כאשר לוק-FOXP2 וYFP-FOXP2 היה שיתוף הביע (איור 5). si זההפחתת gnal לא הייתה בשל שינוי בלוקליזציה subcellular של החלבון שעבר מוטציה (איור 5 ג) או הבדל ברמות ביטוי כפי שהוערך על ידי מערבי סופג (מידע לא מוצג). הפחתת האות נצפתה גם כאשר לוק-FOXP2 בא לידי הביטוי עם YFP-FOXP2.DE400 (מידע לא מוצג). כך ברט הוא יעיל באיתור homodimerization חלבון, ואת האינטראקציה של חלבונים נשארת ספציפית כאשר חלבונים אלה ביטוי יתר כלוציפראז וYFP התכה. יתר על כן, השימוש בברט בשילוב עם מוטציה ממוקדת של חלבונים יש הפוטנציאל לזהות שאריות בודדות מעורבות באינטראקציות בין חלבונים.

כדי להעריך את האפקטיביות של assay ברט בגילוי אינטראקציות heterotypic, את האינטראקציה של FOXP2 עם FOXP1 נבדקה (איור 6). אות ברט נצפתה בשני תצורות אפשריות של assay (כלומר עם FOXP2 כתורם או כfusio acceptorחלבון n). לכן assay ברט הוא מסוגל לזהות גם הומו ואינטראקציות heterotypic. בנוסף לכך, את התאמתו של assay ברט לגילוי אינטראקציה של FOXP2 עם חלבונים שאינם FOXP נבדקה על ידי בחינת האינטראקציה עם CtBP1, שיתוף repressor תעתיק ושותף האינטראקציה FOXP2 הידוע 21. האינטראקציה בין CtBP1 וFOXP2 הוצעה במקור על ידי מסך שני היברידי שמרים וקבלה תוקף לאחר מכן על ידי שיתוף immunoprecipitation ניסויים 21. האינטראקציה FOXP2-CtBP1 זוהתה על ידי assay ברט כאשר FOXP2 היה חלבון היתוך התורם וCtBP1 היה acceptor, אבל לא בתצורה ההפוכה (איור 7 א). תוצאות כאלה הן צפויות עם מערכת ברט (ראה סעיף דיון). האינטראקציה בין FOXP2 וCtBP1 נצפתה למרות שחלק קטן בלבד של CtBP1 היה מקומי לגרעין (איור 7), המדגיש את הרגישות של assay זה. כך ברטassay הוא שימושי עבור האימות של אינטראקציות המשוערת זוהו באמצעות הקרנת שתי היברידי שמרים.

לבסוף, assay ברט הועסק כדי לבחון את ההשפעות של מוטציות פתוגניים בFOXP2 על אינטראקציות בין חלבונים. שתי מוטציות נקודתיות בFOXP2 דווחו לגרום להפרעה אוטוזומלית דומיננטית נדיר המשפיעה על דיבור ושפה (איור 8 א). המוטציה missense R553H התגלתה באמצעות מחקר הצמדה במשפחה גדולה שבה מחצית מהחברים הושפעו מההפרעה 14. המוטציה שטויות R328X התגלתה דרך רצף ממוקד של מוקד FOXP2 בprobands עם אבחנה של דיספרקסיה המילולית התפתחותית 22. היכולת של חלבוני המוטציה לdimerize עם FOXP2 פראי מהסוג הוערכה באמצעות assay ברט. התוצאות באמצעות FOXP2 פראי מהסוג כתורם וFOXP2 המוטציה כacceptor מוצגות באיור 8 ב. אותן התוצאות נצפו באמצעות מ ' FOXP2 utant כתורם ופראי מהסוג כacceptor (מידע לא מוצג). המוטציה R553H, אשר נמצאת בתחום המחייב-DNA של FOXP2, לא השפיעה על יכולתו של החלבון שעבר מוטציה לdimerize עם wild-type. המנגנון הפתוגני של מוטציה זו עשויה אפוא לכלול השפעה שלילית דומיננטית וכתוצאה מdimerization של המוטציה עם החלבון הנורמלי 23. המוטציה R328X מציגה קודון עצירה מוקדמת, והתוצאה הוא שהחלבון המקודד חסר תחום dimerization רוכסן לאוצין ותחום ה-DNA מחייבת, ומראה כמה mislocalization cytoplasmic (איור 8C). עולה בקנה אחד עם העדר תחום dimerization וmislocalization אל הציטופלסמה, החלבון הקטוע תערוכות מופחתות במידה ניכרת אינטראקציה עם FOXP2 wild-type. מוטציה זו היא אפוא צפויה להיות פתוגניים עקב haploinsufficiency. כך assay ברט יכול לספק תובנות לגבי ההשפעות הביולוגיות של מוטציות שהתגלו בחולים.

s = "jove_content" עבור: לשמור-together.within-page = "תמיד"> איור 1
איור 1. וקטורים לביטוי של חלבוני YFP-ולוציפראז-Fusion. א) מפות מעגל של וקטורי pYFP וpLuc. וקטור pLuc משמש לביטוי של חלבוני היתוך לוציפראז כתורמי ברט. וקטור pYFP משמש לביטוי של חלבוני היתוך YFP כברט acceptors. יש וקטורים אמרגן CMV (P CMV) לביטוי ברמה גבוהה בתאי יונקים, אתר מרובה שיבוט (MCS) להחדרת cDNAs לחלבונים של עניין, וגן התנגדות kanamycin (r קאן) ומוצא שכפול חיידקים להתפשטות של פלסמיד בחיידקים. ב ') אתר שיבוט מרובה של וקטורי pLuc וpYFP. סופו של רצף קידוד YFP מוצג בכחול. אתרי הגבלה נבחרו מבואר. שים לב שאתר Xba אני חסום על ידי overlapping מתילציה סכר בזנים סטנדרטיים של ה coli. cDNAs קידוד חלבונים של עניין צריכים להיות משובטים במסגרת עם רצף חומצות אמינו שמוצג. בניסויים שתוארו כאן, מוסיף היו משובטים לאתרים בם HI וXba אני הגבלה (קו תחתון). קודונים לעצור הוסרו מסוף לוציפראז וYFP קידוד רצפים לספק מסגרת קריאה פתוחה המקיפה את לוציפראז / YFP וcDNA subcloned של עניין. קודונים תפסיקו נמצאים בסוף אתר השיבוט מרובה בכל שלוש מסגרות הקריאה (מוצגות באדום), ולכן זה לא חיוני לכלול קודון עצירה בcDNA מוכנס.

איור 2
איור 2. העיקרון של מערכת ברט. חלבונים של עניין, X ו-Y, הם התמזגו לאנזים בלוציפראז התורם (לוק, פליטת שיא 475 nמ ') וחלבון acceptor ניאון (YFP, ננומטר פליטת 530 שיא), בהתאמה. חלבוני ההיתוך באים לידי ביטוי בתאי יונקים בתרבית ותוספת של מצע תא חדיר לוציפראז, פליטה מלוק הבאה נמדדת באמצעות מסנן חוסם אורכי גל ארוכים יותר מאשר 470 ננומטר ופליטה מYFP נמדד באמצעות מסנן להקה עובר 500-600 ננומטר. אינטראקציה) אין אינטראקציה בין X החלבון והעברת אנרגיה י 'חלבון מלוק לYFP אינה מתרחשת. ב') בין X החלבון וחלבון העברת אנרגיית התהודה י 'מתרחשת מלוק לYFP גורמת לעלייה בשיעור הפליטה נמדדה באמצעות מסנן להקה עוברת 500-600 ננומטר בהשוואה למסנן חוסם אורכי גל ארוכים יותר מאשר 470 ננומטר.

איור 3
איור 3. התקנת Assay. התקנת assay לבדיקהאינטראקציה בין שני חלבונים של עניין, X וי 'חלבונים של עניין הם התמזגו ללוציפראז (לוק) כתורם ברט וחלבון צהוב ניאון (YFP) כacceptor ברט. בחלבוני הבקרה, לוק וYFP הם התמזגו לפפטיד המכיל אות מיקוד לתא הרלוונטי subcellular (P), אם מתאים.) שולט להיכלל בכל צלחת. 1) שליטת מוק-transfection להקים רמות רקע של הארה וקרינה כתוצאה מרעש luminometer והתמוטטות אנזים עצמאי של מצע; 2) pLuc השליטה transfection רק להקים את שיעור פליטת לוציפראז שהוא זוהה בטווח הפליטה של ​​YFP בהעדר acceptor ברט; 3) Transfection של pLuc שליטה ובקרת pYFP להקים את אות ברט הבסיסי הנובעת מאינטראקצית לוק-YFP; 4) Transfection של היתוך לוק-YFP כביקורת חיובית, כדי להבטיח שאות ברט ניתן למדוד. B) סט experimתנאי ental לבדיקת אינטראקציה בין שני חלבונים של עניין, X ו 1 י ', 2, 4, 5) בקרות לאינטראקציה שאינה ספציפית בין החלבונים של עניין ולוק / YFP; 3) מצב מבחן עם X כתורם ו-Y כacceptor; 6) מצב מבחן עם Y כתורם וX כacceptor.

איור 4
איור 4. איתור של homodimerization FOXP2. א) כדי לאמת את assay ברט לצורך זיהוי של homodimers FOXP2, HEK293 תאים היו transfected עם מבנים לביטוי של בלוציפראז (תורם) או YFP (acceptor) התמזגו שני FOXP2 (P2) או אות לוקליזציה גרעינית (-). לוציפראז הממוקד הגרעיני והחלבונים YFP לשרת פקדים שליליים. כביקורת חיובית לגילוי אות ברט, תאים היו גם transfected עם מבנה לביטוי של לוציפראז-פותחי עתידתמונות חלבון היתוך P (+) B) מיקרוסקופ פלואורסצנטי של תאי transfected עם YFP התמזגו לאות גרעינית לוקליזציה (-). או עם YFP התמזגו FOXP2 (P2).

איור 5
איור 5. שימוש בFOXP2 dimerization לקוי להפגין סגוליות assay. א) תרשים סכמטי של חלבון FOXP2 מראה את המיקום של המוטציה DE400, אשר משבשת dimerization. תחום dimerization הרוכסן לאוצין מוצג בירוק ותחום ה-DNA מחייבת בצהוב. ב ') כדי לבדוק אם ביטוי יתר של חלבונים עשוי להוביל לתוצאות חיוביות שגויות בassay ברט, הספציפיות של assay הוערך באמצעות FOXP2.DE400 גרסה. תאים היו transfected עם מבנים לביטוי של בלוציפראז (תורם) או YFP (acceptor) התמזגו FOXP2 (P2), FOXP2.DE400 (DE) או nucleaתמונות C) מיקרוסקופ פלואורסצנטי של תאי transfected עם YFP התמזגו FOXP2 (P2) או לFOXP2.DE400 (DE) - אות לוקליזציה r ()..

איור 6
איור 6. איתור של heterodimerization FOXP1-FOXP2. א) כדי לאמת את assay ברט לצורך זיהוי של heterodimerization בין החלבונים הומולוגיים FOXP2 וFOXP1, תאים היו transfected עם מבנים לביטוי של בלוציפראז (תורם) או YFP (acceptor) התמזגו שני FOXP2 (P2), FOXP1 (P1) או תמונות ב ') מיקרוסקופ פלואורסצנטי של תאי transfected עם YFP התמזגו FOXP1 (P1) או לFOXP2 (P2) - אות לוקליזציה גרעינית ()..

איור 7
ב ') תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של תאי transfected עם YFP התמזגו CtBP1 (CtBP) או לFOXP2 (P2).

איור 8
איור 8. הערכת ההשפעות של מוטציות FOXP2 פתוגניים על אינטראקציות בין חלבונים. א) תרשים סכמטי של חלבון FOXP2 המציג את עמדותיהם של מוטציות R553H וR328X אשר גורמות עבור נדירrm של דיבור והפרעת שפה. תחום dimerization הרוכסן לאוצין מוצג בירוק ותחום ה-DNA מחייבת בצהוב. ב ') על מנת להעריך את התועלת של assay ברט להערכת ההשפעה של מוטציות פתולוגי על אינטראקציות בין חלבונים, את ההשפעות של מוטציות R553H וR328X על היכולת של חלבוני FOXP2 מוטציה לdimerize עם FOXP2 הנורמלי נבדקה. תאים היו transfected עם מבנים לביטוי של בלוציפראז (תורם) או YFP (acceptor) התמזגו שני FOXP2 הרגיל (P2), FOXP2.R553H (553), FOXP2.R328X (328), או אות לוקליזציה גרעינית (-). C ) תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של תאי transfected עם YFP התמזגו FOXP2.R553H (R553H) או לFOXP2.R328X (R328X). בתמונה זו FOXP2.R328X הוא בעיקר גרעיני, אבל בתאים אחרים בתוך האוכלוסייה תערוכות הפצת cytoplasmic יותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

העיצוב של מבני ביטוי חלבון ההיתוך הוא שלב קריטי בהקמת assay ברט. בניסויים שהוצגו כאן, החלבונים של העניין היו התמזגו C-הסופית של בלוציפראז או YFP. זה גם אפשרי, וייתכן שיהיה צורך, הפתיל חלבונים N-הסופית של בלוציפראז / YFP. עבור חלק מחלבונים, התכה עשויה להתקבל רק בבית או N-או C-הסופית על מנת למנוע שיבוש של מבנה חלבון ותפקודו. יתר על כן, לחלבונים הטרנסממברני בי N וTermini C מתגוררים בתאי subcellular שונים, לוציפראז / חלבון YFP יש התמזגו לתחנה הסופית שבו נמצאת באותו התא ששותף האינטראקציה. לדוגמא, במחקרים על יחסי הגומלין בין רצפטורים הטרנסממברני G-חלבון בשילוב וβ-arrestin cytoplasmic, לוציפראז היה התמזגו לזנב carboxyl תאיים של הקולטן הטרנסממברני 8. במקרים אחרים את הגיאומטריה של interacti חלבוניםבעלול להוביל להעברת אנרגיה להיות יעילה יותר באמצעות אחת משני הצירופים האפשריים של חלבוני היתוך. מדי פעם העברת אנרגיה לא יכולה להיות מזוהה בכלל אם רק באמצעות שילוב אחד, מה שמוביל לתוצאות שליליות כוזבות.

הרצף של פפטיד מקשר בין לוציפראז / YFP והחלבון של עניין עשוי להשפיע גם על היעילות של העברת אנרגיית תהודה. מקשר צריך להיות ארוך מספיק כדי לאפשר לוציפראז / YFP והחלבון של עניין לקפל ללא מעצור. מקשר ארוך יותר יהיה להקנות גמישות רבה יותר לפוליפפטיד בצומת בין לוציפראז / YFP והחלבון של עניין, אשר עשוי להגביר את יעילות ברט ידי הקלת יישור של הדיפולים תורם acceptor. עם זאת, יעילות ברט עלולה להפחית, אם יש יותר מדי גמישות במקשר. בניסויים כאן, שיבוט של החלבונים של עניין לאתרי BamH אני וXba אני של vec הביטויtors הביא מקשר חומצה 23-אמינו, כפי שמוצג באיור 1. מקשר זה היה מוצלח לאיתור יחסי גומלין בין כמה זוגות של חלבונים.

לפני שתמשיך לברט ניסויים יש להבטיח כי חלבוני ההיתוך לשמור על פעילות ביולוגית נורמלית. התפקוד של YFP ניתן להעריך על ידי הדמיה ישירה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. התפקוד של בלוציפראז ניתן assayed באמצעות ערכות זמינות מסחרי. ההשפעה של היתוך על לוקליזציה subcellular של חלבונים של עניין ניתן להעריך על ידי immunostaining, או במקרה של YFP התכה, על ידי הדמיה ישירה. ההשפעה של היתוך על התפקוד של החלבון של עניין יכולה להיחקר על ידי מבחני חלבון ספציפי - למשל, לגורם שעתוק זה עשוי להיות מתאים לפעילות assay-DNA מחייבת. ראוי לציין, כי מדידות הארה שנעשו במהלך הניסוי לספק נוח לאשר ב- assayע פעילות לוציפראז.

חשוב לשקול מה מבני הבקרה הנאותים לחלבון של עניין שלך. YFP ולוציפראז הם בעיקר cytoplasmic ולכן בקרות מתאימות כאשר החלבונים של עניין הם cytoplasmic. עם זאת, כאשר החלבונים של ריבית מקומיים לתאי subcellular אחרים זה עשוי להיות רצוי לשנות לוציפראז וYFP עם אותות פפטיד לכוון הסחר שלהם לתא הרלוונטי. הנה החלבונים של העניין היו גורמי שעתוק שהם מקומיים לגרעין, ולכן לוציפראז וYFP שונו על ידי התוספת של אות לוקליזציה גרעינית. באופן ספציפי, פפטיד הכולל את אות הלוקליזציה הגרעינית של האנטיגן SV40 הגדול T (CGYGPKKKRKVGGLDN) צורף כנספח לC-הסופית של בלוציפראז וYFP ידי ligating oligonucleotides פעמיים תקועים סינתטית בין HI Bam ואתרי Xba של הוקטורי דואר pLuc וpYFP. תוספת של אות זה גרמה חלוקה מחדש משמעותי של חלבון לגרעין (איור 4).

כולל שליטה והבקרה הנאותה חיוני לפרשנות של ניסויי ברט. שליטה מדומה transfection באמצעות פלסמיד מילוי אינרטי היא חיונית כדי לקבוע רמות רקע של הארה וקרינה כתוצאה מרעש luminometer והתמוטטות אנזים עצמאי של מצע. עם luminometers המודרני ומצעי לוציפראז רמות הארה רקע הן בדרך כלל נמוכות מאוד. Transfection עם לוציפראז הבקרה המתאים לבנות בהיעדר מבנה YFP חשוב להקים את שיעור פליטת לוציפראז שהוא זוהה בטווח הפליטה של ​​YFP בהעדר acceptor ברט. Transfection עם לוציפראז השליטה ובקרת YFP בונה מספק אות ברט הבסיסי הנובעת מאינטראקצית לוק-YFP. לערבזוג ר"י של חלבונים הנבדקים לאינטראקציה, חשוב לtransfect כל אחד לבד עם מבנה הבקרה המתאים, כפי שמודגם באיור 3 ב, לשלוט בכל אינטראקציה שאינה ספציפית בין החלבונים שנבדקו ולוציפראז / YFP. במיוחד בעת ביצוע ניסוי ברט בפעם הראשונה, חשוב לכלול חלבון היתוך לוק-YFP בקרה חיובית על מנת להבטיח שאות ברט היא נצפות בהתקנה הניסיונית שלך. הנה רצף הקידוד של YFP שובט לתוך pLuc באתרים בם HI וXba אני לייצר חלבון היתוך שבי YFP הוא קבע את C-הסופית של לוציפראז.

בפרוטוקול המתואר כאן, בהרכב של ה-DNA תערובות transfection חושבו בהנחה שהגודל הממוצע של ביטוי חלבון היתוך לוק / YFP בונה הוא לא יותר מאשר 7.5 kb. אם construc הביטויts הוא גדול יותר באופן משמעותי מזו, ולאחר מכן את מספר השומות של כל מבנה ביטוי הוסיף לתערובת transfection עשוי להיות מופחת, כך שהסכום הכולל של ה-DNA בתמהיל אינו עולה על המקסימום המותר בסך של מגיב transfection. לחלופין הסכום של מגיב transfection וכמות ה-DNA בכל תערובות transfection יכול להיות מוגבר בעקבות ההנחיות של היצרן. מניפולציה ניסויית של צלחות 96, גם היא מזורזת על ידי השימוש בטפטפות רבת ערוצים ויניקת אוויר. רצוי לצמצם את השונות בין דגימות באורך זמן דגירה תערובת transfection לאחר תוספת של ה-DNA לתערובת מגיב בינוני / transfection ללא סרום, לכן להתחיל להוסיף transfection מתערבב לתאים בהקדם התמהיל הראשון כבר דוגרים במשך 10 דקות . מכיוון שחלבוני acceptor ברט הם התכה YFP, ניתן להעריך את יעילות transfection על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי או על ידי מדידת הקרינה בmicroplate מחדשאדר. הצלחה של ניסוי ברט תלוי ברמה טובה של transfection ולכן רצוי להבטיח transfection שהוא משביעת רצון לפני שתמשיך לתוספת של מצע ומדידה של אות ברט. תג YFP גם מאפשר כימות של רמות ביטוי חלבון acceptor באמצעות קורא microplate. כימות של רמות חלבון acceptor עשויה להיות שימושית עבור אופטימיזציה ובעיות ירי של ניסויי ברט.

תאים צריכים להיות טופחו במשך לפחות שעה 2 עם מצע לוציפראז לפני מדידת אות ברט על מנת להבטיח שאות יציבה הושגה. כמו כן, מקובל על דגירה תאים עם מצע עד 24 שעה. במקרה זה בסך הכל ספירת הארה תהיה נמוכה יותר, אבל יחסי ברט צריכים להיות ללא שינוי. incubations יותר עם ​​מצע עשוי להיות נוח יותר (לדוגמא, בלילה) וגם מאפשר המדידה של אותות ברט לפני ואחרי מניפולציה ניסויית כזהכתוספת של תרכובת תרופות. באופן אידיאלי, לייעל את צפיפות זריעת תאים, כך שתאים מגיעים confluency בערך בזמן מדידה. אם צפיפות תאים היא מעל אופטימלי אז זה יכול להיות יתרון למדידת אות ברט בנקודת זמן מוקדמת יותר, כדי למנוע צמיחת יתר של תאים. אם אתה משתמש בסוג התא אחר מאשר HEK293, כדי להיות בטוח כדי לייעל את תנאי תרבית תאים וtransfection. ניסויי ברט גם בוצעו בהצלחה בתאי הלה באמצעות הפרוטוקול המתואר כאן.

בניסויים שתוארו כאן, ספירות הארה נמדדו בטמפרטורת חדר, שהיא הטמפרטורה האופטימלית לפעילות לוציפראז Renilla. אם ביצוע ניסוי בזמן קורס בluminometer עדיף להגדיר את הטמפרטורה ב 37 ° C. אנחנו ביצענו את אותו ניסויים בטמפרטורת חדר ועל 37 מעלות צלזיוס ואין הבדל משמעותי בתוצאות שנצפה. אם ביצוע ניסויים בטמפרטורת חדר, הצלחת דואר צריכה להיות מותרת לאזן 10 דקות בתוך luminometer לפני המדידה כדי לאפשר התייצבות פעילות לוציפראז Renilla. הנה, אותות הארה שולבו מעל 10 שניות, אשר בדרך כלל מספקת רגישות גבוהה, בעיקר לחלבונים עם רמות ביטוי נמוכות. עם זאת, אותות עשויים להיות משולבים על פני תקופות זמן קצרות יותר אם זה מספק רגישות מספקת. בשל היציבות של אות הארה המיוצרת על ידי מצע לוציפראז לחיות תאים, מקובל למדוד עד 10 שניות לכל גם בכל אורך גל.

אינטראקציה בין שני חלבונים של העניין אושר על ידי assay ברט כאשר האות ממצב הבדיקה עולה באופן משמעותי את האותות מתנאי בקרה עליהם. היעדר אות ברט הוא לא בהכרח אישור לכך שאינטראקציה אינה מתרחשת. במקרה של תוצאה בלתי צפויה או שלילית, הארה ולזרוח בסך הכליש לבחון את ספירת NCE כדי להבטיח שכל הבארות היו transfected בצורה נכונה.

אות ברט מושפעת גם מהיחס של רמות ביטוי חלבון ולכן כדאי לבחון את רמות הביטוי היחסית של שני חלבונים של עניין על ידי השוואת ספירות הקרינה מן הבארות transfected עם התכה YFP של שני חלבונים (או ספירות הארה מ בארות transfected עם התכה לוציפראז). כאשר חלבון היתוך אחד מבטא בעצמה רבה יותר מאשר אחרים, תוצאות טובות יותר עשויות להיות מושגת אם החלבון עם רמת הביטוי הנמוכה יותר התמזגו לוציפראז, שהיה במקרה של FOXP2 וCtBP1 בניסויים שהוצגו כאן. כמו כן ניתן לתפעל את רמות חלבון על ידי התאמת היחס טוחנת של פלסמידים ביטוי בתמהיל transfection. העברת אנרגיה בין זוגות מסוימים של חלבוני היתוך עשויה להיות מאוד לא יעילה בשל הגיאומטריה של החלבון מורכב. ב כגוןמקרים שזה עשוי להיות כדאי לנסות פיוזינג החלבונים של עניין לטרמיני החלופי של לוציפראז / YFP.

זה הכרחי כדי לוודא שאות ברט מייצגת אינטראקציה בין חלבונים פיסיולוגיים ולא פשוט בגלל ביטוי יתר של חלבון. מסיבה זו חשובה להימנע מביטוי יתר גולמי של חלבונים. הספציפיות של אינטראקציה בין חלבונים במערכת ברט נוספים יכולות להיות מאושרות על ידי החדרת מוטציות בחלבונים שידועים כי הם להפחית את הזיקה של האינטראקציה, כפי שמודגם כאן באמצעות גרסת DE400 של FOXP2. חלבוני המוטציה נוספים יכולים להיות בשימוש בתחרות ורוויה מחייבת מבחני ברט. בassay תחרות, הריכוזים של תורם וחלבונים היתוך acceptor נשמרים קבועים תוך הגדלת הריכוז של גרסה לא מתויגת של אחד מבני זוג האינטראקציה כמתחרה. חלבון לא מתויג פראי מהסוג צריך להתחרות עם v מתויגersion מחייב את שותף האינטראקציה שלה, וכתוצאה מכך ירידה באות ברט, ואילו חלבון המוטציה צריך להפגין יכולת מופחתת להתחרות את האינטראקציה. בassay הרוויה מחייב, את הריכוז של חלבון היתוך התורם נשמר קבוע, תוך הגברת הריכוז של acceptor. לאינטראקציה ספציפית אות ברט צריך סופו של דבר שיא התפוקה כמו כל המולקולות התורמות הפכו רווי בacceptor. לאינטראקציה שאינה ספציפית, אות ברט תהיה בדרך כלל מראה עלייה ליניארית קטנה כתוצאה מגידול בהתנגשויות אקראיות בין מולקולות תורם acceptor. בפועל, לאינטראקציות של זיקה מתונה בין חלבונים מסיסים, זה עלול להיות קשה כדי להשיג מספיק acceptor גבוה: יחס תורם להתבונן הרוויה תוך שמירה על הרמות מספקות של החלבון התורם לגילוי אות.

יש להיזהר בפרשנות של differences בין יחסי ברט. Assay ברט אינו מספק מדד כמו הזיקה של אינטראקציה בין חלבונים, כי היעילות של העברת אנרגיה מושפעת מגורמים אחרים מאשר כוחו של האינטראקציה בין חלבונים. גורמים אלה כוללים את היחס בין הרמות של חלבוני ההיתוך בתוך התא, את הגיאומטריה של האינטראקציה, ושיעורי התאגדות והניתוק של המתחם. היחסים שהושגו עם שני זוגות שונים של חלבונים ולכן לא בהכרח יכולים להיות בהשוואה, אבל השוואות עשויות להיות אפשריות בין גרסאות השונות של אותו החלבון, כגון עם wild-type ו ΔE400 גרסאות של FOXP2 שמוצגים כאן. לפעמים, יחסי ברט שליליים במקצת יכולים להיות שנצפו. יחס שלילי עלול לנבוע מהשגיאה במדידת היחס הבסיסי בתאי transfected עם רק וקטור pLuc השליטה. יחס גבוה מאוד לעתים קרובות מעיד על צבירת חלבון, אשר יכול להיות מאושרת על ידי תצפית של ce transfectedLLS עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי. יש לקבוע את זה אם הצבירה היא רלוונטית או חפץ של ביטוי יתר של חלבון מבחינה ביולוגית.

לסיכום, assay ברט המתואר כאן הוא גישה רבת עוצמה כדי לחקור אינטראקציות בין חלבונים בתאים חיים. היישום של ברט הודגם לצורך אימות interactors מועמד ממחקרי הקרנת proteomic, זיהוי שאריות ספציפיות מעורבות באינטראקציות בין חלבונים, והערכת ההשפעות של מוטציות שנמצאו ב-DNA של המטופל. בגלל אינטראקציות מזוהות בזמן אמת ללא הדרישה לתמוגה תא, אות ברט ניתן למדוד לפני ואחרי טיפול כגון תוספת של תרכובת או יגנד 7 תרופות. Assay ברט מראה הבטחה גדולה לשימוש במחקר גנומיקה תפקודי כדי להעריך את הרלוונטיות הביולוגיות של וריאנטים גנטיים שהתגלו במהלך רצף של הדור הבא.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי אגודת מקס פלנק.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nanodrop 8000 Nanodrop Any spectrophotometer capable of reading absorbances at 260 nm will be suitable. Determining the molecular mass of the plasmid is crucial for calculating DNA quantities to be used in transfection mixes.
96-microwell plates, flat bottom, white Greiner Bio One 655098 White plates reduce the crosstalk between wells and maximize the sensitivity of luminescence detection. Clear-bottomed wells allow monitoring of cell density. Plates must be suitable for cell culture. If using a top-reading luminometer the plate lid should be taken off.
Infinite F200Pro plate reader with control software TECAN Use the 'Blue 1' and 'Green 1' filters for luminescence measurement and the filter sets and dichoic mirror for GFP for fluorescence measurement. Any top-reading plate reader with capability of measuring dual-color luminescence and fluorescence is suitable. 
pLuc, pYFP, positive control plasmid N/A N/A Plasmids available from the authors upon request.
pGEM-3Zf(+) Promega P2271 Filler plasmid for equilization of DNA mass in transfection mixes. Any plasmid lacking a eukaryotic promoter would be suitable.
HEK293 cells ECACC 85120602 Other cell lines that transfect with reasonable efficiency may be suitable.
DMEM, high glucose, with phenol red Gibco 41966 This is the medium used for culturing HEK293 cells. Warm in 37 °C waterbath before use. If using a different cell line, replace the growth medium described here with cell-line specific medium.
DMEM, high glucose, no phenol red (substrate dilution medium) Gibco 21063 This is the substrate dilution medium used for dilution of the luciferase substrate (EnduRen) as it does not contain phenol red, which reduces the sensitivity of the assay. Contains HEPES to maintain correct pH during luminescence measurements while cells are out of the CO2 incubator. Warm in 37 °C waterbath before use.
OptiMEM Gibco 31985 OptiMEM is used for dilution of GeneJuice transfection reagent. Other serum-free media would also be suitable. Warm to room temperature before use.
Fetal bovine serum Gibco 10270 For supplementation of cell culture media at a concentration of 10% v/v.
GeneJuice transfection reagent Novagen 70967 If using a cell line other than HEK293, it may be necessary to adjust the ratio of Genejuice transfection reagent to DNA in the transfection mixes. Other transfection reagents may be used. If using an alternative transfection reagent, it may be necessary to optimize the amount of DNA used in the transfection mixes based on manufacturer's instructions.
DMSO Sigma D2650 Use sterile DMSO that is suitable for tissue culture. 
EnduRen live-cell substrate Promega E6481 Reconstitute EnduRen at 34 mg/ml in DMSO. Upon dilution of EnduRen in culture medium a precipitate may form. This will not interfere with the assay. Store reconstituted EnduRen at -20 °C, and avoid multiple freeze-thaw cycles. Ensure that reconstituted EnduRen is completely thawed before diluting it in culture medium.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Suter, B., Kittanakom, S., Stagljar, I. Two-hybrid technologies in proteomics research. Curr Opin Biotechnol. 19, 316-323 (2008).
  2. Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 645-654 (2007).
  3. Berggard, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7, 2833-2842 (2007).
  4. Ciruela, F. Fluorescence-based methods in the study of protein-protein interactions in living cells. Curr Opin Biotechnol. 19, 338-343 (2008).
  5. Pfleger, K. D., Eidne, K. A. Illuminating insights into protein-protein interactions using bioluminescence resonance energy transfer. BRET). Nat Methods. 3, 165-174 (2006).
  6. Boute, N., Jockers, R., Issad, T. The use of resonance energy transfer in high-throughput screening. BRET versus FRET. Trends Pharmacol Sci. 23, 351-354 (2002).
  7. Pfleger, K. D., et al. Extended bioluminescence resonance energy transfer (eBRET) for monitoring prolonged protein-protein interactions in live cells. Cell Signal. 18, 1664-1670 (2006).
  8. Kocan, M., Dalrymple, M., Seeber, R., Feldman, B., Pfleger, K. Enhanced BRET technology for the monitoring of agonist-induced and agonist-independent interactions between GPCRs and β-arrestins. Frontiers in Endocrinology. 1, (2011).
  9. Boute, N., Pernet, K., Issad, T. Monitoring the activation state of the insulin receptor using bioluminescence resonance energy transfer. Mol Pharmacol. 60, 640-645 (2001).
  10. Perroy, J., Pontier, S., Charest, P. G., Aubry, M., Bouvier, M. Real-time monitoring of ubiquitination in living cells by BRET. Nat Methods. 1, 203-208 (2004).
  11. Roduit, R., Escher, P., Schorderet, D. F. Mutations in the DNA-binding domain of NR2E3 affect in vivo dimerization and interaction with CRX. PLoS One. 4, (2009).
  12. Deriziotis, P., Fisher, S. E. Neurogenomics of speech and language disorders: the road ahead. Genome Biol. 14, 204 (2013).
  13. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2012).
  14. Lai, C. S., Fisher, S. E., Hurst, J. A., Vargha-Khadem, F., Monaco, A. P. A forkhead-domain gene is mutated in a severe speech and language disorder. Nature. 413, 519-523 (2001).
  15. Fisher, S. E., Scharff, C. FOXP2 as a molecular window into speech and language. Trends Genet. 25, 166-177 (2009).
  16. Graham, S. A., Fisher, S. E. Decoding the genetics of speech and language. Curr Opin Neurobiol. 23, 43-51 (2013).
  17. O'Roak, B. J., et al. Exome sequencing in sporadic autism spectrum disorders identifies severe de novo mutations. Nat Genet. 43, 585-589 (2011).
  18. Horn, D., et al. Identification of FOXP1 deletions in three unrelated patients with mental retardation and significant speech and language deficits. Hum Mutat. 31, 1851-1860 (2010).
  19. Hamdan, F. F., et al. De novo mutations in FOXP1 in cases with intellectual disability, autism, and language impairment. Am J Hum Genet. 87, 671-678 (2010).
  20. Talkowski, M. E., et al. Sequencing chromosomal abnormalities reveals neurodevelopmental loci that confer risk across diagnostic boundaries. Cell. 149, 525-537 (2012).
  21. Li, S., Weidenfeld, J., Morrisey, E. E. Transcriptional and DNA binding activity of the Foxp1/2/4 family is modulated by heterotypic and homotypic protein interactions. Mol Cell Biol. 24, 809-822 (2004).
  22. MacDermot, K. D., et al. Identification of FOXP2 truncation as a novel cause of developmental speech and language deficits. Am J Hum Genet. 76, 1074-1080 (2005).
  23. Vernes, S. C., et al. Functional genetic analysis of mutations implicated in a human speech and language disorder. Hum Mol Genet. 15, 3154-3167 (2006).
חוקר חלבונים אינטראקציות בתאים חיים באמצעות העברת פליטת אור התהודה אנרגיה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer. J. Vis. Exp. (87), e51438, doi:10.3791/51438 (2014).More

Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer. J. Vis. Exp. (87), e51438, doi:10.3791/51438 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter