Introduction
सक्रिय रूप से एक व्यवहार कार्य में लगे एक चेतावनी पशु में neuronal गतिविधि की निगरानी तंत्रिका तंत्र के समारोह और संगठन को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। एकल न्यूरोनल इकाइयों से बिजली की गतिविधि के कोशिकी रिकॉर्डिंग लंबे सिस्टम तंत्रिका विज्ञान के एक प्रधान उपकरण किया गया है और वर्तमान में उपयोग में व्यापक रूप से अभी भी है। इलेक्ट्रोड प्रकार और विन्यास की एक किस्म के लिए एक विशेष रूप से प्रयोग की वैज्ञानिक और तकनीकी की मांग के आधार पर उपलब्ध हैं। लंबे समय से microdrives प्रत्यारोपित या इलेक्ट्रोड सरणियों अक्सर पक्षियों, कृन्तकों, और गैर मानव प्राइमेट 1-4 सहित आज़ादी से घूम रहा जानवर, में उपयोग किया जाता है। वैकल्पिक रूप से, एक बाहरी micromanipulator के माध्यम से धातु या कांच microelectrodes के साथ तीव्र पेनेट्रेशन अक्सर संवेदनाहृत या सिर रोका जानवरों से रिकॉर्ड करने के लिए उपयोग किया जाता है। कांच micropipette इलेक्ट्रोड वे juxtacellular में इस्तेमाल किया या "सेल संलग्न" किया जा सकता है फायदा है कि विन्यास असंदिग्ध रूप से अलग करने के लिए5 छंटाई के बाद हॉक कील की जटिलताओं के बिना एकल न्यूरॉन्स की गतिविधियों। वे डाई या neuroanatomical tracers का छोटे जमा इंजेक्षन करने के लिए, या भी व्यक्ति सेल दर्ज भरने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में ये इलेक्ट्रोड आगे, anatomically-पहचान कोशिकाओं या स्थानों से रिकॉर्डिंग की अनुमति है। यह विन्यास सफलतापूर्वक चूहों, चूहों और पक्षियों 6-10 में लागू किया गया है। वर्तमान में वर्णित तकनीक juxtacellular निगरानी और चेतावनी में कोशिकी डाई जमा, सिर रोका चूहों पर केंद्रित है। , इन डाई जमाओं सेल आकृति विज्ञान या axonal अनुमानों 11 के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करते भरता juxtacellular कि विपरीत एकल कोशिका नोट, लेकिन वे सतर्क पशुओं में एक काफी अधिक उपज है, समीक्षकों, लगभग 50 माइक्रोन के लिए सटीक संरचनात्मक स्थानीयकरण सक्षम और। फिर भी संरचनात्मक लेबलिंग के लिए एक वैकल्पिक रणनीति के रूप में प्रदान की जाती है भरता juxtacellular एकल कोशिका के बारे में जानकारी।
संक्षेप में,प्रोटोकॉल के तीन प्रमुख चरणों के होते हैं। पहले चरण में, चूहा 6 दिन की अवधि में एक कपड़ा जुर्राब (चित्रा 1) में शरीर संयम को आदत है। दूसरे चरण में, एक सिर संयम तंत्र (चित्रा 2) और रिकॉर्डिंग कक्ष शल्य चिकित्सा चूहे कई बाद में रिकॉर्डिंग सत्र (चित्रा 3) के दौरान stereotaxic विमान में बनाए रखा जा सकता है कि इस तरह प्रत्यारोपित कर रहे हैं; इस प्रक्रिया के मानक संदर्भ 12 निर्देशांक के आधार पर electrophysiological अध्ययन के लिए मस्तिष्क के विशेष उप-cortical क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए प्रयोगकर्ता के लिए सक्षम बनाता है। तीसरे चरण असंदिग्ध रूप से एकल इकाइयों 6-9 अलग-थलग कि juxtacellular न्यूरोनल रिकॉर्डिंग, (चित्रा 5) एक क्वार्ट्ज केशिका ट्यूब से इलेक्ट्रोड के निर्माण, व्यवहार और electrophysiological प्रयोगों (चित्रा 4) का आयोजन करने के लिए एक उपयुक्त जिग में चूहे रखने शामिल है, और संरचनात्मक locati अंकनशिकागो स्काई ब्लू डाई (आंकड़े 6 और 7) के साथ रिकॉर्डिंग साइट के पर। रिकॉर्डिंग एक साथ व्यवहार की निगरानी के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं; हालांकि, व्यवहार की तकनीकी जानकारी प्रत्येक प्रयोग के वैज्ञानिक लक्ष्यों पर निर्भर करेगा और एक एकल प्रोटोकॉल के दायरे से परे इस प्रकार हैं। कई दिनों पर दोहराया जा सकता है, जो प्रायोगिक प्रक्रिया के पूरा होने के बाद, पशु euthanized है। मस्तिष्क उज्ज्वल क्षेत्र या प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग या तो मानक neuroanatomical तकनीक के अनुसार निकाले और कार्रवाई की है।
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Protocol
संघ निर्धारित जानवरों की देखभाल और उपयोग के दिशा निर्देशों के अनुसार - (350 ग्राम 250) और कैलिफोर्निया के सैन डिएगो के विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल महिला लांग इवांस चूहों पर किए गए।
1. शारीरिक संयम को चूहा acclimating
नोट: एक प्रतिबंधित आहार पर चूहा रखें। संयम (नीचे वर्णित) के लिए चूहे acclimate करने के लिए तुरंत प्रत्येक दैनिक निपटने के सत्र के बाद एक बार प्रति दिन चूहे फ़ीड। अपने प्रारंभिक वजन के 80% से कम पशु बनाए रखने के लिए पर्याप्त फ़ीड प्रदान करें। इस राशि को एक 250 ग्राम महिला लांग इवांस चूहे के लिए प्रति दिन फ़ीड के लगभग 6 ग्राम है।
- मनुष्य के द्वारा नियंत्रित किया जा रहा करने के लिए चूहे acclimate। धीरे लगभग 5 सेकंड हर 30 सेकंड की अवधि के लिए हाथ से चूहे को नियंत्रित। लगातार 2 दिनों पर 15 मिनट के एक दिन के लिए यह मत करो। प्रशिक्षण अवधि के दौरान तनाव के लक्षण के लिए दैनिक चूहों मॉनिटर। साइन्स मैं संघर्ष में शामिलसंयम, वोकलिज़ेशन, और दांत-बकबक n करने के लिए प्रतिक्रिया।
- 3 दिन, 15 मिनट लगातार दो दिनों पर एक दिन के लिए एक शरीर में बाधा कपड़ा जुर्राब (चित्रा 1) में चूहे जगह है।
- 5 वें दिन, जुर्राब अंदर चूहा जगह है, और प्रयोगात्मक जिग पर एक कठोर ट्यूब (चित्रा 4) के अंदर जुर्राब जगह है। लगातार 2 दिनों पर 15 मिनट के एक दिन के लिए ट्यूब में चूहे छोड़ दें।
- प्रत्येक प्रशिक्षण सत्र के तुरंत बाद चूहे फ़ीड। पिछले सत्र (6 वें दिन) के अंत में भोजन करने के लिए अप्रतिबंधित पहुँच दे। आरोपण के लिए पिछले प्रशिक्षण दिन पर अत्यधिक तनाव के लक्षण नहीं दिखा है जो केवल उन चूहों का चयन करें।
नोट: आरोपण के लिए चूहों का चयन हमारे हाथ में, व्यक्तिपरक है हालांकि चूहों के 90% से अधिक आदी होना करने के लिए संवेदनशील और आरोपण से गुजरना करने में सक्षम होना पाया गया है।
2. रिकॉर्डिंग कक्ष और सिर संयम तंत्र दाखिल
- एक फिर से बनाओएक पिन कनेक्टर के लिए नंगे स्टेनलेस स्टील के तार टांका द्वारा सम्मेलन के तार। 3-5 मिमी अवशेष पिन का पर्दाफाश किया है, ताकि तार कट। सभी सर्जिकल उपकरणों के साथ, संदर्भ तार आटोक्लेव।
- Ketamine / xylazine संज्ञाहरण प्रशासन। 95 मिलीग्राम / intraperitoneally / किलो xylazine 5 मिलीग्राम के साथ मिश्रित किलो ketamine प्रशासन। प्रारंभिक खुराक 1 आधा से 2 घंटे के लिए रहता है। जरूरत के रूप में, हर 30-45 मिनट उसके बाद संज्ञाहरण अनुपूरक। एक नेत्र मरहम के साथ पशु की आँखों चिकनाना।
- संज्ञाहरण के विमान निर्धारित करते हैं, और आवश्यक के रूप में संज्ञाहरण बनाए रखने के लिए पैर की अंगुली वापसी पलटा जाँच करें।
- कान सलाखों के साथ एक stereotaxic पकड़े फ्रेम में चूहे रखें (चित्रा 3A)। सिर पर बाल दाढ़ी और povidone आयोडीन (10% समाधान) के साथ घाव साइट कीटाणुरहित। वे कान ड्रम को नुकसान नहीं है कि इतनी उचित कान सलाखों सम्मिलित करने के लिए ध्यान रखना। कुंद सुझावों के साथ कान सलाखों बेहतर कर रहे हैं।
- एक स्केलपेल अनुमानित के साथ एक चीराmately कान के पीछे करने के लिए आंखों का समास में प्रयुक्त रूप-दुम स्तर से कपाल की midline के साथ। कटौती और चीरा के दोनों ओर त्वचा के 2-3 मिमी पट्टी को हटाने के लिए कैंची का प्रयोग करें।
- पार्श्व लकीरें करने के लिए बाहर कपाल की सतह को बेनकाब करने के लिए periosteum दूर परिमार्जन। Superglue की पतली परत के साथ उजागर कपाल कवर।
- एक साढ़े मिमी व्यास ड्रिल गड़गड़ाहट का उपयोग कर, 0-80 शिकंजा की तुलना में एक थोड़ा छोटे व्यास के साथ, एक छोटा सा छेद ड्रिल (सामग्री अनुभाग देखें)। पेंच नीचे से भी अधिक पार्श्व शीर्ष के साथ में जा सकते हैं कि इतने छेद तुरंत पर्वबिन्दु सिवनी पार्श्व रिज से मिलता है, और कपाल में एक 30-45 डिग्री के कोण पर जहां के पीछे ड्रिल।
- 30-45 डिग्री के कोण पर, छेद (लगभग 3 बदल जाता है) के लिए एक 0-80 फ्लैट नीचे मशीन पेंच में भाड़ में। अंतर्निहित मस्तिष्क के ऊतकों को नुकसान पहुँचाए से बचने के लिए भी गहराई में स्क्रू करने के लिए नहीं सावधान रहना होगा।
- दिखाया विन्यास में छह अतिरिक्त शिकंजा के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ
- Stereotax जोड़तोड़ में एक सिरिंज सुई रखें। एक संदर्भ के चिह्न के रूप में वांछित craniotomy स्थान के पर्वबिन्दु सिवनी से उपाय है, और निकट सुई के साथ कपाल में सेंध, लेकिन बाहर।
नोट: इस प्रदर्शन में, मार्क की stereotaxic निर्देशांक 3 मिमी पीछे और पर्वबिन्दु सिवनी के लिए पार्श्व 1 मिमी हैं। - एक स्थायी मार्कर के साथ सेंध निशान। यह एक stereotaxic संदर्भ बिंदु के रूप में काम करेंगे, के रूप में मार्क की stereotaxic निर्देशांक नोट (3B चित्रा)।
- वांछित निर्देशांक (3 मिमी पीछे और इस उदाहरण में शीर्षस्थान के लिए पार्श्व 3 मिमी) पर केंद्रित एक craniotomy बनाओ। बरकरार ड्यूरा मेटर छोड़ दें। संशोधित कृत्रिम मस्तिष्क रीढ़ की हड्डी में तरल पदार्थ के साथ craniotomy आवरण (125 मिमी NaCl, 10 मिमी ग्लूकोज, 10 मिमी HEPES, 3.1 मिमी 2 CaCl, 1.3 मिमी 2 MgCl, पीएच 7.4) 13 (चित्रा -3 सी)। 4 करने के लिए एक 0.2 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब कट - लंबाई में 5 मिमी, और टोपी काट दिया। कपाल पर ट्यूब प्लेस और craniotomy पर यह केंद्र।
- कपाल को ट्यूब के आधार सील करने के लिए ट्यूब के नीचे चारों ओर दंत सीमेंट लागू करें। उजागर craniotomy (चित्रा 3 डी) में सीमेंट रिसाव के लिए नहीं सावधान रहना होगा।
- प्रतिपक्षी कपाल थाली में एक छोटा सा छेद (लगभग साढ़े मिमी व्यास) ड्रिल और ध्यान संदर्भ तार डालें। (उपकरण अनुभाग देखें) तार के अंत करने के लिए रिकॉर्डिंग एम्पलीफायर के साथ इंटरफेस है कि एक पिन टांका द्वारा संदर्भ तार का निर्माण। संदर्भ तार कदम नहीं है कि यह इस कारण हो सकता है क्षति के रूप में मस्तिष्क में एक बार।
- तार डाला गया था, जिसमें छेद करने के लिए superglue लागू करें। यह अस्थायी रूप से जगह में पिन और तार सील होगा।
- सिलिकॉन जेल किट के दो भागों मिक्स लगभग बराबर भागों में (सामग्री अनुभाग देखें)। मिश्रण और fil के लिए दो मिनट रुकोएल अपकेंद्रित्र ट्यूब लगभग ⅓ जेल के साथ भरा है।
- एक सही कोण पद दबाना संलग्न सिर संयम पट्टी करने के लिए (सामग्री अनुभाग देखें)। प्लेट के नीचे जानवर की नाक की ओर इतना है कि एक 45 डिग्री पिच कोण पर पकड़े बार (चित्रा 2 बी) को सिर प्लेट (2A चित्रा) संलग्न। यह प्रयोगात्मक जिग (चित्रा 4) के उस मैच के लिए पिच कोण सेट करने के लिए एक कोण नापने का यंत्र का उपयोग करने के लिए उपयोगी है।
- बार कान सलाखों के समानांतर है कि इतनी stereotax जोड़तोड़ हाथ पकड़े बार संलग्न। थाली दुम सबसे पेंच को लैम्ब्डा सिवनी और पूर्वकाल के पीछे इतना है कि बार और प्लेट कम करें।
- सामने सिर बोल्ट मुट्ठी (एक 8-32 संवर्धन या पेंच, माल अनुभाग देखें) पेंच के सिर नीचे और जानवर की पूंछ की ओर का सामना कर रहा है, ताकि एक मदद हाथ हाथ और क्लैंप के साथ लगभग 45 डिग्री के कोण पर। यह चींटी को छूता है कि इतने पेंच लोअरerior 0-80 शिकंजा (चित्रा 3F, छ)।
- दंत एक्रिलिक के साथ जगह में बोल्ट और प्लेट सुरक्षित। हड्डी पेंच सिर के चारों ओर दंत एक्रिलिक, संदर्भ पिन लागू करें, और अपकेंद्रित्र ट्यूब के किनारों के आसपास। दंत एक्रिलिक शुष्क करने के लिए लगभग 10 मिनट तक प्रतीक्षा करें (चित्रा 3H)।
- प्रत्यारोपण के लिए त्वचा जोड़नेवाला, दंत एक्रिलिक के किनारों के आसपास दंत सीमेंट की एक परत लागू करें। सीमेंट शुष्क करने के लिए प्रतीक्षा करें।
- अपकेंद्रित्र ट्यूब की टोपी में कई छेद प्रहार, और ट्यूब पर टोपी जगह है।
- मदद के हाथ दबाना निकालें। फिर ध्यान से stereotax से सिर पकड़े बार हटाने, और फिर बार (चित्रा 3I) से सिर प्लेट हटा दें।
- Stereotax से पशु निकालें और सभी लागू नियमों, विनियमों, और कानून (के अनुसार पोस्ट ऑपरेटिव देखभाल और निगरानी के लिए प्रशासन जैसे, buprenorphine 0.02 मिलीग्राम / किग्रा, 24 की एक न्यूनतम के लिए हर 8-12 घंटामानव संसाधन)। सूजन प्रत्यारोपण के किनारों के आसपास विकसित करता है तो हल हो गई है, जब तक दैनिक प्रभावित साइट के लिए एंटीबायोटिक मलहम की एक पतली परत लागू होते हैं।
Neuronal इकाइयों 3. Juxtacellular निगरानी
- एक कार्बन डाइऑक्साइड लेजर micropipette खींचने पर क्वार्ट्ज केशिका ट्यूबिंग खींचो कम से कम 1 माइक्रोन (चित्रा 5A) की नोक व्यास के साथ (उपकरण अनुभाग देखें)।
नोट: ताप मापदंडों विशेष साधन के अनुसार अलग अलग होंगे, और आवश्यक गर्दन व्यास ब्याज की मस्तिष्क संरचना के आधार पर भिन्न होगा। चूहे थैलेमस में रिकॉर्डिंग के लिए, micropipettes 5-7 मिमी से लेकर गर्दन है। - लंबे समय तक काम दूरी उद्देश्यों के साथ सुसज्जित एक अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) खुर्दबीन के नीचे जगह में पिपेट सुरक्षित। माइक्रोस्कोप के मंच पर जगह में पिपेट धारण करने के लिए क्ले मॉडलिंग का प्रयोग करें।
- पहुंच के लिए इस्तेमाल किया कांच के टुकड़े, 1 सेमी मोटी - धीरे 0.5 एक गिलास ब्लॉक (चालअल्ट्रा सूक्ष्म चाकू आईएनजी विंदुक टिप के साथ देखने के क्षेत्र में) सुविधाजनक है। मंच micromanipulator का उपयोग, धीरे इसे तोड़ने के लिए है, जिससे कांच विंदुक टिप को छूने। विंदुक टिप बाहरी व्यास 1-3 माइक्रोन के बीच है जब तक आवश्यक के रूप में दोहराएँ (चित्रा 5 ब, सी)। इन micropipettes लगभग 5-15 MΩ के बीच impedances है कि सुनिश्चित करें।
- कोशिकी खारा (135 मिमी NaCl, 5.4 मिमी KCl, 1.8 मिमी 2 CaCl, 1 मिमी 2 MgCl, NaOH के साथ 5 मिमी HEPES, पीएच 7.2) 8 को तैयार है और शिकागो स्काई ब्लू (w / v) 2% जोड़ें। एक 30 जी सुई या छोटे के साथ एक सिरिंज का प्रयोग, समाधान के साथ पिपेट के पीछे के अंत भरें। वैकल्पिक रूप से, एकल कोशिका juxtacellular लेबलिंग के लिए 2% जोड़ने (डब्ल्यू / वी) Neurobiotin या biotinylated dextran एमाइन (बीडीए-3000 या बीडीए-10000) शिकागो स्काई ब्लू के स्थान पर खारा समाधान करने के लिए।
- एक उपयुक्त प्रयोगात्मक जिग पर कठोर ट्यूब के अंदर कपड़े जुर्राब अंदर चूहा रखें (
- जिग पर इसी टुकड़ा करने के लिए चूहे पर सिर-निरोधक प्लेट संलग्न। ऐसा करने के लिए, पहली जगह में सिर-संयम थाली पिन, और फिर एक 4-40 पेंच का उपयोग कर इसे सुरक्षित। पशु सिर करने के लिए अत्यधिक टोक़ लागू करने से बचने के क्रम में शांत है जब तक इंतजार करना न भूलें। अगला, चूहे पर प्रत्यारोपित किया जाता है कि सिर-निरोधक बोल्ट पर एक 8-32 अखरोट जगह है। फिर सिर-बोल्ट के लिए एक पिरोया स्टेनलेस स्टील रॉड में पेंच। यह जगह में कड़ा किया जा सकता है कि इस तरह से (चित्रा 4) में प्रयोगात्मक जिग करने के लिए रॉड प्रत्यय।
नोट: सिर-संयम थाली मिनट के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सिर-बोल्ट के साथ पशु सुरक्षिततंत्र के झुकने imizes और रिकॉर्डिंग स्थिरता में सुधार। पहले दिन शुरू कर सकते हैं रिकॉर्डिंग ज्यादातर मामलों में पशु सिर रोका है। पशु जरूरत से ज्यादा fidgets या vocalizes हालांकि, अगर किसी भी रिकॉर्डिंग शुरू होने से पहले सिर-संयम आदी होना प्रशिक्षण के एक दिन प्रदान करते हैं। इस मामले में, 15 मिनट के लिए जिग पर पशु छोड़ दो और फिर अपने पिंजरे में इसे वापस जगह है। अगले दिन इस चरण को दोहराएँ और प्रोटोकॉल के साथ जारी है।- रिकॉर्डिंग कक्ष खोलें और सिलिकॉन जेल को हटा दें। ऊतक craniotomy में फिर से वृद्धि हुई है, अगर ठीक संदंश का उपयोग craniotomy साफ करें।
- मोटर चालित micromanipulator से पिपेट देते हैं, और headstage के पूर्व एम्पलीफायर में प्लग।
नोट: वर्तमान प्रदर्शन में, headstage पर एक छोटा सा रिले सर्किट एम्पलीफायर नेतृत्व तारों और उच्च अनुपालन (चित्रा 6A-सी) के साथ एक बाहरी वर्तमान स्रोत के बीच स्विच करने के लिए प्रयोग किया जाता है। कुछ एम्पलीफायरों में निर्मित एक उपयुक्त उच्च अनुपालन स्रोत है कि नोट(चर्चा और सामग्री वर्गों देखें)।- रिकॉर्डिंग कक्ष में stereotaxically पहचान चिह्नित करने के लिए पिपेट की नोक स्थानांतरित करने के लिए मोटर चालित micromanipulator का प्रयोग करें। इस स्थान के निर्देशांक ध्यान दें। कपाल पर पिपेट की नोक तोड़ने के लिए नहीं सावधान रहना होगा।
- -पूर्वकाल पीछे और Medio-पार्श्व कुल्हाड़ियों में वांछित रिकॉर्डिंग स्थान पर पिपेट ले जाएँ। यह इरादा रिकॉर्डिंग स्थान पर लगभग 500 माइक्रोन पृष्ठीय है तो जब तक ड्यूरा के माध्यम से पेट के बल पिपेट अग्रिम।
- विंदुक टिप और संदर्भ तार के बीच दर्ज की गई परिलक्षित वोल्टेज का एक ऑडियो मॉनिटर पर घटनाओं spiking के लिए सुन, जबकि धीरे धीरे पिपेट अग्रिम। एक बार spiking घटनाओं पहचान कर रहे हैं, लगभग 500 μV मनाया जाता है और अधिक से अधिक सकारात्मक जा रहा वोल्टेज विक्षेपण तक पिपेट 0-100 माइक्रोन स्थानांतरित करने के लिए जारी है।
नोट: इलेक्ट्रोड प्रतिरोध लगभग 1.5-10 क का एक पहलू से वृद्धि होगीयह तब होता है एन।- एक बार एक इकाई के हित के अन्य सभी व्यवहार और शारीरिक उपायों के साथ साथ, 3.11 कदम के अनुसार के रूप में अलग कर दिया गया है रिकॉर्डिंग शुरू। वर्तमान प्रदर्शन में, स्वयं उत्पन्न vibrissa आंदोलनों (सामग्री अनुभाग देखें) उच्च गति वीडियोग्राफी के साथ निगरानी कर रहे हैं।
- रिकॉर्डिंग साइट लेबल करने के लिए, इलेक्ट्रोड वर्तमान स्रोत से कनेक्ट करने के लिए सुराग स्विच। , एक निर्मित में मैन्युअल रूप से चालू एम्पलीफायर पर स्रोत, या (चित्रा 6D, देखने के कदम 3.8 और चर्चा) - या तो एक रिले सर्किट (सी चित्रा 6A) का उपयोग कर ऐसा करने के कई तरीके हैं। दर्रा -4 μA 50% शुल्क साइकिल पर दो सेकंड दालों के साथ 4 मिनट के लिए iontophoretically पिपेट के माध्यम से शिकागो स्काई ब्लू इंजेक्षन करने के लिए।
- मार डालो और मानक अभ्यास के अनुसार कई लेबलिंग प्रक्रियाओं के बाद पशु छिड़कना। धारा के रूप में आवश्यक मस्तिष्क और counterstain रिकॉर्डिंग के संरचनात्मक स्थान बैठने की पहचान करने के लिएई। 14 के अनुसार साइटोक्रोम ओक्सीडेस जेट के लिए ऊतक Counterstain। वैकल्पिक रूप से, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग शिकागो स्काई ब्लू जमाओं की पहचान।
नोट: सही लेबल के बीच पिपेट unclamping के बिना, यह सभी लेबल एक ही दिन में एक ही विंदुक के साथ बना रहे हैं महत्वपूर्ण है कि अलग-अलग लेबल वाली इकाइयों के बीच अंतर करना। इस मामले में रिकॉर्डिंग साइटों प्रत्येक साइट का उल्लेख किया जोड़तोड़ निर्देशांक के साथ पोस्ट-हॉक ऊतक विज्ञान में उनके रिश्तेदार स्थानों से भेदभाव किया जा सकता है (कदम 3.9 देखें)। स्पष्ट पहचान के लिए, एक दूसरे, और मस्तिष्क क्षेत्र प्रतिशत से अधिक नहीं 3-5 लेबल से कम से कम 200 माइक्रोन अलग लेबल निशान। - जिग पर इसी टुकड़ा करने के लिए चूहे पर सिर-निरोधक प्लेट संलग्न। ऐसा करने के लिए, पहली जगह में सिर-संयम थाली पिन, और फिर एक 4-40 पेंच का उपयोग कर इसे सुरक्षित। पशु सिर करने के लिए अत्यधिक टोक़ लागू करने से बचने के क्रम में शांत है जब तक इंतजार करना न भूलें। अगला, चूहे पर प्रत्यारोपित किया जाता है कि सिर-निरोधक बोल्ट पर एक 8-32 अखरोट जगह है। फिर सिर-बोल्ट के लिए एक पिरोया स्टेनलेस स्टील रॉड में पेंच। यह जगह में कड़ा किया जा सकता है कि इस तरह से (चित्रा 4) में प्रयोगात्मक जिग करने के लिए रॉड प्रत्यय।
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Representative Results
एक चूहे को सक्रिय रूप से whisking है के रूप में vibrissa आंदोलन के चरण स्वयं उत्पन्न 15,16 whisking दौरान सांकेतिक शब्दों में बदलना चेतक उदर पीछे औसत दर्जे का (VPM) में neuronal इकाइयों। चित्रा 7A एक VPM thalamic इकाई का नमूना spiking गतिविधि से पता चलता है। चित्रा 7B कील का एक हिस्टोग्राम से पता चलता है टाइम्स vibrissa गति 17 की तात्कालिक चरण के लिए गठबंधन। Whisking का त्याग चरण के दौरान अधिक spikes रहे हैं। चित्रा 7C रूप में दिखाया गया रिकॉर्डिंग के बाद, इकाई के स्थान, शिकागो आकाश नीले रंग के योणोगिनेसिस के माध्यम से चिह्नित किया गया। ऊतक VPM चेतक की neuroanatomical सीमाओं प्रकट करने के लिए साइटोक्रोम ओक्सीडेस गतिविधि के लिए counterstained है। इस प्रोटोकॉल के एक समान संस्करण हाल ही में विशिष्ट brainstem के नाभिक 18 में whisking से संबंधित multiunit neuronal गतिविधि (10-20 माइक्रोन व्यास पिपेट सुझावों) की निगरानी करने के लिए लागू किया गया था।
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चित्रा 1: क्लॉथ निरोधक जुर्राब drawstrings और उपयुक्त clasps के साथ एक चूहे जुर्राब की (ए) तस्वीर।। छोटे अंत उरोस्थि, और पूंछ के आसपास बड़े अंत के आसपास फिट रखा गया है। पैनल 1A में जुर्राब के लिए (बी) के डिजाइन पैटर्न। आयाम इंच में हैं।
चित्रा 2: सिर संयम तंत्र के मैकेनिकल डिजाइन (ए) चूहों के लिए एक सटीक सिर संयम थाली के यांत्रिक डिजाइन।। आयाम इंच में हैं। (बी) के पैनल 2A में थाली के साथ प्रयोग के लिए एक सिर संयम बार मैकेनिकल डिजाइन। प्रोटोकॉल इन भागों के दो, एक ही पिच कोण पर सही कोण पद clamps का उपयोग कर मुहिम शुरू की आवश्यकता है।"_blank> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: सर्जिकल प्रक्रिया एक stereotaxic पकड़े फ्रेम में (ए) चूहा (प्रोटोकॉल कदम 2.4)।। (बी) प्रत्यारोपित शिकंजा और कपाल चिह्नों (प्रोटोकॉल कदम 2.10) के साथ शल्य साइट। (सी) एक craniotomy (प्रोटोकॉल कदम 2.12) के साथ शल्य साइट। (डी) रिकॉर्डिंग कक्ष (प्रोटोकॉल कदम 2.14) के साथ शल्य साइट। (ई) संदर्भ तार और सिलिकॉन जेल (प्रोटोकॉल कदम 2.17) के साथ शल्य साइट। (च, छ) जगह में आयोजित सिर संयम की थाली और बार (प्रोटोकॉल कदम 2.20) के साथ शल्य साइट। (एच) थाली और बार साथ में शल्य साइट जगह (प्रोटोकॉल कदम 2.21) में पुख्ता। (मैं) अंतिम सिर-संयम और रिकॉर्डिंग कक्ष implचींटी (प्रोटोकॉल कदम 2.24)। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4:। Electrophysiological और व्यवहार की निगरानी के प्रयोगों के लिए यांत्रिक जिग में चूहे की प्रायोगिक जिग आरेख (प्रोटोकॉल 3.5-3.6 कदम)। जिग चित्रा 2 में बार और प्लेट का इस्तेमाल करता।
चित्रा 5: Micropipette इलेक्ट्रोड निर्माण एक अटूट micropipette (प्रोटोकॉल कदम 3.1) (ए) सूक्ष्मछवि।। स्केल बार खुर्दबीन के नीचे अटूट micropipette और गिलास ब्लॉक (प्रोटोकॉल कदम 3.2) के पैनल सी (बी) सूक्ष्मछवि में के रूप में है।टिप का प्रतिबिंब गिलास में देखा जा सकता है। स्केल बार टूटा micropipette (प्रोटोकॉल कदम 3.3) के पैनल सी (सी) सूक्ष्मछवि में के रूप में है। (डी) पैनल ए स्केल बार की बॉक्सिंग क्षेत्र में अटूट micropipette की नोक की सूक्ष्मछवि पैनल सी की बॉक्सिंग क्षेत्र में टूटी micropipette की नोक के ई (ई) सूक्ष्मछवि पैनल के रूप में है के लिए यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।
चित्रा 6:। एम्पलीफायर और वर्तमान स्रोत के बीच स्विच करने के लिए उपकरण (ए) सेटअप (वैकल्पिक) एक चुंबकीय रिले के माध्यम से वर्तमान स्रोत के लिए एम्पलीफायर से सुराग स्विच करने के लिए। वोल्टेज नियंत्रित रिले स्विच युक्त एक मुद्रित सर्किट बोर्ड attac हैएम्पलीफायर सिर चरण के लिए hed। पैनल 6A में मुद्रित सर्किट बोर्ड के लिए (बी) के लेआउट। बोर्ड एम्पलीफायर सुराग जोड़ता है और वर्तमान स्रोत रिले के इनपुट पिन की ओर जाता है, और इलेक्ट्रोड उत्पादन पिन की ओर जाता है। इलेक्ट्रोड रिले नियंत्रण पिन करने के लिए या तो शून्य या 5 वी लगाने से वर्तमान स्रोत या एम्पलीफायर या तो से जुड़ा है। नीचे का नजारा। आयाम इंच में हैं। (सी) पैनल 6B में बोर्ड लेआउट के शीर्ष दृश्य। स्वयं (वैकल्पिक) वर्तमान स्रोत के लिए एम्पलीफायर से सुराग स्विच करने के लिए (डी) सेटअप (: उपकरण खंड भी देखें) दिखाया लोगों की तरह एक खुली पिपेट धारक और लचीला नेतृत्व तार की आवश्यकता है। यह दृष्टिकोण पैनलों 6A-सी में रिले सर्किट के लिए एक विकल्प है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
एक इकाई (प्रोटोकॉल कदम 3.12) से प्रायोगिक स्थापना और प्रतिनिधि परिणाम (ए) Spikes और vibrissa आंदोलन: 7 चित्रा।। धीरे चक्र में चरण बनाम (बी 1) सामान्यीकृत vibrissa स्थिति। प्रत्येक धीरे धीरे दौरान सबसे दुम स्थिति शून्य के रूप में परिभाषित किया गया है और सबसे व्याख्यान चबूतरे स्थिति एक के रूप में परिभाषित किया गया है कि इस तरह के सामान्यीकृत है। प्रक्षेपवक्र धीरे चक्र 17 में तात्कालिक चरण बनाम सामान्यीकृत स्थिति का प्रतिनिधित्व करता है। सभी की पहचान whisks आरोपित कर रहे हैं। (बी 2) spikes के होते हैं, जिस पर धीरे चक्र में चरण के रेखापुंज। ऊर्ध्वाधर अक्ष पर प्रत्येक परीक्षण एक भी धीरे प्रतिनिधित्व करता है। एक ही इकाई के लिए सम्मान धीरे चक्र चरण के साथ कील दरों का (बी 3) हिस्टोग्राम। साइटोक्रोम ओक्सीडेस counterstaining के साथ शिकागो स्काई ब्लू रंग के (सी 1) स्थान (प्रोटोकॉल 3.13-3.14 कदम)। (सी 2 यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
प्रयोगात्मक जिग का निर्माण
यह तरीकों की एक किस्म में निर्माण किया जा सकता है के रूप में प्रयोगात्मक जिग (चित्रा 4) का निर्माण किया जाता यांत्रिक भागों का विवरण, प्रोटोकॉल से छोड़ा जाता है। इस प्रदर्शन के मानक में ऑप्टो यांत्रिक भागों और समर्थन clamps के सिर संयम बार और शरीर संयम ट्यूब (सामग्री अनुभाग देखें) माउंट करने के लिए उपयोग किया जाता है। इसी प्रकार ऑप्टो यांत्रिक भागों मोटर चालित micromanipulator के लिए इलेक्ट्रोड धारक माउंट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह जिग पर सिर संयम बार सर्जरी के दौरान सिर-संयम प्लेट प्रत्यारोपण के लिए इस्तेमाल किया पट्टी के रूप में एक ही पिच कोण पर मुहिम शुरू की है कि महत्वपूर्ण है। इलेक्ट्रोड मानक stereotaxic axes साथ ले जाया जा रहा है (यदि है, तो इलेक्ट्रोड के एक्स-अक्ष सिर-संयम पट्टी करने के लिए समानांतर बढ़ना चाहिए, और जमीन के लिए लैम्ब्डा और शीर्षस्थान और समानांतर युक्त विमान को सीधा Z अक्ष उपयुक्त एम्पलीफायरों और वर्तमान स्रोतों के प्रकार इस प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि वाणिज्यिक एम्पलीफायरों और वर्तमान स्रोतों की एक किस्म है। 1,000X की कुल लाभ प्राप्त है कि एक वर्तमान दबाना मोड के साथ अधिकांश बाह्य और intracellular इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी एम्पलीफायरों उपयुक्त हैं। 1-3 माइक्रोन pipettes, कम से कम एक μA के एक संकल्प और कम से कम 100 वी के अनुपालन के साथ 10 μA अप करने के लिए वितरित कर सकते हैं कि एक वर्तमान स्रोत के साथ शिकागो स्काई ब्लू की योणोगिनेसिस के लिए सिफारिश की है। कुछ व्यावसायिक एम्पलीफायरों है कि नोट उपयुक्त में निर्मित वर्तमान स्रोतों (सामग्री अनुभाग में वैकल्पिक भागों देखें)। हालांकि, एक उपयुक्त संयुक्त एम्पलीफायर / वर्तमान स्रोत की आवश्यकता को दरकिनार करने के लिए, एक चुंबकीय रिले सर्किट एम्पलीफायर headstage के सामने अंत (चित्रा 6A - सी) के साथ संलग्न किया जा सकता है। इस तरह के एक सर्किट ओ हैptional लेकिन यह प्रयोगकर्ता एम्पलीफायर और शारीरिक रूप से इलेक्ट्रोड perturbing बिना योणोगिनेसिस दालों वितरित करने के लिए एक अलग से वर्तमान स्रोत के बीच स्विच करने के लिए अनुमति देता है। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण मैन्युअल रूप से वर्तमान स्रोत से कनेक्ट है कि लोगों के साथ इलेक्ट्रोड नेतृत्व तारों को बदलने के लिए है। इस मामले में, यह विंदुक के शीर्ष (अटूट अंत) लगा देना नहीं है, और लचीला नेतृत्व तार (चित्रा 6D) का उपयोग करने के लिए जो एक पिपेट धारक उपयोग करने के लिए सबसे अच्छा है। अभ्यास दोहराया पड़ सकता है कदम मास्टर करने के लिए अभ्यास की आवश्यकता हो सकती है कि कई कदम उठाए हैं। सबसे निपुणता की आवश्यकता है कि कदम पिपेट की नोक टूट रहा है। यह गिलास में टिप का प्रतिबिंब कल्पना करने के लिए गिलास ब्लॉक के किनारे पेंट करने के लिए उपयोगी है। टिप मुश्किल से अपनी परछाई से मिलता है तो जब तक एक धीरे-धीरे ब्लॉक और पिपेट अग्रिम कर सकते हैं। Micropipette चकनाचूर और टिप व्यास भी larg कर सकते हैं भी तेजी से पिपेट या ब्लॉक में आगे बढ़नेई या असमान। प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में हम, क्वार्ट्ज से बना micropipettes का उपयोग करना चाहिये। Micropipettes प्रभावी रूप से झुकने या तोड़ने के बिना लंबे समय से तैयार craniotomies में बरकरार चूहे ड्यूरा घुसना quarts। इस अतिरिक्त जटिलताएं पैदा कर सकता है, जो ड्यूरा लकीर लिए की जरूरत है, समाप्त। कम tapers साथ borosilicate micropipettes (<5 मिमी) भी ड्यूरा घुसना, लेकिन उनके उपयोग सेरेब्रल कॉर्टेक्स या स्ट्रिएटम तरह सतही संरचनाओं से रिकॉर्डिंग करने के लिए सीमित है। विशेष रूप से चेतक या brainstem में गहरे ढांचे, से रिकॉर्डिंग, लंबा पतला, अधिमानतः क्वार्ट्ज micropipettes की आवश्यकता है। अभ्यास की आवश्यकता है कि एक दूसरे कदम juxtacellular विन्यास में पिपेट स्थिति है। बहुत जल्दी एक सेल करने के लिए जब करीब पिपेट बढ़ते झिल्ली टूटना कर सकते हैं। इसलिए, यह टिप एक ख्यात सेल के करीब है जब पता करने के लिए पिपेट का प्रतिरोध की निगरानी के लिए उपयोगी है। कम से कम दो गुना की झिल्ली प्रतिरोध में परिवर्तन इलेक्ट्रोड NE हो सकता है कि संकेत मिलता हैगिरफ्तारी या एक कोशिका झिल्ली को छू। आम नुकसान मन में सहन करने के लिए कई आम नुकसान कर रहे हैं। विंदुक टिप बहुत करीब सेल करने के लिए जरूरी है, क्योंकि सबसे पहले, यह पिपेट झिल्ली से दूर drifts अगर सेल "खो" के लिए संभव है। एक सेल उत्तेजित हो जाते हैं या रिकॉर्डिंग के माध्यम से रास्ते के मध्य में संबंध विच्छेद करने के लिए यह भी संभव है। यदि ऐसा है, स्पाइक चौड़ाई और फायरिंग दर में वृद्धि हो सकती है और कील आयाम कम हो सकती है। ये सेल अस्वस्थ हो सकता है कि संकेत हैं। पशु आंदोलन अनिवार्य रूप से इन घटनाओं रिकॉर्डिंग के कुछ अनुपात पर होने के कारण होगा, लेकिन पशु अच्छी तरह से आदी होने से और पशु डराना कंपन है कि अनावश्यक, अचानक जोर से शोर मचा रहा से बचने या पैदा करने के द्वारा कम किया जा सकता है। प्रोटोकॉल के लिए संभावित संशोधनों यह जानवर है जिसमें संदर्भों में इस रिकॉर्डिंग और लेबलिंग तकनीक का उपयोग करने के लिए संभव हैव्यवहार कार्यों की एक किस्म प्रदर्शन। एक विशेष व्यवहार कार्य के लिए प्रशिक्षण सर्जरी के बाद, लेकिन रिकॉर्ड करने के लिए शुरुआत से पहले बाहर किया जा सकता है। Neuronal गतिविधि craniotomy तैयार करने के बाद कम से कम 1-2 सप्ताह दर्ज किया जा सकता है, और iontophoretic धब्बे कम से कम 2-3 दिनों के लिए पिछले कर सकते हैं। इस समय सीमा के अलग रिकॉर्डिंग सत्र के दौरान कई मस्तिष्क क्षेत्रों से रिकॉर्डिंग सहित प्रयोगात्मक जोड़तोड़ की एक किस्म परमिट। तकनीक भी रिकॉर्डिंग बना रहे हैं जिसमें से व्यक्तिगत न्यूरॉन्स को भरने के लिए संशोधित किया जा सकता है। एकल न्यूरॉन्स की juxtacellular लेबलिंग के इस वैकल्पिक रणनीति पशु अभी भी या anesthetized है जब केवल हासिल की है कि यांत्रिक स्थिरता की आवश्यकता है। इस लेबलिंग रणनीति के लिए, बीडीए के उपयोग Neurobiotin से अधिक की सिफारिश की है। बीडीए काफी Neurobiotin अधिक सफलता की दर बढ़ जाती है, जो प्रोटिएजों, द्वारा अपमानित नहीं है। लेबल perfusing पहले पिछले रिकॉर्डिंग सत्र के दौरान प्रयास किया जाना चाहिएजानवर। Juxtacellular प्रोटोकॉल की है कि विस्तृत विवरण शिकागो स्काई ब्लू के हमारे अनुभव iontophoretic इंजेक्शन में, चेतावनी चूहों 8 में सफलतापूर्वक नियोजित किया गया है तकनीक .While पहले से 6,19 वर्णित किया गया है नोट एक काफी अधिक उपज है। शिकागो स्काई ब्लू और Neurobiotin या बीडीए लेबलिंग दोनों एक ही पशु में किया जा सकता है कि ध्यान दें। इस तकनीक प्रजातियों में से एक किस्म के लिए उपयुक्त होने की संभावना है। Juxtacellular रिकॉर्डिंग, उदाहरण के लिए चेतावनी चूहों 9 की cortical क्षेत्रों में किया गया है कि ध्यान दें। प्रशिक्षण, हैंडलिंग, और सिर-संयम विशिष्ट प्रजातियां हैं, वहीं इस प्रोटोकॉल में वर्णित निगरानी और लेबलिंग के लिए विशेष तकनीक ही रहना चाहिए। अंत में, बस विंदुक टिप और इस तकनीक औषधीय एजेंटों 20,21 सहित अणुओं की एक किस्म की iontophoretic इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है वर्तमान दालों के मापदंडों के आकार बदलकर। इस प्रकार,तकनीक भी बर्ताव जानवरों शामिल है जो neuropharmacological अध्ययन के लिए उपयोगी हो सकता है। निष्कर्ष यह अक्सर एक साथ बेहद करीब हैं, जो मस्तिष्क क्षेत्रों स्पष्ट रूप से अलग गुण और / या कार्य 22 हो सकता है कि मामला है। ऐसे मामलों में, जीवधारी व्यवहार करने के लिए संरचनात्मक रूप में परिभाषित क्षेत्रों से एकल न्यूरॉन्स की गतिविधियों से संबंधित तंत्रिका सर्किट और गणना को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। वर्तमान अनुच्छेद मानक तकनीक के संयोजन का उपयोग यह पूरा करने के लिए एक प्रोटोकॉल को दर्शाता है और एक उदाहरण के रूप VPM thalamic न्यूरॉन्स में संवेदी एन्कोडिंग का वर्णन है। तकनीक विभिन्न पशु मॉडल में मस्तिष्क क्षेत्रों और व्यवहार मानदंड की एक किस्म में प्रासंगिक और संभव होने की संभावना है। यह चेतावनी जानवरों 6,8 में एकल कक्ष juxtacellular लेबलिंग की तुलना में काफी अधिक सफलता दर है, और बहु-हाथी का उपयोग तकनीक है कि अधिक बेहतर संरचनात्मक संकल्प का लाभ दिया हैctrode सरणियों या microdrives।
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Disclosures
लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketaset (Ketamine HCl) | Fort Dodge | N/A | |
| Anased (Xylazine solution) | Lloyd Laboratories | N/A | |
| Betadyne (Povidone-Iodine) | CVS Pharmacy | 269281 | |
| Loctite 495 | Grainger Industrial Supply | 4KL86 | 20 - 40 cp cyanoacrylate |
| Vetbond | 3M | 1469SB | |
| Grip cement powder | Dentsply Intl | 675571 | For the base of the recording chamber |
| Grip cement liquid | Dentsply Intl | 675572 | For the base of the recording chamber |
| Silicone gel | Dow Corning | 3-4680 | |
| Jet denture repair acrylic powder | Lang Dental Manufacturing Co. | N/A | For securing the head restraint apparatus to the cranium |
| Ortho-Jet Fast curing orthodontic acrylic resin liquid | Lang Dental Manufacturing Co. | N/A | For securing the head restraint apparatus to the cranium |
| Chicago sky blue | Sigma | C8679 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | For perfusion and tissue fixation |
| Phosphate-buffered saline | Sigma | P3813 | For perfusion and tissue fixation |
| Cytochrome C | Sigma | C2506 | For cytochrome-oxidase staining, Figure 7 |
| Diaminobenzidine | Sigma | D5905 | For cytochrome-oxidase staining, Figure 7 |
| Rat sock | Sew Elegant (San Diego, CA) | N/A | Custom made, Figures 1, 4 |
| PVC tube 2 ½” | U.S. Plastic Co. | 34108 | Figure 4 |
| Subminiature D pins & sockets | TE Connectivity | 205089-1 | Figure 3 |
| Stainless steel music wire 0.010” diameter | Precision Brand Products, Inc. | 21010 | Figure 3 |
| Stereotaxic holding frame | Kopf Instruments | Model 900 | Figure 3 |
| Stereotaxic ear bars | Kopf Instruments | Model 957 | Figure 3 |
| Stereotaxic manipulator | Kopf Instruments | Model 960 | Figure 3 |
| ½ mm drill burr | Henry Schein | 100-3995 | |
| Quiet-Air dental drill | Midwest Dental | 393-1600 | |
| Stainless steel 0-80 ⅛” screw | Fastener superstore | 247438 | Figure 3 |
| 0.2 ml centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-407-8A | Figure 3 |
| Custom head-holding bar | UCSD SIO Machine Shop | N/A | Custom made, Figures 2 - 4 |
| Custom head-holding plate | UCSD SIO Machine Shop | N/A | Custom made, Figures 2 - 4 |
| Right angle post-clamp | Newport | MCA-1 | Figures 3, 4; standard opto-mechanical parts for the experimental jig (Figure 4) are also from Newport Corp. |
| 8-32 ¾” screw | Fastener Superstore | 240181 | For head-restraint, Figure 3 |
| 4-40 ¼” screw | Fastener Superstore | 239958 | For head restraint, Figures 3, 4 |
| Quartz capillary tubing | Sutter Instruments | QF-100-60-10 | Figure 5 |
| Carbon dioxide laser puller | Sutter instruments | P-2000 | |
| Motorized micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | |
| Microelectrode amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | Alternate part: Molecular Devices Axoclamp 900A |
| Microelectrode amplifier head stage | Molecular Devices | CV-7B | Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A |
| Isolated pulse stimulator | A-M Systems | Model 2100 | Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A |
| Audio monitor | Radio Shack | 32-2040 | |
| Pipette holder | Warner Instruments | #MEW-F10T | Alternate parts: see Discussion, Figure 6A |
| Electrode lead wire | Cooner wire | NEF34-1646 | (optional), Figure 6D |
| Relay for amplifier head-stage | COTO Technology | #2342-05-000 | (optional) Used with a custom-made printed circuit board (UCSD Physics Electronics Shop), Figure 6A-C |
| Digital video camera | Basler | A602fm | (optional) For behavioral monitoring, Figure 7 |
| Puralube vet ointment | Amazon.com, Inc | NC0138063 |
References
- Fee, M. S., Leonardo, A. Miniature motorized microdrive and commutator system for chronic neural recording in small animals. Journal of Neuroscience Methods. 112 (2), 83-94 (2001).
- Ventakachalam, S., Fee, M. S., Kleinfeld, D. Ultra-miniature headstage with 6-channel drive and vacuum-assisted micro-wire implantation for chronic recording from neocortex. Journal of Neuroscience Methods. 90 (1), 37-46 (1999).
- Szuts, T. A. A wireless multi-channel neural amplifier for freely moving animals. Nature Neuroscience. 14 (2), 263-269 (2011).
- Roy, S., Wang, X. Wireless multi-channel single unit recording in freely moving and vocalizing primates. Journal of neuroscience. 203 (1), 28-40 (2012).
- Hill, D. N., Mehta, S. B., Kleinfeld, D. Quality metrics to accompany spike sorting of extracellular signals. Journal of Neuroscience. 31 (24), 8699-8705 (2011).
- Pinault, D. A novel single-cell staining procedure performed in vivo under electrophysiological control: morpho-functional features of juxtacellularly labeled thalamic cells and other central neurons with biocytin or Neurobiotin. Journal of neuroscience. 65 (2), 113-136 (1996).
- Person, A. L., Perkel, D. J. Pallidal neuron activity increases during sensory relay through thalamus in a songbird circuit essential for learning. The Journal of neuroscience. 27 (32), 8687-8698 (2007).
- Kock, C. P., Sakmann, B. Spiking in primary somatosensory cortex during natural whisking in awake head-restrained rats is cell-type specific. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 106 (38), 16446-16450 (2009).
- Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice. Neuron. 67 (6), 10481061 (2010).
- Hellon, R. The marking of electrode tip positions in nervous tissue. The Journal of physiology. 214, 12P (1971).
- Furuta, T., Deschênes, M., Kaneko, T. Anisotropic distribution of thalamocortical boutons in barrels. The Journal of Neuroscience. 31 (17), 6432-6439 (2011).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (1986).
- Kleinfeld, D., Delaney, K. R. Distributed representation of vibrissa movement in the upper layers of somatosensory cortex revealed with voltage sensitive dyes. Journal of Comparative Neurology. 375 (1), 89-108 (1996).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain research. 171 (1), 11-28 (1979).
- Moore, J. D., Deschênes, M., Kleinfeld, D. Self-generated vibrissa motion and touch are differentially represented throughout ventral posterior medial thalamus in awake, head-fixed rats. Society for Neuroscience Annual Meeting. 41 496.08/TT424 Society for Neuroscience. 41, (2011).
- Khatri, V., Bermejo, R., Brumberg, J. C., Zeigler, H. P. Whisking in air: Encoding of kinematics by VPM neurons in awake rats. Somatosensory and Motor Research. 27 (2), 344-356 (2010).
- Hill, D. N., Curtis, J. C., Moore, J. D., Kleinfeld, D. Primary motor cortex reports efferent control of vibrissa position on multiple time scales. Neuron. 72 (2), 344-356 (2011).
- Moore, J. D. Hierarchy of orofacial rhythms revealed through whisking and breathing. Nature. 497, 205-210 (2013).
- Duque, A., Zaborszky, L. Neuroanatomical Tract-Tracing 3. , Springer. 197-236 (2006).
- Neuroactive substances: Neuropharmacology by microiontophoresis. , Kation Scientific. Available from: http://kationscientific.com/fsubstances.html Forthcoming.
- Dyes and Tracers: Sitemarking and tracktracing by microiontophoresis. , Kation Scientific. Available from: http://kationscientific.com/fdyes.html Forthcoming.
- Urbain, N., Deschênes, M. Neuroactive substances: Neuropharmacology by microiontophoresis. (Kation Scientific), Dyes and Tracers: Sitemarking and tracktracing by microiontophoresis. (Kation). Journal of Neuroscience. 27 (45), 12407-12412 (2007).
