Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Исследование белок-белковых взаимодействий в живых клетках с помощью биолюминесценции резонансный перенос энергии

doi: 10.3791/51438 Published: May 26, 2014
* These authors contributed equally

Summary

Взаимодействия между белками являются основополагающими для всех клеточных процессов. Использование биолюминесценции резонансный перенос энергии, взаимодействие между парой белков можно контролировать в живых клетках и в реальном времени. Кроме того, эффекты потенциально патогенных мутаций могут быть оценены.

Abstract

Анализы, основанные на Биолюминесценция резонансный перенос энергии (BRET) обеспечивают чувствительные и надежные средства контроля за белок-белковых взаимодействий в живых клетках. BRET является безызлучательное передача энергии от «донора» фермента люциферазы к «акцепторной» флуоресцентного белка. В наиболее общем конфигурации этом анализе донор Renilla reniformis люциферазы и акцептора желтый флуоресцентный белок (YFP). Поскольку эффективность передачи энергии сильно зависящая от расстояния, наблюдение явления BRET требует, чтобы донор и акцептор находиться в непосредственной близости. Для проверки взаимодействия между двумя представляющих интерес белков в культивируемых клетках млекопитающих, один белок экспрессируется в виде слияния с люциферазы, а второй в виде слияния с YFP. Взаимодействие между двумя представляющих интерес белков может привести донора и акцептора достаточно близко для передачи энергии происходит. По сравнению с другими методами для исследования белок-белковых ввзаимодействий, анализ BRET чувствителен, требует мало практического времени и несколько реагентов, и способен обнаруживать взаимодействия, которые слабы, преходящее, или зависит от биохимической среде найденного в живой клетке. Поэтому идеальный подход для подтверждения предполагаемых взаимодействий предложенные дрожжей двух гибридных или масс-спектрометрии протеомики исследований, и, кроме того это хорошо подходит для отображения взаимодействия регионов, оценивает эффект от пост-трансляционных модификаций на белок-белковых взаимодействий, и оценки воздействия мутаций, выявленных в ДНК пациента.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Оба классическая связь и следующего поколения секвенирования анализ нарушений в организме человека являются выявление клиническую значимость белков, участвующих в диапазоне биологических путей. Это часто бывает, что до их идентификации в таких исследований, было мало или вообще не исследование биологической роли этих белков. Один плодотворным начать изучение биологической функции белка интереса является определить, какие другие белки он взаимодействует с в физиологическом контексте. Характеризуя молекулярные сети таким образом дает представление о биологических путей, лежащих в основе фенотипа человека.

Наиболее часто используемый масштабный скрининг подходов для идентификации партнеров кандидатов взаимодействия белков, представляющих интерес, дрожжи двугибридная скрининг 1 и масс-спектрометрии на основе протеомики 2. Эти методы могут быть очень успешным в предложении потенциальных взаимодействующих белков, но аре уязвимы к ложным положительным результатам. Таким образом, подтверждение взаимодействия, определенных дрожжей двух гибридных или массового скрининга спектрометрии требуется проверку взаимодействия с использованием второго технику. Обычно со-иммунопреципитацию или тянуть вниз анализ используют для этой цели 3. Одним из недостатков использования таких методов для проверки является требование к лизису клеток, которая разрушает внутриклеточные условия, которые могут быть необходимы для поддержания определенных белковых взаимодействий. Вторым недостатком является то, что слабые или переходные белковых взаимодействий может быть нарушена во время стадий промывки. Кроме того, эти анализы требуют значительных практического времени, ограничены в количестве образцов, которые могут быть обработаны одновременно, и часто требуют много времени оптимизации реагентов и протоколов.

Чтобы преодолеть некоторые из проблем, связанных с со-иммунопреципитации экспериментов, несколько анализы были разработаны на основе флуоресцентных и bioluminescent белки, которые могут быть использованы в живых клетках. Первые такие анализы были основаны на флуоресценции (или Ферстер) резонансный перенос энергии (FRET), не-лучистого переноса энергии между двумя флуоресцентных белков с перекрытием спектров испускания и возбуждения 4. Эффективность передачи энергии сильно зависящая от расстояния, поэтому наблюдение явления FRET требует, чтобы доноров и акцепторов флуорофоры находиться в непосредственной близости. Для проверки взаимодействия между двумя белками, представляющих интерес, один белок экспрессируется в виде слияния с донорного флюорофора (обычно голубой флуоресцентный белок; CFP) и второй виде слитого с акцепторного флюорофора (обычно желтого флуоресцентного белка; YFP). Взаимодействие между двумя белками интересов может привести донора и акцептора флуорофоры достаточно близкие для передачи энергии происходят, что приведет к ощутимым увеличением эмиссии света от YFP акцепторной относительно донора CFP. FRET успешно обнаружения белок-белковых взаимодействий в живых клетках 4. Основным недостатком использованием FRET для обнаружения белок-белковых взаимодействий является требование наружного освещения для возбуждения доноров флуорофора. Внешние результаты освещенности в высоком фоне в сигнале выбросов, нежелательного возбуждения акцептора и фотообесцвечивания как донора и акцептора флуорофорами. Эти эффекты уменьшить чувствительность анализа для обнаружения белок-белковых взаимодействий.

Модификация FRET анализа, который преодолевает проблему высокой фоне из наружного освещения является передача Биолюминесценция резонансной энергии (BRET) анализ 5,6. В системе BRET донор флуорофор заменен фермента люциферазы. Таким образом, энергия возбуждения акцепторного флюорофора генерируется внутри системы окислением люциферазы субстрата, что делает ненужным внешний освещение. В наиболеестандартная конфигурация этого анализа, донором является Renilla reniformis люциферазу и акцептора YFP (для обсуждения альтернативного донора и акцепторных белков см. Pfleger соавт. 5). Соответственно, в этой системе, представляющий интерес белок слит с люциферазы и потенциально-взаимодействующего белка к YFP, или наоборот. BRET анализ требует добавления коэлентеразина в качестве субстрата для люциферазы. Поскольку целентеразин является проницаемым для клеток, можно выполнить BRET анализов в живых клетках. Тем не менее, родной целентеразин неустойчиво в водном растворе, и фермент-независимый пробой коэлентеразина и снижает концентрацию субстрата, доступной для анализа и генерирует autoluminescence, что снижает чувствительность измерений активности люциферазы. Использование BRET в живых клетках было облегчено развитию охраняемых coelenterazines, устойчивых в водном растворе, но расщепляются цитозольным эстеразыс после диффузии через клеточную мембрану, чтобы генерировать активный коэлентеразина внутри клетки 7.

После добавления субстрата в клетках, экспрессирующих люциферазы-и YFP-слитые белки, передача энергии в результате белок-белковых взаимодействий количественно путем мониторинга выбросов от люциферазы и YFP. Поскольку белковые взаимодействия можно контролировать непосредственно в живых клетках в мульти-луночных планшетах, анализ BRET представляет собой простую, масштабируемую способ проверки предполагаемых взаимодействий, что является экономически и эффективный по времени.

В дополнение к проверке предполагаемых interactors выявленных в протеомных скрининговых исследований, система BRET также может быть использован для тестирования кандидатов interactors, вытекающих из предыдущих биохимических и структурных исследований по представляющим интерес белком. После того, как существование белок-белкового взаимодействия было установлено (либо с помощью анализа BRET или другими методами), существует возможность BRET анализ быть EMPloyed далее характеризуют взаимодействие. Например, взаимодействующие участки могут быть отображены путем генерации усеченные варианты белков, и вовлечение специфических остатков в взаимодействия может быть продемонстрирована путем создания точечных мутаций. Кроме того, модулирующее действие посттрансляционных модификаций или малых молекул (например, лекарственных препаратов или лигандов) на белок-белковых взаимодействий могут быть исследованы 8-10.

BRET анализ также имеет большой потенциал для исследования мутаций, выявленных в ДНК пациента. В случаях, когда была создана причинную роль для мутации, изучении влияния мутации на белок-белковых взаимодействий с помощью BRET может выявить больше о молекулярном этиологии фенотипа 11. С появлением методик секвенирования следующего поколения, становится все более распространенным в течение нескольких потенциально повреждающих мутации, которые будут определены в течение индивидуума, и в этом случае остается неясным, которые РелеВант в фенотипе 12. В этой ситуации анализ BRET может быть ценным в оценке воздействия мутаций на функцию белка и, следовательно, их актуальность для расстройства.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Создание плазмид

  1. Субклонировани кДНК для каждого интересующего белка в обоих векторов pLuc и pYFP, ​​с использованием стандартных способов молекулярной биологии (рис. 1). Подробные протоколы см. Зеленый и др. 13.
  2. Последовательность всех строит, чтобы убедиться, что белки интересные в рамке с последовательностью Люк / YFP без промежуточных стоп-кодонов.
  3. Выполнение функциональных анализов по желанию, чтобы подтвердить, что слитые белки сохраняют биологическую активность. В случае представленной здесь внутриклеточной локализации слитых белков YFP было установлено путем флуоресцентной микроскопии.
  4. Сделать плазмиды экспрессии для соответствующих белков управления Люк и YFP инженерными соответствующие сигналы таргетинга в векторы экспрессии pLuc и pYFP. В случае, представленном здесь, генерировать ядерных таргетингом Luc и YFP конструкции, вставив сигнал ядерной локализации в векторы pLuc и pYFP.
  5. Делатьположительное конструкция управления, в котором Люк и YFP слиты в единый полипептид. В случае, представленном здесь, генерировать положительный контроль, в котором кодирующая последовательность YFP вставлен в вектор pLuc.
  6. Выбор нейтральный наполнитель плазмиды, которые будут использоваться для выравнивания массу ДНК в трансфекции смесей. Использование плазмиды, которая не имеет эукариотический промотор и, следовательно, будет транскрипционно неактивный в клетках млекопитающих, таких как бактериальный клонирующий вектор.

2. Подготовка ДНК Mixes

  1. Оценить концентрацию всех плазмид, описанных в разделе 1 на основе поглощения при 260 нм (1 оптическая плотность единица эквивалентна 50 мкг / мл ДНК). Определить молекулярную массу каждой плазмиды путем умножения количества пар оснований на 650 дальтон. С помощью концентрации и молекулярную массу вычислить молярную концентрацию каждого препарата плазмиды. Развести препараты плазмидной ДНК в концентрации 36 нМ. Это будут рабочие запасы, который будет использоваться для приготовления смесей ДНК для трансфекции.
  2. Приготовьте смесь управления ДНК, содержащего 1800 нг плазмиды наполнителя в конечном объеме 20 мкл воды.
  3. Подготовьте смесь управления ДНК, содержащего 5 мкл pLuc контроля конструкции. Добавить заливной плазмиды довести общую массу ДНК в 1800 нг. Добавьте воду, чтобы довести до конечного объема 20 мкл.
  4. Подготовьте смесь управления ДНК, содержащего 5 мкл pLuc контроля конструкции и 5 мкл pYFP контроля конструкции. Добавить заливной плазмиды довести общую массу ДНК в 1800 нг. Добавьте воду, чтобы довести до конечного объема 20 мкл.
  5. Приготовьте смесь управления ДНК, содержащего 5 мкл положительного контроля конструкции. Добавить заливной плазмиды довести общую массу ДНК в 1800 нг. Добавьте воду, чтобы довести до конечного объема 20 мкл.
  6. Подготовьте следующие ДНК смешивается для проверки гомодимеризации белка интересов, X. Для каждой смеси ДНК объединить 5 мкл соответствующего pLuc построить и 5 мкл РуFP построить. Добавить заливной плазмиды довести общую массу ДНК в 1800 нг. Добавьте воду, чтобы довести до конечного объема 20 мкл.
    А) pLuc-контроль и pYFP-X
    Б) pLuc-X и pYFP-контроль
    С) pLuc-X и pYFP-X
  7. Подготовьте следующие ДНК смешивается для проверки взаимодействия между парой белков, представляющих интерес, X и Y. Для каждой смеси ДНК объединить 5 мкл соответствующего pLuc построить и 5 мкл pYFP построить. Добавить заливной плазмиды довести общую массу ДНК в 1800 нг. Добавьте воду, чтобы довести до конечного объема 20 мкл.
    А) pLuc-контроль и pYFP-X
    Б) pLuc-X и pYFP-контроль
    С) pLuc-контроль и pYFP-Y
    D) pLuc-Y и pYFP-контроль
    Е) pLuc-X и pYFP-Y
    F) pLuc-Y и pYFP-X

3. Трансфекцию

  1. Урожай субконфлюентные HEK293 клетки от 75 см 2 колбы. Развести 10% от общего количества клеток в 13 мл культуральной среды. Внесите 130 мкл клеточной суспензии в каждую лунку белыйпрозрачным дном 96-луночного планшета для культуры ткани. Культуры клеток течение 24 часов.
  2. Рассчитайте количество скважин для трансфекции путем умножения количества миксов ДНК на 3. Принесите бессывороточную культуральной среды до комнатной температуры. Подготовка основной смеси, содержащей 6,3 мкл бессывороточной среды и 0,18 мкл реагента для трансфекции на лунку. Смешайте на вортексе и инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин.
  3. Подготовка трансфекции смеси путем добавления 2 мкл смеси ДНК в 20 мкл сыворотки средний / трансфекции реагента мастер-микса. Не вихрь. Инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин.
  4. Трансфекции три скважины с каждым трансфекции смеси дозирования 6,5 мкл трансфекции смеси в каждую лунку. Культура клетки для дальнейшего 36-48 часов.

4. Измерение BRET сигнала

  1. Растворите живых клеток субстрата люциферазы в 34 мг / мл в ДМСО встряхиванием.
  2. Развести восстановленного субстрата люциферазы живых клеток на 1:1000 в подложки разбавления среды рповторно нагревали до 37 ° С. Разрешить 50 мкл субстрата разбавления среды на каждую лунку. Vortex перемешать. Может образовываться осадок, но не будет мешать анализа.
  3. Аспирируйте культуральной среды из 96-луночного планшета. Внесите 50 мкл разбавленного субстрата люциферазы живых клеток в каждую лунку. Культуры клеток, по крайней мере 2 часов (до 24 ч).
  4. Удалить крышку с 96-луночного планшета и инкубировать пластины в течение 10 мин при комнатной температуре внутри люминометра.
  5. Измерьте излучение Люком и YFP одной хорошо одновременно. Измерьте излучение Luc используя фильтр блокировки длины волн длиннее 470 нм. Измерьте излучение YFP ​​использованием 500-600 нм полосовой фильтр. Интеграция сигналы выбросов в течение 10 сек.

5. Анализ данных

  1. Среднее значение на основании показаний выбросов Luc от 3 скважины, которые получили только наполнитель плазмиды. Вычтите это значение от всех других показаний выбросов Luc производить значения выбросов Luc фоновые вычитается.
  2. Среднее значение на основании показаний выбросов YFP от 3 скважины, которые получили только наполнитель плазмиды. Вычтите это значение от всех других показаний выбросов YFP производить значения выбросов YFP фоновые вычитается.
  3. Для каждой лунки, разделить значение выбросов YFP фона вычитается на величину выбросов, Люк фон вычитается дать нескорректированного соотношение Брет.
  4. Нормальное нескорректированных отношения Брет из трех скважин, которые были трансфицированных только pLuc-контрольной плазмиды. Вычтите это значение от всех других неисправленных отношений BRET дать скорректированные коэффициенты Брет.
  5. Для каждого из оставшихся наборов исправленных коэффициентов BRET, усреднить значения за три трансфектированных скважин для получения конечного соотношение Брет.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Принцип BRET анализа показан на рисунке 2. Установка анализ используется во всех экспериментах, представленных здесь изображен на рисунке 3. Обнаружение сильного сигнала от BRET клеток, трансфицированных слитого белка люциферазы-YFP подтвердил, что передача энергии можно было наблюдать в этом экспериментальной установки (рис. 4).

Наше исследование фокусируется на роли семьи FOXP транскрипционных репрессоров в развитии мозга. Гетерозиготные мутации, затрагивающие FOXP2 привести к редкой формой речи и языка расстройства, из которых наиболее характерной особенностью является развития словесного диспраксии-трудность с производством сложных последовательностей orofocial мышечных движений, необходимых для речи 14-16. FOXP1 мутации были зарегистрированы у пациентов с расстройствами аутистического спектра и интеллектуальной инвалидности в сопровождении тяжелой слова и языковые проблемы 17-20. Взаимодействие FOXPs с другими белками расследуется получить представление о молекулярных механизмах, имеющих отношение к роли этих белков в развитии мозга.

FOXP2, как известно, образуют гомо-или гетеродимеры с другими членами FOXP семьи 21, поэтому FOXP2 гомодимеризация был использован для проверки Брет анализа (рис. 4). Чтобы исключить возможность того, что взаимодействие FOXP2 слитых белков в этом анализе был быть просто белка избыточной экспрессии, специфика взаимодействия была продемонстрирована путем введения мутации в лейциновой молнии димеризации области FOXP2 (в рамке удаление остатков E400), который Известно сорвать гомо-и гетеродимеризацию 21 (рис. 5А). Когда Luc-FOXP2.DE400 и YFP-FoxP2 слитые белки экспрессировали совместно, уменьшение сигнала BRET наблюдалось по сравнению с тем, когда Luc-FOXP2 и YFP-FOXP2 были ко-экспрессировали (фиг. 5В). Это сигнал снижение не было вызвано изменением в субклеточном локализации мутантного белка (фиг. 5C) или к разнице в уровне экспрессии как определено Вестерн-блоттинг (данные не показаны). Снижение сигнал наблюдался также при была выражена Люк-FOXP2 с YFP-FOXP2.DE400 (данные не представлены). Таким образом BRET эффективен в обнаружении белка гомодимеризацию, и взаимодействие белков остается конкретным, когда эти белки сверхэкспрессируется как люциферазы-и YFP-гибридов. Кроме того, использование BRET в сочетании с целенаправленной мутации белков имеет потенциал определить индивидуальные остатков, участвующих в белок-белковых взаимодействий.

Для оценки эффективности анализа BRET в обнаружении гетеротипические взаимодействия, взаимодействие FOXP2 с FOXP1 был протестирован (рис. 6). BRET сигнал наблюдался в обоих возможных конфигураций анализа (т.е. с FOXP2 как донора или акцептора Fusioн белка). Таким образом, анализ BRET способен обнаруживать как гомо-и гетеротипические взаимодействий. Кроме того, пригодность анализа BRET для обнаружения взаимодействие FOXP2 с не FOXP белков проходят проверку рассмотрении взаимодействия с CtBP1, транскрипционный ко-репрессор и известного партнера FOXP2 взаимодействия 21. Взаимодействие между CtBP1 и FOXP2 первоначально была предложена дрожжевой двухгибридной экране и был впоследствии подтверждено совместное иммунопреципитации экспериментов 21. Взаимодействие FOXP2-CtBP1 был обнаружен с помощью анализа BRET когда FOXP2 была белок слияния и донор CtBP1 был акцептор, но не в обратном конфигурации (7А). Такие результаты можно ожидать с системой BRET (см. обсуждение в разделе). Взаимодействие между FOXP2 и CtBP1 наблюдалось даже при том, что лишь незначительная доля CtBP1 был локализован в ядро (рис. 7В), подчеркивая чувствительность данного анализа. Таким образом, BRETанализ является полезным для проверки предполагаемых взаимодействий, выявленных в ходе дрожжей двухгибридной скрининга.

Наконец, анализ BRET была использована для изучения влияния патогенных мутаций в FOXP2 на белок-белковых взаимодействий. Два точечных мутаций в FOXP2, как сообщается, вызвать редкое аутосомно-доминантное заболевание, влияющих речь и язык (Рисунок 8а). Миссенс мутация R553H был обнаружен через изучение связей в многодетной семье, в которой половина членов были пострадавших от беспорядков 14. Ерунда мутация R328X был обнаружен путем целенаправленного секвенирования FOXP2 локуса в пробандов с диагнозом развития словесного диспраксии 22. Способность мутантных белков в димеризации с дикого типа FOXP2 оценивали с помощью анализа BRET. Результаты, использующие дикого типа FOXP2 в качестве донора и мутантного FOXP2 в качестве акцептора показаны на фиг.8В. Те же результаты были получены с использованием мutant FOXP2 в качестве донора и дикого типа в качестве акцептора (данные не показаны). Мутация R553H, который находится в ДНК-связывающим доменом FOXP2, не влияет на способность мутантного белка к димеризации с дикого типа. Таким образом, патогенный механизм этой мутации могут включать доминантный негативный эффект в результате димеризации мутанта с нормальным белком 23. Мутация R328X вводит преждевременный стоп-кодон, с тем результатом, что кодируемый белок не хватает лейцин молнии домен димеризации и ДНК-связывающий домен и цитоплазматический показывает некоторые неправильной локализации (рис. 8в). В соответствии с отсутствием домена димеризации и неправильной локализации в цитоплазму, усеченный белок показывает значительно снижается взаимодействие с диким типом FOXP2. Эта мутация Поэтому вероятно, являются патогенными в связи с гаплонедостаточности. Таким образом, анализ BRET может дать представление о биологических эффектов мутаций, обнаруженных у пациентов.


Рисунок 1. Векторы для экспрессии YFP-и люциферазы-слитых белков. А) Circle карты векторов pYFP и pLuc. Вектор pLuc используется для экспрессии люциферазы слитых белков, как BRET доноров. Вектор pYFP используется для экспрессии слитых белков YFP как акцепторы BRET. Векторы имеют CMV промотор CMV) для экспрессии высокого уровня в клетках млекопитающих, сайт множественного клонирования (MCS) для вставки кДНК для белков, представляющих интерес, и ген устойчивости к канамицину (Кан г) и бактериальное происхождение репликации для распространения плазмиду в бактерий. B) сайт множественного клонирования векторов pLuc и pYFP. В конце кодирующей последовательности YFP показаны синим цветом. Отдельные сайты рестрикции аннотированный. Следует отметить, что сайт Xba I блокируется Овеrlapping плотины метилирование в стандартных штаммов E. палочка. кДНК, кодирующие белки, представляющих интерес, должны быть клонированы в рамке с аминокислотной последовательностью, показанной. В экспериментах, описанных здесь, вставки клонировали в сайты рестрикции Bam HI и Xba I (подчеркнуты). Стоп-кодонов были удалены из конца люциферазы и YFP кодирующие последовательности, чтобы обеспечить открытую рамку считывания, охватывающий люциферазы / YFP и субклонировали кДНК интерес. Стоп-кодонов присутствуют в конце сайтом множественного клонирования во всех трех рамок считывания (красный), поэтому это не существенно, чтобы включить стоп-кодон в кДНК вставленной.

Рисунок 2
Рисунок 2. Принцип системы BRET. Белки интереса, X и Y, сливают с донорской фермента люциферазы (Luc, пик выбросов 475 нм) и флуоресцентный белок акцептор (YFP, пик излучения 530 нм), соответственно. Слитые белки экспрессируются в культивируемых клетках млекопитающих и следующее добавление клеточной проницаемого субстрата люциферазы, излучение от Luc измеряется с помощью фильтра блокировки длины волн длиннее 470 нм и излучении YFP измеряют с использованием 500-600 нм полосовой фильтр. А) Нет взаимодействия между белка Х и белка передачи Ю. энергии от Luc к YFP не происходит. Б) Взаимодействие белка Х и белка Ю. резонансный перенос энергии происходит от Luc чтобы YFP вызывая увеличение соотношения эмиссии измеренный с помощью 500-600 нм полосовой фильтр по сравнению с фильтром блокирования длин волн длиннее 470 нм.

Рисунок 3
Рисунок 3. Настройка Анализ. Установка анализ, чтобы проверить навзаимодействие между двумя белками, представляющих интерес, Х и Y. Белки интересных сливают с люциферазы (Luc) в качестве донора BRET и желтого флуоресцентного белка (YFP) в качестве BRET акцептора. В контрольных белков, Люк и YFP слиты с пептидом, содержащим ориентации сигнал для соответствующего субклеточном отсека (P), если это необходимо.) Управления должны быть включены в каждой пластины. 1) контроль Макет трансфекции установить фоновые уровни люминесценции и флуоресценции в результате люминометра шума и фермента-независимый пробоя подложки; 2) pLuc-контроль трансфекции только установить пропорцию люциферазы эмиссии которое обнаруживается в пределах эмиссии YFP в отсутствие акцептора BRET; 3) Трансфекцию pLuc-контроля и pYFP-контроля, чтобы установить базовый Брет сигнал результате Люк-YFP взаимодействия; 4) Трансфекция Luc-YFP синтеза в качестве положительного контроля, чтобы гарантировать, что сигнал BRET может быть измерена. B) Набор Эксперимental условия для проверки на взаимодействие между двумя белками, представляющих интерес, X и Y. 1, 2, 4, 5) контролю за неспецифического взаимодействия между белками, представляющих интерес и Люка / YFP; 3) состояние Тест с X в качестве донора и Y в качестве акцептора; 6) состояние Тест с Y в качестве донора и X в качестве акцептора.

Рисунок 4
Рисунок 4. Обнаружение FOXP2 гомодимеризации. A) Для проверки BRET анализа для обнаружения FoxP2 гомодимеров, HEK293-клетки трансфицировали конструкции для экспрессии люциферазы (донор) или YFP (акцептора), слитый либо FOXP2 (P2) или сигнал ядерной локализации (-). Люциферазную ядерного целенаправленной и YFP белки служат отрицательные контроли. В качестве положительного контроля для обнаружения сигнала BRET клетки также трансфицировали конструкцией для экспрессии люциферазы-YF. P слитый белок (+) В) флуоресцентной микроскопии снимки клеток, трансфицированных YFP слитых с сигнал ядерной локализации (-) или с YFP слит с FOXP2 (P2).

Рисунок 5
Рисунок 5. Использование димеризации с дефицитом FOXP2 продемонстрировать анализа специфики. А) Принципиальная схема FOXP2 белка, показывающий положение мутации DE400, что нарушает димеризацию. Домен димеризации лейцин молния показана на зеленый и ДНК-связывающий домен в желтый цвет. B) Для проверки того, избыточная экспрессия белков может привести к ложно-положительных результатов в BRET анализа, специфичность анализа оценивали с помощью FOXP2.DE400 вариант. Клетки трансфицировали конструкции для экспрессии люциферазы (донор) или YFP (акцептора), слитый с FOXP2 (Р2), FOXP2.DE400 (DE) или NucleaСигнал R локализации (-). С) флуоресцентной микроскопии снимки клеток, трансфицированных YFP слитых с FOXP2 (P2) или FOXP2.DE400 (DE).

Рисунок 6
Рисунок 6. Обнаружение FOXP1-FOXP2 гетеродимеризации. A) Для проверки BRET анализа для обнаружения гетеродимеризации между гомологичных белков FoxP2 и FOXP1, клетки трансфицировали конструкции для экспрессии люциферазы (донор) или YFP (акцептора), слитый либо FOXP2 (Р2), FOXP1 (P1) или сигнал ядерной локализации (-). B) флуоресцентной микроскопии снимки клеток, трансфицированных YFP слитых с FOXP1 (Р1) или в FOXP2 (P2).

Рисунок 7
B) флуоресцентной микроскопии снимки клеток, трансфицированных YFP слитых с CtBP1 (CtBP) или FOXP2 (P2).

Рисунок 8
Рисунок 8. Оценивая влияние патогенных мутаций FOXP2 на белок-белковых взаимодействий. А) Принципиальная схема белка FOXP2 показывая позиций R553H и R328X мутаций, которые вызывают редкое FOп.м. речи и языка расстройства. Домен димеризации лейцин молния показана на зеленый и на ДНК-связывающего домена в желтый цвет. B) оценить полезность BRET анализа для оценки воздействия патологических мутаций на белок-белковых взаимодействий, эффекты на R553H и R328X мутаций на способность мутантных белков FoxP2 к димеризации с нормальной FOXP2 были исследованы. Клетки трансфицировали конструкции для экспрессии люциферазы (донор) или YFP (акцептора), слитый либо нормальной FOXP2 (Р2), FOXP2.R553H (553), FOXP2.R328X (328), или сигнал ядерной локализации (-). C ) флуоресцентной микроскопии снимки клеток, трансфицированных YFP слит с FOXP2.R553H (R553H) или FOXP2.R328X (R328X). На этом изображении FOXP2.R328X преимущественно ядерный, но в других клеток в популяции показывает более цитоплазматический распределение.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Конструкция экспрессирующих конструкций гибридного белка является важным шагом в создании Брет анализа. В экспериментах, представленных здесь, белки, представляющие интерес, слит с С-концом люциферазы или YFP. Кроме того, возможно, и может быть необходимым, чтобы сплавить протеины к N-концу люциферазы / YFP. Для некоторых белков, слитых могут быть приняты только либо на N-или С-конца во избежание нарушения структуры и функции белков. Кроме того, для трансмембранных белков, в которых не указан и С-концы которого проживают в различных субклеточных отсеков, люциферазы / YFP белок должен быть слит с конечной остановки, которая находится в том же отделении, партнера взаимодействия. Например, при исследовании взаимодействий между трансмембранными G-белком рецепторов и цитоплазматического β-аррестина, люциферазы был присоединен к внутриклеточной карбоксильной хвостовой части трансмембранного рецептора 8. В других случаях геометрия белок-белок interactiна может привести к перенос энергии будучи более эффективным с помощью одного из двух возможных комбинаций слитых белков. Иногда передача энергии не могут быть обнаружены на всех, если, используя только одну комбинацию, что приводит к ложным отрицательным результатам.

Последовательность пептидного линкера между люциферазы / YFP и интерес белка может также влиять на эффективность резонансного переноса энергии. Компоновщик должен быть достаточно длинным, чтобы люциферазы / YFP и представляющий интерес белок сложить беспрепятственно. Больше компоновщик придаст большую гибкость в полипептида на стыке между люциферазы / YFP и интерес белка, которые могут повысить эффективность Брет, облегчая выравнивание донора и акцептора диполей. Тем не менее, эффективность BRET может уменьшить, если есть слишком много гибкости в линкере. В экспериментах здесь, клонирование белков, представляющих интерес в сайты BamHI-I и Xba I экспрессии VECТЗ в результате линкер 23-аминокислоты, как показано на рисунке 1. Этот линкер был успешным для обнаружения взаимодействий между несколькими парами белков.

Прежде чем перейти к Брет эксперименты следует обеспечить, что слитые белки сохраняют нормальную биологическую активность. Функционирование YFP ​​можно оценить, используя флуоресцентный микроскоп по прямой визуализации. Функционирование люциферазы может быть проанализирована с использованием коммерчески доступных наборов. Эффект слияния на субклеточном локализации интерес белков может быть оценена путем иммунного окрашивания, или в случае YFP-слитых, по прямой визуализации. Эффект слияния на функцию белка, представляющего интерес может быть исследована с помощью протеин-специфические анализы - например, для фактора транскрипции может быть целесообразным для анализа ДНК-связывающей активности. Обратите внимание, что измерения люминесценции, сделанные в ходе эксперимента обеспечивают удобный подтвердить в-анализаAtion люциферазной деятельности.

Важно учитывать, что соответствующие управляющие конструкции для вашего белка. YFP и люциферазы преимущественно цитоплазматическая и поэтому соответствующие меры контроля, когда белки интересные цитоплазматическая. Однако, когда эти белки, представляющие интерес, локализованы в других субклеточных компартментах может быть желательно модифицировать люциферазы и YFP с пептидными сигналов направить их оборота в соответствующий отсек. Здесь белки, представляющие интерес, факторы транскрипции, которые локализованы в ядре, поэтому люциферазы и YFP были изменены добавлением сигнал ядерной локализации. В частности, пептид, в том числе ядерной локализации сигнала SV40 крупного Т антигена (CGYGPKKKRKVGGLDN) был добавлен к С-концу люциферазы и YFP путем лигирования синтетических двухцепочечных олигонуклеотидов между Bam HI и Xba I сайтах йэ pLuc и pYFP векторы. Добавление этого сигнала вызвало значительное перераспределение белка в ядро (фиг.4В).

В том числе соответствующие элементы управления имеет решающее значение для интерпретации BRET экспериментов. Контроль макет трансфекции с использованием инертного наполнителя плазмиды важно установить фоновые уровни люминесценции и флуоресценции в результате люминометра шума и фермента-независимый пробоя подложки. С современными люминометров и люциферазы субстратов фоновые уровни люминесценции, как правило, очень низка. Трансфекция с соответствующей контрольной люциферазы построить в отсутствие конструкцией YFP важно установить пропорцию люциферазы эмиссии которое обнаруживается в пределах эмиссии YFP в отсутствие акцептора BRET. Трансфекцию с контрольной люциферазы и контроля YFP строит обеспечивает базовый Брет сигнал результате Люк-YFP взаимодействия. Для наканунеры пара белков, которые проверены для взаимодействия, важно для трансфекции каждый один с соответствующей контрольной конструкции, как показано на фиг.3В, чтобы управлять для любого неспецифического взаимодействия между белками быть проверено и люциферазы / YFP. Особенно при выполнении эксперимента Брет впервые, важно включить гибридный белок Люк-YFP в качестве положительного контроля, чтобы убедиться, что сигнал BRET наблюдается в вашей экспериментальной установки. Здесь кодирующая последовательность YFP был клонирован в pLuc на участках Bam HI и Xba I, чтобы генерировать слитый белок, в котором YFP слит с С-концом люциферазы.

В протоколу, описанному здесь, состав ДНК смеси для трансфекции была рассчитана в предположении, что средний размер экспрессии слитого белка Luc / YFP строит не превышает 7,5 кб. Если выражение строительTS значительно больше, чем это, то число молей каждого экспрессионной конструкции добавленного в смесь для трансфекции может должны быть уменьшены, так что общее количество ДНК в смеси не превышает максимально допустимую количеством реагента для трансфекции. Альтернативно количество реагента для трансфекции и количества ДНК во всех трансфекции смеси может быть увеличена в соответствии с руководствами производителя. Экспериментальные манипуляции 96-луночных планшетах ускоряется при использовании многоканальных пипеток и отсасывающее. Желательно, чтобы свести к минимуму различия между образцами в продолжительности времени инкубации трансфекции смесь после добавления ДНК в бессывороточной среде / трансфекции смеси реагента, поэтому начать добавлять трансфекцию клеток в смеси, как только первое соединение было инкубации в течение 10 мин . Поскольку акцепторных белков BRET являются YFP слияния, можно оценить эффективность трансфекции с помощью флуоресцентной микроскопии или путем измерения флуоресценции в микропланшет повторноАдер. Успех эксперимента BRET зависит от хорошего уровня трансфекции поэтому желательно, чтобы гарантировать, что трансфекции удовлетворительное прежде чем приступить к добавлением субстрата и измерения сигнала BRET. Тег YFP также позволяет количественно оценить уровни экспрессии акцептор белковых помощи микропланшет-ридера. Количественное определение уровней акцептора белка могут быть полезны для оптимизации и устранения неисправностей Брет экспериментов.

Клетки должны быть инкубировали в течение по крайней мере 2 ч с субстрата люциферазы Перед измерением сигнала BRET чтобы гарантировать, что стабильный сигнал был достигнут. Это также приемлемо для инкубации клеток с субстратом в течение 24 часов. В этом случае общая сумма на счету люминесценции будет ниже, но отношения Брет должен быть неизменным. Более длинные инкубации с субстратом может быть более удобным (например, на ночь), а также позволяют измерять сигналы BRET до и после экспериментального манипулирования такимиКроме того в качестве фармацевтического соединения. В идеале, оптимизировать плотность посева клеток, так что клетки достигают слияния примерно в то время измерения. Если плотность клеток выше оптимальной, то может быть предпочтительным, чтобы измерить сигнал BRET в более ранний момент времени, чтобы избежать чрезмерно быстрый рост клеток. При использовании типа клеток, кроме HEK293, убедитесь, что для оптимизации культуры и трансфекции клеток условия. Брет эксперименты также успешно выполняется в HeLa клеток, используя протокол, описанный здесь.

В экспериментах, описанных здесь, имеет значение люминесценции были измерены при комнатной температуре, что оптимальная температура для активности люциферазы Renilla. Если выполняется эксперимент время блюд в люминометра предпочтительно установить температуру при 37 ° С Мы провели те же эксперименты при комнатной температуре и при 37 ° С и не наблюдалось существенной разницы в результатах. При выполнении экспериментов при комнатной температуре, тыс.е пластина должна быть предоставлена ​​возможность уравновешивания 10 мин в фотометр перед измерением, чтобы обеспечить стабилизацию активности люциферазы Renilla. Здесь сигналов люминесценции были интегрированы в течение 10 сек, которое обычно обеспечивает высокую чувствительность, особенно для белков с низким уровнем экспрессии. Тем не менее, сигналы могут быть интегрированы в течение более коротких периодов времени, если это обеспечивает достаточную чувствительность. Благодаря стабильности люминесценции сигнала, формируемого живых клеток субстрата люциферазы, это приемлемо для измерения до 10 сек на лунку на каждой длине волны.

Взаимодействие между двумя представляющих интерес белков подтверждено с помощью анализа BRET, когда сигнал от условия теста значительно превышает сигналы от соответствующих контрольных условиях. Отсутствие сигнала BRET не обязательно подтверждение того, что взаимодействие не происходит. В случае неожиданного или отрицательном результате общее люминесценции и светитьсярассчитывает NCE должны быть рассмотрены для того, чтобы все скважины трансфецировали правильно.

Сигнал BRET также зависит от соотношения уровней экспрессии белка, следовательно, полезно рассмотреть относительные уровни экспрессии этих двух белков, представляющих интерес ют, сравнива счет флуоресценции из скважин, трансфицированных YFP слияния двух белков (или отсчетов люминесценции от скважин трансфицировали люциферазы слитых). Когда один слитый белок выражает сильнее, чем другие, лучшие результаты, вероятно, будут получены, если белок с более низким уровнем экспрессии слит с люциферазы, который был в случае с FOXP2 и CtBP1 в экспериментах, представленных здесь. Кроме того, можно манипулировать уровни белка путем регулировки молярное отношение плазмид экспрессии в трансфекции смеси. Передача энергии между определенными парами гибридных белков может быть очень неэффективной из-за геометрии белкового комплекса. В такихслучаях может быть стоит попробовать слияния белков, представляющих интерес для альтернативной концах люциферазы / YFP.

Необходимо, чтобы подтвердить, что BRET сигнал представляет собой физиологический белок-белкового взаимодействия, и не просто из-за избыточной экспрессии белка. По этой причине важно, чтобы избежать валовой сверхэкспрессию белков. Специфика белок-белкового взаимодействия в системе BRET может быть дополнительно подтверждена путем введения мутаций в белков, которые, как известно, снижают сродство взаимодействия, как показано здесь, используя DE400 вариант FOXP2. В мутантные белки могут быть также использованы в конкуренции и насыщения связывания Брет анализов. В конкурентном анализе, концентрации донора и акцептора слитых белков остаются постоянными при увеличении концентрации без тега версии одного из партнеров взаимодействия в качестве конкурента. Untagged дикого типа белка должно конкурировать с меткой Version за связывание с партнером взаимодействия, что приводит к уменьшению в сигнале BRET, тогда как мутантный белок должен обладать пониженной способностью конкурировать за взаимодействие. В связывания насыщение анализа, концентрация белка слияния донор остается постоянным, а при увеличении концентрации акцептора. Для конкретного взаимодействия сигнал BRET должны в конечном итоге плато, как всех молекул-доноров насыщаются акцептора. Для неспецифического взаимодействия, сигнал BRET как правило, показывают небольшое линейное увеличение связано с увеличением в случайных столкновений между молекул донора и акцептора. На практике для взаимодействий между умеренной аффинностью растворимых белков, это может быть трудно достичь достаточно высокого акцептор соотношение донор наблюдать насыщение при одновременном сохранении достаточного уровня белка доноров для детектирования сигнала.

Следует проявлять осторожность в интерпретации разностныхэс между отношениями BRET. BRET анализ не обеспечивает количественную меру сродства к белок-белкового взаимодействия, поскольку эффективность передачи энергии зависит от иных, чем сила белок-белкового взаимодействия факторов. К таким факторам относятся соотношение количества уровней слитых белков внутри клетки, геометрию взаимодействия и темпы ассоциации и диссоциации комплекса. Коэффициенты, полученные с двух разных пар белков поэтому не всегда можно сравнивать, но было возможно сравнение между различными вариантами того же самого белка, таких как со дикого типа и ΔE400 вариантов FOXP2, показанных здесь. Иногда, немного отрицательные коэффициенты Брет можно наблюдать. Отрицательные коэффициенты могут быть результатом ошибок в измерении базовой соотношении в клетках, трансфицированных только вектором pLuc-управления. Очень высокие коэффициенты часто свидетельствует о агрегации белка, который может быть подтверждено наблюдением трансфицированных сеLLS с флуоресцентным микроскопом. Следует определить, если агрегация биологически значимым или артефакт белка избыточной экспрессии.

В заключение, анализ BRET описано здесь является мощным подход к расследованию белок-белковых взаимодействий в живых клетках. Применение BRET была продемонстрирована для целей проверки кандидатов interactors от протеомических скрининговых исследований, конкретные остатки, участвующие в белок-белковых взаимодействий, и оценки влияния мутаций, обнаруженных в ДНК пациента. Поскольку взаимодействие обнаружены в реальном времени без необходимости для лизиса клеток, сигнал BRET может быть измерена до и после обработки, такой как добавление фармацевтического соединения или лиганд 7. BRET анализ показывает большие перспективы для использования в функциональных исследований в области геномики, чтобы оценить биологическую значимость генетических вариантов, открытых через следующего поколения секвенирования.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Общества Макса Планка.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nanodrop 8000 Nanodrop Any spectrophotometer capable of reading absorbances at 260 nm will be suitable. Determining the molecular mass of the plasmid is crucial for calculating DNA quantities to be used in transfection mixes.
96-microwell plates, flat bottom, white Greiner Bio One 655098 White plates reduce the crosstalk between wells and maximize the sensitivity of luminescence detection. Clear-bottomed wells allow monitoring of cell density. Plates must be suitable for cell culture. If using a top-reading luminometer the plate lid should be taken off.
Infinite F200Pro plate reader with control software TECAN Use the 'Blue 1' and 'Green 1' filters for luminescence measurement and the filter sets and dichoic mirror for GFP for fluorescence measurement. Any top-reading plate reader with capability of measuring dual-color luminescence and fluorescence is suitable. 
pLuc, pYFP, positive control plasmid N/A N/A Plasmids available from the authors upon request.
pGEM-3Zf(+) Promega P2271 Filler plasmid for equilization of DNA mass in transfection mixes. Any plasmid lacking a eukaryotic promoter would be suitable.
HEK293 cells ECACC 85120602 Other cell lines that transfect with reasonable efficiency may be suitable.
DMEM, high glucose, with phenol red Gibco 41966 This is the medium used for culturing HEK293 cells. Warm in 37 °C waterbath before use. If using a different cell line, replace the growth medium described here with cell-line specific medium.
DMEM, high glucose, no phenol red (substrate dilution medium) Gibco 21063 This is the substrate dilution medium used for dilution of the luciferase substrate (EnduRen) as it does not contain phenol red, which reduces the sensitivity of the assay. Contains HEPES to maintain correct pH during luminescence measurements while cells are out of the CO2 incubator. Warm in 37 °C waterbath before use.
OptiMEM Gibco 31985 OptiMEM is used for dilution of GeneJuice transfection reagent. Other serum-free media would also be suitable. Warm to room temperature before use.
Fetal bovine serum Gibco 10270 For supplementation of cell culture media at a concentration of 10% v/v.
GeneJuice transfection reagent Novagen 70967 If using a cell line other than HEK293, it may be necessary to adjust the ratio of Genejuice transfection reagent to DNA in the transfection mixes. Other transfection reagents may be used. If using an alternative transfection reagent, it may be necessary to optimize the amount of DNA used in the transfection mixes based on manufacturer's instructions.
DMSO Sigma D2650 Use sterile DMSO that is suitable for tissue culture. 
EnduRen live-cell substrate Promega E6481 Reconstitute EnduRen at 34 mg/ml in DMSO. Upon dilution of EnduRen in culture medium a precipitate may form. This will not interfere with the assay. Store reconstituted EnduRen at -20 °C, and avoid multiple freeze-thaw cycles. Ensure that reconstituted EnduRen is completely thawed before diluting it in culture medium.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Suter, B., Kittanakom, S., Stagljar, I. Two-hybrid technologies in proteomics research. Curr Opin Biotechnol. 19, 316-323 (2008).
  2. Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 645-654 (2007).
  3. Berggard, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7, 2833-2842 (2007).
  4. Ciruela, F. Fluorescence-based methods in the study of protein-protein interactions in living cells. Curr Opin Biotechnol. 19, 338-343 (2008).
  5. Pfleger, K. D., Eidne, K. A. Illuminating insights into protein-protein interactions using bioluminescence resonance energy transfer. BRET). Nat Methods. 3, 165-174 (2006).
  6. Boute, N., Jockers, R., Issad, T. The use of resonance energy transfer in high-throughput screening. BRET versus FRET. Trends Pharmacol Sci. 23, 351-354 (2002).
  7. Pfleger, K. D., et al. Extended bioluminescence resonance energy transfer (eBRET) for monitoring prolonged protein-protein interactions in live cells. Cell Signal. 18, 1664-1670 (2006).
  8. Kocan, M., Dalrymple, M., Seeber, R., Feldman, B., Pfleger, K. Enhanced BRET technology for the monitoring of agonist-induced and agonist-independent interactions between GPCRs and β-arrestins. Frontiers in Endocrinology. 1, (2011).
  9. Boute, N., Pernet, K., Issad, T. Monitoring the activation state of the insulin receptor using bioluminescence resonance energy transfer. Mol Pharmacol. 60, 640-645 (2001).
  10. Perroy, J., Pontier, S., Charest, P. G., Aubry, M., Bouvier, M. Real-time monitoring of ubiquitination in living cells by BRET. Nat Methods. 1, 203-208 (2004).
  11. Roduit, R., Escher, P., Schorderet, D. F. Mutations in the DNA-binding domain of NR2E3 affect in vivo dimerization and interaction with CRX. PLoS One. 4, (2009).
  12. Deriziotis, P., Fisher, S. E. Neurogenomics of speech and language disorders: the road ahead. Genome Biol. 14, 204 (2013).
  13. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2012).
  14. Lai, C. S., Fisher, S. E., Hurst, J. A., Vargha-Khadem, F., Monaco, A. P. A forkhead-domain gene is mutated in a severe speech and language disorder. Nature. 413, 519-523 (2001).
  15. Fisher, S. E., Scharff, C. FOXP2 as a molecular window into speech and language. Trends Genet. 25, 166-177 (2009).
  16. Graham, S. A., Fisher, S. E. Decoding the genetics of speech and language. Curr Opin Neurobiol. 23, 43-51 (2013).
  17. O'Roak, B. J., et al. Exome sequencing in sporadic autism spectrum disorders identifies severe de novo mutations. Nat Genet. 43, 585-589 (2011).
  18. Horn, D., et al. Identification of FOXP1 deletions in three unrelated patients with mental retardation and significant speech and language deficits. Hum Mutat. 31, 1851-1860 (2010).
  19. Hamdan, F. F., et al. De novo mutations in FOXP1 in cases with intellectual disability, autism, and language impairment. Am J Hum Genet. 87, 671-678 (2010).
  20. Talkowski, M. E., et al. Sequencing chromosomal abnormalities reveals neurodevelopmental loci that confer risk across diagnostic boundaries. Cell. 149, 525-537 (2012).
  21. Li, S., Weidenfeld, J., Morrisey, E. E. Transcriptional and DNA binding activity of the Foxp1/2/4 family is modulated by heterotypic and homotypic protein interactions. Mol Cell Biol. 24, 809-822 (2004).
  22. MacDermot, K. D., et al. Identification of FOXP2 truncation as a novel cause of developmental speech and language deficits. Am J Hum Genet. 76, 1074-1080 (2005).
  23. Vernes, S. C., et al. Functional genetic analysis of mutations implicated in a human speech and language disorder. Hum Mol Genet. 15, 3154-3167 (2006).
Исследование белок-белковых взаимодействий в живых клетках с помощью биолюминесценции резонансный перенос энергии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer. J. Vis. Exp. (87), e51438, doi:10.3791/51438 (2014).More

Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer. J. Vis. Exp. (87), e51438, doi:10.3791/51438 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter