Summary
यहाँ हम astrocytic जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स के plasticity के अध्ययन के लिए न्यूरॉन्स में homeostatic plasticity प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल पर आधारित एक फिल्म का वर्णन. हाल ही में astrocytic समूह किशोर चूहों में मैं mGluRs में परिवर्तन की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया, विधि बगल में और vivo में वयस्क चूहों से ऊतक में, विभिन्न astrocytic GPCRs की स्केलिंग को मापने के लिए, और astrocytic रिसेप्टर्स की संवेदनशीलता का एक बेहतर सराहना हासिल करने के लिए लागू किया जा सकता है neuronal गतिविधि में परिवर्तन करने के लिए.
Abstract
अनुसंधान के दो दशकों के करीब बगल में और vivo में astrocytes neuronally में जारी ट्रांसमीटर द्वारा प्रेरित किया जा सकता है कि कई जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (GPCRs) व्यक्त कि की स्थापना की है. हालांकि, neuronal गतिविधि में बदलाव के जवाब में plasticity प्रदर्शन करने के लिए astrocytic रिसेप्टर्स की क्षमता कम ध्यान दिया गया है. यहाँ हम विश्व स्तर तक पैमाने या astrocytic समूह नीचे मैं तीव्र मस्तिष्क स्लाइसें में ग्लूटामेट रिसेप्टर्स (mGluRs) metabotropic करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक मॉडल प्रणाली का वर्णन. शामिल bidirectionally फ्लोरोसेंट सीए 2 + सूचक के साथ neuronal कार्रवाई संभावित आवृत्ति, भार astrocytes और astrocyte प्रक्रियाओं में हेरफेर, लंबी अवधि टुकड़ा ऊष्मायन के लिए उपयुक्त कक्षों का निर्माण, parasagittal hippocampal स्लाइस तैयार है, और रिकॉर्डिंग से astrocytic GQ GPCR गतिविधि में परिवर्तन को मापने के लिए कैसे पर तरीके हैं confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग सहज और पैदा astrocyte सीए 2 + घटनाओं. संक्षेप में, एक "कैल्शियम Roadmap "astrocytic GQ GPCRs के plasticity को मापने के लिए के लिए प्रदान की जाती है. Astrocytes के अध्ययन के लिए तकनीक के आवेदन पर विचार विमर्श कर रहे हैं. Astrocytic रिसेप्टर संकेतन neuronal गतिविधि में परिवर्तन से प्रभावित है की एक समझ के बाद दोनों सामान्य synaptic समारोह के साथ ही प्रक्रियाओं अंतर्निहित मस्तिष्क संबंधी विकार और neurodegenerative रोग के लिए महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है.
Introduction
Astrocytes 2 + astrocytic GQ GPCRs की सक्रियता से लगभग विशेष परिणामस्वरूप cytoplasmic CA में वृद्धि के साथ न्यूरॉन्स या neuronal axons की उत्तेजना को सेकंड के भीतर जवाब. उदाहरण के लिए, मुस्कारिनिक acetylcholine रिसेप्टर्स 1, cannabinoid रिसेप्टर्स 2, α 1 ए एड्रीनर्जिक रिसेप्टर्स 3, 4, और समूह मैं mGluRs (नीचे देखें) तीव्रता से neuronal गतिविधि का जवाब है कि सभी astrocytic GQ GPCR उपप्रकार हैं. Astrocytic समूह मैं mGluRs के सक्रियण (जैसे तीव्र hippocampal स्लाइस के रूप में) बगल में neuronal glutamatergic afferents की उत्तेजना 5-7, साथ ही इन विवो में वयस्क माउस प्रांतस्था में संवेदी उत्तेजना 8 निम्नलिखित के बाद, सबसे बड़े पैमाने पर प्रदर्शन किया गया है. जीव विज्ञान और astrocytes, न्यूरॉन्स, या astrocyte न्यूरॉन बातचीत के शरीर क्रिया विज्ञान पर संकेत astrocytic GQ GPCR की सक्रियता का परिणाम बहस 9-12 की बात की गई है. यह है हो जाएगान्यूरॉन से astrocyte रिसेप्टर संकेतन के समारोह से पहले ome समय पूरी तरह से सराहना की है.
यह न्यूरॉन्स प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का उपयोग astrocytic रिसेप्टर्स को सक्रिय कर सकते हैं कि स्पष्ट है, बुरा समझा रहते हैं कि न्यूरॉन से astrocyte रिसेप्टर संचार के पहलू हैं. सबसे पहले, astrocytic GQ GPCRs सक्रिय करने की आवश्यकता neuronal गतिविधि की वास्तविक राशि अच्छी तरह से परिभाषित नहीं है, और दूसरा, उपयोग पर निर्भर plasticity प्रदर्शन करने के लिए astrocytic रिसेप्टर्स की क्षमता कम ध्यान दिया गया है. इन सवालों का पता करने के लिए शुरू करने के लिए, हमने हाल ही में neuronal कार्य क्षमता में दीर्घकालिक परिवर्तन (एपी) पर निर्भर synaptic गतिविधि के जवाब में astrocytic समूह तीव्र किशोर hippocampal स्लाइस में मैं mGluRs की द्विदिश स्केलिंग प्रेरित करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित की है. मैं mGluRs के लिए ऊपर पैमाने पर neuronal ionotropic ग्लूटामेट रिसेप्टर्स 13, 14, astrocytic समूह की द्विदिश homeostatic plasticity के लिए खोज की गई है के समानllowing neuronal कार्रवाई क्षमता की नाकाबंदी और neuronal कार्रवाई संभावित आवृत्ति 15 की वृद्धि हुई है जब नीचे पैमाने. Astrocytic रिसेप्टर्स में ये प्रतिपूरक परिवर्तन सहज रिकॉर्डिंग से मापा और astrocyte सीए 2 + यात्रियों पैदा की और नियंत्रण की स्थिति में astrocytes से उन लोगों के लिए इन घटनाओं के गुणों की तुलना की जा सकती है. इस पांडुलिपि में, हम astrocyte रिसेप्टर स्केलिंग प्रेरित करने के लिए तीव्र hippocampal स्लाइस, ऊष्मायन शर्तों की तैयारी सहित, इस प्रोटोकॉल के उपयोग के लिए पूरी पद्धति का वर्णन, astrocyte सीए 2 + सूचक डाई लोड हो रहा है, सीए 2 + इमेजिंग confocal माइक्रोस्कोपी तकनीक का उपयोग कर, और उम्मीद प्रभाव astrocyte GQ GPCR गतिविधि पर. Astrocyte पर उम्मीद के मुताबिक प्रभाव 2 सीए संकेत गुणों + - GQ GPCRs के विभिन्न अभिव्यक्ति के स्तर के साथ ट्रांसफ़ेक्ट संवर्धित कोशिकाओं में पहले से रिकॉर्ड से मेल - जो के रूप में परिवर्तन के लिए परख करने के लिए भविष्य के अध्ययनों में इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक "रोडमैप" प्रदानtrocytic GPCR अभिव्यक्ति. इस तकनीक के इस्तेमाल के लिए प्रभाव और संभावित अनुप्रयोगों स्वस्थ और रोगग्रस्त मस्तिष्क में astrocyte-neuronal बातचीत की हमारी समझ के लिए योगदान देगा.
Protocol
पालन प्रक्रियाओं है कि कैलिफोर्निया, रिवरसाइड विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है.
1. ऊष्मायन चैंबर और टुकड़ा धारक का निर्माण
- ऊष्मायन कक्ष का निर्माण: nontoxic है कि सामग्री से ऊष्मायन कक्ष का निर्माण. कक्ष हवा परिसंचरण नियंत्रित सुनिश्चित करें कि, फ्लोट करने के लिए एक टुकड़ा धारक के लिए ACSF के लिए पर्याप्त मात्रा में रखती है, और ऑक्सीजन लाइनों से गैस फैलाव पर होता है, जबकि टुकड़ा धारक चैम्बर के एक छोर पर फ्लोट कर सकते हैं कि इतना काफी बड़ी है दूसरे छोर. इसकी हवा तंग ढक्कन (चित्रा 1 ए) के साथ एक पिपेट भंडारण कंटेनर की दराज भाग अच्छी तरह से इन मानदंडों को फिट बैठता है.
- लगभग 1 ¼ ऊपर से में और ¼ में ओर से कंटेनर की तरफ एक छोटा सा छेद ड्रिल. छेद के माध्यम से लचीला टयूबिंग की एक टुकड़ा फिट (चित्रा 1 बी). ढक्कन बंद कर दिया है जब ट्यूबिंग यह समाधान ऊपर है तो काफी उच्च है और अभी तक संकुचित नहीं होगा कि इतना काफी कम ड्रिल करने के लिए सावधान रहें.
- ऑक्सीजन लाइन और कक्ष के बीच एक पानी से तंग सील बनाने के लिए सिलिकॉन सीवन सीलेंट ("मछलीघर सीवन मुहर") लागू करें.
- एक पुरुष Luer फिटिंग का उपयोग कर एक गैस टैंक (95% ऑक्सीजन, 5% कार्बन डाइऑक्साइड) के लिए ट्यूबिंग का "बाहर" अंत कनेक्ट. एक कस्टम फिट करने के लिए, कट करने के लिए फिट एक प्राकृतिक beveled 200 μl विंदुक टिप (चित्रा 1C).
- एक एक से छह लाइन प्लास्टिक कई गुना करने के लिए ट्यूबिंग के अंदर "" अंत कनेक्ट. कट से फिट प्रत्येक कई गुना इनलेट (चित्रा -1) के लिए छह 20 μl Eppendorf microloader विंदुक युक्तियाँ. microloaders के ठीक उद्घाटन छोटे बुलबुले की एक सतत स्ट्रीम के उत्पादन के लिए आदर्श है.
- वेंटिलेशन के लिए अनुमति देने के लिए, कंटेनर (चित्रा 1E) के ढक्कन पर दो छोटे छेद ड्रिल.
- टुकड़ा घंटे का निर्माणपुराने: टुकड़ा धारक एक फ्लोटिंग बुलबुला रैक (चित्रा 1F) से बनाया गया है.
- बुलबुला रैक के नीचे "पैर" निकालें, और लगभग 1 ¾ अंदर करने के लिए शीर्ष कटौती
- एक आठ अच्छी तरह टुकड़ा धारक (चित्रा 1G) बनाने के लिए cyanoacrylate गोंद (जैसे मानक क्रेजी गोंद के रूप में) का उपयोग दौर रैक की तह तक नायलॉन जाल सामग्री का एक टुकड़ा गोंद. हर अच्छी तरह से एक माउस hippocampal टुकड़ा फिट कर सकते हैं.
- एक ऊष्मायन चैम्बर के अंत और दूसरे छोर पर microloader कई गुना तंत्र में टुकड़ा धारक फिट. Microloader सुझावों चैम्बर मंजिल (चित्रा 1H) पर आराम करने की अनुमति. इस सेटअप ऊपर और तीव्र hippocampal स्लाइस के नीचे दोनों के लिए पर्याप्त ऑक्सीजन सुनिश्चित करने के लिए, और बुलबुले टुकड़ा आंदोलन को कम करने और hippocampal स्लाइस के साथ बुलबुले के सीधे संपर्क को रोकने के क्रम में सीधे टुकड़ा धारक के नीचे से बाहर आने से बचने के लिए बनाया गया है.
- ऊष्मायन कक्षों एक कुल्लाप्रत्येक प्रयोग के बाद DDH 2 हे के साथ अच्छी तरह से डी टुकड़ा धारकों, और साप्ताहिक 70% EtOH के साथ शुद्ध करना. अलग अलग समाधान में स्लाइस incubating के मामले में, कई कक्षों / टुकड़ा धारकों की जरूरत होगी.
2. समाधान और ड्रग्स
- कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF): 125 NaCl, 2.5 KCl, 2.5 2 CaCl, 1.3 2 MgCl, 1.25 नाह 2 पीओ 4, 26.0 NaHCO 3, 15: (मिमी) निम्नलिखित का उपयोग DDH 2 हे में मानक ACSF के 4 एल को तैयार ग्लूकोज, और 0.1 Trolox. एक osmometer का उपयोग कर समाधान की osmolarity उपाय है, यह ~ 310 mOsm के लिए आना चाहिए. प्रयोगात्मक शर्तों के लिए ACSF रचनाओं (प्रोटोकॉल 3 देखें) नीचे वर्णित है. Autoclaved कांच की बोतलों में 0.22 सुक्ष्ममापी बोतल टॉप फिल्टर का उपयोग सभी के समाधान तक. समाधान एक महीने तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस में स्थिर रहे हैं.
- टुकड़ा करने की क्रिया बफर: 125 NaCl, 2.5 KCl, 3.8 MGC: (मिमी) से युक्त एक संशोधित ACSF का उपयोग स्लाइस की तैयारीएल 2, 1.25 नाह 2 पीओ 4, 26.0 3 NaHCO, 15 ग्लूकोज, और 1.3 एस्कॉर्बिक एसिड. एक osmometer का उपयोग कर समाधान की osmolarity उपाय है, यह ~ 310 mOsm के लिए आना चाहिए. टुकड़ा करने की क्रिया बफर में 2 MgCl साथ 2 CaCl की रिप्लेसमेंट टुकड़ा स्वास्थ्य में सुधार.
- Sulforhodamine 101 (एसआर-101, 1 माइक्रोन) तीव्र hippocampal स्लाइस में astrocytes की पहचान करने के लिए प्रयोग किया जाता है. 125 NaCl, 2.5 KCl, 0.5 CaCl 2, 6 2 MgCl, 1.25 नाह 2: (मिमी में) के रूप में तैयार एक संशोधित कम कैल्शियम ACSF की 100 मिलीलीटर में 60.67 मिलीग्राम एसआर-101 गिराए एसआर-101 के एक 1 मिमी शेयर बनाओ पीओ 4, 26.0 3 NaHCO, 15 ग्लूकोज, और 1.3 एस्कॉर्बिक एसिड. कम कैल्शियम ACSF की osmolarity ~ 310 mOsm है कि सत्यापित करें. लोड करने के लिए संशोधित कम सीए 2 + ACSF में 1 मिमी एसआर-101 शेयर 1,000 बार पतला. 4 डिग्री सेल्सियस में अंतिम एसआर-101 समाधान स्टोर और प्रयोग के लिए जब तक जरूरत प्रकाश से रक्षा की.
3. एल का हेरफेरतीव्र hippocampal स्लाइस में दरें निशानेबाजी ong शब्द Neuronal
लंबी अवधि के neuronal फायरिंग दरों में हेरफेर करने के लिए अलग प्रयोगों में दो ऊष्मायन एक प्रोटोकॉल का उपयोग:
- Neuronal फायरिंग बाधित: tetrodotoxin (TTX, 1 माइक्रोन) में सेते हैं: चेतावनी: पर्याप्त मात्रा में किया जाता है अगर यह घातक हो सकता है के रूप में देखभाल के साथ TTX संभाल लेना. दस्ताने और काले चश्मे की सिफारिश की है. TTX पूरी तरह से तीव्र स्लाइस में एपी संचालित neuronal फायरिंग समाप्त करता है. 3.5 मिमी कश्मीर + ACSF में स्लाइस सेते हैं, अधिक प्रयोगात्मक हालत में 1 माइक्रोन TTX. नियंत्रण हालत में, TTX बिना 3.5 मिमी कश्मीर + ACSF में स्लाइस सेते हैं. दो स्थितियों के बीच तुलना astrocytic GQ GPCR गतिविधि में ऊपर स्केलिंग के प्रभाव का पता चलता है. TTX उपचार के प्रभाव को अधिकतम करने के लिए (2.5 मिमी कश्मीर + कहने के लिए विरोध के रूप में) 3.5 मिमी कश्मीर + ACSF नियंत्रण शर्त के रूप में कार्य करता है.
- या -
- ऊपर neuronal फायरिंग बढ़ाएँबेसल दरें: उच्च पोटेशियम में सेते: बढ़ती कोशिकी + K एकाग्रता न्यूरॉन्स depolarizes और उनके बेसल फायरिंग दर बढ़ जाती है. 5.0 मिमी कश्मीर + ACSF में ऊष्मायन काफी 2.5 मिमी कश्मीर + ACSF 15 की तुलना में neuronal कार्रवाई संभावित आवृत्ति उठ. प्रयोगात्मक हालत के लिए 5.0 मिमी कश्मीर + ACSF में स्लाइस सेते हैं, और नियंत्रण की स्थिति के लिए, मानक 2.5 मिमी कश्मीर + ACSF में स्लाइस सेते हैं. दो स्थितियों के बीच तुलना astrocytic GQ GPCR गतिविधि में नीचे स्केलिंग प्रभाव का पता चलता है.
4. तीव्र hippocampal टुकड़ा तैयारी
- गर्म वसूली कक्ष की स्थापना:
- 35 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान गर्म, तो अंदर तैयार ऊष्मायन कक्षों जगह है. ऊष्मायन कक्षों (चित्रा 1G) के भीतर ACSF की ऊंचाई तक पानी के साथ नहाने के पानी भरें.
- 95% 2 हे, 5% सी के साथ प्रयोगात्मक और नियंत्रण ACSF आक्सीजनओ 2. microloader कई गुना तंत्र से उत्सर्जित बुलबुले छोटे और भरपूर मात्रा में है लेकिन यह भी कोमल होना चाहिए, कक्ष के भीतर ACSF के किसी भी दृश्य आंदोलन नहीं होना चाहिए.
- ठंडा विच्छेदन कक्ष की स्थापना:
- बर्फ की दो बाल्टी ले लो. बर्फ की एक बाल्टी में बफर करने की क्रिया के लगभग 300 मिलीलीटर की एक बोतल रखें और यह 95% 2 हे, 20 मिनट के लिए 5% सीओ 2 के साथ ऑक्सीजन रखना. सिर्फ बर्फ की सतह के नीचे अन्य बर्फ बाल्टी में एक 100 मिमी पेट्री डिश, डूब. पेट्री डिश की ओर बर्फ के साथ सीधे संपर्क में है सुनिश्चित करें. पेट्री डिश में कुछ टुकड़ा करने की क्रिया बफर डालो और यह रूप में अच्छी तरह से ऑक्सीजन रखना.
- अधिक से अधिक 1 मिनट के लिए पेट्री डिश में बर्फ ठंड टुकड़ा करने की क्रिया बफर में submerging द्वारा एकल बढ़त रेजर ब्लेड की धार शांत रहो.
- Vibratome सेटअप:
- Vibratome पर मुड़ें और जल निकासी बंद हो गया है सुनिश्चित करें.
- VIBRA में काटने कक्ष सुरक्षितटोम और काटने कक्ष के आसपास पैक बर्फ. 0-4 डिग्री सेल्सियस तक यह Precool
- कारखाने के 5 मिनट के लिए 70% EtOH में भिगोने और फिर ddH2O साथ rinsing द्वारा डबल धार रेज़र ब्लेड से greases निकालें. (ब्लेड मोड़ नहीं है) और काटने ब्लॉक पर एक आधा ब्लेड माउंट ध्यान से हिस्सों में काटा.
- माउस मस्तिष्क हटाना:
- एक Kimwipe या कपास गेंद में भिगो 0.5 मिलीलीटर isoflurane के साथ पहले से लोड एक छोटे से कक्ष में एक 12-18 दिन पुरानी C57BL/6J माउस anesthetize. धीरे कोई दर्द पलटा है बनाना जानवर के पैर की उंगलियों चुटकी.
- तेज कैंची की एक जोड़ी का उपयोग माउस सिर काटना, फिर छोटे संदंश का उपयोग खोपड़ी को हटा दें. अनुदैर्ध्य विदर साथ घ्राण बल्ब सेरिबैलम से खोपड़ी में कटौती करने के लिए छोटी हड्डी कैंची का प्रयोग करें. छोटे संदंश का उपयोग कपाल फ्लैप निकालें. धीरे से एक रंग के साथ मस्तिष्क को हटा दें, और पेट्री डिश में ठंडा ऑक्सीजन टुकड़ा करने की क्रिया बफर में डूब.
- Bisecठंडा और oxygenation के लिए अधिक सतह क्षेत्र की अनुमति के लिए पेट्री डिश में ठंडा धार के साथ माउस मस्तिष्क टी. Bisected गोलार्द्धों 2-3 मिनट के लिए बर्फ ठंड टुकड़ा करने की क्रिया बफर में बैठते हैं. मस्तिष्क पूरी तरह शांत और अधिक ठोस हो जाना चाहिए.
- Vibratome के मंच पर cyanoacrylate गोंद की एक पतली परत लागू करें. आगे का सामना करना पड़ घ्राण बल्ब के साथ, मंच कट तरफ नीचे और पार्श्व पक्षों अप करने के लिए दोनों गोलार्द्धों गोंद. काटने कक्ष में मंच सुरक्षित, फिर, बर्फ ठंड के साथ अच्छी तरह से ऑक्सीजन टुकड़ा करने की क्रिया बफर काटने चैम्बर भरें.
- Vibratome का उपयोग 300 माइक्रोन मोटी parasagittal स्लाइस की तैयारी समय काटने कक्ष oxygenating जारी. 85 हर्ट्ज की एक आवृत्ति पर स्लाइस काटें, 0.20 / सेक मिमी, और 1.40 मिमी की एक आयाम के आगे गति. नोट: हम स्वस्थ तीव्र hippocampal स्लाइस की तैयारी में सबसे महत्वपूर्ण चर vibratome की गुणवत्ता है कि मिल गया है. हमारी प्रयोगशाला Leica वीटी 1200 एस चुंबक का उपयोग करता हैआईसी "जेड" कंपन को कम करने के लिए vibrocheck साथ vibratome ड्राइव.
- टुकड़ा करने की क्रिया के बाद, तेज संदंश का उपयोग कर प्रत्येक parasagittal टुकड़ा के बाहर हिप्पोकैम्पस और आसन्न entorhinal प्रांतस्था काटना. Vibratome के काटने के चैम्बर में ठंडा, अच्छी तरह से ऑक्सीजन टुकड़ा करने की क्रिया बफर में इस प्रक्रिया का प्रदर्शन. यह स्लाइस की हैंडलिंग कम से कम के रूप में संदंश के तीखेपन टुकड़ा स्वास्थ्य के लिए बहुत महत्वपूर्ण है.
- एक गिलास पाश्चर पिपेट की लंबी सिरे से टूट गया और एक पिपेट बल्ब के साथ टूटा हुआ हिस्सा टॉपिंग द्वारा एक हस्तांतरण विंदुक बनाओ. इस स्लाइस स्थानांतरित करने के लिए पिपेट की बड़ी अंत का उपयोग सक्षम बनाता है. (सामग्री तालिका देखें) बड़े अंत में कपास प्लग बिना pipettes ऑर्डर करने के लिए सुनिश्चित करें. स्लाइस nonsterile परिस्थितियों में तैयार कर रहे हैं के रूप में एक नया पिपेट तैयार है और एक प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए, हालांकि, यह प्रयोग करने से पहले पिपेट आटोक्लेव के लिए आवश्यक नहीं है.
- 35 डिग्री सेल्सियस पानी में ऊष्मायन कक्ष में प्रत्येक hippocampal टुकड़ा स्थानांतरणस्नान, टुकड़ा धारक के प्रत्येक अच्छी तरह से अंदर ACSF में हस्तांतरण विंदुक सूई और टुकड़ा aspirating द्वारा. इस प्रक्रिया के दौरान टुकड़ा के आंदोलन को कम. धीरे - धीरे तापमान ऊपर "ramping" की तुलना में बेहतर गुणवत्ता स्लाइस में गर्म ऊष्मायन स्नान परिणामों के स्लाइस के सीधे हस्तांतरण.
- Hippocampal स्लाइस के रूप में निम्नानुसार टूट 45 मिनट की कुल के लिए गर्म पानी के स्नान में ठीक करने की अनुमति: बिना (कम कैल्शियम ACSF के लिए उन्हें स्थानांतरित तो, कम कैल्शियम ACSF में पतला 1 माइक्रोन एसआर-101 में 20 मिनट के लिए स्लाइस सेते एसआर-101) 10 मिनट के लिए. इसके बाद गर्म ऊष्मायन के शेष 15 मिनट के लिए नियंत्रित करने के लिए स्लाइस या प्रयोगात्मक ACSF हस्तांतरण.
- 45 मिनट गर्म वसूली के बाद, ध्यान से बेंच शीर्ष करने के लिए 35 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान से ऊष्मायन कक्षों ले जाते हैं, और फिर स्लाइस सांस लोडिंग शुरू होने से पहले 3 घंटे के कुल ऊष्मायन समय के लिए कमरे के तापमान पर सेते करने के लिए जारी करने की अनुमति प्रोटोकॉल (नीचे देखें). 5. सीए 2 + संकेतक के साथ astrocytes की सांस लोड हो रहा है
- तैयारी सीए 2 + सूचक सांस लोडिंग डाई:
- डाई (50 ग्राम) के प्रत्येक शीशी के लिए, ताजा डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) और अच्छी तरह से भंवर के 3.87 μl जोड़ें. DMSO की ताजगी अच्छा लदान के लिए महत्वपूर्ण है और इसलिए, एक ताजा ampule हर समय खुला दरार.
- अच्छी तरह से 20% pluronic एसिड और भंवर के 9 μl में मिलाएं. 10 माइक्रोन का एक अंतिम डाई एकाग्रता के लिए, उचित प्रयोगात्मक या नियंत्रण ACSF और अच्छी तरह से भंवर के 100 μl के साथ डाई मिश्रण.
- एक अपकेंद्रित्र फिल्टर ट्यूब का उपयोग कर समाधान तक. यह कदम डाई का इंजेक्शन दौरान clogging से लोड हो रहा है पिपेट रोकता है.
- डाई समाधान के साथ भरा जब लगभग 1.3 MΩ का प्रतिरोध करने के लिए खींच लिया एक borosilicate ग्लास केशिका से एक विंदुक तैयार करें.
- माइक्रोस्कोप के साथ प्रयोग के लिए बनाया गया एक रिकॉर्डिंग कक्ष में एक hippocampal टुकड़ा रखेंऔर लगातार यह (1.5 मिलीग्राम / मिनट) में incubated था कि एक ही रचना के oxygenated ACSF साथ छिड़कना. नियंत्रण और प्रयोगात्मक शर्तों के बीच वैकल्पिक एक hippocampal टुकड़ा का चयन करते समय.
- अस्वस्थ देख hippocampal स्लाइस त्यागें. स्लाइस की गुणवत्ता भी एक भी प्रयोग के भीतर अलग अलग होंगे. टुकड़ा स्वास्थ्य बढ़ाता के लिए कोई निर्धारित मानदंड हैं, इसलिए टुकड़ा स्वास्थ्य के निर्धारण व्यक्तिपरक और ज्यादातर अनुभव पर आधारित है.
- सामान्यतया, एक चिकनी दिखने सतह और स्वस्थ CA1 पिरामिड कोशिकाओं के एक उच्च प्रतिशत (2A चित्रा) है कि स्लाइस रख. CA1 पिरामिड कोशिकाओं एक टुकड़ा स्वीकार या अस्वीकार करने के लिए एक उपयोगी मापदंड हो सकता है ताकि स्वस्थ CA1 पिरामिड न्यूरॉन्स का एक बड़ा प्रतिशत (≥ 75%) होने, विशेष रूप से संवेदनशील और सीएनएस अपमान की चपेट में हैं.
- लगभग> 25% मृत न्यूरॉन्स है कि स्लाइस त्यागें. मृत न्यूरॉन्स एक तला हुआ अंडा उपस्थिति की तरह (चित्रा 2 बी) है. नोट: हम हाकटौती के कोण न्यूरॉन्स स्वस्थ है या नहीं दिखाई देते हैं कि क्या में एक प्रमुख भूमिका निभाता है देखा है. Neuronal डेन्ड्राइट (टुकड़ा के बाहर) ऊपर की ओर पेश कर रहे हैं, तो न्यूरॉन्स ज्यादातर मर जाएगा. न्यूरॉन मात्रा का इतना बड़ा हिस्सा वृक्ष के समान वृक्ष के भीतर निहित है, क्योंकि इस डेन्ड्राइट विच्छेद कोशिकाओं के लिए घातक है कि संभवतः है. डेन्ड्राइट टुकड़ा सतह से एक नीचे कोण करने के लिए या में समानांतर पेश कर रहे हैं, तो दूसरी ओर, स्वस्थ न्यूरॉन्स की एक उच्च प्रतिशत हो जाएगा. कभी कभी, इसलिए, न्यूरॉन्स ज्यादातर टुकड़ा के एक तरफ मर चुका है और दूसरी तरफ देख स्वस्थ हो जाएगा.
- अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) प्रकाशिकी का उपयोग कर आकार, आकृति विज्ञान, और स्थान के आधार पर 40-70 माइक्रोन टुकड़ा सतह के नीचे एसआर astrocytes के एक उपयुक्त क्षेत्र जानें.
- डाई समाधान के साथ कांच विंदुक लोड और एक मानक पैच दबाना microelectrode holde का उपयोग कर इस क्षेत्र से ऊपर टुकड़ा की सतह के लिए इसे कमआर. टुकड़ा की सतह पर पिपेट के साथ, बाहर खदेड़ना डाई शुरू करने के लिए पिपेट के लिए दबाव वापस लागू होते हैं. डाई के इंजेक्शन डीआईसी प्रकाशिकी और इस तरह एक हरे रंग के लिए एक 488 पंक्ति के रूप में एक उपयुक्त लेजर दोनों के तहत दिखाई जाएगी.
- धीरे धीरे लगभग 40 माइक्रोन एक micromanipulator का उपयोग टुकड़ा सतह के नीचे करने के लिए पिपेट कम और डाई लगभग 45-60 सेकंड के लिए बेदखल करने के लिए अनुमति देते हैं. फिर, पिपेट एक अतिरिक्त 35 माइक्रोन (टुकड़ा सतह के नीचे 75 माइक्रोन) कम है और लगभग 45-60 सेकंड के लिए डाई बाहर निकालें. धीरे धीरे टुकड़ा से पिपेट टिप वापस लेना. अब इंजेक्शन रिकॉर्डिंग का संकेत करने वाली शोर अनुपात कम हो जाती है जो पृष्ठभूमि लोड हो रहा है, बढ़ जाता है जबकि छोटा इंजेक्शन समय, अपर्याप्त डाई लोड हो रहा है में परिणाम की संभावना है.
- Astrocytes की एक बड़ी संख्या डाई को लेने के लिए सुनिश्चित करें कि, यह एक छोटी दूरी पर एक दूसरे डाई सांस में इंजेक्षन करने के लिए आम तौर पर उपयोगी है. वापस टुकड़ा की सतह पर पिपेट उठाएँ, पिपेट भरा हुआ नहीं है कि यह सुनिश्चित कर लें, तो मोपरत radiatum साथ, लगभग 80-100 माइक्रोन दूर पहले इंजेक्शन साइट से पिपेट लिया. इस साइट पर सांस में इंजेक्शन दोहराएँ.
- डाई को लेने के लिए astrocytes के लिए इमेजिंग से पहले और कम करने के लिए पृष्ठभूमि संकेत के लिए 30-45 मिनट की अनुमति दें. इस समय के दौरान छिड़काव कक्ष में टुकड़ा छोड़ दें. इस ऊष्मायन समय प्रयोग की कुल 4 घंटा उपचार में बनाया गया है सुनिश्चित करें. अगले टुकड़ा और दोहराने 5.2-5.8 कदमों प्राप्त करते हैं.
- इमेजिंग के लिए confocal खुर्दबीन स्थापना:
- उच्च जोखिम विरंजन और / या phototoxicity डाई करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं के रूप में लेजर प्रकाश को टुकड़ा जोखिम को सीमित करने, अत्यंत महत्व का है. उच्च ऑप्टिकल बढ़ाई या एक बढ़ा ज़ूम सेटिंग का उपयोग imaged क्षेत्र को प्रकाश जोखिम बढ़ जाता है. इसलिए, एक उच्च photomultiplier settin के लिए प्रत्येक लेजर के लिए डिफ़ॉल्ट मान सेटजी, 1x लाभ और 0.5% लेजर उत्पादन शक्ति.
- Astrocyte प्रक्रियाओं का बेहतर दृश्य के लिए एक 1.5x ज़ूम लागू करें.
- क्षेत्र संकल्प 512 x 512 पिक्सल पर सेट करें.
- ~ एक तरह से स्कैन मोड का उपयोग कर स्कैन प्रति 1.2 सेकंड है, जो तेजी से संभव करने के लिए स्कैन गति सेट करें.
- 488 एनएम लेजर के लिए 503-548 एनएम, और 559 एनएम लेजर के लिए 624-724 एनएम की bandpass फिल्टर का उपयोग उत्सर्जन स्पेक्ट्रा लीजिए. ये सेटिंग्स astrocyte सेल निकायों और मुख्य प्रक्रियाओं का पालन करने के लिए पर्याप्त एक प्रस्ताव पर एक अपेक्षाकृत तीव्र गति से ~ 5-8 astrocytes के एक क्षेत्र की इमेजिंग अनुमति देते हैं. आदर्श रूप में, क्षेत्र में astrocytes स्पष्ट रूप से देखा जा करने के लिए काफी उज्ज्वल है, लेकिन किसी भी पिक्सेल संतृप्ति के बिना किया जाएगा.
- + 559 एनएम लेजर का उपयोग एसआर-101 colabeling visualizing द्वारा astrocytes के रूप में डाई 2 सीए के साथ भरी हुई कोशिकाओं की पहचान की पुष्टि.
- रिकॉर्डिंग astrocyte सीए 2 + गतिविधि:
- हित के क्षेत्रों पर छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर (आरओ का उपयोग कर बक्से ड्राAstrocyte सेल शरीर पर इस मामले में, सेल के अंदर) है. बक्से संभव सबसे अच्छा संकेत करने वाली शोर अनुपात को प्राप्त करने के लिए, पृष्ठभूमि पिक्सल शामिल नहीं होना चाहिए. संदर्भ के रूप में की पृष्ठभूमि पर एक बॉक्स बनाएँ.
- प्रयोग के शेष के माध्यम से प्रायोगिक ACSF प्लस 1 माइक्रोन TTX (Abcam) के लिए छिड़काव स्विच. यह किसी भी संभव neuronal एपी संचालित astrocyte कैल्शियम प्रतिक्रियाओं समाप्त. Astrocytic सीए 2 + एकाग्रता में शेष बढ़ जाती है तो कारण quantal vesicular रिहाई, विधान (बेसल) GPCR गतिविधि, या दोनों तंत्र के कुछ संयोजन के लिए किया जाएगा.
- सभी ROIs से समय के साथ रिकार्ड प्रतिदीप्ति. आधारभूत अधिक प्रतिदीप्ति में किसी भी बढ़ जाती cytoplasmic सीए 2 + एकाग्रता 16 में वृद्धि से संकेत मिलता है, और astrocytes 10, 17, 18 में इसलिए GPCR गतिविधि. TTX द्वारा astrocytic रिसेप्टर्स पर किसी भी संभव जल्दी स्केलिंग प्रभाव से बचने के लिए, 40 मिनट fr भीतर पूरा प्रयोगोंओम समय 1 माइक्रोन TTX छिड़काव शुरू किया.
- सहज सीए 2 + गतिविधि के आधारभूत रिकॉर्डिंग के 10 मिनट प्राप्त करने के बाद, क्रमिक रूप से बढ़ रही है सांद्रता में (जैसे DHPG के रूप में) ब्याज की एक agonist लागू होते हैं. संभव रिसेप्टर desensitization को कम करने के लिए आवेदन के बीच 5 मिनट की एक न्यूनतम छोड़ दें.
- रिकॉर्डिंग के अंत में बरकरार astrocytic GQ GPCR संकेत दे रास्ते के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में अन्य astrocytic GQ GPCRs के लिए agonists के एक कॉकटेल लागू होते हैं. एगोनिस्ट कॉकटेल के घटक ब्याज की रिसेप्टर पर निर्भर करेगा. GQ GPCR में से प्रत्येक के 10 माइक्रोन [H1R], मुस्कारिनिक acetylcholine रिसेप्टर्स [mAchR], और purinergic रिसेप्टर्स [P2YR], क्रमशः, आमतौर पर इस्तेमाल किया एगोनिस्ट कॉकटेल है हिस्टामाइन एच 1 रिसेप्टर्स प्रोत्साहित हिस्टामाइन, carbachol, और 2NA-एटीपी agonists.
- बाद के प्रयोग छवि अधिग्रहण:
- सीए 2 + रिकॉर्डिंग के पूरा होने पर, 488 एनएम और 559 एनएम लेज़रों, च के साथ अभी भी चित्र लेया astrocyte पहचान और रॉय नियुक्ति के बाद पुष्टि. (2A चित्रा) डेटा को प्रभावित लेजर प्रकाश की तीव्रता के बारे में एक चिंता का विषय नहीं रह गया है के रूप में लेजर शक्ति और एचवी सेटिंग्स, colocalization के लिए एक इष्टतम छवि प्राप्त करने के लिए इस बिंदु पर स्वतंत्र रूप से बदला जा सकता है.
- दोहराएँ लगभग 8 स्लाइस और / समूह 40 astrocytes की कुल के लिए 6.1-6.3 कदम. स्लाइस 3 अलग चूहों की एक न्यूनतम से आना चाहिए.
- एक सीए 2 + ऊंचाई परिभाषित: 2 + यात्रियों सीए को परिभाषित करने में मानकीकरण मजबूती से वैज्ञानिक समुदाय के भीतर स्थापित नहीं किया गया है. इसके बाद आधारभूत शोर से बाहर झूठी सकारात्मक घटनाओं का पता लगाने के सीमित करते हुए संवेदनशीलता बढ़ाने वाला ठेठ प्रोटोकॉल है.
- एक और प्रयोगशाला सदस्य आँख बंद करके उनका विश्लेषण करने के क्रम में प्रत्येक टुकड़ा एक अंकीय कोड आवंटित किया है. विश्लेषण के समापन पर, प्रत्येक टुकड़ा समझाना.
- ऑफ़लाइन इमेजिंग विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर सहज और पैदा astrocyte सीए 2 + उन्नयन का विश्लेषण करें. पुनर्लेखन और / या आकार, आकृति और वांछित के रूप में ROIs के स्थान को समायोजित.
- एक सीए 2 + ऊंचाई के रूप में आधारभूत अधिक प्रतिदीप्ति तीव्रता में स्कोर बढ़ता शिखर आयाम में कम से कम दो लगातार नमूना अंक के लिए औसत आधारभूत प्रतिदीप्ति के 30 सेकंड का मतलब ऊपर दो मानक विचलन (एसडी) से अधिक है. विशेष रूप से शोर रिकॉर्डिंग में (संकेत करने वाली शोर कम), इस मापदंड मतलब आधारभूत प्रतिदीप्ति ऊपर 3 एसडी को समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है. प्रतिदीप्ति तीव्रता मतलब ऊपर एक मानक विचलन से अधिक से पहले पिछले डेटा बिंदु के रूप में प्रत्येक सीए 2 + ऊंचाई की शुरुआत परिभाषित करें.
- Multipeak बनाम लगातार एकल शिखर घटनाओं के बीच अंतर. प्रतिदीप्ति तीव्रता और स्थान (औसत आधारभूत मूल्य 2 एसडी नीचे) आधारभूत को वापस नहीं करता है जब "multipeak" के रूप में एक घटना स्कोर# 8804; चोटियों के बीच 9 लगातार डेटा अंक (10.8 सेकंड). इस प्रकार, एक चोटी की घटनाओं के बीच उन्हें 10 या अधिक लगातार आधारभूत डेटा बिंदु होगा.
- प्रतिदीप्ति तीव्रता कम से कम 3.6 सेकंड के लिए शिखर आयाम (शिखर मूल्य की ± 10%) का कहना है कि जब "पठार" प्रकार की प्रतिक्रियाएं रूप में की घटनाओं को वर्गीकृत.
- सहज और एगोनिस्ट पैदा कैल्शियम यात्रियों के आयाम, आवृत्ति, और कैनेटीक्स का विश्लेषण करें.
- ("Multipeak" प्रतिक्रियाओं के मामलों में पहली शिखर उपयोग, चित्रा 2B देखें) उच्चतम तीव्रता मूल्य के साथ डेटा बिंदु के रूप में सीए 2 + ऊंचाई के शिखर आयाम को परिभाषित.
- शिखर आयाम को इसी प्रतिक्रिया शुरुआत और समय के बीच अंतर के रूप में वृद्धि समय की गणना. नोट: 0 से 100% वृद्धि समय एक समय मूल्य प्राप्त करने के लिए डेटा बिंदुओं की एक पर्याप्त संख्या के क्रम में इस्तेमाल किया जा करना पड़ सकता है, गति यहाँ एक महत्वपूर्ण चर रहा है स्कैन.
- समय के रूप में विलंबता की गणनाप्रतिक्रिया शुरुआत करने एगोनिस्ट छिड़काव की दीक्षा के बीच. समय के रूप में लंबे धोने में बार प्रतिक्रिया सुप्तावस्था की गणना में एक उलझाना बनाने, मस्तिष्क स्लाइसें में एक अधिक उपयोगी उपाय हो सकता है उठो.
- छात्र स्वतंत्र टी परीक्षण का उपयोग कर प्रत्येक पैरामीटर के लिए दो समूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर सांख्यिकीय वहाँ रहे हैं यह जानने. 'एन' के रूप में astrocytes की संख्या का प्रयोग करें. नियंत्रण और उपचार समूहों के बीच सीए 2 + गतिविधि के पैटर्न की तुलना करने के लिए पियर्सन की ची के वर्ग परीक्षण का उपयोग करें. नियंत्रण और उपचार समूहों के बीच विशिष्ट सीए 2 + गतिविधि पैटर्न के प्रतिशत की तुलना करने फिशर सटीक 2 पूंछ परीक्षण का उपयोग करें. * पी <0.05, ** पी <0.01 के रूप में मतभेद एक्सप्रेस, और *** 0.001 <पी.
6. Hippocampal स्लाइस में रिकॉर्डिंग सहज और GQ GPCR Agonist पैदा astrocytic सीए 2 + गतिविधि
7. Astrocyte सीए 2 + गतिविधि का विश्लेषण
Representative Results
चित्रा 3 में प्रतिनिधि परिणाम एसआर astrocyte सीए 2 + गतिविधि पर 4-6 घंटे के लिए TTX में तीव्र माउस hippocampal स्लाइस की ऊष्मायन के प्रभाव दिखाते हैं. डाटा ACSF प्लस TTX बनाम नियंत्रण ACSF में incubated स्लाइस से सहज सीए 2 + यात्रियों और DHPG पैदा समूह मैं mGluR सीए 2 + प्रतिक्रियाओं, दोनों शामिल हैं. बुनियादी विशेषता रूपात्मक सुविधाओं, तारामय प्रक्रिया विधानसभा और छोटे सोमा आकार (~ 10 माइक्रोन) के अलावा, astrocytes चयनात्मक astrocyte मार्कर एसआर-101 19, 20 (साथ सीए 2 + सूचक OGB-1 बजे के ओवरले द्वारा SR में पहचाने जाते हैं चित्रा 3). astrocyte सेल शरीर पर गिने बक्से चित्रा 3 बी में दिखाया समय निशान के ऊपर गिने प्रतिदीप्ति के अनुरूप हैं. समूह 1 mGluR एगोनिस्ट (राज्यसभा)-3.5-DHPG astrocytes में समूह 1 mGluRs पर विशिष्ट स्केलिंग प्रभाव का निर्धारण करने के लिए लागू किया जाता है. मानसिक बीच भेदभावअन्य GQ GPCRs बनाम समूह 1 mGluRs के लिए स्केलिंग प्रभाव की विशिष्टता में iology, agonists के एक कॉकटेल प्रत्येक प्रयोग के अंत में लागू किया जाता है. यहाँ हम हिस्टामाइन, carbamylcholine क्लोराइड (carbachol) और adenosine 5'-एटीपी disodium (ना एटीपी) agonists 10 माइक्रोन GQ GPCR के प्रत्येक इस्तेमाल किया. एगोनिस्ट कॉकटेल भी उन विशेष astrocytes DHPG के लिए एक प्रतिक्रिया प्रकाश में लाना रिसेप्टर के लिए पर्याप्त मात्रा में व्यक्त नहीं करते, शायद क्योंकि कोशिकाओं DHPG का जवाब नहीं है जहां मामलों में व्यवहार्य, उत्तरदायी astrocytes की पहचान करने के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है.
हम astrocytic समूह मैं mGluRs में परिवर्तन खुलासा करने में सहायता करने के लिए 5 माइक्रोन और 15 माइक्रोन (3B चित्रा) के साथ ही 30 माइक्रोन और 50 माइक्रोन (चित्रा -4 ए) सहित DHPG के विभिन्न सांद्रता का उपयोग किया था. सेलुलर सीए 2 + प्रतिक्रियाओं और GQ GPCR अभिव्यक्ति के स्तर के बीच संबंध विट्रो 21-24 में पहले से जांच की गई है. सबसे पहले,एक विशेष agonist एकाग्रता के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए सीमा प्रत्येक सेल द्वारा व्यक्त रिसेप्टर्स के घनत्व पर निर्भर करता है. कोशिकाओं की आबादी में अधिक कोशिकाओं कोशिकाओं रिसेप्टर्स की उच्च घनत्व के साथ ट्रांसफ़ेक्ट हैं जब एगोनिस्ट की दी एकाग्रता के लिए एक सीए 2 + ऊंचाई के साथ जवाब. TTX में स्लाइस incubating के बाद, जनसंख्या में astrocytes का प्रतिशत एगोनिस्ट बढ़ जाती है की एक निश्चित एकाग्रता (आंकड़े 3B और 3 सी) का जवाब. हम 30 और 50 माइक्रोन DHPG 5.0 मिमी कश्मीर + नियंत्रण बनाम इलाज में समूह मैं mGluR प्रतिक्रियाओं की तुलना करने के लिए आवश्यक हैं, जबकि 5 माइक्रोन और 15 माइक्रोन DHPG, नियंत्रण और TTX इलाज कोशिकाओं के बीच उत्तरदायी astrocytes के प्रतिशत में स्पष्ट मतभेद प्रकट पाया है कि कोशिकाओं (चित्रा -4 ए).
astrocytic सीए 2 + प्रतिक्रिया पैटर्न और agonist एकाग्रता के बीच संबंधों को भी बगल में जांच की गई है. एगोनिस्ट बढ़ाने सेएकाग्रता एक चोटी सीए 2 + उन्नयन 2 + उन्नयन 25-27 सीए multipeak और पठार से astrocytes में सीए 2 + प्रतिक्रिया के पैटर्न में बदलाव. इन पिछले निष्कर्षों के आधार पर हमने रिसेप्टर अभिव्यक्ति के स्तर में परिवर्तन कर रहे हैं अगर एगोनिस्ट की एक भी एकाग्रता के जवाब पैटर्न में बदलाव होगा कि भविष्यवाणी की. इस प्रकार, दो स्केलिंग तरीकों की जो (neuronal फायरिंग बाधा या इसे बढ़ाने) का उपयोग किया जा रहा है पर निर्भर करता है, एक विशेष प्रतिक्रिया पैटर्न का उत्पादन करने के लिए आवश्यक एगोनिस्ट की एकाग्रता में वृद्धि या कमी होगी. उदाहरण के लिए, TTX में incubated astrocytes अधिक पठार प्रकार सीए 2 + उन्नयन के लिए उनके DHPG पैदा सीए 2 + प्रतिक्रिया स्वरूप पारी और astrocytes (चित्रा -3 सी) पर नियंत्रण की तुलना एगोनिस्ट सांद्रता कम करने के लिए जवाब है. खाते में पहले के अध्ययनों में ले रहा है, इन टिप्पणियों समूह astrocytes में मैं mGluR रिसेप्टर अभिव्यक्ति के स्तर बढ़ गया है कि सुझाव है.
सीए 2 + उन्नयन के समय और शुरुआत (विलंबता) वृद्धि सीधे संवर्धित कोशिकाओं 22-24 में GQ GPCR अभिव्यक्ति के स्तर में परिवर्तन करने के लिए सहसंबंधी दिखाया गया है. रिसेप्टर घनत्व में कमी विपरीत प्रभाव पैदा करता है, जबकि उच्च रिसेप्टर अभिव्यक्ति के स्तर कम प्रतिक्रिया सुप्तावस्था और तेजी से वृद्धि के दिनों में परिणाम. TTX, CA में incubated astrocytes के लिए DHPG के आवेदन के द्वारा पैदा की 2 + यात्रियों नियंत्रण ACSF (चित्रा 3 डी) में incubated astrocytes की तुलना में काफी तेजी से वृद्धि समय है. एगोनिस्ट पैदा सीए 2 + प्रतिक्रियाओं के रूप में पहले उल्लेख किया है, आयाम की परवाह किए बिना agonist एकाग्रता या स्केलिंग मॉडल 15 (चित्रा 3 डी) के अपरिवर्तित ही रहेंगे.
सीधे समूह सक्रिय द्वारा मनाया परिवर्तन करने के अलावा मैं DHPG साथ mGluRs, सहज astrocyte सीए 2 + गतिविधि भी महत्वपूर्ण इस जोड़ - तोड़ से प्रभावित है. हम निरीक्षणनियंत्रण बनाम TTX में incubated अनायास सक्रिय astrocytes के प्रतिशत में दा 2.26 गुना वृद्धि हुई है. इस astrocytes (चित्रा 3E) incubated TTX में 42.1% की सोमा में सहज गतिविधि का प्रदर्शन नियंत्रण astrocytes के केवल 12.9% से वृद्धि हुई है. यह जाना जाता है कि क्योंकि एगोनिस्ट 21, 26, 28 का अभाव, और रिसेप्टर अभिव्यक्ति के स्तर में वृद्धि के साथ यह आंतरिक गतिविधि का स्तर बढ़ता है, ये आंकड़े बताते हैं कि में GPCRs प्रदर्शनी "आंतरिक" या विधान गतिविधि कि astrocytic GQ GPCRs का बढ़ता घनत्व neuronal कार्रवाई संभावित फायरिंग में दीर्घकालिक कमी के बाद. एगोनिस्ट पैदा प्रतिक्रियाओं के लिए इसी प्रकार, सहज सीए 2 + उन्नयन की वृद्धि बार भी (चित्रा 3E) बढ़ रहे हैं.
दूसरा प्रोटोकॉल, ऊंचा कोशिकी पोटेशियम (5.0 मिमी) में ऊष्मायन का उपयोग प्रतिनिधि डेटा, फाई में दिखाया गया हैgure 4. कोशिकी कश्मीर में + बेसल सीए 3 न्यूरॉन कार्रवाई संभावित आवृत्ति 15 में एक उल्लेखनीय वृद्धि में 2.5-5.0 मिमी परिणामों से वृद्धि हुई है. DHPG (30 माइक्रोन और 50 माइक्रोन) के उच्च सांद्रता उच्च पोटेशियम (आंकड़े -4 ए और 4 बी) में incubated astrocytes से समूह मैं mGluR सीए 2 + प्रतिक्रियाओं का आह्वान करने के लिए आवश्यक हैं. इस neuronal कार्रवाई क्षमता में एक लंबे समय तक वृद्धि निम्नलिखित astrocytes में समूह मैं mGluR जवाबदेही का एक कम स्तर के अनुरूप है. इसके अलावा, DHPG की एक निश्चित एकाग्रता के लिए पैदा की प्रतिक्रिया स्वरूप कमजोर एकल शिखर प्रतिक्रियाओं (चित्रा 4 बी) को पठार की तरह प्रतिक्रियाओं से पाली. दो पोटेशियम की स्थिति में अनायास सक्रिय astrocytes के प्रतिशत की जांच उच्च + K में incubated कम astrocytes नियंत्रण हालत (चित्रा 4C) की तुलना में अनायास सक्रिय हैं कि पता चलता है. इस आशय opposit में हैसहज सीए 2 + उन्नयन प्रदर्शन astrocytes के प्रतिशत में वृद्धि हुई है, जिसमें TTX हालत के ई दिशा. अंतिम, दोनों पैदा की और सहज सीए 2 + उन्नयन नियंत्रण हालत (आंकड़े 4C और 4D) बनाम उच्च + K में incubated astrocytes में धीमी वृद्धि समय है. कुल मिलाकर इन आंकड़ों astrocytic GQ GPCR अभिव्यक्ति के स्तर bidirectionally एक विस्तारित समय अवधि में neuronal कार्रवाई संभावित गतिविधि के स्तर पर निर्भर करता है कि पैमाने पर सुझाव देते हैं.
चित्रा 1. स्लाइस ऊष्मायन चैम्बर निर्माण और स्थापित. (ए) ने अपने हवाई तंग ढक्कन के साथ एक Brinkmann पिपेट भंडारण कंटेनर की दराज भाग टुकड़ा ऊष्मायन कक्ष के निर्माण के लिए प्रयोग किया जाता है. (बी) डीऊपर से में कंटेनर लगभग 1 ¼ के पक्ष में नाला एक छेद और ¼ में पक्ष से. लचीला टयूबिंग की एक टुकड़ा में फिट बैठते हैं. (सी) लचीला टयूबिंग के अंदर समाप्त करने के लिए microloader कई गुना तंत्र से कनेक्ट करें. नोट कटौती से फिट प्राकृतिक 200 μl विंदुक टिप (सफेद तीर). (डी) छह से 20 μl Eppendorf microloaders कट से फिट हैं एक एक से छह लाइन कई गुना करने के लिए एक microloader कई गुना तंत्र बनाने के लिए. (ई) ढक्कन पर दो छोटे छेद ड्रिल. (एफ) टुकड़ा धारक बनाने के लिए एक अस्थायी बुलबुला रैक. (जी) नायलॉन जाल सामग्री का एक टुकड़ा नीचे से चिपके जा सकता है कि इतने चल बुलबुला रैक के नीचे "पैर" को हटा रहे हैं. (एच) ACSF की पर्याप्त राशि के साथ ऊष्मायन चैम्बर भरें टुकड़ा धारक मंगाई हैं. Microloaders के सुझावों चैम्बर मंजिल के एक कोने में आराम कर सकते हैं तो टयूबिंग लंबाई समायोजित करें. में ऊष्मायन चैम्बर रखकर जबपानी के स्नान, स्नान में जल स्तर कक्ष में ACSF रूप में एक ही स्तर पर होना चाहिए. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 2. टुकड़ा स्वास्थ्य का आकलन. (ए) अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) प्रकाशिकी का उपयोग कर एक स्वस्थ दिखने hippocampal टुकड़ा. स्वस्थ स्लाइस एक चिकनी, मख़मली उपस्थिति और स्वस्थ CA1 पिरामिड न्यूरॉन्स की एक उच्च प्रतिशत है. परत radiatum में पेश एपिकल डेन्ड्राइट नोट. यहाँ दिखाया गया है उन लोगों की तरह लग रही है कि न्यूरॉन्स के पैच दबाना कुछ सहज कार्रवाई क्षमता के साथ मानक 2.5 मिमी कश्मीर + ACSF में एक कम आराम झिल्ली क्षमता (-61 -62 के लिए एम वी) प्रकट करते हैं. झिल्ली क्षमता और फायरिंग दरें पूर्व के एक समारोह के रूप में अलग अलग होंगेtracellular + K (झी एट अल. 15). तीर ख्यात astrocytes को इंगित करें. लघुरूप: एसआर, परत radiatum; s.py., परत pyramidale. स्केल बार, 10 माइक्रोन. (बी) के अस्वस्थ स्लाइस तले हुए अंडे (सफेद तीर मृत न्यूरॉन्स के नाभिक को इंगित - तला हुआ अंडा की "जर्दी") की भूमिका है जो मृत CA1 पिरामिड न्यूरॉन्स की एक उच्च प्रतिशत, होगा. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 3. GQ GPCR गतिविधि प्रवर्धित और TTX में ऊष्मायन द्वारा neuronal APs की लंबी अवधि के निषेध के बाद पैदा समूह मैं mGluR सीए 2 + प्रतिक्रियाओं रिकॉर्डिंग. (ए) रिकॉर्डिंग क्षेत्र में कोशिकाओं के प्रतिनिधि छवियों सी में incubatedontrol ओरेगन ग्रीन BAPTA-01:00 सीए 2 + सूचक डाई (बाएं पैनल) और एसआर-101 (मध्यम पैनल) ले लिया है कि स्थितियां (ऊपरी पैनल) या TTX (कम पैनल) में. स्केल बार 10 माइक्रोन है. दोनों संकेतों के ओवरले ("मर्ज") सीए 2 + सूचक के साथ कि astrocytes लोड इंगित करता है. बक्से astrocytes में सीए 2 + गतिविधि पर नजर रखने के लिए ग्रीन चैनल में समय के साथ प्रतिदीप्ति तीव्रता रिकॉर्ड करने के लिए व्यक्तिगत astrocyte सोमा पर तैयार कर रहे हैं. Astrocytes में सीए 2 + गतिविधि का एक में रिकॉर्डिंग बक्से से (बी) नमूना निशान). प्रतिक्रिया के पैटर्न में परिवर्तन के सबूत के रूप TTX शो में incubated astrocytes सहज गतिविधि में वृद्धि हुई और अधिक मजबूत हुई समूह मैं mGluR सीए 2 + हिमायती हैं. एकल शिखर (चक्र), multipeak (आयत), और पठार (डॉटेड आयत) के उदाहरण सीए 2 + यात्रियों दिखाए जाते हैं. प्रतिक्रिया पैटर्न में (सी) परिवर्तन अलग concent का उपयोग विशेष रूप से स्पष्ट कर रहे हैंसमूह मैं mGluR एगोनिस्ट DHPG का राशन. अधिक multipeak और पठार प्रतिक्रियाओं एक दिया agonist एकाग्रता पर नियंत्रण की तुलना में TTX में ऊष्मायन के बाद स्पष्ट कर रहे हैं. आयाम (कम पैनल) को बदल नहीं है, जबकि (डी) "सभी या कोई नहीं" प्रतिक्रिया आयाम का संकेत, नियंत्रण (ऊपरी पैनल) की तुलना में TTX में incubated astrocytes में तेजी DHPG पैदा सीए 2 + प्रतिक्रियाओं का समय है उठो एक बार प्रतिक्रिया करने की दहलीज पर पहुंच गया है. (ई) सहज astrocyte के समय उदय सीए 2 + यात्रियों आबादी में astrocytes का प्रतिशत सहज GQ GPCR सीए 2 + गतिविधि बढ़ जाती है (कम पैनल) का प्रदर्शन करते हुए, astrocytes (ऊपरी पैनल) incubated भी तेजी TTX में नियंत्रण बनाम incubated हैं. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 4. ऊंचा कोशिकी पोटेशियम में ऊष्मायन द्वारा neuronal ए पी एस में लंबे समय तक वृद्धि निम्नलिखित रिकॉर्डिंग कम astrocytic GQ GPCR गतिविधि और पैदा समूह मैं mGluR सीए 2 + हिमायती हैं. (ए) 5.0 मिमी कश्मीर + ACSF में incubated स्लाइस से astrocyte सीए 2 + रिकॉर्डिंग के प्रतिनिधि निशान न्यूरॉन्स बिगाड़ना और ACSF (2.5 मिमी कश्मीर + ACSF) पर नियंत्रण की तुलना उनके बेसल फायरिंग दर को बढ़ाने के लिए. 5.0 मिमी कश्मीर + ACSF प्रदर्शनी कम सहज दैहिक सीए 2 + यात्रियों और कमजोर DHPG साथ incubated astrocytes नियंत्रण ACSF में incubated astrocytes की तुलना में पैदा प्रतिक्रियाएँ. (बी) DHPG के कई सांद्रता के लिए पैदा प्रतिक्रियाओं के पैटर्न की तुलना neuronal ए पी एस में लंबे समय तक वृद्धि के बाद कमजोर प्रतिक्रिया प्रकार का पता चलता है. पुलिस में astrocytes के प्रतिशत में (ग) एक कमीसहज गतिविधि की वृद्धि धीमी बार (कम पैनल) बन जबकि सहज सीए 2 + गतिविधि का प्रदर्शन pulation, ऊंचा कश्मीर में लंबी अवधि के ऊष्मायन के बाद मनाया + ACSF (ऊपरी पैनल) को नियंत्रित करने के लिए तुलना में है. (डी) DHPG के विभिन्न सांद्रता में पैदा astrocyte के समय सीए 2 + प्रतिक्रियाओं उठो नियंत्रण ACSF में incubated astrocytes की तुलना में 5.0 मिमी + K इलाज के बाद धीमी हो गई है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
Discussion
वर्णित स्केलिंग मॉडल astrocytic समूह मैं mGluRs की लंबी अवधि के plasticity शोध के लिए व्यावहारिक तरीकों का प्रतिनिधित्व करते हैं. इमेजिंग सहज और पैदा सीए 2 + घटनाओं, ठोस सबूत astrocyte सीए 2 + उन्नयन GQ GPCR सक्रियण 10 के बहाव आईपी 3 आर संवेदनशील दुकानों से रिहाई के बाद होती है कि स्थापित किया गया है, के रूप में astrocytic GQ GPCR गतिविधि में परिवर्तन को मापने के लिए एक संवेदनशील परख प्रदान करता है 12, 17, 18. जनसंख्या में astrocytes का प्रतिशत समूह मैं mGluR एगोनिस्ट और ऐसे सीए 2 + प्रतिक्रियाओं के पैटर्न का जवाब देने astrocytes द्वारा समूह मैं mGluRs में परिवर्तन रिपोर्ट.
सीए 2 + सूचक के साथ astrocytes लोड करने के लिए प्रयोग किया जाता विशिष्ट तकनीक astrocytic GQ GPCR गतिविधि में परिवर्तन देखने के लिए प्रयोगों के डिजाइन में एक महत्वपूर्ण विचार है. सांस में लोडिंग या थोक लोड कई astrocytes, या पीव्यक्तिगत astrocytes के ATCH दबाना लोड हो रहा है astrocytes में छवि सीए 2 + यात्रियों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रत्येक दृष्टिकोण कुछ फायदे और नुकसान प्रदान करता है. सीधे पैच दबाना के माध्यम से सीए 2 + सूचक के साथ astrocytes भरने ऐसे एसआर-101 के रूप में एक माध्यमिक मार्कर के लिए आवश्यकता के बिना एक astrocyte के रूप में सेल की स्पष्ट पहचान देता है. सूचक का पैच दबाना वितरण भी कोशिकाओं को स्वस्थ हैं जहां टुकड़ा में और synapses (उपलब्ध लेजर शक्ति पर निर्भर करता है) के साथ और अधिक बरकरार बातचीत के साथ संभावित गहरी जंगली ठीक प्रक्रियाओं, सहित छोटे astrocytic डिब्बों से सीए 2 + गतिविधि की रिकॉर्डिंग में सक्षम बनाता है. डेटा एक बार में एक कक्ष एकत्र कर रहे हैं लेकिन, जैसा कि पैच दबाना लोडिंग कम throughput से ग्रस्त है. थोक लोड हो रहा है, इसके विपरीत, astrocytes की एक बड़ी संख्या में सीए 2 + सूचक के साथ भरी हुई है और एक साथ imaged किया जा अनुमति देता है. हालांकि, केवल astrocytes सतह के पास टुकड़ा (<20 माइक्रोन) जुड़े चिंता के साथ, लोड कर रहे हैंसेल स्वास्थ्य और बरकरार synapses के बारे में है.
यहाँ प्रस्तुत backpressure सांस लोडिंग प्रोटोकॉल अपेक्षाकृत उच्च throughput और टुकड़ा (40-75 माइक्रोन) के भीतर गहरी सीए 2 + गतिविधि पर नजर रखने की क्षमता के साथ, एक बीच का रास्ता प्रदान करता है. सांस में लोडिंग तकनीक का उपयोग कर अनायास सक्रिय astrocytes के प्रतिशत में एक उल्लेखनीय वृद्धि neuronal synapses और astrocytic प्रक्रियाओं के बीच कनेक्शन 15 अधिक पूरा कर रहे हैं, सुझाव है कि थोक लोडिंग की तुलना में मनाया जाता है. अच्छा लदान के साथ, एक बार 2 photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग astrocytes (नहीं दिखाया डेटा) या संभवतः भी छोटे डिब्बों की मुख्य प्रक्रियाओं में सीए 2 + गतिविधि की निगरानी कर सकते. हालाँकि, ध्यान सीमाओं अविशिष्ट पृष्ठभूमि धुंधला में मिश्रण के रूप में, एक विशेष astrocyte के लिए छोटे प्रक्रियाओं बताए में प्रयोग करने की आवश्यकता होगी. थोक लोडिंग या सांस लोडिंग प्रक्रियाओं के उपयोग के साथ एक अतिरिक्त चिंता एक माध्यमिक मार्च के लिए की जरूरत हैastrocyte पहचान के लिए केर. यह astrocytes preferentially सीए 2 + संकेतक AM एस्टर ऊपर ले कि कई वर्षों के लिए जाना जाता रहा है, वहीं माध्यमिक मार्कर एसआर-101 अक्सर astrocytes के रूप में भरी हुई कोशिकाओं को सत्यापित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. एसआर-101 अपने आप में न्यूरॉन्स 29 की आंतरिक excitability बदल सकता है. एसआर-101 का प्रयोग neuronal excitability पर संभव एसआर-101 प्रभाव को सीमित करने के लिए TTX में सभी astrocyte सीए 2 + माप प्रदर्शन करने की जरूरत की पुष्टि होती है. नियंत्रण और प्रयोगात्मक समूहों दोनों एसआर-101 में शामिल मानते हुए कि, अपने आप में मार्कर neuronal कार्रवाई क्षमता के लंबी अवधि के हेरफेर निम्नलिखित astrocyte सीए 2 + संकेतन में मनाया प्रभाव के लिए खाते में नहीं होना चाहिए. यह 2.5 मिमी कश्मीर + बनाम के बीच अंतर कम हो सकता है के रूप में एसआर-101, तथापि, उच्च + K प्रयोगों में एक चिंता का विषय हो सकता है 5.0 मिमी कश्मीर + बेसल फायरिंग दर आनुपातिक रूप से परिवर्तित नहीं है.
सीए 2 + वितरित करने के लिए एक बहुत ही होनहार दृष्टिकोण 2 + रंगों का उपयोग कर अधिक परंपरागत तरीकों के लिए एक आकर्षक विकल्प प्रदान करता है जो हाल ही में उभरा है. उल्लेखनीय प्रगति astrocytes 30-32 के लिए लक्षित आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम संकेतक (GECIs) के साथ पिछले कुछ वर्षों में किया गया है. GECIs ऐसे हिप्पोकैम्पस के रूप में ब्याज की एक मस्तिष्क क्षेत्र में एडिनो से जुड़े वायरल वैक्टर के vivo microinjection द्वारा astrocytes के लिए दिया जा सकता है. GECIs की अभिव्यक्ति वायरल संक्रमण 32 निम्नलिखित लगभग दो सप्ताह के बाद हासिल की है. Astrocytes में GECIs के उपयोग द्वारा प्रस्तुत कई फायदे हैं. सबसे पहले, वैक्टर एक astrocyte विशिष्ट प्रमोटर का उपयोग astrocytes को निशाना बनाया, तो लेबल कोशिकाओं astrocytes 32 हैं. दूसरा, संकेत करने वाली शोर अब लेकिन सेल 32 पर एक पैच विंदुक था होने के invasiveness के बिना, डाई का पैच दबाना वितरण का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है क्या करने के लिए तुलनीय है. तीसरा, संकेतक डेल हो सकता हैivered और थोक लदान प्रसव के तरीके का उपयोग समस्याग्रस्त है जो वयस्क ऊतकों में व्यक्त किया. इसके अलावा, अभिव्यक्ति कई astrocytes के बीच अंतर करने की क्षमता की पेशकश की पच्चीकारी है. यह भी एक ही समय में सोमा और ठीक टहनियों में रिकॉर्डिंग इस प्रकार, जबकि कई astrocytes संभवतः, एक साथ imaged किया जा सकता है. इसलिए, संभवतः एक ही तकनीक बहुत कार्यकुशलता बढ़ाने, astrocytic GQ GPCRs की स्केलिंग गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए तीन अलग तकनीक (थोक लोड हो रहा है, सांस में लोडिंग, और पैच दबाना लोड हो रहा है) के स्थान पर प्रयोग किया जा सकता है.
Astrocytes के लिए सीए 2 + संकेतक के वायरल की मध्यस्थता वितरण का उपयोग करने का एक संभावित दोष यह टुकड़ा स्वास्थ्य 32 पर संभव प्रभाव है. GECIs देने के लिए इस्तेमाल एडिनो से जुड़े वायरल वैक्टर astrocytes 33 की प्रतिक्रियाशील gliosis पैदा करने के लिए पहले से दिखाया गया है. सामान्य रूप में मस्तिष्क स्लाइस की तैयारी संभावना inf की रिहाई सहित विकृति के प्रारंभिक दौर आरंभ करता हैlammatory 10 अणुओं. इसलिए, GECIs का उपयोग वायरल वैक्टर का उपयोग कर दिया astrocytic रिसेप्टर्स की स्केलिंग को प्रेरित करने के लिए आवश्यक लंबी ऊष्मायन टाइम्स, साथ संयुक्त प्रयोगों के इन प्रकारों में टुकड़ा स्वास्थ्य के संदर्भ में अतिरिक्त ध्यान प्राप्त करने की आवश्यकता होगी.
इस प्रोटोकॉल को रोजगार है, यह एक प्रतिक्रिया का उत्पादन करने के लिए एगोनिस्ट के लिए आवेदन समय रिसेप्टर उपलब्धता के एक समारोह के रूप में अलग अलग होंगे कि मन में रखने के लिए महत्वपूर्ण है. एगोनिस्ट की दी एकाग्रता के लिए, आवेदन समय रिसेप्टर्स नीचे पहुंचा, और कम किया है तो रिसेप्टर्स एक सीए 2 + निर्माण करने के लिए पर्याप्त रिसेप्टर्स को सक्रिय करने के लिए ऊतक में एक पर्याप्त एकाग्रता तक पहुँचने के लिए दवा के लिए, ऊपर पहुंचा दिया है कि अगर लंबे समय तक रहना होगा प्रतिक्रिया. इसलिए, दवा आवेदन टाइम्स, और संभवतः उनके सांद्रता, स्केलिंग का इरादा दिशा पर निर्भर करता है समायोजित किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, agonist एकाग्रता सी में उतारा जाना पड़ सकता हैTTX के एएसई प्रतिक्रियाओं saturating से बचने, और यहां तक कि एक प्रतिक्रिया देखने के लिए उच्च + K में स्लाइस incubating के बाद वृद्धि हुई है. विशेष रूप से, DHPG एकाग्रता 5-15 माइक्रोन अक्सर में विश्वसनीय प्रतिक्रियाओं का उत्पादन करने के लिए बहुत कम था, के रूप में सीए 2 + प्रतिक्रिया पैटर्न का अध्ययन करने के क्रम में 5.0 मिमी + K उपचार के बाद 30-50 माइक्रोन तक TTX उपचार के बाद 5-15 माइक्रोन से स्थानांतरित कर दिया गया था समूह मैं mGluRs के नीचे स्केलिंग के बाद astrocytes.
Astrocyte सीए 2 + गतिविधि की रिकॉर्डिंग प्लाज्मा झिल्ली को या से रिसेप्टर प्रविष्टि या internalization का कोई प्रत्यक्ष सबूत उपलब्ध कराता है. हालांकि, GQ GPCR अभिव्यक्ति के स्तर और सहज बीच सीधे संबंध की जांच की और सीए 2 + यात्रियों 21-24, सीए 2 + में परिवर्तन का सबसे तार्किक व्याख्या पैदा की जो इन विट्रो में पिछले अध्ययनों से डेटा के साथ डेटा की उल्लेखनीय समानता के आधार पर संकेतन astrocyte सतह रिसेप्टर अभिव्यक्ति के स्तर हैबदला. एक सीए 2 + गतिविधि पर प्रभाव का ठिकाना बारे में अतिरिक्त साक्ष्य प्रदान करना चाहता है, तो एक पूरक दृष्टिकोण से एक महत्वपूर्ण विचार हो सकता है. हम इस्तेमाल एक रणनीति astrocytic MrgA1R चूहों से hippocampal स्लाइस पर TTX ऊष्मायन के प्रभाव की जांच करने के लिए किया गया था. इन ट्रांसजेनिक चूहों केवल astrocytes में एक विदेशी GQ GPCR (MrgA1R) व्यक्त करते हैं. इस रिसेप्टर मस्तिष्क का निवासी नहीं है, क्योंकि अपनी गतिविधि का स्तर परिवर्तित करने के लिए उपस्थित नहीं अंतर्जात neurotransmitter है. पिछला काम इस रिसेप्टर एक ही astrocytes 34 में अंतर्जात समूह मैं mGluRs रूप संकेतन अणुओं वही intracellular संलग्न है कि सुझाव दिया. TTX में MrgA1R चूहों से स्लाइस के बाद लंबे समय तक ऊष्मायन, littermate नियंत्रण की तुलना में एगोनिस्ट पैदा MrgA1R प्रतिक्रियाओं में कोई मतभेद नहीं, स्लाइस astrocyte पर प्रभाव सीए 2 + गतिविधि सतह रिसेप्टर के लिए स्थानीय परिवर्तन की वजह से है कि सबूत उपलब्ध कराएगा incubated विशेष रूप से समूह मैं mGluR प्रतिक्रियाओं अभी भी signif रहे हैंicantly एक ही astrocytes में बढ़ाया. एक विकल्प है, शायद अधिक शामिल रणनीति के रूप में लंबे समय से एक झिल्ली अंश सतह रिसेप्टर अभिव्यक्ति के स्तर में परिवर्तन के लिए विश्लेषण किया जा सकता है, जैसा कि पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए स्लाइस से astrocytes को अलग करने के लिए किया जाएगा, हालांकि. प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) या प्रवाह cytometry यहाँ मददगार हो सकता है.
न्यूरॉन्स का अध्ययन करने के लिए इस तकनीक के संभावित अनुप्रयोगों, astrocytes और astrocyte-neuronal बातचीत कई हैं. हमारे प्रयोगों में, केवल DHPG पैदा समूह मैं astrocytic सीए 2 + प्रतिक्रियाओं किशोर चूहों से अलग तीव्र hippocampal स्लाइस में, अध्ययन किया गया mGluR. यह तैयारी बरकरार afferents (Schaffer कोलेटरल), लेकिन यह भी उन्हें (CA3 पिरामिड कोशिकाओं) को जन्म दे कि न्यूरॉन्स है कि यह संभव postsynaptic कोशिकाओं (सीए 1 पिरामिड कोशिकाओं) पर इन glutamatergic न्यूरॉन्स की फायरिंग दर में हेरफेर करने के लिए कर रही है और न ही जिसका प्रक्रियाओं associat परत radiatum में astrocytesइन synapses के साथ ई. तीव्र hippocampal टुकड़ा न्यूरॉन्स के अन्य प्रकार की फायरिंग दरों से छेड़छाड़ के लिए सबसे अच्छी तैयारी नहीं हो सकता है, तथापि, के रूप में कई afferents उन्हें को जन्म दे कि न्यूरॉन्स से कटे हैं. फिर भी, यह अन्य astrocytic GQ GPCR उपप्रकार के plasticity निरीक्षण करने के लिए कुछ टुकड़ा तैयारी में संभव हो सकता है. उदाहरण के लिए, स्लाइस बरकरार हिप्पोकैम्पस के लिए बेसल अग्रमस्तिष्क cholinergic न्यूरॉन्स और उनके अनुमानों के साथ तैयार किया जा सकता है. TTX या ऊंचा + K में इन स्लाइस की ऊष्मायन कोलिनर्जिक इनपुट 1 के एक महत्वपूर्ण हिस्से को प्राप्त जो परत oriens की astrocytes में mAchRs के स्केलिंग के लिए अग्रणी cholinergic न्यूरॉन्स की बेसल फायरिंग दरों को प्रभावित करेगा. एक वैकल्पिक स्केलिंग तब होती है, जबकि TTX की एक निरंतर जारी एक प्लास्ट का आरोपण द्वारा हासिल की है, जहां एक Vivo में मॉडल का उपयोग करने के लिए हो सकता है बरकरार कनेक्शन के सभी के साथ मस्तिष्क के एक विशेष क्षेत्र के भीतर astrocytic रिसेप्टर स्केलिंग, अध्ययन करने के लिए अभी तक untested दृष्टिकोणआईसी बहुलक Elvax 40W ब्याज 35 के क्षेत्र के ऊपर. यह दृष्टिकोण neuronal स्केलिंग के एक अध्ययन में पहले से इस्तेमाल किया गया है, लेकिन यह भी astrocytic स्केलिंग के लिए लागू किया जाना चाहिए. अंत में, उचित readout के साथ, भविष्य के अध्ययन जी एस या जी मैं GPCRs में परिवर्तन सहित अन्य GPCR परिवारों की जांच कर सके. एक मैं GPCRs स्थानीय स्तर पर किसी भी टुकड़ा तैयारी के भीतर GABA interneurons पेश करने में फायरिंग के निषेध निम्नलिखित प्रभावित होने की astrocytic GABA बी जी की भविष्यवाणी सकता. इस तरह के दूसरे दूत शिविर के एक वास्तविक समय सूचक के रूप में अन्य संकेतन अणुओं को लक्षित नए संकेतकों के विकास, न्यूरॉन करने वाली astrocyte रिसेप्टर संचार पर अनुसंधान का एक नया क्षेत्र खुल जाएगा.
बेसल न्यूरॉन फायरिंग दरों के हेरफेर से astrocytic mGluRs के द्विदिश स्केलिंग neurotransmitter के एपी की मध्यस्थता रिलीज करने के लिए astrocytes की संवेदनशीलता का एक उपाय प्रदान करता है. Astrocytes जाहिरा तौर पर सहज ए पी एस और glutama समझ सकते हैंकोशिकी कश्मीर + एक शारीरिक सीमा के भीतर है, तब भी जब Schaffer जमानत के-CA1 पिरामिड सेल synapses पर ते रिहाई. TTX की तीव्र आवेदन सहज astrocyte की आवृत्ति astrocytic रिसेप्टर्स एपी डिटेक्टरों हैं कि सबूत उपलब्ध कराने सीए 2 + गतिविधि 18, 36, 37, हो जाता है 36 decorrelated आबादी में astrocytes के बीच सीए 2 + गतिविधि को कम नहीं करता है. इस astrocytes कोई उनके समग्र सीए 2 + गतिविधि पर असर के साथ सहज neuronal APs भावना है कि पता चलता है. यह व्यापक रूप से आईपी 3 के intracellular सांद्रता एक detectable सीए 2 + ऊंचाई करने के लिए नेतृत्व करने के लिए पर्याप्त रूप से आईपी 3 रुपये प्रोत्साहित करने के लिए एक सीमा के स्तर तक पहुँचने की जरूरत है कि स्वीकार कर लिया है. सहज neuronal APs औसत दर्जे सीए 2 + उन्नयन के बिना उत्पादन astrocytic GPCRs को सक्रिय कर सकता है? भविष्य के अध्ययन प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) या इसी तरह के एक techn उपयोग कर सकता रिसेप्टर को जी प्रोटीन युग्मन (रिसेप्टर सक्रियण का एक उपाय) और आंतरिक दुकानों से सीए 2 + रिहाई के बीच संबंध की जांच करने के लिए (जैसे कि ब्रेट के रूप में) ique. इस तकनीक बरकरार ऊतक तैयारी में इस्तेमाल के लिए उपलब्ध हो जाता है कि कुछ समय पहले हो सकता है, हालांकि ब्रेट, जी प्रोटीन से GPCR युग्मन 38 का पता लगाने के लिए इन विट्रो में बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है. यह astrocytic GQ GPCRs बहुत अधिक बार वर्तमान में उपलब्ध सीए 2 + इमेजिंग उपकरणों का उपयोग करके दर्ज किया जा सकता से सक्रिय किया जा रहा है कि संभव है. कार्रवाई क्षमता संवेदन के अलावा, astrocytic GQ GPCRs भी हाल के एक अध्ययन में 39 रिपोर्ट में neurotransmitter के लघु quantal रिहाई पता लगाने में सक्षम हो सकता है. यहाँ वर्णित द्विदिश स्केलिंग पद्धति जो astrocytic GQ GPCRs ऊष्मायन प्रोटोकॉल में bafilomycin A1 शामिल करके neurotransmitter के quantal vesicular रिहाई, पता लगाने के लिए किस हद तक का एक उपाय प्रदान करने के लिए भविष्य के अध्ययनों में इस्तेमाल किया जा सकता है.
astrocytic रिसेप्टर स्केलिंग भी वयस्क चूहों से प्राप्त ऊतकों में प्रेरित किया जा सकता है अगर ntent "> इस प्रकार अब तक, स्केलिंग प्रोटोकॉल केवल किशोर चूहों (P12-P18) से hippocampal स्लाइस में इस्तेमाल किया गया है. इसलिए, यह अभी अज्ञात है. एक सम्मोहक ताजा अध्ययन astrocytes में समूह मैं mGluR अभिव्यक्ति उम्र के पहले हफ्ते के बाद काफी कम हो और वयस्क astrocytes 40 में रिसेप्टर अभिव्यक्ति की बहुत कम स्तर के साथ, वयस्कता तक गिरावट जारी है. इसलिए यह astrocytic mGluRs निम्नलिखित ऊपर पैमाने निर्धारित करने के लिए दिलचस्प होगा पता चलता है लंबी किशोर चूहों से astrocytes में देखा उन निकट स्तर के लिए वयस्क माउस hippocampal स्लाइस में neuronal फायरिंग की अवधि के निषेध. यह निष्कर्ष astrocytic रिसेप्टर अभिव्यक्ति एक भी उम्र में स्थिर नहीं है लेकिन neuronal गतिविधि के स्तर पर निर्भर करता है तेजी से बदल सकते हैं सुझाव है. के विपरीत वयस्क चूहों में समूह मैं mGluRs की कम अभिव्यक्ति, सबूत सहित & # कि एड्रीनर्जिक रिसेप्टर्स, उभर रहा है945, 1 ए, α 2A, और β 1 उपप्रकार, मुख्य रूप से वयस्क मस्तिष्क 3, 4 में astrocytes द्वारा व्यक्त कर रहे हैं. α 1 ए एड्रीनर्जिक GQ GPCR इन रिसेप्टर्स एड्रीनर्जिक न्यूरॉन फायरिंग दरों में परिवर्तन के प्रति संवेदनशील हैं कि क्या सहित न्यूरॉन करने वाली astrocyte संचार के भविष्य के अध्ययन के लिए एक आकर्षक लक्ष्य हो सकता है.Disclosures
लेखकों इन अध्ययनों में प्रयुक्त tetrodotoxin Abcam से खरीदा गया था कि खुलासा करने के लिए कामना करते हैं. Abcam परिकल्पना, डिजाइन, या डेटा के संग्रह में कोई भागीदारी थी. सहकर्मी की समीक्षा प्रक्रिया के पूरा होने के बाद Abcam द्वारा काम के प्रायोजन के बारे में सभी संचार हुआ.
Acknowledgments
लेखकों स्केलिंग प्रोटोकॉल और डेटा की बहुमूल्य चर्चा के लिए glial-neuronal बातचीत के लिए यूसी रिवरसाइड केंद्र को स्वीकार करना होगा. लेखकों को भी अपने काम के प्रकाशन के प्रायोजन के लिए Abcam के लिए एक गंभीर धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chamber Supplies | |||
| Brinkmann pipette storage container | Fisher Scientific | 03-491 | Use the drawer portion as the incubation chamber |
| Electrical drill | |||
| Flexible tubing | Tygon | R-3603 | |
| Silicone seam sealant | Also called aquarium seam sealer | ||
| Gas tank | 95% oxygen, 5% carbon dioxide | ||
| Natural beveled pipette tip | USA Scientific | 1111-1000 | Cut-to-fit to connect oxygenate lines |
| One-to-six lines manifold | Warner Instruments | 64-0210 (MP-6) | For the microloader-manifold apparatus |
| Microloader | Eppendorf | 5242 956.003 | For the microloader-manifold apparatus, cut-to-fit |
| Floating Bubble Rack | Bel Art Scienceware | F18875-0400 | For slice holder |
| 600 µm Sefar Nitex Nylon mesh | ELKO Filtering Co. | 06-600/51 | For slice holder |
| Krazy Glue | For slice holder | ||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Baxter | 1001936060 | |
| NaCl | Fisher | S271-3 | |
| KCl | Fisher | P333-500 | |
| CaCl2 | Fisher | C79-500 | |
| MgCl2 | Fisher | M33-500 | |
| NaH2PO4 | Fisher | S369-500 | |
| NaHCO3 | Fisher | S233-500 | |
| Glucose | Fisher | Fisher | |
| (±)-6-Hydroxy-2,5,7,8- tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox) | Acros Organics | 53188-07-1 | |
| Ascorbic acid | Acros Organics | 401471000 | |
| Tetrodotoxin citrate (TTX) | Abcam | ab120055 | |
| Sulforhodamine 101 (SR-101) | Sigma-Aldrich | 284912 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
| Pluronic Acid F-127 | Invitrogen, Molecular Probes | P6867 | |
| Oregon Green 488 BAPTA-1 AM *cell permeant (special packaging) | Invitrogen, Molecular Probes | O6807 | |
| (RS)-3,5-DHPG | Abcam | ab120020 | |
| Histamine | Sigma-Aldrich | H7125 | |
| Carbamoylcholine chloride (Carbachol) | Sigma-Aldrich | C4382 | |
| Adenosine 5’-ATP disodium (Na-ATP) | Sigma-Aldrich | A7699 | |
| Dissection Tools | |||
| Single-edge razor blade | GEM | 62-0161 | For bisection |
| Double edge razor blade | TED PELLA, INC. | 121-6 | For cutting slices |
| Mayo Scissors, supercut | WPI | 14010-15 | For decapitation |
| Fine iris scissors, straight | Fine Science Tools | 14094-11 | For cutting the skull |
| Iris forceps, curved | WPI | 15915 | To remove the skin and skull |
| Small spatula | To remove/transfer the brain | ||
| Dumostar Dumont #5 Biologie Tip forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | For hippocampus dissection |
| Glass Pasteur pipette | Fisher | 13-678-20B | For transferring brain slices |
| Pasteur pipette rubber bulb | Fisher | 03-448-22 | For transferring brain slices |
| Polystyrene 100 mm tissue culture dishes | Corning | 25020 | |
| Vibratome | Leica | VT 1200S | |
| Water bath | Fisher | ISOTEMP 210 | For warm incubation |
| Micropipette puller | Narishige | PC-10 | For bolus-loading pipette |
| Confocal microscope | Olympus | Olympus Fluoview 1000 | |
| Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber with PM-1 platform | Warner Instruments | RC-26GLP | diamond bath with low profile |
| Borosilicate glass pipette | World Precision Instruments | TW150F-4 | For bolus-loading pipette |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | ROE-200 | For bolus-loading pipette |
| Spin-X centrifuge tube filter with 0.22 µm cellulose acetate | Costar | 8161 |
References
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