Introduction
Overvåking neuronal aktivitet i et varsel dyr aktivt engasjert i et atferds oppgave er kritisk for å forstå funksjon og organisering av nervesystemet. Ekstracellulære opptak av den elektriske aktiviteten fra enkelt nevronale enheter har lenge vært et fast innslag verktøy av systemer nevrovitenskap og er fortsatt mye i bruk i dag. En rekke elektrodetyper og konfigurasjoner er tilgjengelige avhengig av de vitenskapelige og tekniske kravene til en bestemt eksperiment. Kronisk implanterte mikrodrivere eller elektrodegrupper er ofte brukt i fritt bevegelige dyr, inkludert fugler, gnagere og ikke-humane primater 1-4. Alternativt blir akutte gjennomføringer med metall eller glass microelectrodes via en ekstern micromanipulator ofte brukt til å ta opp fra bedøvede eller hode-behersket dyr. Glass mikropipette elektroder har den fordel at de kan brukes i juxtacellular eller "celle festet" konfigurasjon entydig å isolereaktivitet av enkeltnerveceller uten komplikasjoner av post-hoc pigg sortering 5. Disse elektroder videre muliggjøre registrering av anatomisk identifiserte celler eller steder, så de kan brukes til å injisere små forekomster av fargestoff eller nevroanatomi sporstoff, eller til å fylle de enkelte registrert cellen. Denne konfigurasjonen har blitt brukt i rotter, mus og fugler 6-10. Den beskrevne teknikken fokuserer på juxtacellular overvåking og ekstracellulære dye innskudd i varsling, head-behersket rotter. Merk at i motsetning enkelt celle juxtacellular fyller ikke disse dye depositum ikke gi informasjon om cellemorfologi eller aksonale anslag 11, men de gjør det mulig presis anatomisk lokalisering til ca 50 mikrometer og kritisk, har en betydelig høyere avkastning i varselet dyr. Informasjon om encellede juxtacellular fyller er likevel gitt som en alternativ strategi for anatomisk merking.
I korte trekk, denprotokollen består av tre hovedfaser. I den første fasen blir rotten akklimatisert til kroppsbeherskelse i en klut sokk (figur 1) over en periode på 6 dager. I den andre fasen, er et hodestøttene apparat (figur 2) og opptak kammer kirurgisk implantert slik at rotta kan opprettholdes i stereotaxic plan under flere påfølgende innspillinger (figur 3); denne prosedyren gjør at eksperimentator å målrette bestemte subkortikale regioner av hjernen for elektrofysiologisk undersøkelse basert på standard referanse koordinerer 12. Den tredje fasen innebærer å plassere rotte i en passende jigg for å gjennomføre de atferdsmessige og elektrofysiologiske eksperimenter (figur 4), bygging elektroden fra en kvarts kapillarrør (figur 5), noe som gjør juxtacellular nevronale opptak som entydig isolerer enkle enheter 6-9, og merking de anatomiske beliggpå fra opptaksstedet med Chicago himmelen blå fargestoff (figur 6 og 7). Opptakene er utført med samtidig atferds overvåking; Imidlertid vil de tekniske detaljer ved virkemåten være avhengig av de vitenskapelige målene for hvert forsøk og er således utenfor rammen av en enkelt protokoll. Etter fullføring av den eksperimentelle fremgangsmåte, som kan bli gjentatt på flere dager, er dyret avlives. Hjernen ble ekstrahert og behandlet i henhold til standard teknikker ved hjelp av nevroanatomi enten lyse felt eller fluorescens mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Eksperimentelle protokoller ble utført på kvinnelige Long Evans rotter (250-350 g) i samsvar med statlig fastsatte dyr omsorg og retningslinjer for bruk og ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of California San Diego.
1. acclimating Rat til Body Restraint
MERK: Plasser rotte på en diett. Mate rotte en gang per dag umiddelbart etter hvert daglig håndtering økt for å akklimatisere rotta til tilbakeholdenhet (beskrevet nedenfor). Tilveiebringe nok til å opprettholde tilførsels dyret ved 80% av sin opprinnelige vekt. Dette beløpet er ca 6 gram fôr per dag for en 250 g kvinnelige Long Evans rotte.
- Akklimatisere rotta til å bli håndtert av mennesker. Forsiktig begrense rotte for hånd i perioder på ca 5 sek hvert 30 sek. Gjør dette i 15 minutter om dagen på to påfølgende dager. Overvåke rottene daglig for tegn på stress under opplæringsperioden. Tegn inkluderer sliter jegn respons på tilbakeholdenhet, stemmebruk, og tann-chattering.
- På 3. dagen, plasserer rotte i en body-begrensende klut sokk (figur 1) for 15 min en dag på to påfølgende dager.
- På den 5. dagen, plasserer rotte inne i sokken, og plasser sokk inne i en stiv slange på den eksperimentelle pilk (figur 4). Forlate Rat i røret i 15 minutter om dagen på to påfølgende dager.
- Mate rotte umiddelbart etter hver treningsøkt. På slutten av den siste økten (6 th dag) gi ubegrenset tilgang til mat. Velg for implantasjon bare de rottene som ikke viser tegn til overdreven stress på siste treningsdag.
MERK: Selv om valget av rotter for implantering er subjektivt, i våre hender over 90% av rottene ble funnet å være responsiv for tilvenning og i stand til å gjennomgå implantasjon.
2. Implantere Recording Chamber og leder beherskelse Mechanism
- Lag en reskjellen ledning ved lodding bart rustfritt stål wire til en pinners kontakt. Kutt ledningen slik at 3-5 mm restene avdekket av pinnen. Autoklaver referansetråd, sammen med alle kirurgiske verktøy.
- Administrere ketamin / xylazin anestesi. Administreres 95 mg / kg ketamin blandet med 5 mg / kg xylazin intraperitonealt. Den første dosen varer i 1 ½ til 2 timer. Supplere anestesi hvert 30-45 min etterpå, etter behov. Smør dyrets øyne med en oftalmisk salve.
- Kontroller tå tilbaketrekking refleks for å bestemme planet av anestesi, og opprettholde anestesi etter behov.
- Plasser rotte i en stereotaksisk holding ramme med øret barer (Figur 3A). Barbere håret på hodet og desinfisere såret med povidon-jod (10% løsning). Vær nøye med å sette inn øret barene på riktig måte slik at de ikke skader trommehinnen. Øre barer med sløv tips er å foretrekke.
- Gjøre et snitt med en skalpell approxilag langs midtlinjen av kraniet fra rostro-caudal nivå av øynene til baksiden av ørene. Bruke saks for å kutte og fjerne en 2-3 mm stripe av huden på hver side av snittet.
- Skrape bort periosteum å eksponere overflaten av kraniet ut til siderygger. Dekke utsatte kraniet med tynt lag med superlim.
- Bore et lite hull, med en litt mindre diameter enn 0-80 skruer, ved hjelp av en ½ mm diameter drill Burr (se Materialer avsnitt). Bor hullet umiddelbart posterior til der bregma sutur møter den laterale mønet, og ved en vinkel på 30-45 ° i kraniet, slik at skruen kan gå inn med den øverste mer sideveis enn bunnen.
- Skru i en 0-80 flat-bottom maskin skrue til hullet (ca 3 omdreininger), ved 30-45 ° vinkel. Vær forsiktig med å skru inn for dypt for å unngå å skade den underliggende hjernevev.
- Gjenta denne prosedyren for 6 ekstra skruer i konfigurasjonen vist
- Plasser en sprøyte nål i stereotax manipulator. Mål fra bregma sutur, og lage en bulk i kraniet med nålen nær, men utenfor den ønskede kraniotomi sted, som et referansemerke.
MERK: I denne demonstrasjonen, de stereotaksiske koordinatene merket er 3 mm posterior og 1 mm lateral til bregma sutur. - Markere bulke med en permanent markør. Legg merke til de stereotaksiske koordinatene til, da det vil tjene som et stereotaksisk referansepunkt (Figur 3B).
- Gjør en kraniotomi sentrert på de ønskede koordinater (3 mm posterior og 3 mm lateralt for bregma i dette eksempel). La dura mater intakt. Dekk kraniotomi med modifisert kunstig cerebral spinalvæske (125 mM NaCl, 10 mM glukose, 10 mM HEPES, 3,1 mM CaCl2, 1,3 mM MgCl2, pH 7,4), 13 (figur 3C). Skjær en 0,2 ml sentrifugerør til 4-5 mm i lengde, og kuttet av hetten. Plasser røret på kraniet og sentrere den over kraniotomi.
- Anvende dental sement rundt bunnen av røret for å forsegle bunnen av røret til kraniet. Vær forsiktig med å lekke sement inn i den eksponerte kraniotomi (Figur 3D).
- Bore en annen lite hull (ca ½ mm diameter) i kontralaterale kranieplate, og sett nøye referansen wire. Konstruer referansetråd ved å lodde en tapp som grensesnitt med innspillingsforsterkeren til enden av tråden (se Utstyr avsnitt). Ikke flytt referansen ledningen når den er i hjernen, da dette kan forårsake skade.
- Anvende superlim til hullet i hvilken tråden ble innsatt. Dette vil forsegle pinnen og wire på plass midlertidig.
- Bland de to delene av silikongel sett (se Materialer avsnitt) i omtrent like deler. Vent i to minutter for å blande og fill sentrifugerøret omtrent ⅓ full med gel.
- Fest en rett vinkel klemmen (se Materialer avsnitt) til hodestøttene bar. Feste hodeplaten (figur 2A) til holdetangen (figur 2B) i en 45 ° stigningsvinkel, slik at undersiden av platen vender mot nesen av dyret. Det er nyttig å bruke en inklino å sette banen vinkel for å matche den eksperimentelle pilk (figur 4).
- Fest holde bar til stereotax manipulator arm, slik at baren er parallelt med øret barer. Lavere bar og plate slik at platen er posterior av lambda sutur og anteriort for kaudal-mest skrue.
- Grip front head-bolt (en 8-32 stud eller skrue, se Materialer avsnitt) på ca 45 ° vinkel med en hjelpende hender arm og klemme, slik at skruehodet vender ned og mot halen på dyret. Senk skruen så den berører maurerior 0-80 skruer (Figur 3F, G).
- Sikre bolten og plate på plass med dental akryl. Påfør dental akryl rundt bein skruehodene, referanse pin, og rundt sidene av sentrifugerør. Vent ca 10 min for tann akryl tørke (Figur 3 H).
- Påføre et lag av dentalsement rundt kantene av dental akryl, sementering av huden til implantatet. Vente på at sementen tørker.
- Poke flere hull i korken på sentrifugerør, og legg lokket på røret.
- Ta av hjelpende hender klemme. Deretter fjerner forsiktig hodet-holding bar fra stereotax, og deretter fjerne hodet plate fra baren (figur 3I).
- Fjerne dyret fra stereotax og administrere postoperativ behandling og oppfølging i henhold til gjeldende regler, forskrifter og lover (f.eks Buprenorfin 0,02 mg / kg, hver 8-12 timer i minimum 24hr). Hvis betennelse utvikler rundt kantene av implantatet, påfør et tynt lag med antibiotisk salve til det berørte området daglig inntil løst.
3. Juxtacellular Overvåking av Nevronale Units
- Trekk kvarts kapillarrør på en karbondioksyd-laser mikropipette avtrekker (se Utstyr seksjon) med tippe diametre på mindre enn 1 um (figur 5A).
MERK: varme parametre vil variere i forhold til den enkelte instrument, og at den nødvendige halsen diameter vil variere avhengig av hjernens struktur av interesse. For opptak i rotte thalamus, mikropipetter har nakker som spenner fra 5-7 mm. - Sikre pipetten på plass under en kontrast differensial forstyrrelser (DIC) mikroskop utstyrt med lang arbeidsavstand mål. Bruk modellering leire for å holde pipetten på plass på mikroskopet scenen.
- Beveg et glass blokk (0,5 til 1 cm tykk, et stykke glass brukes til making ultra-mikrotomkniver er praktisk) inn i synsfeltet med pipettespissen. Bruke scenen mikromanipluatoren, forsiktig berøre pipettespissen til glasset, slik at det å bryte. Gjenta om nødvendig til pipettespissen ytre diameter er mellom 1-3 mikrometer (Figur 5B, C). Sikre at disse mikropipetter har impedanser mellom ca 5-15 Megohm.
- Forbered ekstracellulær saltløsning (135 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5 mM HEPES, pH 7,2 med NaOH) 8 og legge til 2% (w / v) Chicago himmelblå. Ved hjelp av en sprøyte med en 30 G nål eller mindre, fylle baksiden slutten av pipetten med løsningen. Alternativt, for enkeltcelle juxtacellular merking tilsett 2% (w / v) Neurobiotin eller biotinylert dekstran amin (BDA-3000 eller BDA-10000) i saltoppløsning i stedet for Chicago himmelblå.
- Plasser rotte inne kluten sokk inni den stive rør på en hensiktsmessig eksperimentell pilk (
- Fest head-begrensende plate på rotte til tilsvarende brikke på jiggen. For å gjøre dette, må du først feste hodet beherskelse plate på plass, og fest den med en 4-40 skrue. Sørg for å vente til dyret er rolig for å unngå å legge for stort dreiemoment til hodet. Deretter plasserer en 8-32 mutteren på hodet dempende bolt som er implantert på rotte. Skru deretter i en gjenget rustfritt stål stang til hodet-bolt. Feste stangen til den eksperimentelle jiggen på en slik måte at den kan strammes på plass (figur 4).
MERK: Feste dyr med hode-bolt samt hodet beherskelse plate minimizes bøying av anordningen og forbedrer opptaket stabilitet. I de fleste tilfeller opptak kan starte på den første dagen dyret er head-behersket. Men hvis dyret fidgets overdrevent eller vocalizes, gi en dag av hodet beherskelse tilvenning trening før du begynner noen innspillinger. I dette tilfellet, la dyret på jiggen i 15 minutter og deretter plassere den tilbake i buret sitt. Gjenta dette trinnet neste dag og fortsette med protokollen.- Åpne opptakskammeret, og ta ut silikongel. Rengjør craniotomy hjelp fin pinsett hvis vev har re-vokst i kraniotomi.
- Fest pipetten til den motoriserte micromanipulator, og plugg i heads pre-forsterker.
MERK: I dagens demonstrasjon, er en liten relékrets på heads brukes til å bytte mellom forsterkeren ledningene og en ekstern strømkilde med høy etterlevelse (figur 6A-C). Merk at noen forsterkere har en passende innebygd høy compliance kilde(Se Diskusjon og materialer seksjoner).- Bruke motoriserte mikromanipluatoren å flytte pipettetuppen til stereotaksikalt identifisert mark i innspillingen kammeret. Oppmerksom koordinatene til dette stedet. Vær forsiktig med å bryte spissen av pipetten på kraniet.
- Flytt pipetten til ønsket opptaks plassering i anterior-posterior og medio-lateral akser. Da videre pipetten ventralt gjennom dura inntil den er ca. 500 um dorsal til den tilsiktede opptak sted.
- Sakte avansere pipetten mens du lytter for spiking hendelser på en lyd-skjerm av den forsterkede spenningen registrert mellom pipettespissen og referanse wire. Når tilsetnings hendelser er identifisert, fortsette å bevege pipetten 0-100 mikrometer til positive kommer spennings nedbøyninger større enn ca 500 uV er observert.
MERK: elektrode motstanden vil øke med en faktor på ca 1,5-10 whno dette skjer.- Starte innspillingen gang en enhet har blitt isolert som følge trinn 3.11, sammen med alle andre adferdsmessige og fysiologiske tiltak av interesse. I dagens demonstrasjon, er selvgenerert vibrissa bevegelser overvåkes med høyhastighets videoopptak (se Materialer avsnitt).
- Å merke registreringsstedet, slår elektroden fører for å koble til den aktuelle kilden. Det er flere måter å gjøre dette på, ved hjelp av enten en relé krets (Figur 6A - C), en innebygd gjeldende kilde på forsterkeren, eller manuelt (figur 6D, se trinn 3,8 og diskusjon). Passere -4 fiA med 2 sek pulser med 50% driftssyklus for 4 min til iontoforetisk injisere Chicago Himmelblå gjennom pipette.
- Drepe og perfuse dyret etter flere fremgangsmåter for merking i henhold til vanlig praksis. § hjernen og farge som er nødvendig for å identifisere den anatomiske plassering av opptaket sittere. Counterstain vevet for cytokromoksydase reaktivitet som per 14. Alternativt identifisere Chicago Sky Blå innskudd med fluorescens mikroskopi.
MERK: For nøyaktig skille mellom ulike merkede enheter er det viktig at alle etikettene er laget med samme pipette på samme dag, uten unclamping pipetten mellom etikettene. I dette tilfellet opptakssteder kan differensieres etter deres relative steder i post-hoc histologi sammen med den kjente manipulator koordinatene for hvert område (se trinn 3.9). For entydig identifikasjon, markere etikettene minst 200 mikrometer fra hverandre, og ikke mer enn 3-5 etiketter per hjernen regionen. - Fest head-begrensende plate på rotte til tilsvarende brikke på jiggen. For å gjøre dette, må du først feste hodet beherskelse plate på plass, og fest den med en 4-40 skrue. Sørg for å vente til dyret er rolig for å unngå å legge for stort dreiemoment til hodet. Deretter plasserer en 8-32 mutteren på hodet dempende bolt som er implantert på rotte. Skru deretter i en gjenget rustfritt stål stang til hodet-bolt. Feste stangen til den eksperimentelle jiggen på en slik måte at den kan strammes på plass (figur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nevronale enheter i ventral posterior medial (VPM) thalamus kode fasen av vibrissa bevegelser under egenprodusert visping 15,16. Figur 7A viser prøve spiking aktiviteten til en VPM thalamisk enhet som en rotte er aktivt visping. Figur 7B viser et histogram av spike ganger justert til øyeblikkelig fasen av vibrissa bevegelse 17. Det er flere pigger under retraksjonsfasen av visping. Etter innspillingen, ble plasseringen av enheten merket via iontoforese av Chicago himmelen blå fargestoff, som vist i figur 7C. Vevet motfarget for cytokromoksydase aktivitet for å avsløre nevroanatomi grenser VPM thalamus. En lignende versjon av denne protokollen ble nylig brukt til å overvåke visping relaterte multiunit neuronal aktivitet (10-20 mikrometer i diameter pipettespisser) i spesifikke hjernestammen kjerner 18.
re en "src =" / files / ftp_upload / 51453 / 51453fig1.jpg "/>
Figur 1: Cloth besøksforbud sokk (A) Fotografi av en rotte sokk med snorer og snøring hekter.. Den minste enden er plassert tett rundt brystbenet, og den store ende rundt halen. (B) Design mønster for sokken i panelet 1A. Dimensjonene er oppgitt i inches.
Figur 2: Mekanisk design av hodestøttene apparat (A) Mekanisk design av en presisjon hodestøttene plate for rotter.. Dimensjonene er oppgitt i inches. (B) Mekanisk design av en hodestøttene bar for bruk med platen i panel 2A. Protokollen krever to av disse delene, montert ved hjelp av rettvinklede legg klemmer på den samme banen vinkel._blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Kirurgisk prosedyre (A) rotte i en stereotaksisk holderammen (protokoll trinn 2.4).. (B) på operasjonsstedet med implanterte skruer og kranie markeringer (protokoll trinn 2.10). (C) på operasjonsstedet med en kraniotomi (protokoll trinn 2.12). (D) på operasjonsstedet med innspillingen kammer (protokoll trinn 2.14). (E) på operasjonsstedet med referanse wire og silikon gel (protokoll trinn 2.17). (F, G) på operasjonsstedet med hodestøttene plate og bar holdes på plass (protokoll trinn 2.20). (H) på operasjonsstedet på med plate og bar sementert på plass (protokoll trinn 2.21). (I) Slutt hode beherskelse og opptak kammer implmaur (protokoll trinn 2.24). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4:. Experimental pilk Diagram av rotte i den mekaniske jigg for elektrofysiologiske og atferdsovervåkings eksperimenter (protokoll trinn 03.05 til 03.06). Jiggen benytter baren og plate i figur 2.
Figur 5: Mikropipette elektrode konstruksjon (A) Micrograph av en ubrutt mikropipette (protokoll trinn 3.1).. Målestokk er som i panel C. (B) Micrograph av den ubrutte mikropipette og glass kloss under mikroskop (protokoll trinn 3.2).Refleksjonen av spissen kan sees i glasset. Målestokk er som i panel C. (C) Micrograph av den ødelagte mikropipette (protokoll trinn 3.3). (D) Micrograph av tuppen av den ubrutte mikropipette i eske regionen panel A. Scale bar er som i panelet E. (E) Micrograph av tuppen av den ødelagte mikropipette i eske regionen panel C. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6:. Utstyr for å bytte mellom forsterkeren og gjeldende kilde (A) Oppsett for å bytte ledningene fra forsterkeren til strømforsyningen gjennom en magnetisk relé (valgfritt). Et trykket kretskort som inneholder den spenningsstyrte relé bryteren er Attached til forsterkerhodet trinn. (B) Layout for kretskortet i panelet 6A. Styret kobler forsterkeren leads og gjeldende kilde fører til inngangs pinnene på stafetten, og elektroden fører til utgangsnålene. Elektroden er forbundet med enten strømkilden eller forsterkeren ved å anvende enten 0 eller 5 V til relé kontrollnålene. Sett nedenfra. Dimensjonene er oppgitt i inches. (C) ovenfra styret layout i panel 6B. (D) Oppsett for å bytte ledningene fra forsterkeren til den aktuelle kilden manuelt (valgfritt) krever en åpen pipette holder og fleksibel ledning som de som vises (se også: Utstyr avsnitt). Denne tilnærmingen er et alternativ til relékrets i paneler 6A-C. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: Eksperimentell oppsett og representative resultater (A) Spikes og vibrissa bevegelse fra én enhet (protokoll trinn 3.12).. (B1) Normalisert vibrissa stilling versus fase i vispen syklus. Hver visp er normalisert slik at de kaudale stilling under vispen er definert som null, og den mest rostralt posisjon definert som en. Banen representerer den normaliserte øyeblikkelige stilling i forhold til fasen i vispen syklus 17. Alle identifiserte visper lagres. (B2) Raster av fasen i vispen syklusen ved hvilken toppene oppstår. Hver prøveperiode på den vertikale aksen representerer en enkelt visp. (B3) Histogram av pigg priser med respekt visp syklus fase for samme enhet. (C1) Plassering av Chicago Sky Blå farge med cytokromoksydase kontra (protokoll trinn 03.13 til 03.14). (C2- Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Byggingen av den eksperimentelle pilk
Beskrivelsen av de mekaniske deler som brukes til å bygge opp den eksperimentelle jiggen (figur 4) er utelatt fra protokollen, som det kan konstrueres på en rekke forskjellige måter. I denne demonstrasjonen standard opto-mekaniske deler og støtte klemmer blir brukt til å montere hodestøtten bar og kroppen beherskelse tube (se Materialer avsnitt). Lignende opto-mekaniske deler kan brukes til å montere elektrodeholderen til den motoriserte mikromanipluatoren. Det er viktig at hodebøylen på jiggen er montert på samme banen vinkel som bar brukt til å implantere hodet beherskelse plate under operasjonen. Dersom elektroden skal beveges langs de standard stereotaksiske akser, da x-aksen av elektroden skal bevege seg parallelt med hodebøylen, og z-aksen vinkelrett på planet som inneholder lambda og bregma, og parallelt med bakken ( Typer av egnede forsterkere og aktuelle kilder Det finnes en rekke kommersielle forsterkere og strømkilder som kan bli anvendt for dette eksperiment. De fleste ekstracellulære og intracellulære elektrofysiologiske forsterkere med en strømtang modus som oppnår en samlet gevinst på 1,000X er hensiktsmessig. For iontoforese av Chicago Himmelblå med 1-3 mikrometer pipetter, en strømkilde som kan levere opptil 10 uA med en oppløsning på minst 1 fiA og en etterlevelse av minst 100 V anbefales. Merk at noen kommersielle forsterkere har passende innebygd strømkilder (se alternative deler i Materials delen). Imidlertid, for å omgå behovet for en hensiktsmessig kombinert forsterker / strømkilde, kan en magnetisk relé krets være festet til den fremre ende av forsterkeren heads (figur 6A - C). En slik krets er optional men det gjør at eksperimentator å veksle mellom forsterker og en egen strømkilde å levere iontoforese pulser uten fysisk perturbing elektroden. En alternativ tilnærming er å manuelt erstatte elektrode ledningene med de som kobles til strømkilden. I dette tilfelle er det best å bruke en pipette holder som ikke omslutter toppen (ubrutt ende) av pipetten, og å bruke fleksible ledning (figur 6D). Trinn som kan kreve gjentatte praksis Det er flere tiltak som kan kreve praksis å mestre. Trinnet som krever mest fingerferdighet er å bryte pipettetuppen. Det er nyttig å male kanten av glasset blokken for å visualisere refleksjon av spissen i glasset. Deretter kan man sakte avansere blokken og pipetten til spissen knapt oppfyller sin refleksjon. Advancing pipette eller blokkere for fort kan knuse mikropipette og gjøre diameter spissen for large eller ujevn. Vi anbefaler å bruke mikropipetter laget av kvarts, som beskrevet i protokollen. Quarts mikropipetter effektivt trenge intakte rotte dura i kronisk forberedt craniotomies uten å bøye eller bryte. Dette eliminerer behovet for dura reseksjon, noe som kan føre til ytterligere komplikasjoner. Borosilicate mikropipetter med korte smalner (<5 mm) også trenge dura, men bruken er begrenset til opptak fra overfladiske strukturer som hjernebarken eller striatum. Opptak fra dypere strukturer, spesielt i thalamus eller hjernestammen, krever lange koniske, helst kvarts mikropipetter. Et annet punkt som krever praksis er å plassere pipetten i juxtacellular konfigurasjon. Å bevege pipetten for raskt når nær til en celle kan briste membranen. Derfor er det nyttig å overvåke motstands av pipetten for å vite når spissen er i nærheten av en antatt celle. Endringer i membranmotstand på minst 2-fold indikerer at elektroden kan være near eller berøre en cellemembran. Vanligste fallgruvene Det finnes flere vanlige fallgruver å huske på. Først fordi pipettespissen er nødvendigvis meget nær cellen, er det mulig å "miste" cellen hvis pipetten driver bort fra membranen. Det er også mulig for en celle til å bli opphisset eller briste midtveis i opptaket. Hvis den gjør det, kan den pigg bredde og avfyring hastighet øke og pigg amplitude kan avta. Dette er indikasjoner på at cellen kan være usunn. Animal bevegelse vil uunngåelig føre til disse hendelsene til å skje på noen del av opptakene, men kan minimeres ved å ha dyret godt tilvent og ved å unngå å gjøre unødvendige, plutselige høye lyder eller forårsaker vibrasjoner som skremme dyret. Mulige modifikasjoner av protokollen Det er mulig å bruke denne teknikk for opptak og merking i sammenhenger der dyretå utføre en rekke forskjellige adferdsoppgaver. Trening for en bestemt atferds oppgave kan utføres etter operasjonen, men før du begynner å spille inn. Neuronal aktivitet kan registreres minst 1-2 uker etter forberede kraniotomi, og iontoforetiske flekker kan vare i minst 2-3 dager. Denne tidsrammen tillater en rekke eksperimentelle manipulasjoner, inkludert opptak fra flere områder av hjernen under separate innspillinger. Teknikken kan også bli modifisert til å fylle de enkelte neuroner fra hvilken registreringene er utført. Dette alternativ strategi for juxtacellular merking av enkeltnerveceller krever mekanisk stabilitet som oppnås først når dyret er i ro eller bedøvet. For denne merking strategi, er bruk av BDA anbefalt over Neurobiotin. BDA er ikke brytes ned av proteaser, som i betydelig grad øker frekvensen av suksess gjennom Neurobiotin. Merking skal være forsøkt i løpet av siste innspilling før perfusert dendyr. Merk at detaljerte beskrivelser av juxtacellular protokollen har blitt beskrevet tidligere 6,19 .Mens teknikken har vært ansatt hell i varselet rotter 8, i vår erfaring iontoforetisk injeksjon av Chicago Sky Blue har en betydelig høyere yield. Merk at både Chicago Sky Blue and Neurobiotin eller BDA merking kan gjøres i samme dyr. Denne teknikken er sannsynlig å være passende for en rekke arter. Merk at juxtacellular opptak er gjort i kortikale regioner av varsling mus 9, for eksempel. Mens trening, håndtering, og hodet beherskelse er artsspesifikke, bør de spesielle teknikker for overvåking og merking er beskrevet i denne protokollen forbli den samme. Til slutt, ved å endre størrelsen på pipettespissen og parametre av strømpulsene denne teknikken kan bli anvendt for iontoforetisk tilførsel av en rekke molekyler, inkludert farmakologiske midler 20,21. Dermed blirTeknikken kan også være nyttig for nevrofarmakologiske studier som involverer oppfører dyr. Konklusjoner Det er ofte slik at hjernen regioner som er svært nær hverandre kan ha markert forskjellige egenskaper og / eller funksjoner 22. I slike tilfeller er relatert til aktiviteten til enkelt neuroner fra anatomisk definerte regioner til organisme oppførsel er avgjørende for forståelsen av nevrale kretser og beregning. Den foreliggende artikkelen viser en protokoll for å oppnå dette ved hjelp av en kombinasjon av standard teknikker, og beskriver sensoriske koding i VPM talamiske neuroner som et eksempel. Teknikken er sannsynlig å være relevant og gjennomførbart i en rekke områder av hjernen og atferds paradigmer i forskjellige dyremodeller. Den har en vesentlig høyere suksessrate enn én celle juxtacellular merking i varselet dyr 6,8, og har fordelen av bedre anatomisk oppløsning over teknikker som utnytter multi-electrode arrays eller Microdrive.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketaset (Ketamine HCl) | Fort Dodge | N/A | |
| Anased (Xylazine solution) | Lloyd Laboratories | N/A | |
| Betadyne (Povidone-Iodine) | CVS Pharmacy | 269281 | |
| Loctite 495 | Grainger Industrial Supply | 4KL86 | 20 - 40 cp cyanoacrylate |
| Vetbond | 3M | 1469SB | |
| Grip cement powder | Dentsply Intl | 675571 | For the base of the recording chamber |
| Grip cement liquid | Dentsply Intl | 675572 | For the base of the recording chamber |
| Silicone gel | Dow Corning | 3-4680 | |
| Jet denture repair acrylic powder | Lang Dental Manufacturing Co. | N/A | For securing the head restraint apparatus to the cranium |
| Ortho-Jet Fast curing orthodontic acrylic resin liquid | Lang Dental Manufacturing Co. | N/A | For securing the head restraint apparatus to the cranium |
| Chicago sky blue | Sigma | C8679 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | For perfusion and tissue fixation |
| Phosphate-buffered saline | Sigma | P3813 | For perfusion and tissue fixation |
| Cytochrome C | Sigma | C2506 | For cytochrome-oxidase staining, Figure 7 |
| Diaminobenzidine | Sigma | D5905 | For cytochrome-oxidase staining, Figure 7 |
| Rat sock | Sew Elegant (San Diego, CA) | N/A | Custom made, Figures 1, 4 |
| PVC tube 2 ½” | U.S. Plastic Co. | 34108 | Figure 4 |
| Subminiature D pins & sockets | TE Connectivity | 205089-1 | Figure 3 |
| Stainless steel music wire 0.010” diameter | Precision Brand Products, Inc. | 21010 | Figure 3 |
| Stereotaxic holding frame | Kopf Instruments | Model 900 | Figure 3 |
| Stereotaxic ear bars | Kopf Instruments | Model 957 | Figure 3 |
| Stereotaxic manipulator | Kopf Instruments | Model 960 | Figure 3 |
| ½ mm drill burr | Henry Schein | 100-3995 | |
| Quiet-Air dental drill | Midwest Dental | 393-1600 | |
| Stainless steel 0-80 ⅛” screw | Fastener superstore | 247438 | Figure 3 |
| 0.2 ml centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-407-8A | Figure 3 |
| Custom head-holding bar | UCSD SIO Machine Shop | N/A | Custom made, Figures 2 - 4 |
| Custom head-holding plate | UCSD SIO Machine Shop | N/A | Custom made, Figures 2 - 4 |
| Right angle post-clamp | Newport | MCA-1 | Figures 3, 4; standard opto-mechanical parts for the experimental jig (Figure 4) are also from Newport Corp. |
| 8-32 ¾” screw | Fastener Superstore | 240181 | For head-restraint, Figure 3 |
| 4-40 ¼” screw | Fastener Superstore | 239958 | For head restraint, Figures 3, 4 |
| Quartz capillary tubing | Sutter Instruments | QF-100-60-10 | Figure 5 |
| Carbon dioxide laser puller | Sutter instruments | P-2000 | |
| Motorized micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | |
| Microelectrode amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | Alternate part: Molecular Devices Axoclamp 900A |
| Microelectrode amplifier head stage | Molecular Devices | CV-7B | Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A |
| Isolated pulse stimulator | A-M Systems | Model 2100 | Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A |
| Audio monitor | Radio Shack | 32-2040 | |
| Pipette holder | Warner Instruments | #MEW-F10T | Alternate parts: see Discussion, Figure 6A |
| Electrode lead wire | Cooner wire | NEF34-1646 | (optional), Figure 6D |
| Relay for amplifier head-stage | COTO Technology | #2342-05-000 | (optional) Used with a custom-made printed circuit board (UCSD Physics Electronics Shop), Figure 6A-C |
| Digital video camera | Basler | A602fm | (optional) For behavioral monitoring, Figure 7 |
| Puralube vet ointment | Amazon.com, Inc | NC0138063 |
References
- Fee, M. S., Leonardo, A. Miniature motorized microdrive and commutator system for chronic neural recording in small animals. Journal of Neuroscience Methods. 112 (2), 83-94 (2001).
- Ventakachalam, S., Fee, M. S., Kleinfeld, D. Ultra-miniature headstage with 6-channel drive and vacuum-assisted micro-wire implantation for chronic recording from neocortex. Journal of Neuroscience Methods. 90 (1), 37-46 (1999).
- Szuts, T. A. A wireless multi-channel neural amplifier for freely moving animals. Nature Neuroscience. 14 (2), 263-269 (2011).
- Roy, S., Wang, X. Wireless multi-channel single unit recording in freely moving and vocalizing primates. Journal of neuroscience. 203 (1), 28-40 (2012).
- Hill, D. N., Mehta, S. B., Kleinfeld, D. Quality metrics to accompany spike sorting of extracellular signals. Journal of Neuroscience. 31 (24), 8699-8705 (2011).
- Pinault, D. A novel single-cell staining procedure performed in vivo under electrophysiological control: morpho-functional features of juxtacellularly labeled thalamic cells and other central neurons with biocytin or Neurobiotin. Journal of neuroscience. 65 (2), 113-136 (1996).
- Person, A. L., Perkel, D. J. Pallidal neuron activity increases during sensory relay through thalamus in a songbird circuit essential for learning. The Journal of neuroscience. 27 (32), 8687-8698 (2007).
- Kock, C. P., Sakmann, B. Spiking in primary somatosensory cortex during natural whisking in awake head-restrained rats is cell-type specific. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 106 (38), 16446-16450 (2009).
- Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice. Neuron. 67 (6), 10481061 (2010).
- Hellon, R. The marking of electrode tip positions in nervous tissue. The Journal of physiology. 214, 12P (1971).
- Furuta, T., Deschênes, M., Kaneko, T. Anisotropic distribution of thalamocortical boutons in barrels. The Journal of Neuroscience. 31 (17), 6432-6439 (2011).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (1986).
- Kleinfeld, D., Delaney, K. R. Distributed representation of vibrissa movement in the upper layers of somatosensory cortex revealed with voltage sensitive dyes. Journal of Comparative Neurology. 375 (1), 89-108 (1996).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain research. 171 (1), 11-28 (1979).
- Moore, J. D., Deschênes, M., Kleinfeld, D. Self-generated vibrissa motion and touch are differentially represented throughout ventral posterior medial thalamus in awake, head-fixed rats. Society for Neuroscience Annual Meeting. 41 496.08/TT424 Society for Neuroscience. 41, (2011).
- Khatri, V., Bermejo, R., Brumberg, J. C., Zeigler, H. P. Whisking in air: Encoding of kinematics by VPM neurons in awake rats. Somatosensory and Motor Research. 27 (2), 344-356 (2010).
- Hill, D. N., Curtis, J. C., Moore, J. D., Kleinfeld, D. Primary motor cortex reports efferent control of vibrissa position on multiple time scales. Neuron. 72 (2), 344-356 (2011).
- Moore, J. D. Hierarchy of orofacial rhythms revealed through whisking and breathing. Nature. 497, 205-210 (2013).
- Duque, A., Zaborszky, L. Neuroanatomical Tract-Tracing 3. , Springer. 197-236 (2006).
- Neuroactive substances: Neuropharmacology by microiontophoresis. , Kation Scientific. Available from: http://kationscientific.com/fsubstances.html Forthcoming.
- Dyes and Tracers: Sitemarking and tracktracing by microiontophoresis. , Kation Scientific. Available from: http://kationscientific.com/fdyes.html Forthcoming.
- Urbain, N., Deschênes, M. Neuroactive substances: Neuropharmacology by microiontophoresis. (Kation Scientific), Dyes and Tracers: Sitemarking and tracktracing by microiontophoresis. (Kation). Journal of Neuroscience. 27 (45), 12407-12412 (2007).
