Introduction
Overvågning neuronal aktivitet i en advarsel dyr aktivt engageret i en adfærdsmæssig opgave er afgørende for at forstå funktion og organisering af nervesystemet. Ekstracellulær registrering af den elektriske aktivitet fra enkelte neuronale enheder har længe været en hæfteklamme værktøj systemer neurovidenskab og er stadig i vid udstrækning anvendes på nuværende tidspunkt. En række af elektrode typer og konfigurationer, afhængigt af de videnskabelige og tekniske krav, som en bestemt eksperiment. Kronisk implanteret Microdrives eller elektrode arrays anvendes ofte i frit bevægelige dyr, herunder fugle, gnavere og ikke-menneskelige primater 1-4. Alternativt er akutte gennemføringer med metal eller glas mikroelektroder via en ekstern mikromanipulator ofte til at optage fra bedøvede eller head-behersket dyr. Glasmikropipette elektroder har den fordel, at de kan anvendes i juxtacellular eller "celle vedlagte" konfiguration utvetydigt isolereaktivitet af enkelte neuroner uden komplikationer af post-hoc spike sortering 5. Disse elektroder endvidere muliggøre optagelse fra anatomisk identificerede celler eller steder, da de kan anvendes til at injicere små aflejringer af farvestof eller neuroanatomiske sporstoffer, eller endda til at fylde den enkelte optaget celle. Denne konfiguration er blevet anvendt med succes i rotter, mus og fugle 6-10. Det for tiden beskrevne teknik fokuserer på juxtacellular overvågning og ekstracellulære farvestof indskud i alarm, head-behersket rotter. Bemærk, at i modsætning til enkelt celle juxtacellular fylder, disse farvestof indskud ikke give oplysninger om cellemorfologi eller axonale fremspring 11, men de gør det muligt nøjagtigt anatomisk lokalisering til ca. 50 um og kritisk, har en betydeligt højere udbytte i Alert dyr. Oplysninger om encellede juxtacellular fylder ikke desto mindre fastsat som en alternativ strategi for anatomiske mærkning.
Kort sagt, denprotokol består af tre hovedfaser. I den første fase, er rotten akklimatiseret til kroppen tilbageholdenhed i en klud sok (Figur 1) over en periode på 6 dage. I den anden fase, er en nakkestøtte apparat (figur 2) og optagelse kammer indopereret sådan, at rotten kan opretholdes i stereotaktisk fly under flere efterfølgende indspilningerne (Figur 3); denne procedure giver forsøgslederen at målrette bestemte subcorticale områder af hjernen for elektrofysiologiske undersøgelse baseret på standard henvisning koordinater 12. Den tredje fase indebærer at placere rotten i et passende jig for udførelse af adfærdsmæssige og elektrofysiologiske forsøg (figur 4), konstruere elektroden fra en kvarts kapillarrør (figur 5), hvilket gør juxtacellular neuronale optagelser, entydigt isolere enkelte enheder 6-9, og markerer anatomiske locatipå af optagelsen site med Chicago Sky blå farvestof (figur 6 og 7). Optagelserne udføres med samtidig adfærdsmæssige overvågning; dog vil de tekniske detaljer i den adfærd afhænge af de videnskabelige mål for hvert forsøg, og er således uden for rammerne af en enkelt protokol. Efter afslutning af den eksperimentelle procedure, der kan gentages på flere dage, dyret aflivet. Hjernen udvindes og forarbejdes i overensstemmelse med standard neuroanatomiske teknikker, der anvender enten lyse felt eller fluorescens mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forsøgsprotokoller blev udført på kvindelige Long Evans rotter (250-350 g) i overensstemmelse med føderalt foreskrevne dyr pleje og brug retningslinier og blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg på University of California San Diego.
1. acclimating Rat til kroppen Restraint
BEMÆRK: Placer rotte på en diæt. Feed rotter en gang om dagen umiddelbart efter hver daglige håndtering session at akklimatisere rotte til fastholdelsesanordningen (beskrevet nedenfor). Giv foder nok til at opretholde dyret ved 80% af dens oprindelige vægt. Dette beløb er cirka 6 gram foder per dag for en 250 g kvindelige Lang Evans rotte.
- Akklimatisere rotten til at blive håndteret af mennesker. Forsigtigt begrænse rotten med hånden i perioder på ca. 5 sek hvert 30. sek. Gør dette i 15 minutter om dagen på 2 på hinanden følgende dage. Overvåg rotterne dagligt for tegn på stress i løbet af praktikperioden. Tegn omfatter kæmper in reaktion på tilbageholdenhed, vokalisering, og tand-snakkende.
- På den 3. dag, placere rotte i et organ-begrænsende klud sok (figur 1) i 15 minutter om dagen på to på hinanden følgende dage.
- På den 5. dag, placeres rotten inde i strømpen, og placere sok inde i et stift rør på den eksperimentelle jig (figur 4). Lad rotte i røret i 15 minutter om dagen på 2 på hinanden følgende dage.
- Feed rotter umiddelbart efter hver træning. Ved slutningen af den sidste session (6 th dag) giver ubegrænset adgang til mad. Vælg til implantation kun de rotter, som ikke udviser tegn på overdreven stress på den sidste træningsdag.
BEMÆRK: Selv udvælgelsen af rotter for implantation er subjektiv, i vore hænder over 90% af rotter blev fundet at være responsive til tilvænning og i stand til at undergå implantation.
2. Implantation af Recording Afdeling og Head-tilbageholdenhed Mechanism
- Lav en reference tråd ved lodning nøgne tråd af rustfrit stål til en polet stik. Skær tråden, så 3-5 mm forbliver udækket af pinden. Autoklaver reference tråd, sammen med alle kirurgiske redskaber.
- Administrer ketamin / xylazin anæstesi. Administrer 95 mg / kg ketamin blandet med 5 mg / kg xylazin intraperitonealt. Startdosis varer 1½ til 2 timer. Supplement anæstesi hver 30-45 min derefter efter behov. Smør dyrets øjne med en oftalmisk salve.
- Kontroller tilbagetrækning tå refleks at bestemme plan anæstesi, og opretholde anæstesi er nødvendigt.
- Placer rotte i en stereotaktisk bedrift ramme med øre barer (Figur 3A). Barber håret på hovedet og desinficere såret med povidon-iod (10% opløsning). Vær omhyggelig med at indsætte øre barer hensigtsmæssigt, så de ikke beskadiger trommehinden. Øre barer med stumpe tips er at foretrække.
- Lav et snit med en skalpel indbyrdesende langs midterlinjen af kraniet fra Rostro-caudale øjeplanet på bagsiden af ørerne. Brug saks til at klippe og fjerne en 2-3 mm strimmel af huden på hver side af snittet.
- Skrabes væk periosteum for at blotlægge overfladen af kraniet ud til de laterale kamme. Dæk den udsatte kraniet med tyndt lag af superlim.
- Bor et lille hul med en lidt mindre diameter end 0-80 skruer ved hjælp af en ½ mm bore grat (se Materialer afsnit). Bor hullet umiddelbart bagved hvor bregma sutur opfylder den laterale kant og ved en vinkel på 30-45 ° i kraniet, således at skruen kan gå ind med den øverste mere lateral end bunden.
- Skru en 0-80 fladbundet maskine skruen til hullet (ca. 3 omgange), ved 30-45 ° vinkel. Pas på ikke at skrue på for dybt til at undgå at beskadige underliggende hjernevæv.
- Gentag denne procedure for 6 yderligere skruer i konfigurationen vist
- Placer en sprøjte nål i stereotax manipulator. Mål fra bregma sutur, og lave en bule i baghovedet med nålen nær, men uden for det ønskede kraniotomi placering, som en reference mærke.
BEMÆRK: I denne demonstration stereotaktisk koordinater for mærket er 3 mm posteriort og 1 mm sideværts til bregma sutur. - Mærk bule med en permanent markør. Bemærk stereotaktisk koordinater for spillet, da det vil tjene som et stereotaktisk referencepunkt (Figur 3B).
- Lav en kraniotomi centreret på de ønskede koordinater (3 mm posteriort og 3 mm lateralt for bregma i dette eksempel). Lad dura mater intakt. Dæk kraniotomi med modificeret kunstig cerebral spinalvæske (125 mM NaCl, 10 mM glucose, 10 mM HEPES, 3,1 mM CaCl2, 1,3 mM MgCl2, pH 7,4) 13 (figur 3C). Skær en 0,2 ml centrifugerør til 4 - 5 mm i længden, og afbrød hætten. Glasset anbringes på kraniet og centrere det over kraniotomi.
- Anvend dental cement omkring bunden af røret for at forsegle bunden af røret med baghovedet. Pas på ikke at lække cement i den udsatte kraniotomi (figur 3D).
- Bor anden lille hul (ca. ½ mm diameter) i den kontralaterale kranie plade og omhyggeligt indsætte henvisningen wire. Konstruer henvisning tråd ved lodning en stift, grænseflader med optagelsen forstærker til enden af wiren (se Equipment afsnit). Flyt ikke henvisningen ledning, når det er i hjernen, da det kan forårsage skade.
- Anvend superlim til hullet, hvor tråden blev indsat. Dette vil forsegle stiften og tråd på plads midlertidigt.
- Bland de to dele af siliconegel kit (se Materialer afsnit) i omtrent lige store portioner. Vent i to minutter for at blande og fill centrifugeglasset ca. ⅓ fuld med gel.
- Vedhæft en ret vinkel stolpe klemme (se Materialer afsnit) til nakkestøtten bar. Fastgør toppladen (figur 2A) til bedriften bar (figur 2B) ved en 45 ° stigningsvinkel, så at bunden af pladen mod næsen af dyret. Det er nyttigt at bruge en hældningsmåler til at indstille stigningsvinklen så det passer til den eksperimentelle jig (figur 4).
- Fastgør den bedrift bar til stereotax manipulatorarm så linjen er parallel til øret barer. Sænk bar og plade således at pladen er posterior af lambda sutur og forreste til den caudale-mest skrue.
- Tag fat i forreste hoved-bolt (en 8-32 stud eller skrue, se Materialer afsnit) ved ca. 45 ° vinkel med en hjælpende hænder arm og klemme, således at skruehovedet vender nedad og mod halen af dyret. Sænk skruen, så den rører myrenerior 0-80 skruer (Figur 3F, G).
- Fastgør bolten og pladen på plads med dental akryl. Anvend dental akryl omkring knoglen skruehoveder henvises pin, og omkring siderne af centrifugerøret. Vent ca. 10 min til dental akryl tørre (Figur 3H).
- Påfør et lag af dental cement omkring kanterne af dental akryl, cementering huden til implantatet. Vent, til cement til tørre.
- Poke flere huller i hatten på centrifugerøret, og placer hætten på tuben.
- Fjern hjælpende hænder klemme. Derefter forsigtigt fjerne head-bedrift bar fra stereotax, og fjern derefter hoved plade fra baren (Figur 3I).
- Fjern dyret fra stereotax og administrere postoperativ pleje og overvågning i overensstemmelse med alle gældende regler, forskrifter og love (f.eks Buprenorphin 0,02 mg / kg, hver 8-12 timer i mindst 24h). Hvis betændelse udvikler omkring kanterne af implantatet, et tyndt lag af antibiotisk salve på det angrebne sted dagligt indtil løst.
3. Juxtacellular Overvågning af neuronal Units
- Træk kvarts kapillær slange på en kuldioxid laser mikropipette aftrækker (se Equipment afsnit) med spids diameter på mindre end 1 um (figur 5A).
BEMÆRK: opvarmningen vil variere alt efter den særlige instrument, og at den krævede hals diameter vil variere afhængigt af hjernens struktur af interesse. For optagelser i rotter thalamus, mikropipetter har halse spænder fra 5-7 mm. - Fastgør pipetten på plads under en kontrast differential interferens (DIC) mikroskop udstyret med lange arbejds- mål afstande. Brug modellervoks til at holde pipetten på plads på mikroskopet scene.
- Langsomt bevæger et glas blok (0,5-1 cm tykke, et stykke glas, der anvendes til making ultra-mikrotomknive er praktisk) i synsfeltet med pipettespidsen. Brug scenen mikromanipulator, røre forsigtigt pipettespidsen til glasset, så den knækker. Gentag om nødvendigt, indtil pipettespidsen ydre diameter er mellem 1-3 um (Figur 5B, C). Sørg for, at disse mikropipetter har impedanser mellem ca. 5-15 MQ.
- Forbered ekstracellulære saltvand (135 mM NaCl, 5,4 mM KCI, 1,8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5 mM HEPES, pH 7,2 med NaOH) 8 og tilsættes 2% (w / v) Chicago sky blue. Ved hjælp af en sprøjte med en 30 G nål eller mindre, fylde bagenden af pipetten med opløsningen. Alternativt, for enkelt celle juxtacellular mærkning tilsættes 2% (w / v) Neurobiotin eller biotinyleret dextran amin (BDA-3000 eller BDA-10000) til saltopløsningen i stedet for Chicago sky blue.
- Placer rotte inde i kluden sok inden i stive rør på en passende eksperimentel jig (
- Fastgør head-fastholdende plade på rotten til det tilsvarende brik på jig. For at gøre dette, først pin hovedet tilbageholdenhed plade på plads, og fastgør den med en 4-40 skrue derefter. Vær sikker på at vente, indtil dyret er rolig for at undgå at bruge stort drejningsmoment til hovedet. Herefter sættes en 8-32 møtrik på head-fastholdende bolt, der er implanteret på rotten. Skru derefter i en med gevind rustfrit stål stang til hovedet-bolt. Fastgør stangen til den eksperimentelle jig på en sådan måde, at det kan strammes på plads (figur 4).
BEMÆRK: Sikring af dyret med head-bolt samt hoved-tilbageholdenhed plade minimizes bøjning af apparatet og forbedrer optagelse stabilitet. I de fleste tilfælde Optagelsen kan begynde på den første dag dyret er head-behersket. Men hvis dyret fidgets overdrevent eller vocalizes, giver én dag i head-tilbageholdenhed tilvænning træning, før de påbegynder optagelser. I dette tilfælde, skal du lade dyret på jig i 15 minutter og derefter placere den tilbage i sit bur. Gentag dette trin den følgende dag og fortsætte med protokollen.- Åbn optagelsen kammeret og fjern silikonegel. Rengør kraniotomi med fin pincet hvis væv er igen vokset i kraniotomi.
- Sæt pipetten til den motoriserede mikromanipulator, og tilslut hovedtrin forforstærker.
BEMÆRK: I denne demonstration er en lille relæ kredsløb på hovedtrin bruges til at skifte mellem de forstærker ledninger og en ekstern strømkilde med høj overholdelse (figur 6A-C). Bemærk, at nogle forstærkere har en passende indbygget høj overholdelse kilde(Se Diskussion og Materialer sektioner).- Brug den motoriserede mikromanipulator at flytte spidsen af pipetten til stereotaksisk identificerede mærke i optagelsen kammer. Bemærk koordinaterne for denne placering. Vær omhyggelig med ikke at bryde spidsen af pipetten på kraniet.
- Flyt pipette til den ønskede optagelse placering i anterior-posterior og medio-laterale akser. Derefter videre pipetten ventralt gennem dura, indtil det er ca. 500 um dorsale til den tilsigtede optagelse placering.
- Langsomt fremme pipette, mens du lytter til spiking begivenheder på en lyd monitor af den forstærkede spænding registreret mellem pipettespidsen og henvisningen wire. Når standardtilsætningsforsøg begivenheder er identificeret, fortsætte med at bevæge pipetten 0-100 um indtil positivt gående spænding omlægninger større end ca. 500 μV overholdes.
BEMÆRK: elektrode modstand vil stige med en faktor på ca. 1,5-10 whda dette sker.- Begynd optagelse en gang om enheden er blevet isoleret som ifølge trin 3.11, sammen med alle andre adfærdsmæssige og fysiologiske mål af interesse. I den foreliggende demonstration, er selv-genereret vibrissa bevægelser overvåget med høj hastighed videography (se Materialer afsnit).
- For at mærke optagelsen site, skifte elektroden fører til forbindelse til strømkilden. Der er flere måder at gøre dette, enten ved hjælp et relæ kredsløb (figur 6A - C), en indbygget strømkilde på forstærkeren, eller manuelt (figur 6D, se trin 3.8 og diskussion). Pass -4 uA med 2 sek pulser ved 50% duty cycle for 4 min til iontoforetisk injicere Chicago Himmelblå gennem pipetten.
- Dræb og perfundere dyret efter flere etikettering i henhold til standardpraksis. § hjernen og kontrastfarve som nødvendige for at identificere den anatomiske placering af optagelsen siddee. Kontrastfarve vævet for cytochromoxidase reaktivitet pr 14. Alternativt identificere Chicago Sky Blå indskud ved hjælp af fluorescens mikroskopi.
BEMÆRK: For at præcist skelne mellem forskellige mærkede enheder er det vigtigt, at alle mærkater er lavet med den samme pipette på samme dag, uden frakobling pipetten mellem etiketterne. I dette tilfælde optagelse sites kan differentieres ved deres relative placeringer i post-hoc histologi sammen med de angivne manipulator koordinaterne for hvert sted (se trin 3.9). For entydig identifikation, markere etiketterne mindst 200 um fra hinanden, og ikke mere end 3-5 etiketter pr hjerne region. - Fastgør head-fastholdende plade på rotten til det tilsvarende brik på jig. For at gøre dette, først pin hovedet tilbageholdenhed plade på plads, og fastgør den med en 4-40 skrue derefter. Vær sikker på at vente, indtil dyret er rolig for at undgå at bruge stort drejningsmoment til hovedet. Herefter sættes en 8-32 møtrik på head-fastholdende bolt, der er implanteret på rotten. Skru derefter i en med gevind rustfrit stål stang til hovedet-bolt. Fastgør stangen til den eksperimentelle jig på en sådan måde, at det kan strammes på plads (figur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Neurale enheder i ventrale posterior mediale (VPM) thalamus indkode fasen af vibrissa bevægelse under selv-genererede røre 15,16. Figur 7A viser stikprøve spiking aktivitet af en VPM thalamiske enhed som en rotte aktivt røre. Figur 7B viser et histogram af spike gange tilpasset til den øjeblikkelige fase af vibrissa bevægelse 17. Der er flere pigge under tilbagetrækning fase piskning. Efter optagelsen var placeringen af enheden mærket via iontoforese Chicago sky blue farvestof, som vist i figur 7C. Vævet er modfarvet for cytochromoxidase aktivitet at afsløre de neuroanatomiske grænser VPM thalamus. En lignende version af denne protokol blev for nylig anvendt til at overvåge røring-relaterede multiunit neuronal aktivitet (10-20 um diameter pipettespidser) i bestemte hjernestamme kerner 18.
re 1 "src =" / files / ftp_upload / 51453 / 51453fig1.jpg "/>
Figur 1: Cloth fastholdende sok (A) Fotografi af en rotte sok med snører og løbegang hægter.. Den lille ende er placeret tæt omkring brystbenet, og den store ende omkring halen. (B) mønster for sokken i panel 1A. Dimensioner i inches.
Figur 2: Udførelse af apparater nakkestøtte (A) Udførelse af en præcision nakkestøtte plade for rotter.. Dimensioner i inches. (B) Udførelse af en nakkestøtte bar til brug med pladen i panelet 2A. Protokollen kræver to af disse dele, der er monteret ved hjælp af retvinklede indlæg klemmer på samme tonehøjde vinkel._blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3: Kirurgisk procedure (A) Rotte i en stereotaktisk holderamme (protokol trin 2.4).. (B) operationsstedet med implanterede skruer og kranielle markeringer (protokol trin 2.10). (C) operationsstedet med en kraniotomi (protokol trin 2.12). (D) operationsstedet med optagelsen kammer (protokol trin 2.14). (E) operationsstedet med henvisning wire og silikone gel (protokol trin 2.17). (F, G) operationsstedet med nakkestøtte plade og bar holdes på plads (protokol trin 2.20). (H) operationsstedet i med plade og bar cementeret på plads (protokol trin 2.21). (I) Final head-tilbageholdenhed og registreringskammer implant (protokol trin 2.24). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 4:. Eksperimentel jig Diagram af rotte i den mekaniske jig for elektrofysiologiske og adfærdsmæssige overvågning eksperimenter (protokol trin 3,5-3,6). Den jig udnytter bar og plade i figur 2.
Figur 5: Mikropipette elektrode konstruktion (A) Micrograph af en ubrudt mikropipette (protokol trin 3.1).. Scale bar er som i panel C. (B) Micrograph af den ubrudte mikropipette og glas blok under mikroskop (protokol trin 3.2).Refleksionen af spidsen kan ses i glasset. Scale bar er som i panel C. (C) Micrograph af den brudte mikropipetten (protokol trin 3.3). (D) Micrograph af spidsen af den ubrudte mikropipette i boxed region panel A. Scale bar er som i panel E. (E) mikrograf af spidsen af den brudte mikropipette i boxed region panel C. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6:. Udstyr til at skifte mellem forstærkeren og strømkilde (A) Setup for at skifte ledningerne fra forstærkeren til den aktuelle kilde via en magnetisk relæ (ekstraudstyr). En printplade, der indeholder den spændingsstyrede relækobling attached til forstærkeren hoved fase. (B) Layout for printkortet i panel 6A. Brættet forbinder forstærkeren ledninger og strømkilden fører til input stifter af relæet, og elektroden fører til output pins. Elektroden er forbundet til enten strømkilden eller forstærkeren ved at anvende enten 0 eller 5 V til relækontrol ben. Set nedefra. Dimensioner i inches. (C) Ovenfra af bestyrelsen layout i panelet 6B. (D) Setup for at skifte ledningerne fra forstærkeren til den aktuelle kilde manuelt (ekstraudstyr) kræver et åbent pipette holder og fleksibel ledning som dem der er vist (se også: Udstyr afsnit). Denne fremgangsmåde er et alternativ til relæet kredsløb i paneler 6A-C. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 7: Eksperimentel opsætning og repræsentative resultater (A) Spikes og vibrissa bevægelse fra én enhed (protokol trin 3.12).. (B1) Normalized vibrissa position versus fase i piskeris cyklus. Hver piskeris normaliseres, således at den mest kaudale position under piskeris er defineret som nul, og mest rostrale position defineres som én. Den bane repræsenterer den normaliserede position versus øjeblikkelige fase i piskeris cyklus 17. Alle identificerede piskeris overlejres. (B2) Raster af fasen i piskeris cyklus, ved hvilken der opstår spikes. Hvert forsøg på den lodrette akse repræsenterer en enkelt piskeris. (B3) Histogram af Spike satser med hensyn piskeris cyklus fase for den samme enhed. (C1) Placering af Chicago Sky Blå farvestof med cytochromoxidase kontrastfarvning (protokol trin 3,13-3,14). (C2 Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Konstruktion af den eksperimentelle jig
Beskrivelsen af de mekaniske dele, der anvendes til at bygge den eksperimentelle jig (figur 4) er udeladt fra protokol, da det kan konstrueres i en række forskellige måder. I denne demonstration standard opto-mekaniske dele og support klemmer bruges til at montere nakkestøtten bar og kroppen tilbageholdenhed rør (se Materialer afsnit). Lignende opto-mekanisk dele kan bruges til at montere elektrodeholder til den motoriserede mikromanipulator. Det er vigtigt, at nakkestøtten bar på jig er monteret ved samme stigningsvinkel som bar anvendes til at implantere nakkestøtternes pladen under kirurgi. Hvis elektroden skal bevæges langs faste stereotaksiske akser, så x-aksen af elektroden skal bevæge sig parallelt med hovedet tilbageholdenhed bar, og z-aksen vinkelret på planet indeholdende lambda og bregma og parallelt med jorden ( Typer af egnede forstærkere og nuværende kilder Der er en række kommercielle forstærkere og strømkilder, som kan anvendes til dette eksperiment. De fleste ekstracellulære og intracellulære elektrofysiologi forstærkere med en strømtang tilstand, der opnår en samlet gevinst på 1.000X er hensigtsmæssige. Anbefales til iontoforese af Chicago Sky Blå med 1-3 um pipetter, en strømkilde, der kan levere op til 10 uA med en opløsning på mindst 1 uA og en compliance på mindst 100 V. Bemærk, at nogle kommercielle forstærkere have passende indbyggede nuværende kilder (se alternative dele i Materials afsnit). For at omgå kravet om en passende kombineret forstærker / strømkilde, kan et magnetisk relæ kredsløb være fastgjort til den forreste ende af forstærkeren hovedtrin (figur 6A - C). Et sådant kredsløb er ooptional men det giver eksperimentatoren for at skifte mellem forstærker og en separat strømkilde til at levere iontoforese pulser uden fysisk forstyrrende elektroden. En alternativ metode er at manuelt at udskifte elektroden ledninger med dem, der opretter forbindelse til den aktuelle kilde. I dette tilfælde er det bedst at anvende en pipette holder, som ikke omslutter toppen (ubrudt ende) af pipetten, og at anvende fleksibel ledning (figur 6D). Trin, der kan kræve gentagne praksis Der er flere trin, der kan kræve praksis at mestre. Det trin, der kræver mest fingerfærdighed er bryde spidsen af pipetten. Det er nyttigt at male kanten af glasblokke at visualisere afspejling af spidsen i glasset. Derefter kan man langsomt videre blokken og pipetten indtil spidsen næppe opfylder sine overvejelser. Fremme pipette eller blokere for hurtigt kan splintre mikropipetten og gøre spidsen diameter for large eller ujævn. Vi anbefaler at bruge mikropipetter lavet af kvarts, som beskrevet i protokollen. Quarts mikropipetter effektivt trænge intakte rotte dura i kronisk forberedte craniotomies uden at bøje eller bryde. Dette eliminerer behovet for dura resektion, som kan forårsage yderligere komplikationer. Borsilicat mikropipetter med korte vokslys (<5 mm) også trænge ind i dura, men deres anvendelse er begrænset til optagelse fra overfladiske strukturer som hjernebarken eller striatum. Optagelse fra dybere strukturer, især i thalamus eller hjernestammen, kræver lange koniske, fortrinsvis kvarts mikropipetter. Et andet trin, der kræver praksis er at positionere pipetten i juxtacellular konfiguration. Flytning af pipetten for hurtigt, tæt på en celle kan sprænges membranen. Derfor er det nyttigt at overvåge modstanden af pipetten at vide, hvornår spidsen er tæt på en formodet celle. Ændringer i modstanden af mindst 2-fold membran indikerer, at elektroden kan være neAr eller røre en cellemembran. Almindelige faldgruber Der er flere almindelige faldgruber at huske på. For det første fordi pipettespidsen er nødvendigvis meget tæt til cellen, er det muligt at "miste" cellen hvis pipetten driver væk fra membranen. Det er også muligt for en celle at blive ophidsede eller brud midtvejs gennem optagelsen. Hvis den gør det, kan spike bredde og fyring sats stige og spike amplitude kan falde. Det er tegn på, at cellen kan være usundt. Animal bevægelse vil uundgåeligt medføre disse begivenheder til at ske på nogle del af optagelserne, men kan minimeres ved at have dyret godt vant og ved at undgå at gøre unødvendige, pludselige høje lyde eller forårsager vibrationer, forskrække dyret. Potentielle ændringer af protokollen Det er muligt at anvende denne optagelse og mærkning teknik i sammenhænge, hvor dyret erudførelse af en række adfærdsmæssige opgaver. Uddannelse til en bestemt adfærdsmæssig opgave kan udføres efter operation, men før du begynder at optage. Neuronal aktivitet kan registreres mindst 1-2 uger efter at forberede kraniotomi, og iontoforetiske pletter kan vare i mindst 2-3 dage. Denne tidsramme tillader en række eksperimentelle manipulationer, herunder optagelse fra flere hjerneregioner under særskilte indspilningerne. Teknikken kan også modificeres til at fylde de enkelte neuroner hvorfra optagelser lavet. Denne alternative strategi juxtacellular mærkning af enkelte neuroner kræver mekanisk stabilitet, som kun opnås, når dyret er stille eller bedøvet. Til denne mærkning strategi, er brugen af BDA anbefales over Neurobiotin. BDA ikke nedbrydes af proteaser, der øger hastigheden af succes i Neurobiotin. Mærkning bør forsøges under sidste indspilningen før perfusion afdyr. Bemærk at detaljerede beskrivelser af juxtacellular protokol er blevet beskrevet tidligere 6,19 .Mens teknikken har været beskæftiget med succes i Alert rotter 8, i vores erfaring iontoforetisk injektion af Chicago Sky Blue har et væsentligt højere udbytte. Bemærk, at både Chicago Sky Blå og Neurobiotin eller BDA mærkning kan gøres i det samme dyr. Denne teknik er sandsynligvis at være passende for en række arter. Bemærk, at juxtacellular optagelser er foretaget i corticale områder af alarm mus 9, f.eks. Mens uddannelse, håndtering, og head-tilbageholdenhed er artsspecifikke, bør de særlige teknikker til overvågning og mærkning, der er beskrevet i denne protokol forbliver de samme. Endelig, ved blot at ændre størrelsen af pipettespidsen og parametre for strømimpulserne denne teknik kan anvendes til iontophoretisk tilførsel af en række molekyler, herunder farmakologiske midler 20,21. Såledesteknik kan også være anvendelige til neurofarmakologiske undersøgelser, der involverer opfører dyr. Konklusioner Det er ofte tilfældet, at hjerneområder, som er meget tæt på hinanden kan have markant forskellige egenskaber og / eller funktioner 22. I sådanne tilfælde vedrørende aktiviteten af enkelte neuroner fra anatomisk definerede regioner organismal adfærd er kritisk for forståelsen af neurale kredsløb og beregning. Denne artikel viser en protokol til at opnå dette ved hjælp af en kombination af standard teknikker og beskriver sensorisk kodning i VPM thalamiske neuroner som eksempel. Teknikken vil sandsynligvis være relevant og muligt i en række forskellige hjerneområder og adfærdsmæssige paradigmer i forskellige dyremodeller. Det har en i det væsentlige højere succesrate end enkelt celle juxtacellular mærkning i Alert dyr 6,8, og har den fordel, bedre anatomisk opløsning i teknikker, der anvender multi-electrode arrays eller Microdrives.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketaset (Ketamine HCl) | Fort Dodge | N/A | |
| Anased (Xylazine solution) | Lloyd Laboratories | N/A | |
| Betadyne (Povidone-Iodine) | CVS Pharmacy | 269281 | |
| Loctite 495 | Grainger Industrial Supply | 4KL86 | 20 - 40 cp cyanoacrylate |
| Vetbond | 3M | 1469SB | |
| Grip cement powder | Dentsply Intl | 675571 | For the base of the recording chamber |
| Grip cement liquid | Dentsply Intl | 675572 | For the base of the recording chamber |
| Silicone gel | Dow Corning | 3-4680 | |
| Jet denture repair acrylic powder | Lang Dental Manufacturing Co. | N/A | For securing the head restraint apparatus to the cranium |
| Ortho-Jet Fast curing orthodontic acrylic resin liquid | Lang Dental Manufacturing Co. | N/A | For securing the head restraint apparatus to the cranium |
| Chicago sky blue | Sigma | C8679 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | For perfusion and tissue fixation |
| Phosphate-buffered saline | Sigma | P3813 | For perfusion and tissue fixation |
| Cytochrome C | Sigma | C2506 | For cytochrome-oxidase staining, Figure 7 |
| Diaminobenzidine | Sigma | D5905 | For cytochrome-oxidase staining, Figure 7 |
| Rat sock | Sew Elegant (San Diego, CA) | N/A | Custom made, Figures 1, 4 |
| PVC tube 2 ½” | U.S. Plastic Co. | 34108 | Figure 4 |
| Subminiature D pins & sockets | TE Connectivity | 205089-1 | Figure 3 |
| Stainless steel music wire 0.010” diameter | Precision Brand Products, Inc. | 21010 | Figure 3 |
| Stereotaxic holding frame | Kopf Instruments | Model 900 | Figure 3 |
| Stereotaxic ear bars | Kopf Instruments | Model 957 | Figure 3 |
| Stereotaxic manipulator | Kopf Instruments | Model 960 | Figure 3 |
| ½ mm drill burr | Henry Schein | 100-3995 | |
| Quiet-Air dental drill | Midwest Dental | 393-1600 | |
| Stainless steel 0-80 ⅛” screw | Fastener superstore | 247438 | Figure 3 |
| 0.2 ml centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-407-8A | Figure 3 |
| Custom head-holding bar | UCSD SIO Machine Shop | N/A | Custom made, Figures 2 - 4 |
| Custom head-holding plate | UCSD SIO Machine Shop | N/A | Custom made, Figures 2 - 4 |
| Right angle post-clamp | Newport | MCA-1 | Figures 3, 4; standard opto-mechanical parts for the experimental jig (Figure 4) are also from Newport Corp. |
| 8-32 ¾” screw | Fastener Superstore | 240181 | For head-restraint, Figure 3 |
| 4-40 ¼” screw | Fastener Superstore | 239958 | For head restraint, Figures 3, 4 |
| Quartz capillary tubing | Sutter Instruments | QF-100-60-10 | Figure 5 |
| Carbon dioxide laser puller | Sutter instruments | P-2000 | |
| Motorized micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | |
| Microelectrode amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | Alternate part: Molecular Devices Axoclamp 900A |
| Microelectrode amplifier head stage | Molecular Devices | CV-7B | Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A |
| Isolated pulse stimulator | A-M Systems | Model 2100 | Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A |
| Audio monitor | Radio Shack | 32-2040 | |
| Pipette holder | Warner Instruments | #MEW-F10T | Alternate parts: see Discussion, Figure 6A |
| Electrode lead wire | Cooner wire | NEF34-1646 | (optional), Figure 6D |
| Relay for amplifier head-stage | COTO Technology | #2342-05-000 | (optional) Used with a custom-made printed circuit board (UCSD Physics Electronics Shop), Figure 6A-C |
| Digital video camera | Basler | A602fm | (optional) For behavioral monitoring, Figure 7 |
| Puralube vet ointment | Amazon.com, Inc | NC0138063 |
References
- Fee, M. S., Leonardo, A. Miniature motorized microdrive and commutator system for chronic neural recording in small animals. Journal of Neuroscience Methods. 112 (2), 83-94 (2001).
- Ventakachalam, S., Fee, M. S., Kleinfeld, D. Ultra-miniature headstage with 6-channel drive and vacuum-assisted micro-wire implantation for chronic recording from neocortex. Journal of Neuroscience Methods. 90 (1), 37-46 (1999).
- Szuts, T. A. A wireless multi-channel neural amplifier for freely moving animals. Nature Neuroscience. 14 (2), 263-269 (2011).
- Roy, S., Wang, X. Wireless multi-channel single unit recording in freely moving and vocalizing primates. Journal of neuroscience. 203 (1), 28-40 (2012).
- Hill, D. N., Mehta, S. B., Kleinfeld, D. Quality metrics to accompany spike sorting of extracellular signals. Journal of Neuroscience. 31 (24), 8699-8705 (2011).
- Pinault, D. A novel single-cell staining procedure performed in vivo under electrophysiological control: morpho-functional features of juxtacellularly labeled thalamic cells and other central neurons with biocytin or Neurobiotin. Journal of neuroscience. 65 (2), 113-136 (1996).
- Person, A. L., Perkel, D. J. Pallidal neuron activity increases during sensory relay through thalamus in a songbird circuit essential for learning. The Journal of neuroscience. 27 (32), 8687-8698 (2007).
- Kock, C. P., Sakmann, B. Spiking in primary somatosensory cortex during natural whisking in awake head-restrained rats is cell-type specific. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 106 (38), 16446-16450 (2009).
- Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice. Neuron. 67 (6), 10481061 (2010).
- Hellon, R. The marking of electrode tip positions in nervous tissue. The Journal of physiology. 214, 12P (1971).
- Furuta, T., Deschênes, M., Kaneko, T. Anisotropic distribution of thalamocortical boutons in barrels. The Journal of Neuroscience. 31 (17), 6432-6439 (2011).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (1986).
- Kleinfeld, D., Delaney, K. R. Distributed representation of vibrissa movement in the upper layers of somatosensory cortex revealed with voltage sensitive dyes. Journal of Comparative Neurology. 375 (1), 89-108 (1996).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain research. 171 (1), 11-28 (1979).
- Moore, J. D., Deschênes, M., Kleinfeld, D. Self-generated vibrissa motion and touch are differentially represented throughout ventral posterior medial thalamus in awake, head-fixed rats. Society for Neuroscience Annual Meeting. 41 496.08/TT424 Society for Neuroscience. 41, (2011).
- Khatri, V., Bermejo, R., Brumberg, J. C., Zeigler, H. P. Whisking in air: Encoding of kinematics by VPM neurons in awake rats. Somatosensory and Motor Research. 27 (2), 344-356 (2010).
- Hill, D. N., Curtis, J. C., Moore, J. D., Kleinfeld, D. Primary motor cortex reports efferent control of vibrissa position on multiple time scales. Neuron. 72 (2), 344-356 (2011).
- Moore, J. D. Hierarchy of orofacial rhythms revealed through whisking and breathing. Nature. 497, 205-210 (2013).
- Duque, A., Zaborszky, L. Neuroanatomical Tract-Tracing 3. , Springer. 197-236 (2006).
- Neuroactive substances: Neuropharmacology by microiontophoresis. , Kation Scientific. Available from: http://kationscientific.com/fsubstances.html Forthcoming.
- Dyes and Tracers: Sitemarking and tracktracing by microiontophoresis. , Kation Scientific. Available from: http://kationscientific.com/fdyes.html Forthcoming.
- Urbain, N., Deschênes, M. Neuroactive substances: Neuropharmacology by microiontophoresis. (Kation Scientific), Dyes and Tracers: Sitemarking and tracktracing by microiontophoresis. (Kation). Journal of Neuroscience. 27 (45), 12407-12412 (2007).
