Introduction
Övervakning neuronal aktivitet i en varning djur aktivt engagerad i en beteendevetenskaplig uppgift är avgörande för att förstå funktion och organisation av nervsystemet. Extracellulär inspelning av den elektriska aktiviteten från enstaka neuronala enheter har länge varit en stapel verktyg av system neurovetenskap och är fortfarande mycket i bruk för närvarande. En mängd olika elektrodtyper och konfigurationer finns tillgängliga beroende på de vetenskapliga och tekniska kraven i en viss experiment. Kroniskt implanterade microdrives eller elektrod arrayer används ofta i fritt rörliga djur, inklusive fåglar, gnagare och icke-mänskliga primater 1-4. Alternativt är akuta ingar med metall eller glas mikroelektroder via en extern mikromanipulator ofta för att spela in från sövda eller huvud-hållsamma djur. Glasmikropipett elektroder har fördelen att de kan användas i juxtacellular eller "cell fäst" konfiguration för att entydigt isoleraaktivitet av enstaka nervceller utan komplikationer av post-hoc spik sortering 5. Dessa elektroder tillåta ytterligare inspelning från anatomiskt identifierade celler eller platser, eftersom de kan användas för att injicera små fyndigheter av färgämnen eller neuroanatomiska spårämnen, eller till och med för att fylla den enskilde inspelade cellen. Denna konfiguration har framgångsrikt tillämpats i råttor, möss och fåglar 6-10. Den nu beskrivna tekniken fokuserar på juxtacellular övervakning och extracellulära färgämnes insättningar i beredskap, huvud-hållsamma råttor. Till skillnad från en enda cell juxtacellular fyller, dessa färgämnes insättningar inte ge information om cellmorfologi eller axonal prognoser 11, men de möjliggör exakt anatomisk lokalisering till cirka 50 pm, och kritiskt, har en betydligt högre avkastning i varnings djur. Information beträffande encelliga juxtacellular fyller är ändå tillhandahålls som en alternativ strategi för anatomisk märkning.
I korthetProtokollet består av tre huvudfaser. I den första fasen, är råttan acklimatiserad till kroppen återhållsamhet i en trasa socka (Figur 1) under en period av 6 dagar. I den andra fasen, är ett nackstöd apparat (Figur 2) och inspelningskammare inopererade så att råttan kan upprätthållas i stereotaxisk planet under flera efterföljande inspelningar (Figur 3); Detta förfarande gör det möjligt för försöksledaren att rikta särskilda subkortikala regioner i hjärnan för elektro studie baserad på standardreferenskoordinater 12. Den tredje fasen innebär att placera råttan i en lämplig jigg för att genomföra de beteende- och elektrofysiologiska experiment (Figur 4), konstruera elektroden från en kvarts kapillärrör (Figur 5), vilket gör juxtacellular neuronala inspelningar som entydigt isolera enstaka enheter 6-9, och märkning de anatomiska locatipå av inspelningsplatsen med Chicago Sky Blue färgämne (figurerna 6 och 7). Inspelningarna sker med samtidig beteendeövervakning; kommer dock de tekniska detaljerna i beteendet beror på de vetenskapliga målen för varje experiment och är därmed utanför ramen för ett enda protokoll. Efter slutförandet av den experimentella proceduren, vilket kan upprepas på flera dagar, är djuret avlivas. Hjärnan utvinns och bearbetas enligt standardneuroanatomiska tekniker med antingen ljusa fält eller fluorescensmikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Experimentella protokoll utfördes på kvinnliga Long Evans råttor (250-350 g) i enlighet med federalt föreskrivna Djurvård och användning riktlinjer och har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of California i San Diego.
1. acclimating Rat till Body Restraint
OBS: Placera råttan på en begränsad kost. Feed råttan en gång per dag direkt efter varje daglig hantering session att acklimatisera råttan till fasthållningsanordningen (beskriven nedan). Ge tillräckligt med foder för att hålla djuret vid 80% av sin ursprungliga vikt. Detta belopp är ca 6 gram foder per dag för en 250 g kvinnliga Lång Evans råttan.
- Acklimatisera råttan att bli hanterade av människor. Hålla försiktigt råttan hand i perioder om ca 5 sek var 30 sek. Gör detta i 15 minuter om dagen på 2 dagar i följd. Övervaka råttorna dagligen för tecken på stress under utbildningsperioden. Tecken inkluderar kämpar jagn svar på återhållsamhet, läte, och tand tjattrande.
- På 3: e dagen, placera råttan i en kropp-begränsande trasa socka (Figur 1) i 15 min en dag på två på varandra följande dagar.
- På den 5: e dagen, placera råttan inuti strumpan, och placera sockan inuti ett stelt rör på det experimentella jiggen (Figur 4). Lämna råttan i röret för 15 minuter om dagen på 2 dagar i följd.
- Mata råttan direkt efter varje träningspass. Vid slutet av den sista sessionen (6: e dagen) ger obegränsad tillgång till mat. Välj för implantation endast de råttor som inte visar tecken på kraftig stress på sista träningsdagen.
OBS: Även val av råttor för implantering är subjektiv, i våra händer över 90% av råttor befanns vara mottaglig för tillvänjning och kan genomgå implantation.
2. Implantation inspelnings avdelningen och chef-återhållsamhet mekanismen
- Gör en rekonferens tråd genom lödning bare tråd av rostfritt stål med en stiftskontakt. Klipp tråden så att 3-5 mm återstår avslöjats av stiftet. Autoklavera referenstråden, tillsammans med alla kirurgiska verktyg.
- Administrera ketamin / xylazin anestesi. Administrera 95 mg / kg ketamin blandades med 5 mg / kg xylazin intraperitonealt. Den initiala dosen varar 1 ½ till 2 tim. Komplettera anestesi varje 30-45 min därefter efter behov. Smörj djurets ögon med en ögon salva.
- Kontrollera tån tillbakadragande reflexen att bestämma plan av anestesi, och underhålla anestesi vid behov.
- Placera råttan i en stereotaktisk innehav ram med örat barer (Figur 3A). Raka håret på huvudet och desinficera sårstället med povidon-jod (10% lösning). Var noga med att sätta örat barer på lämpligt sätt så att de inte skadar trumhinnan. Öron barer med trubbiga tips är att föredra.
- Gör ett snitt med en skalpell approxiändan längs mittlinjen av kraniet från rostro-kaudala ögonhöjd på baksidan av öronen. Använd sax för att klippa och avlägsna en 2-3 mm remsa av hud på vardera sidan av snittet.
- Skrapa bort benhinnan för att exponera ytan av kraniet ut till de laterala åsar. Täck den exponerade kraniet med tunt lager av superlim.
- Borra ett litet hål, med en något mindre diameter än 0-80 skruvar, med ½ mm diameter borr grad (se Material avsnitt). Borra hålet omedelbart posteriort där bregma sutur möter sido åsen, och vid en 30-45 ° vinkel i kraniet, så att skruven kan gå in med den övre mer lateral än botten.
- Skruva i en 0-80 flatbottnad maskinskruv i hålet (ca 3 varv), vid 30-45 ° vinkel. Var noga med att inte skruva in för djupt för att undvika att skada den underliggande hjärnvävnaden.
- Upprepa denna procedur för 6 extra skruvar i konfigurationen visas
- Placera en spruta nål i stereotax manipulator. Mät från bregma sutur, och göra en buckla i kraniet med nålen nära, men utanför det önskade kraniotomi platsen, som ett referensmärke.
OBS: I denna demonstration, de stereotaktiska koordinaterna för märket är 3 mm bakre och 1 mm i sidled till bregma sutur. - Markera buckla med en permanent markör. Notera de stereotaktiska koordinaterna för märket, eftersom det kommer att fungera som en stereotaktisk referenspunkt (Figur 3B).
- Gör en kraniotomi centrerad på de önskade koordinaterna (3 mm posteriort och 3 mm lateralt i förhållande till bregma i detta exempel). Lämna dura mäter intakt. Täck kraniotomi med modifierad artificiell cerebrospinalvätska (125 mM NaCl, 10 mM glukos, 10 mM HEPES, 3,1 mM CaCl2, 1,3 mM MgCl2, pH 7,4) 13 (figur 3C). Skär en 0,2 ml centrifugrör till 4-5 mm lång, och avskurna locket. Placera röret på kraniet och centrera den över kraniotomi.
- Applicera dentalcement runt botten av röret för att täta basen av röret till kraniet. Var noga med att inte läcka cement i den exponerade kraniotomi (Figur 3D).
- Borra ett annat litet hål (ca ½ mm diameter) i den kontraskall plattan och försiktigt in referenstråden. Konstruera referenstråden genom lödning av en tapp som gränssnitt med inspelningsförstärkaren till änden av tråden (se avsnitt Equipment). Flytta inte referenstråden när det är i hjärnan eftersom detta kan orsaka skada.
- Applicera superlim till hålet i vilket tråden insattes. Detta kommer att försegla stiftet och tråd i stället tillfälligt.
- Blanda de två delarna av silikongel satsen (se Material avsnitt) i ungefär lika portioner. Vänta i två minuter för att blanda och fill centrifugröret ca ⅓ fullt med gel.
- Bifoga en rät vinkel inlägg klämma (se Material avsnitt) till nackstödet fältet. Fäst huvudplattan (figur 2A) till väntfältet (Figur 2B) vid en 45 ° stigningsvinkel så att botten av plattan är vänd mot näsan hos djuret. Det är bra att använda en lutningsmätare för att ställa in lutningsvinkeln så att de matchar den experimentella jiggen (Figur 4).
- Fäst innehavet fältet till stereotax manipulatorarmen så att stången är parallell med örat barer. Sänk ribban och plattan så att plattan är bakre delen av lambda sutur och främre till den bakre-mest skruv.
- Ta tag i front huvud-bult (en 8-32 stud eller skruv, se Material avsnitt) vid ca 45 ° vinkel med en hjälpande hand arm och klämma, så att skruvhuvudet vänd nedåt och mot svansen av djuret. Sänk skruven så att den vidrör myranerior 0-80 skruvar (Figur 3F, G).
- Säkra bulten och plattan på plats med dentala akryl. Applicera dentala akryl runt benskruven huvudena, referenstapp, och runt sidorna av centrifugröret. Vänta ca 10 min för dentala akryl torka (Figur 3H).
- Applicera ett lager av dentalcement runt kanterna på det dentala akryl, cemente huden till implantatet. Vänta tills cementen torka.
- Peta flera hål i locket av centrifugröret och placera locket på tuben.
- Avlägsna hjälpande händer klämman. Sedan försiktigt bort huvudet hållande bar från stereotax och ta bort huvudplatta från baren (Figur 3I).
- Ta djuret från stereotax och administrera postoperativ vård och övervakning i enlighet med alla tillämpliga regler, förordningar och lagar (t.ex. buprenorfin 0,02 mg / kg, var 8-12 tim i minst 24h). Om inflammationen utvecklas kring kanterna på implantatet, applicera ett tunt lager av antibiotika salva till den drabbade platsen dagligen tills löst.
3. Juxtacellular Övervakning av neurala Units
- Dra kvarts kapillär slangar på en koldioxidlaser mikropipett avdragare (se Equipment avsnitt) med spetsdiametrar på mindre än 1 pm (Figur 5A).
OBS: värmeparametrarna kommer att variera enligt det speciella instrumentet, och att den erforderliga halsdiametern kommer att variera beroende på den hjärnstruktur av intresse. För inspelningar i rått thalamus, mikropipetter har halsar sträcker sig från 5-7 mm. - Säkra pipetten på plats under en differential interferens kontrast (DIC) mikroskop utrustat med långa arbetstider målen avstånd. Använd modellera att hålla pipetten på plats på mikroskop scen.
- Sakta flytta ett glasblock (0,5-1 cm tjock, en bit av glas som används för making ultra mikrotomknivar är bekvämt) i synfältet med pipettspetsen. Använda scenen mikromanipulator trycker försiktigt pipettspetsen till glaset, vilket kan göra att bryta. Upprepa vid behov tills pipettspetsen ytterdiameter är mellan 1-3 um (Figur 5B, C). Se till att dessa mikropipetter har impedanser mellan ca 5-15 Mohm.
- Förbered extracellulär saltlösning (135 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5 mM HEPES, pH 7,2 med NaOH) 8 och tillsätt 2% (vikt / volym) Chicago Sky Blue. Med hjälp av en spruta med en 30 G-nål eller mindre, fylla den bakre änden av pipetten med lösningen. Alternativt, för enskild cell juxtacellular märkning till 2% (vikt / volym) Neurobiotin eller biotinylerad dextran amin (BDA-3000 eller BDA-10000) till koksaltlösning i stället för Chicago Sky Blue.
- Placera råttan innanför duken sockan inuti stela röret på en lämplig experimentell jigg (
- Fäst huvud-hållande plattan på råtta till motsvarande bit på jiggen. För att göra detta, först stift huvudstödets platta på plats, och sedan fast den med en 4-40 skruv. Var noga med att vänta tills djuret är lugnt för att undvika att använda överdrivet vridmoment mot huvudet. Nästa, placera en 8-32 mutter på huvudet-hållande bult som implanteras på råttan. Skruva sedan i en gängad rostfri stång i huvudet-bult. Anbringa stången till den experimentella jiggen på ett sådant sätt att den kan dras åt på plats (Figur 4).
OBS: Säkra djuret med huvudet-bult samt huvudstödets platta minimizes böjning av anordningen och förbättrar inspelning stabilitet. I de flesta fall inspelning kan börja den första dagen djuret är head-spända. Men om djuret svårt att vara stilla drivet eller vocalizes, ger en dag av huvudstödets tillvänjning utbildning innan de inleder några inspelningar. I detta fall, lämna djuret på jiggen i 15 min och sedan placera den tillbaka i sin bur. Upprepa detta steg följande dag och fortsätt med protokollet.- Öppna inspelningen kammaren och avlägsna silikongel. Rengör kraniotomi med fin pincett om vävnad har åter vuxit i kraniotomi.
- Fäst pipetten till den motoriserade mikromanipulator, och koppla in huvudsteg för-förstärkare.
OBS: I det aktuella demonstrationen, är en liten reläkrets på huvudsteg som används för att växla mellan huvudförstärkare ledningar och en extern strömkälla med hög överensstämmelse (Figur 6A-C). Observera att vissa förstärkare har en lämplig inbyggd hög överensstämmelse källa(Se Diskussion och material avsnitt).- Använd den motoriserade mikromanipulator att flytta spetsen på pipetten till stereotaktiskt identifierade märket i inspelningen kammaren. Notera koordinaterna för den här platsen. Var noga med att inte bryta spetsen på pipetten på kraniet.
- Flytta pipetten till önskad inspelnings läge i främre-bakre och medio-laterala axlar. Sedan avancerar pipetten ventralt genom dura tills det är ungefär 500 pm rygg till den avsedda inspelningsplatsen.
- Långsamt framåt pipetten samtidigt som du lyssnar på tillsatta händelser på en ljud monitor den förstärkta spänningen inspelade mellan pipettspetsen och referenstråden. När spiking händelser identifieras, fortsätter att flytta pipetten 0-100 um tills positiva gå spännings omläggning större än cirka 500 μV observeras.
OBS: Elektrodmotståndet ökar med en faktor på cirka 1,5-10 whsv detta inträffar.- Börja inspelningen gång en enhet har isolerats som enligt steg 3.11, tillsammans med alla andra beteendemässiga och fysiologiska åtgärder av intresse. I föreliggande demonstrationen, är självgenere vibrissa rörelser övervakas med hög hastighet videography (se Material avsnitt).
- Att märka inspelningsplatsen, växla elektroden leder till att ansluta till strömkällan. Det finns flera sätt att göra detta, med hjälp av antingen en reläkrets (Figur 6A - C), en inbyggd strömkällan på förstärkaren, eller manuellt (figur 6D, se steg 3.8 och diskussion). Pass -4 iA med 2 sek pulser vid 50% intermittens för 4 minuter till jontoforetiskt injicera Chicago Sky Blue genom pipetten.
- Döda och BEGJUTA djuret efter flera förfaranden märknings enligt gällande praxis. Avsnitt hjärnan och motfärg som är nödvändigt för att identifiera anatomiska belägenhet inspelningen sittae. Motfärga vävnaden för cytokrom oxidas reaktivitet per 14. Alternativt, identifiera Chicago Sky Blue insättningar använder fluorescensmikroskopi.
OBS: För att noggrant skilja mellan olika märkta enheter är det viktigt att alla etiketter är gjorda med samma pipett på samma dag, utan lossning pipetten mellan etiketterna. I detta fall inspelningsplatser kan differentieras genom deras relativa lägen i post-hoc-histologi tillsammans med de noterade manipulerings koordinaterna för varje ställe (se steg 3.9). För entydig identifiering, markera etiketterna minst 200 nm från varandra, och inte mer än 3-5 etiketter per hjärnregion. - Fäst huvud-hållande plattan på råtta till motsvarande bit på jiggen. För att göra detta, först stift huvudstödets platta på plats, och sedan fast den med en 4-40 skruv. Var noga med att vänta tills djuret är lugnt för att undvika att använda överdrivet vridmoment mot huvudet. Nästa, placera en 8-32 mutter på huvudet-hållande bult som implanteras på råttan. Skruva sedan i en gängad rostfri stång i huvudet-bult. Anbringa stången till den experimentella jiggen på ett sådant sätt att den kan dras åt på plats (Figur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Neuronala enheter i ventrala bakre mediala (VPM) thalamus koda den fas av vibrissa rörelse under självgenererade vispa 15,16. Figur 7A visar prov tillsatta aktiviteten hos ett VPM thalamic enhet som en råtta aktivt vispa. Figur 7B visar ett histogram över spik tider anpassas till den momentana fasen av vibrissa motion 17. Det finns fler spikar under indragningsfasen av vispa. Efter inspelningen, var platsen för enheten märkt via jontofores Chicago himmelsblå färg, som visas i figur 7C. Vävnaden motfärgas för cytokrom oxidas aktivitet för att avslöja de neuroanatomiska gränser VPM thalamus. En liknande version av detta protokoll har nyligen ansökt att övervaka vispa relaterade storförpackning nervaktivitet (10-20 um pipett diameter tips) i specifika hjärnstamskärnor 18.
re 1 "src =" / filer / ftp_upload / 51453 / 51453fig1.jpg "/>
Figur 1: Cloth hållande socka (A) Fotografi av en råtta socka med dragsko och dragsko spännen.. Den lilla änden placeras tätt runt bröstbenet, och den stora änden runt svansen. (B) Designmönster för strumpan på panelen 1A. Måtten är i inches.
Figur 2: Mekanisk konstruktion av nackstöd apparat (A) Mekanisk design av en precisions nackstöd platta för råttor.. Måtten är i inches. (B) Mekanisk konstruktion av ett nackstöd bar för användning med plattan i panelen 2A. Protokollet kräver två av dessa delar, monteras med rätvinkliga inlägg klämmor med samma stigningsvinkel._blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Kirurgiskt förfarande (A) Rat i en stereotaktisk innehav ram (protokollsteg 2.4).. (B) Kirurgisk sajt med implanterade skruvar och kraniala markeringar (protokoll steg 2,10). (C) Kirurgisk webbplats med en kraniotomi (protokollsteg 2,12). (D) Kirurgisk plats med inspelningen kammaren (protokollsteg 2,14). (E) Kirurgisk plats med referens tråd och silikongel (protokollsteg 2,17). (F, G) Kirurgisk plats med nackstöd platta och bar hålls på plats (protokollsteg 2,20). (H) Kirurgisk site in med plåt och bar cementerade på plats (protokollsteg 2,21). (I) Slut head-återhållsamhet och inspelning kammar implmyra (protokollsteg 2,24). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4:. Experimentell jigg Diagram över råtta i den mekaniska jigg för elektrofysiologiska och beteendeövervakning experiment (protokoll steg 3,5-3,6). Jiggen utnyttjar stången och plattan i figur 2.
Figur 5: Mikropipett elektrodkonstruktion (A) mikroskop av en obruten mikropipett (protokollsteg 3.1).. Skala bar är som i panelen C. (B) mikroskop av den obrutna mikropipett och glasblock under mikroskop (protokollsteg 3.2).Reflektionen av spetsen kan ses i glaset. Skala bar är som i panelen C. (C) mikroskop av den brutna mikropipett (protokollsteg 3.3). (D) Micrograph av spetsen av den obrutna mikropipett i den inramade regionen av panelen A. Scale bar är såsom i panel E. (E) Micrograph av spetsen av den brutna mikropipett i den inramade regionen av panelen C. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 6:. Utrustning för växling mellan förstärkaren och strömkällan (A) Setup för att växla kablarna från förstärkaren till strömkällan via en magnetisk relä (tillval). Ett tryckt kretskort med den spänningsstyrda reläomkopplare är attached till förstärkaren huvudet scenen. (B) Layout för det tryckta kretskortet i panel 6A. Styrelsen ansluter förstärkarens leder och strömkällan leder till ingångsstiften i reläet, och elektroden leder till utgångsstiften. Elektroden är ansluten till antingen den aktuella källan eller förstärkaren genom att tillämpa antingen 0 eller 5 V till relästyrstiften. Underifrån. Måtten är i inches. (C) Ovanifrån av styrelsen layout i panel 6B. (D) Setup för att växla kablarna från förstärkaren till den aktuella källan manuellt (tillval) kräver ett öppet pipett hållare och flexibel blytråd som de som visas (se även: avsnitt Equipment). Detta tillvägagångssätt är ett alternativ till reläkretsen i paneler 6A-C. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Experimentell setup och representativa resultat (A) Spikes och vibrissa rörelse från en enhet (protokollsteg 3.12).. (B1) Normaliserad vibrissa ställning kontra fas i vispen cykeln. Varje visp normalis sådan att den mest kaudala position under vispen definieras som noll och den mest rostralt positionen definieras som en. Banan representerar den normaliserade positionen kontra momentan fas i vispen cykeln 17. Samtliga identifierade vispar lagras. (B2) Raster för fasen i vispen cykeln där toppar. Varje prov på den vertikala axeln representerar en enda visp. (B3) Histogram av spik hastigheter med avseende visp cykelfasen för samma enhet. (C1) Placering av Chicago Sky Blue färgämne med cytokrom oxidas motfärgning (protokoll steg från 3,13 till 3,14). (C2 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Byggandet av den experimentella jiggen
Beskrivningen av de mekaniska delar som används för att bygga den experimentella jiggen (figur 4) är utelämnad från protokollet, eftersom den kan konstrueras på en mängd olika sätt. I denna demonstration standard opto-mekaniska delar och stödklämmor används för att montera nackskyddet fältet och kroppen återhållsamhet röret (se Material avsnitt). Liknande optomekaniska delar kan användas för att montera elektrodhållaren till den motoriserade mikromanipulator. Det är viktigt att nackskyddet fältet på jiggen monteras på samma stigningsvinkel som baren brukade implantera huvudstödets platta under operation. Om elektroden ska flyttas längs de vanliga stereotaktiska axlarna, sedan x-axeln av elektroden ska flytta parallellt med huvudstödets bar, och z-axeln vinkelrätt mot plan som innehåller lambda och bregma och parallellt med marken ( Typer av lämpliga förstärkare och strömkällor Det finns en mängd olika kommersiella förstärkare och strömkällor som kan användas för detta experiment. De flesta extracellulära och intracellulära elektrofysiologiska förstärkare med en strömtång läge som ger en total vinst på 1,000X är lämpliga. För jontofores av Chicago Sky Blue med 1-3 ìm pipetter, en strömkälla som kan leverera upp till 10 uA med en upplösning på minst 1 iA och efterlevnad av minst 100 V rekommenderas. Observera att vissa kommersiella förstärkare har lämpliga inbyggd strömkällor (se alternativa delar i Materials avsnitt). Men för att kringgå kravet på en lämplig kombinerad förstärkare / strömkälla, kan en magnetisk reläkrets fästas på främre änden av förstärkaren huvudsteg (figur 6A - C). En sådan krets är orivilligt men det tillåter försöks att växla mellan förstärkare och en separat strömkälla för att leverera jontofores pulser utan att fysiskt störa elektroden. Ett alternativt tillvägagångssätt är att manuellt ersätta elektrodledningstrådarna med ettor som ansluter till strömkällan. I detta fall är det bäst att använda en pipett hållare som inte innesluter toppen (obruten änden) av pipetten, och att använda flexibla blytråd (figur 6D). Steg som kan kräva upprepade praxis Det finns flera steg som kan kräva praxis att bemästra. Steget som kräver mest fingerfärdighet är bryta pipettspetsen. Det är till hjälp att måla kanten av glasblock för att visualisera reflektion av spetsen i glaset. Då kan man sakta framåt blocket och pipetten tills spetsen knappt möter dess reflektion. Advancing pipett eller blockera för snabbt kan splittra mikropipett och göra spetsdiameter för large eller ojämn. Vi rekommenderar att du använder mikropipetter tillverkade av kvarts, som beskrivs i protokollet. Quarts mikropipetter effektivt penetrera intakta rått dura i kroniskt förberedda craniotomies utan att böja eller bryta. Detta eliminerar behovet av dura resektion, vilket kan orsaka ytterligare komplikationer. Borosilikatglas mikropipetter med korta konor (<5 mm) också tränga dura, men deras användning är begränsad till inspelning från ytliga strukturer som hjärnbarken eller striatum. Inspelning från djupare strukturer, särskilt i thalamus eller hjärnstammen, kräver långa avsmalnande, företrädesvis kvarts mikropipetter. Ett andra steg som kräver övning är att placera pipetten i juxtacellular konfiguration. Moving pipetten för snabbt när nära en cell kan spräcka membranet. Därför är det till hjälp att avläsa resistansen av pipetten för att veta när spetsen är nära en förmodad cell. Förändringar i membranhållfasthet på minst 2-faldig indikerar att elektroden kan vara near eller vidrör ett cellmembran. Vanliga fallgropar Det finns flera vanliga fallgropar att tänka på. Först, eftersom pipettspetsen är nödvändigtvis mycket nära till cellen, är det möjligt att "förlora" cellen om pipetten driver bort från membranet. Det är även möjligt för en cell att bli upprörd eller brista halvvägs in i inspelningen. Om den gör det, kan spetsen bredd och eldhastighet öka och spik amplituden kan minska. Dessa är tecken på att cellen kan vara ohälsosamt. Djur rörelse kommer oundvikligen att leda dessa händelser att hända på någon del av inspelningarna, men kan minimeras genom att ha djuret väl vana och genom att undvika att göra onödiga, plötsliga höga ljud eller orsakar vibrationer som skrämma djuret. Potentiella ändringar av protokollet Det är möjligt att använda denna inspelning och märkningsteknik i sammanhang där djuret ärutför en mångfald beteende uppgifter. Utbildning för ett visst beteende uppgift kan utföras efter kirurgi men innan börjar spela in. Neuronal aktivitet kan registreras minst 1-2 veckor efter att förbereda kraniotomi, och jontoforetiska fläckar kan pågå i minst 2-3 dagar. Denna tidsram tillåter en mängd olika experimentella manipulationer, inklusive inspelning från flera områden i hjärnan under separata inspelningar. Tekniken kan också modifieras för att fylla de enskilda nervceller från vilka inspelningar görs. Detta alternativ strategi för juxtacellular märkning av enskilda nervceller kräver mekanisk stabilitet som bara uppnås när djuret är stilla eller sövd. För denna märkning strategi, är användningen av BDA rekommenderas över Neurobiotin. BDA inte bryts ned av proteaser, som avsevärt ökar graden av framgång under Neurobiotin. Märkning bör prövas under den sista inspelningen innan perfusion avdjur. Observera att detaljerade beskrivningar av juxtacellular protokollet har beskrivits tidigare 6,19 .While tekniken har använts med framgång hos råttor varnings 8, i vår erfarenhet jontoforetiska injektion av Chicago Sky Blue har en betydligt högre avkastning. Notera att både Chicago Sky Blue och Neurobiotin eller BDA märkningen kan göras i samma djur. Denna teknik kommer sannolikt att vara lämpliga för en mängd olika arter. Observera att juxtacellular inspelningar har gjorts i kortikala regioner alert möss 9, till exempel. Medan utbildning, hantering, och huvud-återhållsamhet är artspecifika, bör de särskilda tekniker för övervakning och märkning som beskrivs i detta protokoll förblir desamma. Slutligen, helt enkelt genom att ändra storleken av pipettspetsen och parametrarna för strömpulserna denna teknik kan användas för jontoforetisk injektion av en mängd olika molekyler, inklusive farmakologiska medel 20,21. SålundaTekniken kan också vara användbar för neurofarmakologiska studier som involverar beter djur. Slutsatser Det är ofta så att områden i hjärnan som är extremt nära varandra kan ha mycket olika egenskaper och / eller funktioner 22. I sådana fall avser aktiviteten av enskilda neuroner från anatomiskt definierade regioner till organism beteende är kritisk för att förstå neurala kretsar och beräkning. Denna artikel visar ett protokoll för att uppnå detta genom att använda en kombination av standardtekniker och beskriver sensorisk kodning i VPM talamiska nervceller som ett exempel. Tekniken kommer sannolikt att vara relevant och genomförbart i en mängd olika hjärnregioner och beteende paradigm i olika djurmodeller. Den har en betydligt större framgång än enskild cell juxtacellular märkning varningsdjur 6,8, och har fördelen av bättre anatomiska upplösning över tekniker som använder multi-electrode kedjor eller microdrives.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketaset (Ketamine HCl) | Fort Dodge | N/A | |
| Anased (Xylazine solution) | Lloyd Laboratories | N/A | |
| Betadyne (Povidone-Iodine) | CVS Pharmacy | 269281 | |
| Loctite 495 | Grainger Industrial Supply | 4KL86 | 20 - 40 cp cyanoacrylate |
| Vetbond | 3M | 1469SB | |
| Grip cement powder | Dentsply Intl | 675571 | For the base of the recording chamber |
| Grip cement liquid | Dentsply Intl | 675572 | For the base of the recording chamber |
| Silicone gel | Dow Corning | 3-4680 | |
| Jet denture repair acrylic powder | Lang Dental Manufacturing Co. | N/A | For securing the head restraint apparatus to the cranium |
| Ortho-Jet Fast curing orthodontic acrylic resin liquid | Lang Dental Manufacturing Co. | N/A | For securing the head restraint apparatus to the cranium |
| Chicago sky blue | Sigma | C8679 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | For perfusion and tissue fixation |
| Phosphate-buffered saline | Sigma | P3813 | For perfusion and tissue fixation |
| Cytochrome C | Sigma | C2506 | For cytochrome-oxidase staining, Figure 7 |
| Diaminobenzidine | Sigma | D5905 | For cytochrome-oxidase staining, Figure 7 |
| Rat sock | Sew Elegant (San Diego, CA) | N/A | Custom made, Figures 1, 4 |
| PVC tube 2 ½” | U.S. Plastic Co. | 34108 | Figure 4 |
| Subminiature D pins & sockets | TE Connectivity | 205089-1 | Figure 3 |
| Stainless steel music wire 0.010” diameter | Precision Brand Products, Inc. | 21010 | Figure 3 |
| Stereotaxic holding frame | Kopf Instruments | Model 900 | Figure 3 |
| Stereotaxic ear bars | Kopf Instruments | Model 957 | Figure 3 |
| Stereotaxic manipulator | Kopf Instruments | Model 960 | Figure 3 |
| ½ mm drill burr | Henry Schein | 100-3995 | |
| Quiet-Air dental drill | Midwest Dental | 393-1600 | |
| Stainless steel 0-80 ⅛” screw | Fastener superstore | 247438 | Figure 3 |
| 0.2 ml centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-407-8A | Figure 3 |
| Custom head-holding bar | UCSD SIO Machine Shop | N/A | Custom made, Figures 2 - 4 |
| Custom head-holding plate | UCSD SIO Machine Shop | N/A | Custom made, Figures 2 - 4 |
| Right angle post-clamp | Newport | MCA-1 | Figures 3, 4; standard opto-mechanical parts for the experimental jig (Figure 4) are also from Newport Corp. |
| 8-32 ¾” screw | Fastener Superstore | 240181 | For head-restraint, Figure 3 |
| 4-40 ¼” screw | Fastener Superstore | 239958 | For head restraint, Figures 3, 4 |
| Quartz capillary tubing | Sutter Instruments | QF-100-60-10 | Figure 5 |
| Carbon dioxide laser puller | Sutter instruments | P-2000 | |
| Motorized micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | |
| Microelectrode amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | Alternate part: Molecular Devices Axoclamp 900A |
| Microelectrode amplifier head stage | Molecular Devices | CV-7B | Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A |
| Isolated pulse stimulator | A-M Systems | Model 2100 | Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A |
| Audio monitor | Radio Shack | 32-2040 | |
| Pipette holder | Warner Instruments | #MEW-F10T | Alternate parts: see Discussion, Figure 6A |
| Electrode lead wire | Cooner wire | NEF34-1646 | (optional), Figure 6D |
| Relay for amplifier head-stage | COTO Technology | #2342-05-000 | (optional) Used with a custom-made printed circuit board (UCSD Physics Electronics Shop), Figure 6A-C |
| Digital video camera | Basler | A602fm | (optional) For behavioral monitoring, Figure 7 |
| Puralube vet ointment | Amazon.com, Inc | NC0138063 |
References
- Fee, M. S., Leonardo, A. Miniature motorized microdrive and commutator system for chronic neural recording in small animals. Journal of Neuroscience Methods. 112 (2), 83-94 (2001).
- Ventakachalam, S., Fee, M. S., Kleinfeld, D. Ultra-miniature headstage with 6-channel drive and vacuum-assisted micro-wire implantation for chronic recording from neocortex. Journal of Neuroscience Methods. 90 (1), 37-46 (1999).
- Szuts, T. A. A wireless multi-channel neural amplifier for freely moving animals. Nature Neuroscience. 14 (2), 263-269 (2011).
- Roy, S., Wang, X. Wireless multi-channel single unit recording in freely moving and vocalizing primates. Journal of neuroscience. 203 (1), 28-40 (2012).
- Hill, D. N., Mehta, S. B., Kleinfeld, D. Quality metrics to accompany spike sorting of extracellular signals. Journal of Neuroscience. 31 (24), 8699-8705 (2011).
- Pinault, D. A novel single-cell staining procedure performed in vivo under electrophysiological control: morpho-functional features of juxtacellularly labeled thalamic cells and other central neurons with biocytin or Neurobiotin. Journal of neuroscience. 65 (2), 113-136 (1996).
- Person, A. L., Perkel, D. J. Pallidal neuron activity increases during sensory relay through thalamus in a songbird circuit essential for learning. The Journal of neuroscience. 27 (32), 8687-8698 (2007).
- Kock, C. P., Sakmann, B. Spiking in primary somatosensory cortex during natural whisking in awake head-restrained rats is cell-type specific. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 106 (38), 16446-16450 (2009).
- Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice. Neuron. 67 (6), 10481061 (2010).
- Hellon, R. The marking of electrode tip positions in nervous tissue. The Journal of physiology. 214, 12P (1971).
- Furuta, T., Deschênes, M., Kaneko, T. Anisotropic distribution of thalamocortical boutons in barrels. The Journal of Neuroscience. 31 (17), 6432-6439 (2011).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (1986).
- Kleinfeld, D., Delaney, K. R. Distributed representation of vibrissa movement in the upper layers of somatosensory cortex revealed with voltage sensitive dyes. Journal of Comparative Neurology. 375 (1), 89-108 (1996).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain research. 171 (1), 11-28 (1979).
- Moore, J. D., Deschênes, M., Kleinfeld, D. Self-generated vibrissa motion and touch are differentially represented throughout ventral posterior medial thalamus in awake, head-fixed rats. Society for Neuroscience Annual Meeting. 41 496.08/TT424 Society for Neuroscience. 41, (2011).
- Khatri, V., Bermejo, R., Brumberg, J. C., Zeigler, H. P. Whisking in air: Encoding of kinematics by VPM neurons in awake rats. Somatosensory and Motor Research. 27 (2), 344-356 (2010).
- Hill, D. N., Curtis, J. C., Moore, J. D., Kleinfeld, D. Primary motor cortex reports efferent control of vibrissa position on multiple time scales. Neuron. 72 (2), 344-356 (2011).
- Moore, J. D. Hierarchy of orofacial rhythms revealed through whisking and breathing. Nature. 497, 205-210 (2013).
- Duque, A., Zaborszky, L. Neuroanatomical Tract-Tracing 3. , Springer. 197-236 (2006).
- Neuroactive substances: Neuropharmacology by microiontophoresis. , Kation Scientific. Available from: http://kationscientific.com/fsubstances.html Forthcoming.
- Dyes and Tracers: Sitemarking and tracktracing by microiontophoresis. , Kation Scientific. Available from: http://kationscientific.com/fdyes.html Forthcoming.
- Urbain, N., Deschênes, M. Neuroactive substances: Neuropharmacology by microiontophoresis. (Kation Scientific), Dyes and Tracers: Sitemarking and tracktracing by microiontophoresis. (Kation). Journal of Neuroscience. 27 (45), 12407-12412 (2007).
