Summary
Descrevemos aqui uma adaptação de protocolos utilizados para induzir plasticidade homeostático em neurónios para o estudo da plasticidade dos receptores acoplados à proteína G astrocíticos. Recentemente usado para examinar as mudanças no grupo I astrocitário mGluRs em ratos juvenis, o método pode ser aplicado para medir o dimensionamento de vários GPCRs astrocitárias, em tecidos de camundongos adultos in situ e in vivo, e para obter uma melhor apreciação da sensibilidade dos receptores astrocitárias a mudanças na atividade neuronal.
Abstract
Perto de duas décadas de pesquisa estabeleceu que os astrócitos in situ e in vivo expressar inúmeros receptores acoplados à proteína G (GPCRs) que podem ser estimulados pelo transmissor neuronalmente-lançado. No entanto, a capacidade dos receptores astrocitárias para expor plasticidade em resposta a mudanças na atividade neuronal tem recebido pouca atenção. Aqui, descrevemos um sistema modelo que pode ser usado para escalonar globalmente para cima ou para baixo grupo astrocíticos que os receptores de glutamato metabotrópicos (mGluRs) em fatias cerebrais agudas. Estão incluídos os métodos de como preparar fatias de hipocampo parassagitais, construir aposentos adequados para a incubação fatia de longo prazo, bidirectionally manipular ação neuronal potencial de freqüência, astrócitos de carga e processos de astrócitos com fluorescente Ca 2 + indicador, e medir as mudanças na atividade Gq GPCR astrocitário por gravação astrócitos espontâneas e evocadas Ca 2 + eventos usando microscopia confocal. Em essência, um "r cálciooadmap "é prevista como medir a plasticidade de GPCRs Gq astrocitárias. São discutidas aplicações da técnica para o estudo dos astrócitos. Ter uma compreensão de como a sinalização do receptor astrocitária é afetada por mudanças na atividade neuronal tem implicações importantes tanto para a função sináptica normal, assim como os processos subjacentes distúrbios neurológicos e doenças neurodegenerativas.
Introduction
Os astrócitos responder em segundos a estimulação dos neurônios ou axônios neuronais com o aumento do Ca 2 + citoplasmático resultantes quase exclusivamente da ativação de GPCRs Gq astrocitárias. Por exemplo, os receptores de acetilcolina muscarínicos 1, 2 receptores de canabinóides, receptores adrenérgicos α 1A 3, 4 e grupo I mGluRs (veja abaixo) são todos os subtipos astrocitárias Gq GPCR que agudamente respondem à atividade neuronal. A activação do grupo astrocitário I mGluR foi demonstrado mais extensivamente, após a estimulação de aferentes glutamatérgicos neuronais in situ (tal como fatias de hipocampo agudas) 5-7, assim como no córtex do rato adulto in vivo após estimulação sensorial 8. O resultado da ativação de astrócitos Gq GPCR sinalização sobre a biologia e fisiologia dos astrócitos, neurônios, ou interações astrócitos-neurônios tem sido uma questão de debate 9-12. Será some tempo antes que a função de sinalização do receptor do neurônio-a-astrócitos é totalmente apreciado.
Embora seja claro que os neurônios podem ativar receptores astrocitárias usando protocolos experimentais, existem aspectos da comunicação neurônio-a-astrócitos receptor que permanecem pouco conhecidos. Em primeiro lugar, a quantidade real de actividade neuronal requerida para activar astrocitário Gq GPCRs não é bem definida, e em segundo lugar, a capacidade dos receptores astrocíticos para expor dependente de utilização plasticidade tem recebido pouca atenção. Para começar a responder a estas questões, que recentemente desenvolveu um protocolo para induzir a descamação bidirecional de grupo astrocitário I mGluRs em fatias de hipocampo juvenis agudos em resposta às mudanças de longo prazo no potencial de ação neuronal (AP)-dependentes atividade sináptica. À semelhança do que foi descoberto para a plasticidade homeostático bidirecional de receptores de glutamato ionotrópicos neuronais 13, 14, grupo astrocitário eu mGluRs expandir as following bloqueio de potenciais de ação neuronais e escala para baixo quando a ação neuronal freqüência potencial é aumentado 15. Estas alterações de compensação em receptores astrocíticos pode ser medido através da gravação espontânea e evocada astrócitos transientes de Ca 2 + e comparação das propriedades destes eventos para aqueles a partir de astrócitos em condições de controle. Neste artigo, descrevemos a metodologia completa para o uso deste protocolo, incluindo a preparação de fatias do hipocampo, condições agudas de incubação para induzir a descamação receptor astrócitos, astrócitos Ca 2 + indicador corante de carregamento, Ca 2 + técnicas de imagem por meio de microscopia confocal e efeitos esperados em astrócitos atividade Gq GPCR. Previsíveis efeitos em astrócitos Ca 2 + propriedades de sinalização - que correspondam às registradas previamente em pilhas cultivadas transfectadas com diferentes níveis de GPCRs Gq de expressão - fornecer um "roteiro", que pode ser usado em estudos futuros para analisar mudanças em comoexpressão GPCR trocytic. As ramificações e aplicações potenciais para o uso desta técnica irá contribuir para a nossa compreensão das interações astrócitos-neurônios no cérebro saudável e doente.
Protocol
Os procedimentos a seguir foram aprovados pelo Comitê da Universidade da Califórnia, Riverside Animal Care Institucional e uso.
1. Construção de Incubação Câmara e Slice Titular
- A construção da câmara de incubação: Construir a câmara de incubação a partir de material que não é tóxico. Certifique-se de que a câmara de circulação de ar foi controlada, segura uma quantidade suficiente de um suporte para ACSF fatia a flutuar, e é suficientemente grande para que o suporte da fatia pode flutuar numa extremidade da câmara, enquanto a dispersão de gás a partir de linhas de oxigénio ocorre no outra extremidade. A porção de gaveta de um recipiente de armazenamento de pipeta com a sua tampa hermética (Figura 1A) se ajusta a esses critérios bem.
- Perfurar um pequeno furo no lado do recipiente de cerca de 1 ¼ a partir do topo e ¼ a partir do lado. Encaixe um pedaço de tubo flexível, através do orifício (Figura 1B). Ter cuidado para perfurar a baixa o suficiente para que o tubo não irá ser comprimida, quando a tampa está fechada, mas suficientemente elevada para que ele está acima da solução.
- Aplicar costura selante de silicone ("selador costura aquário") para criar uma vedação estanque entre a linha de oxigênio e da câmara.
- Ligue a extremidade "fora" da tubulação para um tanque de gás (95% de oxigênio, 5% de dióxido de carbono), utilizando um encaixe Luer macho. Para um ajuste personalizado, cut-to-caber um chanfrado pipeta de 200 mL ponta naturais (Figura 1C).
- Conecte o final "dentro" da tubulação a uma linha colector de plástico de um para seis. Cut-to-fit seis 20 mL Eppendorf dicas microloader pipeta a cada entrada de coletor (Figura 1D). A abertura fina das microloaders é ideal para a produção de um fluxo constante de pequenas bolhas.
- Para permitir a ventilação, faça dois pequenos furos na tampa do recipiente (Figura 1E).
- Construindo a fatia hmais velho: O titular fatia é feita a partir de um rack bolha flutuante (Figura 1F).
- Retire as "pernas" do fundo do rack de bolha, e cortar a parte superior para cerca de 1 ¾ polegadas
- Cole um pedaço de material de malha de nylon para a parte inferior da prateleira rodada utilizando cola de cianoacrilato (como padrão Krazy Glue) para criar um suporte de fatia de oito poços (Figura 1G). Cada poço pode caber uma única fatia do hipocampo do rato.
- Encaixar o suporte da fatia numa extremidade da câmara de incubação e o aparelho microloader-colector na outra extremidade. Deixe as pontas Microloader para descansar no assoalho da câmara (Figura 1H). Esta configuração é destinada a assegurar a oxigenação suficiente tanto para o topo e o fundo das fatias de hipocampo agudas, e para evitar bolhas que saem directamente abaixo titular a fatia a fim de minimizar a fatia agitação e evitar o contacto directo com as bolhas de fatias do hipocampo.
- Lavar as câmaras de incubação de umatitulares d fatia cuidadosamente com DDH 2 O após cada experimento, e descontaminar com etanol 70% semanalmente. No caso de incubação fatias em soluções diferentes, será necessário titulares múltiplas câmaras / fatia.
2. Soluções e Drogas
- Líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF): Preparar 4 L de ACSF padrão em ddH2O utilizando a seguinte (em mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 2,5 de CaCl2, 1,3 de MgCl2, 1,25 NaH 2 PO 4, 26,0 NaHCO3, 15 glicose, e 0,1 Trolox. Medir a osmolaridade da solução usando um osmómetro, que deve vir a ~ 310 mOsm. Composições aCSF para condições experimentais estão descritas a seguir (ver protocolo 3). Filtrar todas as soluções usando um filtro de 0,22 garrafa-top em garrafas de vidro autoclavados. As soluções são estáveis em 4 ° C, durante até um mês.
- Cortando Tampão: Preparar fatias utilizando um ACSF modificada contendo (em mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 3,8 MgCl 2, 1,25 NaH 2 PO 4, 26,0 NaHCO3, 15 de glucose, e 1,3 de ácido ascórbico. Medir a osmolaridade da solução usando um osmómetro, que deve vir a ~ 310 mOsm. Substituição de CaCl 2 com MgCl2 no tampão corte melhora fatia de saúde.
- Sulforrodamina 101 (SR-101, 1 mM) é usado para identificar os astrócitos em fatias de hipocampo agudas. Fazer um estoque 1 mM de SR-101 pela diluição 60,67 mg SR-101 em 100 ml de um ACSF baixo cálcio modificado preparado como se segue (em mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 de CaCl2, 6 de MgCl2, 1,25 NaH 2 PO 4, 26,0 NaHCO3, 15 de glucose, e 1,3 de ácido ascórbico. Verifique se a osmolaridade do ACSF baixo de cálcio é de aproximadamente 310 mOsm. Diluir a 1 mM SR-101 estoque 1.000 vezes em modificado baixo Ca 2 + ACSF para o carregamento. Armazene a solução final SR-101 em 4 ° C e protegida da luz até ser necessário para a experiência.
3. Manipulação de Long Termo Neuronal Firing Preços em Agudo fatias do hipocampo
Use um dos dois protocolos de incubação em experimentos separados para manipular as taxas de disparo neuronal de longo prazo:
- Inibir disparo neuronal: Incubar em tetrodotoxina (TTX, 1 M): CUIDADO: Manuseie TTX com cuidado, pois pode ser fatal se ingerido em quantidades suficientes. Luvas e óculos de proteção são recomendados. TTX abole completamente disparo neuronal AP-conduzido em fatias agudas. Incubar as fatias em 3,5 mM de K + ACSF, acrescido de 1 uM TTX na condição experimental. Na condição controle, incubar fatias em 3,5 mM K + ACSF sem TTX. A comparação entre as duas condições, revela o efeito up-scaling em astrocitário atividade Gq GPCR. 3,5 mM de K + ACSF serve como a condição de controle (em oposição a dizer, 2,5 mM de K +), a fim de maximizar o efeito do tratamento com TTX.
- OU -
- Aumente disparo neuronal acimataxas basais: Incubar em alta de potássio: aumento da concentração de K + extracelular despolariza neurônios e aumenta a sua taxa de disparo basal. Incubação em 5,0 mM K + ACSF eleva significativamente a ação neuronal freqüência potencial em comparação com 2,5 mM K + ACSF 15. Incubar as fatias em 5,0 mM de K + para o ACSF condição experimental, e para a condição de controle, incubar em fatias padrão 2,5 mM de K + ACSF. A comparação entre as duas condições, revela o efeito down-scaling em astrocitário atividade Gq GPCR.
4. Hippocampal aguda Slice Preparação
- Configurando a câmara de recuperação quente:
- Aquecer a água do banho a 35 ° C, em seguida, colocar as câmaras húmidas preparadas dentro. Encher o banho de água com água até a altura do ACSF dentro das câmaras de incubação (Figura 1G).
- Oxigenar o ACSF experimental e de controlo com 95% de O 2, 5% CO 2. As bolhas emitidos pelo aparelho microloader-colector deve ser pequeno e abundante, mas também suave; não deve haver qualquer movimento visível de ACSF dentro da câmara.
- Configurar a câmara de dissecção gelada:
- Pegue dois baldes de gelo. Coloque um frasco de, aproximadamente, 300 ml de tampão que cortam em um balde de gelo e mantê-lo oxigenado com 95% O2, 5% de CO 2 durante 20 minutos. Submerge um prato de 100 mm de Petri para o outro balde de gelo, imediatamente abaixo da superfície de gelo. Assegurar o lado da placa de Petri está em contacto directo com o gelo. Despeje um pouco de tampão de corte na placa de Petri e mantê-lo bem oxigenado.
- Refrigere a ponta da lâmina de barbear de ponta única, submergindo-o para o buffer de corte a frio de gelo na placa de Petri por mais de 1 min.
- Vibratome configuração:
- Ligue o vibratome e certifique-se a drenagem está fechada.
- Fixe a câmara de corte no vibraTomé e bloco de gelo ao redor da câmara de corte. Precool-a 0-4 ° C.
- Retirar fábrica graxas da lâmina de dois gumes, mergulhando-a em 70% de EtOH durante 5 min e, em seguida, a lavagem com ddH2O. Corte-o em duas metades com cuidado (não dobre a lâmina) e montar uma metade lâmina sobre o bloco de corte.
- Remoção do cérebro do rato:
- Anestesiar um rato C57BL/6J doze a dezoito dias de idade em uma pequena câmara de pré-carregado com 0,5 ml de isoflurano embebido em um Kimwipe ou bola de algodão. Aperte suavemente os dedos do animal para se certificar de que não há reflexo da dor.
- Decapitar o mouse usando um par de tesouras afiadas, em seguida, retire o couro cabeludo usando pequenos fórceps. Use pequenas tesouras para cortar o osso do crânio a partir do cerebelo para os bulbos olfativos ao longo da fenda longitudinal. Retirar as abas cranianos utilizando as pequenas fórceps. Remova cuidadosamente o cérebro com uma espátula, e mergulhe-o no buffer de corte oxigenado gelada na placa de Petri.
- Bisect do cérebro do rato com a lâmina de barbear refrigerados na placa de Petri para permitir mais área de superfície para refrigeração e oxigenação. Deixe os hemisférios bifurcadas sentar no buffer de corte gelada por 2-3 min. O cérebro deve se tornar completamente legal e mais sólida.
- Aplicar uma fina camada de cola de cianoacrilato sobre a plataforma de vibratome. Cole ambos os hemisférios para a plataforma de corte lateral para baixo e lateral para cima, com o bulbo olfativo virado para a frente. Fixe a plataforma na câmara de corte, em seguida, encher a câmara de corte com o frio do gelo, o buffer de corte bem oxigenado.
- Continuar oxigenar a câmara de corte enquanto prepara 300 mm fatias grossas parassagitais usando o vibratome. Corte as fatias com uma frequência de 85 Hz, a velocidade de avanço de 0,20 mm / s, e uma amplitude de 1,40 mm. Nota: Verificou-se que a variável mais importante na preparação de fatias de hipocampo agudas saudáveis é a qualidade de vibratome. Nosso laboratório utiliza o ímã Leica VT 1200 Sic dirigir vibratome com VibroCheck para reduzir as vibrações "z".
- Depois de cortar, dissecar o hipocampo eo córtex entorrinal adjacente de cada fatia parasagital usando uma pinça afiada. Execute este procedimento no, tampão corte bem oxigenado gelada na câmara de corte do vibratome. A nitidez das pinças é muito importante para a saúde, uma vez que minimiza a fatia de manuseamento das fatias.
- Faça uma pipeta por romper a longa ponta de uma pipeta Pasteur de vidro e tampando a parte quebrada com uma lâmpada de pipeta. Isto permite o uso da extremidade mais larga da pipeta para transferir as fatias. Certifique-se de pedir pipetas sem o tampão de algodão na grande final (veja a tabela de materiais). Como as fatias são preparados em condições não estéreis, não é necessário para a pipeta autoclave antes da sua utilização, apesar de uma pipeta nova deve ser preparado e utilizado para cada experimento.
- Transfira cada fatia do hipocampo para as câmaras de incubação no 35 ° C águabanho, mergulhando a pipeta de transferência para o ACSF dentro de cada bem do titular da fatia e aspiração da fatia. Minimizar o movimento da fatia durante este processo. Transferência direta das fatias para os resultados de banho quentes incubação em melhores fatias de qualidade do que "aumentando" a temperatura gradualmente.
- Permitir que as fatias do hipocampo se recuperar no banho de água quente para um total de 45 minutos, repartidos da seguinte forma: Incubar fatias por 20 min em 1 PM SR-101 diluído em baixo ACSF cálcio, em seguida, transferi-los para o ACSF baixo de cálcio (sem SR-101) durante 10 min. Posteriormente, transferir as fatias de controlar ou ACSF experimental para os restantes 15 min de incubação quente.
- Após a recuperação de 45 min de aquecimento, mover cuidadosamente as câmaras de incubação a partir do banho de água a 35 ° C para o topo da bancada, e então permitir que as fatias de continuar a incubar à temperatura ambiente durante um tempo total de incubação de 3 horas antes de se iniciar o bolus de carregamento protocolo (ver abaixo). 5. Bolus Carregando de astrócitos com Ca 2 + Indicador
- Preparando Ca 2 + indicador bolus-loading dye:
- Para cada frasco de solução de corante (50 ug), adicionar 3,87 mL de fresco dimetil sulfóxido (DMSO) e vórtice completamente. O frescor do DMSO é importante para uma boa carga e, portanto, se abrir uma nova ampola de cada vez.
- Misturar em 9 ul de 20% de ácido plurónico e vórtice completamente. Misturar o corante com 100 ul da ACSF e vórtice bem experimental ou de controlo apropriado, para uma concentração de corante final de 10 uM.
- Filtrar a solução através de um tubo de filtro de centrifugação. Este passo evita a pipeta de carregamento de entupimento durante a ejecção do corante.
- Prepara-se uma pipeta a partir de um capilar de vidro de borosilicato puxado para uma resistência de cerca de 1,3 mohms quando preenchido com uma solução de corante.
- Coloque uma fatia de hipocampo em uma câmara de registo concebido para ser utilizado com o microscópioe perfundir continuamente com ACSF oxigenado com a mesma composição que foi incubada em (1.5 ml / min). Alterne entre o controle e as condições experimentais ao selecionar uma fatia do hipocampo.
- Descarte insalubres fatias de hipocampo futuro. A qualidade de fatias irá variar mesmo dentro de uma dada experiência. Não existem critérios estabelecidos para a quantificação fatia de saúde e, portanto, a determinação da fatia de saúde é subjetivo e baseado principalmente na experiência.
- De um modo geral, manter as fatias que têm uma superfície lisa e aparecendo uma alta percentagem de células piramidais CA1 saudáveis (Figura 2A). Células piramidais CA1 são particularmente sensíveis e vulneráveis aos insultos do sistema nervoso central, portanto, ter uma grande percentagem (≥ 75%) dos neurônios piramidais CA1 saudáveis pode ser um critério úteis para aceitar ou rejeitar uma fatia.
- Descarte fatias que têm cerca de> 25% neurônios mortos. Neurônios mortos têm uma aparência de ovo frito como (Figura 2B). NOTA: Estamos have observado que o ângulo do corte desempenha um papel importante em saber se os neurónios parecem saudáveis ou não. Se dendritos neuronais estão projetando para cima (fora da fatia), então os neurônios será quase morto. Isto é, presumivelmente, porque uma grande proporção do volume de neurónios tal está contido dentro da árvore dendrítica, que cortando as dendrites é letal para as células. Por outro lado, se os dendritos são projecta paralelo ou com um ângulo para baixo a partir da superfície da fatia, haverá uma elevada percentagem de neurónios saudáveis. Às vezes, por conseguinte, será principalmente neurónios mortos de um lado da fatia e saudável, por outro lado.
- Localizar um campo adequado, de astrócitos sr 40-70 mM abaixo da superfície da fatia com base no tamanho, morfologia e localização usando interferência contraste diferencial (DIC) óptica.
- Carregar a pipeta de vidro com uma solução de corante e baixá-la para a superfície da fatia acima neste campo utilizando um microeléctrodo Holde patch-clamp padrãor. Com a pipeta na superfície da fatia, aplicar a pressão de retorno para a pipeta para começar a tintura de ejecção. Ejeção de corante será visível sob as duas óticas DIC e um laser adequado, como uma linha de 488 para um corante verde.
- Lentamente inferior da pipeta para aproximadamente 40 um abaixo da superfície da fatia usando um micromanipulador e permitir que o corante para ejectar para aproximadamente 45-60 seg. Em seguida, abaixe a pipeta um 35 um adicional (75 mM abaixo da superfície fatia) e ejetar corante por cerca de 45-60 segundos. Lentamente retrair a ponta da pipeta da fatia. Menor tempo de injecção é provável que resulte em carga corante insuficiente, ao passo que mais de injecção tende a aumentar a carga de fundo, o que diminui a relação sinal-para-ruído da gravação.
- Para assegurar que um grande número de astrócitos absorver o corante, que é geralmente útil para injectar um segundo bolus de marcador a uma curta distância. Elevar a pipeta de volta para a superfície da fatia, certifique-se de que a pipeta não está entupido, então move a pipeta de aproximadamente 80-100 mM de distância a partir do primeiro local da injecção, ao longo do estrato radiante. Repetir a injecção bolus neste site.
- Permitir 30-45 min antes de imagem para os astrócitos para assumir o corante e para o sinal de fundo a diminuir. Deixar a fatia na câmara de perfusão durante este tempo. Certifique-se que este tempo de incubação é construído no total de tratamento de 4 horas do experimento. Obter a próxima fatia e repita os passos de 5,2-5,8.
- Configurando o microscópio confocal para imagens:
- Limitar a exposição fatia a luz do laser é de extrema importância, como alta exposição pode levar a tingir de branqueamento e / ou fototoxicidade. Usando ampliação ótica superior ou um ajuste de zoom aumentado aumenta a exposição à luz para o campo com imagens. Portanto, definir os valores padrão para cada laser para um settin alta fotomultiplicadorg, ganho de 1x e 0,5% a potência de saída do laser.
- Aplique um zoom de 1.5x para melhor visualização dos processos de astrócitos.
- Defina a resolução de campo para 512 x 512 pixels.
- Defina a velocidade de varredura para o mais rápido possível, o que é de aproximadamente 1,2 segundos por digitalização usando o modo de verificação de uma maneira.
- Recolhe espectros de emissão usando filtros de banda de passagem de 503-548 nm para o laser de 488 nm, e de 624-724 nm para o laser de 559 nm. Essas configurações permitem que imagens de um campo de ~ 5-8 astrócitos a uma velocidade relativamente rápida em uma resolução suficiente para observar corpos celulares dos astrócitos e os processos principais. Idealmente, os astrócitos no campo será o suficiente para ser visto claramente brilhante, mas sem qualquer saturação pixel.
- Confirmar a identidade de células carregadas com Ca 2 + tingir como astrócitos, visualizando o SR-101 colabeling utilizando o laser de 559 nm.
- Gravação astrocyte Ca 2 + atividade:
- Desenhar caixas usando o software de aquisição de imagem sobre as regiões de interesse (ROÉ) dentro da célula, neste caso, sobre os corpos celulares de astrócitos. As caixas não devem incluir pixels de fundo, para obter a melhor relação sinal-para-ruído. Desenhe uma caixa sobre o fundo como referência.
- Alternar a perfusão para ACSF experimental mais 1 uM TTX (Abcam) através do resto da experiência. Isso elimina quaisquer respostas possíveis astrocyte cálcio AP-driven neuronais. Restante aumenta em astrócitos de Ca 2 + de concentração será, então, devido à libertação quantal vesicular, constitutivo (basal) GPCR, ou alguma combinação dos dois mecanismos.
- Registro de fluorescência ao longo do tempo a partir de todas as ROIs. Qualquer aumento na fluorescência ao longo da linha de base indicam aumentos da concentração citoplasmática de Ca2 + de 16, e, por conseguinte, a actividade de GPCR em astrócitos 10, 17, 18. Para evitar eventuais efeitos de escala no início sobre os receptores astrocitárias por TTX, experimentos completos dentro de 40 min from o momento em que a TTX perfusão 1 PM começou.
- Após a obtenção de 10 min de gravação da linha de base de espontânea de Ca 2 + a actividade, aplicar um agonista de interesse (tais como DHPG) em concentrações crescentes sequencialmente. Deixe um mínimo de 5 min entre as aplicações para reduzir possível dessensibilização do receptor.
- No final da gravação, aplicam uma mistura de agonistas de outros GPCRs Gq astrocíticos como um controlo positivo para a sinalização astrocitário intacta Gq vias de GPCR. Os componentes do coquetel agonista dependerá do receptor de interesse. 10 uM de cada um dos Gq GPCR agonistas de histamina, carbacol, e 2Na-ATP para estimular os receptores de histamina H1 [H1R], os receptores de acetilcolina muscarínicos [mAChR] e receptores purinérgicos [P2YR], respectivamente, é um cocktail agonista utilizado.
- Aquisição de imagem pós-experiência:
- Na conclusão do Ca 2 + a gravação, ter imagens fixas com a 488 nm e 559 nm lasers, fou posterior confirmação da identidade dos astrócitos e colocação ROI. Configurações de energia do laser e alta tensão pode ser alterada livremente neste momento para obter uma imagem ideal para co-localização, como não há mais a preocupação com a intensidade da luz do laser afetar os dados (Figura 2A).
- Repita os passos de 6,1-6,3 para um total de cerca de 8 e 40 fatias astrócitos / grupo. Fatias deve vir de um mínimo de 3 camundongos diferentes.
- Definindo um Ca 2 + elevação: Padronização na definição de Ca 2 + transientes não foi firmemente estabelecida no seio da comunidade científica. O que se segue é um protocolo comum que maximiza a sensibilidade ao mesmo tempo limitar a detecção de eventos positivos falsos de ruído da linha de base.
- Já outro membro laboratório atribuir cada fatia um código numérico, a fim de analisá-los cegamente. Na conclusão da análise, decodificar cada fatia.
- Analisar astrócitos espontâneas e evocadas Ca 2 + elevações offline usando o software de análise de imagem. Redesenhar e / ou ajustar o tamanho, a forma e a localização das ROI, como desejado.
- Pontuação aumentos na intensidade de fluorescência mais da linha de base como Ca 2 + de elevação, se o pico de amplitude é maior do que dois desvios padrão (DP) acima da média de 30 seg de fluorescência média de linha de base durante, pelo menos, dois pontos de amostragem consecutivos. Em gravações particularmente ruidosos (baixa relação sinal-ruído), este critério pode precisar de ser ajustado para 3 SD acima da fluorescência basal médio. Define o início de cada Ca 2 + de elevação como o último ponto de dados antes que a intensidade de fluorescência superior a um desvio padrão acima da média.
- Diferenciar multipeak vs sucessivos eventos de um único pico. Marque um evento como "multipeak", quando a intensidade de fluorescência não retornar à linha de base (abaixo da média valor basal +2 SD) para &# 8804; nove pontos de dados consecutivos (10,8 seg) entre os picos. Assim, os eventos de pico individuais terão 10 ou mais pontos de dados de linha de base consecutivos no meio deles.
- Classificar eventos como respostas "plateau" de tipo quando a intensidade da fluorescência mantém a amplitude de pico (± 10% do valor de pico) para, pelo menos, 3,6 segundos.
- Analisar a amplitude, freqüência e cinética de transientes espontâneas e evocou-agonistas de cálcio.
- Definir amplitude do pico do Ca 2 + de elevação como o ponto de dados com o maior valor de intensidade (no caso de respostas "multipeak" usam o primeiro pico, ver Figura 2B).
- Calcule tempo ascensão como diferença aparecimento resposta eo tempo correspondente amplitude pico. NOTA: 0 a 100% de tempo de subida pode precisar de ser utilizada, a fim de ter um número suficiente de pontos de dados para obter um valor de tempo, velocidade de digitalização é uma variável importante aqui.
- Calcular a latência como o tempoentre o início do agonista de perfusão para o início de resposta. Tempo de subida pode ser uma medida mais útil de fatias cerebrais, enquanto lava-em tempos criar uma confundir no cálculo latências de resposta.
- Determinar se existem diferenças significativas entre os dois grupos para cada parâmetro usando o teste t de Student independente estatisticamente. Use o número de astrócitos como o 'n'. Use o teste do qui-quadrado de Pearson para comparar os padrões de Ca 2 + de atividade entre os grupos de controle e tratamento. Use o teste exato de Fisher 2-tail para comparar percentuais de padrões Ca 2 + atividades específicas entre os grupos de controle e tratamento. Expressar diferenças como * p <0,05, ** p <0,01, e *** p <0,001.
6. A gravação espontânea e Gq GPCR Agonist evocadas astrocítica Ca 2 + Actividade em fatias do hipocampo
7. Análise de astrócitos Ca 2 + Actividade
Representative Results
Os resultados representativos na Figura 3 mostra o efeito da incubação de fatias do hipocampo do rato agudas em TTX para 4-6 horas em astrócitos sr Ca 2 + actividade. Os dados incluem tanto espontâneas Ca 2 + transientes e grupo DHPG evocadas eu mGluR Ca 2 + respostas, a partir de fatias incubadas no controle ACSF vs ACSF mais TTX. Para além de características morfológicas características básicas, a montagem processo stellate e pequeno tamanho físico (~ 10 mM), os astrócitos são identificados na sr por sobreposição do Ca 2 + indicador OGB-01:00 com o marcador de astrócitos selectiva SR-101 19, 20 ( Figura 3A). As caixas numeradas mais de corpos celulares de astrócitos corresponde à fluorescência numeradas sobre traços de tempo mostrado na Figura 3B. O agonista de mGluR do grupo 1 (RS)-3.5-DHPG é aplicado para determinar os efeitos de dimensionamento específicos no grupo 1 mGluRs em astrócitos. Para discriminar entre physiology na especificidade do efeito de escala para os mGluRs do grupo 1, versus outros GPCRs Gq, um cocktail de agonistas é aplicado no final de cada experiência. Aqui utilizou-se 10 ^ M de cada de Gq GPCR agonistas de histamina, cloreto carbamilcolina (carbacol) e adenosina-5'-ATP dissódico (Na-ATP). O coquetel de agonista também serve como um controlo positivo para identificar, os astrócitos reactivos viáveis nos casos em que as células não respondem a DHPG, presumivelmente porque estas astrócitos particulares não expressam quantidades suficientes do receptor para induzir uma resposta a DHPG.
Foram utilizados diferentes concentrações de DHPG, incluindo 5 uM e 15 uM (Figura 3B), bem como 30 uM e 50 uM (Figura 4A) para ajudar a revelar alterações no grupo astrocitária I mGluR. A relação entre Ca 2 + respostas celulares e os níveis de expressão Gq GPCR foi examinado anteriormente in vitro 21-24. Em primeiro lugar, olimiar de resposta a um agonista em particular a concentração depende da densidade de receptores expressos por cada célula. Em uma população de células, mais as células respondem com um Ca2 + elevação para uma dada concentração de agonista quando as células são transfectadas com maiores densidades de receptores. Após a incubação as fatias em TTX, a percentagem de astrócitos na população de responder a uma concentração fixa de agonistas aumentos (figuras 3B e 3C). Verificou-se que 5 uM e 15 uM DHPG revelam diferenças óbvias na percentagem de astrócitos reactivos entre o controlo e as células tratadas TTX, enquanto que 30 e 50 uM DHPG são necessários para comparar as respostas de grupo I de mGluR em 5,0 mM de K + tratados vs controle células (Figura 4A).
A relação entre os padrões de Ca 2 + resposta astrocitárias e concentração agonista também foi examinada in situ. Aumentando o agonistaconcentração muda o padrão do Ca 2 + resposta em astrócitos de pico único Ca 2 + elevações para multipeak e planalto Ca 2 + elevações 25-27. Com base nestas descobertas anteriores, previmos que o padrão de resposta a uma única concentração de agonista mudará se houver alterações no nível de expressão do receptor. Assim, dependendo de qual dos dois métodos de escala está a ser utilizado (inibindo o disparo neuronal ou aumentando-a), a concentração de agonista necessária para produzir um padrão de resposta particular irá aumentar ou diminuir. Por exemplo, os astrócitos foram incubadas em TTX deslocar sua DHPG evocadas Ca 2 + padrão de resposta a mais platô do tipo Ca 2 + elevações e responder a reduzir as concentrações de agonista, em comparação com o controle astrócitos (Figura 3C). Tendo em conta estudos anteriores, estas observações sugerem que o I mGluR os níveis de expressão do receptor em astrócitos grupo aumentou.
Tempo de subida e início (latência) dos Ca 2 + elevações também foram mostrados para correlacionar diretamente a mudanças nos níveis de expressão Gq GPCR em células cultivadas 22-24. Níveis mais elevados de expressão do receptor de resultar em menores latências de resposta e tempos de subida mais rápido enquanto que a redução na densidade do receptor produz o efeito oposto. Para astrócitos incubados em TTX, Ca 2 + transientes evocadas pela aplicação de DHPG têm significativamente mais rápido subir vezes em comparação com os astrócitos incubados no controle ACSF (Figura 3D). Como mencionado anteriormente, as amplitudes das respostas de Ca 2 + evocada por agonista permanecem inalterados, independentemente da concentração de agonista ou o modelo de escalonamento 15 (Figura 3D).
Além das mudanças observadas pelo grupo ativando diretamente eu mGluRs com DHPG, astrócitos espontânea Ca 2 + atividade também é afetada significativamente por esta manipulação. Observamosda aumento de 2,26 vezes na percentagem de astrócitos espontaneamente activos incubadas em TTX versus controlo. Isso representa um aumento de apenas 12,9% dos astrócitos de controle exibindo atividade espontânea na soma para 42,1% no TTX incubadas astrócitos (Figura 3E). Porque é sabido que a actividade GPCR exposição "intrínseco" ou constitutiva na ausência de agonista de 21, 26, 28, e que o nível de esta actividade intrínseca aumenta com o aumento dos níveis de expressão do receptor, estes dados sugerem que a densidade de astrocíticos Gq GPCRs aumentos seguinte redução longo prazo ação neuronal potencial fuzilamento. Similar às respostas evocadas por agonistas, os tempos de subida dos espontâneos Ca 2 + elevações são também aumentou (Figura 3E).
Dados representativos utilizando o segundo protocolo, incubação em potássio extracelular elevada (5,0 mM), está representado na Figura 4. Um aumento em K + extracelular 2,5-5,0 resultados mM em um aumento significativo na acção basal neurónio CA3 potencial de frequência 15. As concentrações mais elevadas de DHPG (30 uM e 50 uM) são necessárias com o fim de provocar o grupo I de mGluR de Ca 2 + as respostas a partir dos astrócitos incubados em elevada de potássio (Figuras 4A e 4B). Isto é consistente com um nível reduzido de mGluR do grupo I, a capacidade de resposta em astrócitos seguindo um aumento de longa duração em potenciais de acção neuronais. Além disso, o padrão de resposta evocada a uma concentração fixa de DHPG muda de respostas do tipo plataforma para respostas mais fracas de um único pico (Figura 4B). Examinando o percentual de astrócitos espontânea ativos nas duas condições potássio revela que menos astrócitos incubados em alta K + são espontânea ativa em relação à condição controle (Figura 4C). Este efeito é na opposite direcção da condição TTX em que a percentagem de astrócitos exibem espontânea de Ca 2 + elevações é aumentada. Por último, tanto evocado e espontâneas Ca 2 + elevações têm tempos de subida mais lenta em astrócitos incubados em relação à condição controle (Figuras 4C e 4D) de altura K +. Globalmente, estes dados sugerem que os níveis de expressão astrocitárias Gq GPCR escama bidirecional, dependendo do nível de ação neuronal atividade potencial ao longo de um período de tempo prolongado.
Figura 1. Fabricação Slice câmara de incubação e configurar. (A) A parte de gaveta de um recipiente de armazenamento pipeta Brinkmann, juntamente com a tampa hermeticamente fechado é usado para construir a câmara de fatia incubação. (B) Drill um furo no lado do recipiente de cerca de 1 ¼ a partir do topo e ¼ a partir do lado. Coloque em um pedaço de tubo flexível. (C) ligação ao aparelho microloader-colector para a extremidade interior da tubagem flexível. Nota cut-to-ajuste natural ponta da pipeta de 200 mL (seta branca). (D) Seis 20 ul microloaders Eppendorf são cortadas-para-ajuste a um colector de linha de um a seis para criar um aparelho microloader-colector. (E) Faça dois pequenos furos na tampa. (F) A cremalheira da bolha flutuante para fazer o suporte da fatia. (G) As "pernas" inferiores da cremalheira bolha flutuante são removidos de modo a que um pedaço de material de malha de nylon pode ser colada à parte inferior. (H) Encha a câmara de incubação com quantidade suficiente de ACSF para que os carros alegóricos titular fatia. Ajuste o comprimento da tubulação de modo que as pontas dos microloaders pode descansar em um canto do chão da câmara. Ao colocar a câmara de incubação ema água do banho, o nível da água no banho deve estar no mesmo nível que o ACSF na câmara. Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 2. Estimativa da fatia de saúde. (A) Uma fatia do hipocampo com aparência saudável usando diferencial interferência contraste (DIC) óptica. Fatias saudáveis têm uma aparência aveludada e uma alta porcentagem de neurônios piramidais CA1 saudáveis. Observe as dendrites apicais projetando em estrato radiatum. Patch-clamp de neurônios que se parecem com os apresentados aqui revelam um potencial de repouso baixa (-61 a -62 mV) no padrão de 2,5 mM K + ACSF com poucos potenciais de ação espontânea. O potencial de membrana e de queima taxas vão variar em função do exintracelular de K + (Xie et al. 15). As setas apontam para os astrócitos putativos. Abreviações: sr, estrato radiatum; s.py., estrato pyramidale. Barra de escala, 10 ^ m. (B) fatias insalubres terá uma alta porcentagem de neurônios piramidais CA1 mortos, que têm a aparência de ovos fritos (setas brancas apontam para núcleos de neurônios mortos - a "gema" do ovo frito). Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 3. Gravação amplificado actividade de GPCR e Gq grupo evocado I de mGluR de Ca 2 + respostas após a inibição de longo prazo de APs neuronais por incubação em TTX. (A) Imagens representativas de células no campo de gravação incubadas em control condições (painéis superiores) ou em TTX (painéis inferiores) que assumiram Oregon Verde BAPTA-1 AM Ca 2 + corante indicador (painéis à esquerda) e SR-101 (painéis de média). A barra de escala representa 10 um. Sobreposição de ambos os sinais ("merge") indica que a carga astrócitos com Ca 2 + indicador. As caixas são desenhadas sobre soma astrocyte indivíduo para registrar a intensidade de fluorescência ao longo do tempo no canal verde para monitorar Ca 2 + atividade em astrócitos. (B) os vestígios de amostra das caixas registradoras em A) de Ca 2 + atividade nos astrócitos. Os astrócitos incubados em TTX mostram aumento da atividade espontânea e evocada grupo mais robusto eu mGluR Ca 2 + respostas como evidenciado por mudanças no padrão de resposta. Exemplos de pico único (círculo), multipeak (retângulo) e planalto (retângulo pontilhado) Ca 2 + transientes são mostrados. (C) As mudanças nos padrões de resposta são especialmente evidentes usando concent diferenterações do grupo I mGluR agonista DHPG. Mais multipeak planalto e respostas são evidentes após incubação em TTX em comparação com o controlo de uma determinada concentração de agonista. (D) Aumento tempos de Ca 2 + respostas DHPG-evocadas são mais rápidos em astrócitos incubados em TTX em relação ao controle (painel superior), enquanto amplitudes não mudam (painel inferior), indicativo de "tudo-ou-nada" amplitudes de resposta, uma vez o limiar de resposta foi atingido. (E) Aumento tempos de astrócitos espontânea de Ca 2 + transientes também são mais rápidos em TTX incubadas vs controle incubadas astrócitos (painel superior), enquanto o percentual de astrócitos na população exibindo espontâneas Gq GPCR Ca 2 + atividade aumenta (painel inferior). Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 4. Gravação astrocitário diminuída atividade Gq GPCR e de grupo evocou eu mGluR Ca 2 + respostas seguintes aumento a longo prazo em APs neuronais por incubação em potássio extracelular elevada. (A) os traços representativos dos astrócitos Ca 2 + gravações de fatias incubadas em 5,0 mM K + ACSF para despolarizar neurônios e aumentar a sua taxa de disparo basal em relação ao controle ACSF (2,5 mM K + ACSF). Os astrócitos incubados com 5,0 mM K + ACSF exposição menos espontâneas somáticas Ca 2 + transientes e mais fraco DHPG respostas evocadas em comparação com os astrócitos incubados no controle ACSF. (B) uma comparação de padrões de respostas evocadas para várias concentrações de DHPG revela tipos de respostas mais fracas após crescimento a longo prazo em APs neuronais. (C) A redução no percentual de astrócitos no população exibindo espontânea de Ca 2 + observa-se a actividade após incubação a longo prazo em elevado K + comparado com o controlo ACSF (painel superior), enquanto que tempos de subida da actividade espontânea tornar mais lento (painel inferior). (D) Aumento tempos de astrócitos evocado Ca 2 + respostas a diferentes concentrações de DHPG ficar mais lenta após 5,0 mM K + tratamento em comparação com os astrócitos incubados no controle ACSF. Clique aqui para ver imagem ampliada.
Discussion
Os modelos de dimensionamento descritos representam métodos práticos para a pesquisa de plasticidade de longo prazo do grupo astrocitário eu mGluRs. Geração de imagens espontâneas e evocadas Ca 2 + eventos fornece um ensaio sensível para medir mudanças na atividade astrocitária Gq GPCR, como evidência empresa foi estabelecido que astrócitos Ca 2 + elevações ocorrem após liberação do IP 3 lojas sensível-R jusante da ativação Gq GPCR 10, 12, 17, 18. O percentual de astrócitos na população responder ao grupo I mGluR agonista eo padrão de tais Ca 2 + respostas relatam mudanças no grupo I mGluRs pelos astrócitos.
A técnica específica utilizada para carregar os astrócitos com Ca 2 + indicador é uma consideração importante na concepção de ensaios para observar as mudanças na actividade astrocitário Gq GPCR. Bolus de carga ou carregamento a granel vários astrócitos, ou patch-carregamento da braçadeira de astrócitos individuais pode ser utilizado para imagem transientes de Ca 2 + em astrócitos. Cada abordagem oferece certas vantagens e desvantagens. Preenchendo diretamente astrócitos com Ca 2 + indicador via patch clamp permite a identificação inequívoca da célula como um astrócitos, sem necessidade de um marcador secundário, como SR-101. Entrega de patch-clamp de indicador também permite a gravação de Ca 2 + atividade de pequenos compartimentos astrocitárias incluindo os processos de multa espessas, potencialmente mais profundas na fatia onde as células são mais saudáveis e com interações mais intactas com as sinapses (dependendo da potência do laser disponível). No entanto, patch-clamp carregamento sofre com baixa taxa de transferência como os dados são coletados uma célula de cada vez. De carregamento de grandes quantidades, por outro lado, permite que um grande número de astrócitos para ser carregado com Ca2 + indicador e fotografada simultaneamente. No entanto, apenas os astrócitos perto da superfície (<20 mm) da fatia são carregados, com a preocupação associadas sobre a saúde das células e sinapses intactas.
O protocolo de bolus de carregamento contrapressão aqui apresentado oferece um meio termo, com relativamente alto rendimento ea capacidade de monitorar Ca 2 + atividade mais profunda dentro da fatia (40-75 mm). Um aumento significativo na percentagem de astrócitos espontaneamente activas utilizando a técnica de bolus de carregamento é observada em relação ao volume de carga, o que sugere que as ligações entre as sinapses neuronais e os processos astrocíticos são mais completa 15. Com boa carga, pode-se frequentemente controlar Ca 2 + na actividade principais processos de astrócitos (dados não mostrados) ou, potencialmente, mesmo compartimentos menores usando microscopia de dois fotões. No entanto, os cuidados que precisam ser exercido em atribuir os processos menores para um astrocyte particular, como os limites mistura no fundo não específica coloração. Uma preocupação adicional com o uso de procedimentos de grandes quantidades de carga ou bolus de carregamento é a necessidade de um mar secundárioker para identificação dos astrócitos. Embora tenha sido conhecida há muitos anos que os astrócitos preferencialmente ocupam AM éster Ca 2 + indicadores, o marcador secundário SR-101 é frequentemente usado para verificar as células carregadas como astrócitos. SR-101 pode, por si só alterar a excitabilidade de neurónios intrínsecos 29. O uso de SR-101 corrobora a necessidade de realizar todos os Ca 2 + medições de astrócitos em TTX para limitar possíveis SR-101 efeitos sobre a excitabilidade neuronal. Supondo-se que ambos os grupos controle e experimentais incluem SR-101, o marcador em si não deve contabilizar os efeitos observados em astrócitos Ca 2 + sinalização seguintes manipulação de longo prazo dos potenciais de ação neuronais. SR-101 pode ser mais uma preocupação em alta K + experiências, no entanto, uma vez que pode reduzir a diferença entre os 2,5 mM de K + vs 5,0 mM K + se a taxa de disparo basal não é alterado proporcionalmente.
Uma abordagem muito promissora para entregar Ca 2 + 2 + corantes. Avanços significativos têm sido feitos ao longo dos últimos anos, com indicadores de cálcio geneticamente codificados (Gecis) direcionados para os astrócitos 30-32. Gecis pode ser entregue a astrócitos in vivo por microinjecção de vectores virais adeno-associados para uma região do cérebro de interesse, tais como o hipocampo. Expressão de Gecis é alcançada após cerca de duas semanas após a infecção viral 32. Há inúmeras vantagens oferecidas pela utilização de Gecis nos astrócitos. Em primeiro lugar, os vetores são direcionados para os astrócitos, utilizando um promotor específico do astrócitos, por isso as células marcadas são astrócitos 32. Em segundo lugar, o ruído de sinal-para-agora parece comparável com o que pode ser obtido usando a entrega de patch-clamp de corante, mas sem a capacidade de invasão de ter tido uma pipeta patch na célula 32. Em terceiro lugar, os indicadores podem ser delivered e expressa em tecidos adultos, o que é problemático usando métodos de entrega em massa-carga. Além disso, a expressão é mosaico, oferecendo a capacidade de diferenciar entre as várias astrócitos. Assim, vários astrócitos podem potencialmente ser trabalhada ao mesmo tempo, e ao mesmo tempo de gravação no soma e Branchlets finas, ao mesmo tempo. Portanto, potencialmente uma técnica simples pode ser usado no lugar de três técnicas diferentes (massa de carregamento, bolus de carregamento, e patch-clamp de carga) para gravar a atividade de escala de GPCRs Gq astrocitárias, aumentando significativamente a eficiência.
Uma desvantagem potencial do uso de entrega viral mediada de Ca 2 + indicadores de astrócitos é o possível efeito sobre a fatia de saúde 32. Os vectores virais adeno-associados utilizados para entregar as Gecis ter sido mostrado previamente para causar a gliose reactiva de 33 astrócitos. Preparação de fatias do cérebro em geral provavelmente inicia estágios iniciais da patologia, incluindo liberação de inflammatory moléculas 10. Portanto, combinado com o tempo de incubação longos necessários para induzir a descamação de receptores astrocíticos, utilização de Gecis entregues utilizando vectores virais que necessitam de receber consideração adicional no contexto da fatia de saúde nestes tipos de experiências.
Quando se emprega este protocolo, é importante ter em mente que o tempo de aplicação para o agonista para produzir uma resposta irá variar em função da disponibilidade de receptor. Para uma dada concentração do agonista, o tempo de aplicação terá de ser mais longo, se os receptores têm reduzida, e mais curtos, se os receptores têm ampliados, para a droga para alcançar uma concentração suficiente no tecido para activar os receptores suficientemente para produzir um Ca2 + resposta. Portanto, os tempos de aplicação de droga, e, potencialmente, as suas concentrações, pode ter de ser ajustado, dependendo da direcção pretendida para o dimensionamento. Por exemplo, a concentração de agonista pode ter de ser reduzido no case de TTX para evitar a saturação respostas, e aumentou após a incubação fatias em alto K + até mesmo ver uma resposta. Especificamente, a concentração de DHPG foi deslocado 5-15 fiM após o tratamento TTX 30-50 uM após tratamento 5,0 mM de K +, a fim de estudar de Ca 2 + os padrões de resposta, tal como de 5-15 uM é muitas vezes demasiado baixa para produzir respostas em fiáveis astrócitos após a escala para baixo do grupo I mGluRs.
Gravação de astrócitos Ca 2 + atividade fornece nenhuma evidência direta de inserção receptor ou internalização de ou para a membrana plasmática. No entanto, com base na similaridade notável dos dados com os dados de estudos anteriores in vitro que examinaram a relação direta entre os níveis de expressão Gq GPCR e espontânea e evocadas Ca 2 + transientes 21-24, a interpretação mais lógica das mudanças em Ca 2 + sinalização é que os níveis de expressão dos receptores de superfície de astrócitos têmalterados. Uma abordagem complementar pode ser uma consideração importante quando se quer fornecer evidências adicionais sobre o locus do efeito sobre o Ca 2 + atividade. Uma estratégia que usamos foi examinar o efeito de TTX incubação em fatias de hipocampo de ratos MrgA1R astrocitárias. Estes ratos transgênicos expressar uma Gq GPCR estrangeira (o MrgA1R) só nos astrócitos. Porque este não é o receptor nativo para o cérebro, não há neurotransmissor endógeno presente para alterar os seus níveis de actividade. Trabalho anterior sugeriu que este receptor envolve o mesmo intracelular moléculas de sinalização como grupo endógeno I mGluR nas mesmas astrócitos 34. Após incubação a longo prazo das fatias de ratinhos MrgA1R em TTX, não há diferenças nas respostas MrgA1R evocada por agonista, em comparação com o controlo de ninhada incubadas fatias poderia fornecer provas de que o efeito em astrócitos de Ca 2 + a actividade é devida a variações localizadas para o receptor da superfície, especialmente se as respostas do grupo I mGluR ainda são signifivamente melhorado nos mesmos astrócitos. Uma alternativa, no entanto estratégia talvez mais envolvido seria isolar astrócitos das fatias para análise de Western blot, enquanto uma fracção de membrana pode ser analisado para alterações nos níveis de expressão dos receptores de superfície. Fluorescência ativado celular (FACS) ou citometria de fluxo pode ser útil aqui.
As possíveis aplicações desta técnica para o estudo de neurónios, astrócitos e interacções astrócitos neuronal são muitos. Em nossos experimentos, único grupo DHPG evocadas eu mGluR foram estudados astrocitárias Ca 2 + respostas, em fatias de hipocampo agudas isoladas de ratos juvenis. Esta preparação não só tem as aferentes intactos (efeitos colaterais Schaffer), mas também os neurônios que dão origem a eles (células piramidais CA3), tornando-se possível manipular as taxas de disparo desses neurônios glutamatérgicos sobre as células pós-sinápticas (células piramidais CA1) e astrócitos no estrato radiatum cujos processos assoenviar um e com estas sinapses. A fatia do hipocampo aguda pode não ser a melhor preparação para a manipulação de taxas de disparo de outros tipos de neurônios, no entanto, como muitos aferentes são cortados a partir dos neurônios que dão origem a eles. No entanto, pode ser possível, em certas preparações fatia observar plasticidade de outros subtipos Gq GPCR astrocíticos. Por exemplo, as fatias podem ser preparados com os neurônios colinérgicos do prosencéfalo basal e suas projeções para hipocampo intacto. A incubação dessas fatias em TTX ou elevada K + afetaria taxas de disparo dos neurônios colinérgicos basais, levando a descamação dos receptores muscarínicos em astrócitos de oriens estrato, que recebem uma parcela significativa da entrada colinérgica 1. Uma alternativa abordagem ainda não testados para estudar o dimensionamento do receptor astrocitário dentro de uma área específica do cérebro, com todas as ligações intactas, enquanto ocorre escamação, poderia ser a utilização de um modelo in vivo, onde uma libertação prolongada de TTX é conseguido por implantação de um plastpolímero ic Elvax 40W acima da região de interesse 35. Esta abordagem tem sido usada anteriormente em um estudo de escalonamento neuronal, mas também deve ser aplicável a descamação astrocitária. Finalmente, com a leitura adequada, estudos futuros poderiam examinar outras famílias GPCR, incluindo mudanças na L s ou L i GPCRs. Alguém poderia prever astrocitário GABA B G i GPCRs a ser afetado com a inibição do disparo no local projetando interneurônios GABA dentro de qualquer preparação fatia. Desenvolvimento de novos indicadores que visam outras moléculas sinalizadoras, como um indicador de tempo real do segundo acampamento mensageiro, abriria toda uma nova área de pesquisa sobre comunicação neurônio receptor-a-astrócitos.
Escamação bidireccional de mGluRs astrocíticos por manipulação das taxas de queima neurónios basais fornece uma medida da sensibilidade dos astrócitos para libertação AP-mediada de neurotransmissor. Os astrócitos aparentemente pode sentir APs espontâneos e glutamatoliberação te a garantia Schaffer-CA1 sinapses celulares piramidal mesmo quando extracelular K + está dentro de uma faixa fisiológica. Embora a aplicação aguda da TTX não reduz a freqüência de astrócitos espontânea Ca 2 + actividade 18, 36, 37, o Ca 2 + atividade entre os astrócitos na população torna-se decorrelated 36, fornecendo evidências de que os receptores astrocitárias são detectores de AP. Isto sugere que os astrócitos sentir APs neuronal espontânea sem afetar em seu Ca 2 + actividade global. É amplamente aceito que as concentrações intracelulares de IP 3 precisa atingir um nível de limiar para estimular IP 3 Rs suficiente para levar a uma detectável Ca 2 + elevação. Poderia APs neuronal espontânea ativar GPCRs astrocitárias sem produzir mensuráveis Ca 2 + elevações? Estudos futuros poderão utilizar fluorescência Resonance Energy Transfer (FRET) ou um tecnol semelhante ique (tais como BRET) para analisar a relação entre a proteína G de acoplamento ao receptor (uma medida da activação do receptor) e Ca 2 + de libertação das reservas internas. BRET tem sido amplamente utilizado para a detecção in vitro de proteína G-a-GPCR de acoplamento 38, embora possa haver algum tempo antes de esta tecnologia esteja disponível para utilização em preparações de tecidos intactos. É possível que GPCRs Gq astrocitárias estão sendo ativados com muito mais freqüência do que pode ser gravado usando as ferramentas de Ca 2 + de imagem atualmente disponíveis. Além de sentir os potenciais de ação, GPCRs Gq astrocitárias também pode ser capaz de detectar liberação quântica miniatura de neurotransmissores como relatado em um estudo recente 39. O método de escalonamento bidireccional aqui descrito pode ser utilizado em estudos futuros para fornecer uma medida da extensão em que os GPCRs astrocitário Gq detectar libertação vesicular quântico de neurotransmissor, incluindo bafilomicina A1 no protocolo de incubação.
ntent "> Até aqui, os protocolos de dimensionamento apenas têm sido utilizadas em fatias de hipocampo de ratinhos jovens (p12-p18). Portanto, é actualmente desconhecido se o dimensionamento do receptor astrocitário também podia ser induzida em tecidos obtidos a partir de ratinhos adultos. Um estudo recente convincente sugere que a expressão grupo I de mGluR em astrócitos diminui consideravelmente após a primeira semana de idade e continua a descer até à idade adulta, com níveis muito baixos de expressão do receptor nos astrócitos adultos 40. Assim, seria interessante determinar se os mGluRs astrocíticos intensificar seguinte longo inibição prazo de disparo neuronal em fatias do hipocampo do rato adulto para níveis próximos aos observados em astrócitos de ratos juvenis. Este achado sugere que a expressão do receptor astrocitário não é estática a uma determinada idade, mas podem mudar rapidamente, dependendo de níveis de atividade neuronal. Em contraste com expressão reduzida de mGluRs grupo I em ratos adultos, estão surgindo evidências que os receptores adrenérgicos, incluindo & #945, 1A, 2A α, e β subtipos 1, são predominantemente expressos por astrócitos no cérebro adulto 3, 4. O adrenérgicos α 1A Gq GPCR pode ser um alvo atraente para futuros estudos de comunicação neurônio-a-astrócitos, inclusive se esses receptores são sensíveis a mudanças nas taxas de disparo dos neurônios adrenérgicos.Disclosures
Os autores pretendem revelar que a tetrodotoxina utilizado nestes estudos foi comprado de Abcam. Abcam não teve nenhuma participação nas hipóteses, design, ou coleta de dados. Toda a comunicação sobre o patrocínio da obra por Abcam ocorreu após o processo de revisão por pares foi completa.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer o Centro de UC Riverside para glia neuronais interações para valiosa discussão dos protocolos de escala e dados. Os autores também gostaria de dar um agradecimento sincero você Abcam por patrocinar a publicação de seu trabalho.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chamber Supplies | |||
| Brinkmann pipette storage container | Fisher Scientific | 03-491 | Use the drawer portion as the incubation chamber |
| Electrical drill | |||
| Flexible tubing | Tygon | R-3603 | |
| Silicone seam sealant | Also called aquarium seam sealer | ||
| Gas tank | 95% oxygen, 5% carbon dioxide | ||
| Natural beveled pipette tip | USA Scientific | 1111-1000 | Cut-to-fit to connect oxygenate lines |
| One-to-six lines manifold | Warner Instruments | 64-0210 (MP-6) | For the microloader-manifold apparatus |
| Microloader | Eppendorf | 5242 956.003 | For the microloader-manifold apparatus, cut-to-fit |
| Floating Bubble Rack | Bel Art Scienceware | F18875-0400 | For slice holder |
| 600 µm Sefar Nitex Nylon mesh | ELKO Filtering Co. | 06-600/51 | For slice holder |
| Krazy Glue | For slice holder | ||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Baxter | 1001936060 | |
| NaCl | Fisher | S271-3 | |
| KCl | Fisher | P333-500 | |
| CaCl2 | Fisher | C79-500 | |
| MgCl2 | Fisher | M33-500 | |
| NaH2PO4 | Fisher | S369-500 | |
| NaHCO3 | Fisher | S233-500 | |
| Glucose | Fisher | Fisher | |
| (±)-6-Hydroxy-2,5,7,8- tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox) | Acros Organics | 53188-07-1 | |
| Ascorbic acid | Acros Organics | 401471000 | |
| Tetrodotoxin citrate (TTX) | Abcam | ab120055 | |
| Sulforhodamine 101 (SR-101) | Sigma-Aldrich | 284912 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
| Pluronic Acid F-127 | Invitrogen, Molecular Probes | P6867 | |
| Oregon Green 488 BAPTA-1 AM *cell permeant (special packaging) | Invitrogen, Molecular Probes | O6807 | |
| (RS)-3,5-DHPG | Abcam | ab120020 | |
| Histamine | Sigma-Aldrich | H7125 | |
| Carbamoylcholine chloride (Carbachol) | Sigma-Aldrich | C4382 | |
| Adenosine 5’-ATP disodium (Na-ATP) | Sigma-Aldrich | A7699 | |
| Dissection Tools | |||
| Single-edge razor blade | GEM | 62-0161 | For bisection |
| Double edge razor blade | TED PELLA, INC. | 121-6 | For cutting slices |
| Mayo Scissors, supercut | WPI | 14010-15 | For decapitation |
| Fine iris scissors, straight | Fine Science Tools | 14094-11 | For cutting the skull |
| Iris forceps, curved | WPI | 15915 | To remove the skin and skull |
| Small spatula | To remove/transfer the brain | ||
| Dumostar Dumont #5 Biologie Tip forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | For hippocampus dissection |
| Glass Pasteur pipette | Fisher | 13-678-20B | For transferring brain slices |
| Pasteur pipette rubber bulb | Fisher | 03-448-22 | For transferring brain slices |
| Polystyrene 100 mm tissue culture dishes | Corning | 25020 | |
| Vibratome | Leica | VT 1200S | |
| Water bath | Fisher | ISOTEMP 210 | For warm incubation |
| Micropipette puller | Narishige | PC-10 | For bolus-loading pipette |
| Confocal microscope | Olympus | Olympus Fluoview 1000 | |
| Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber with PM-1 platform | Warner Instruments | RC-26GLP | diamond bath with low profile |
| Borosilicate glass pipette | World Precision Instruments | TW150F-4 | For bolus-loading pipette |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | ROE-200 | For bolus-loading pipette |
| Spin-X centrifuge tube filter with 0.22 µm cellulose acetate | Costar | 8161 |
References
- Araque, A., Martin, E. D., Perea, G., Arellano, J. I., Buno, W. Synaptically released acetylcholine evokes Ca2+ elevations in astrocytes in hippocampal slices. J. Neurosci. 22, 2443-2450 (2002).
- Navarrete, M., Araque, A. Endocannabinoids mediate neuron-astrocyte communication. Neuron. 57, 883-893 (2008).
- Bekar, L. K., He, W., Nedergaard, M. Locus coeruleus alpha-adrenergic-mediated activation of cortical astrocytes in vivo. Cereb. Cortex. 18, 2789-2795 (2008).
- Hertz, L., Lovatt, D., Goldman, S. A., Nedergaard, M. Adrenoceptors in brain: cellular gene expression and effects on astrocytic metabolism and Ca2. Neurochem. Int. 57, 411-420 (2010).
- Porter, J. T., McCarthy, K. D. Hippocampal astrocytes in situ respond to glutamate released from synaptic terminals. J. Neurosci. 16, 5073-5081 (1996).
- Bernardinelli, Y., et al. Astrocytes display complex and localized calcium responses to single-neuron stimulation in the hippocampus. J. Neurosci. 31, 8905-8919 (2011).
- Panatier, A., et al. Astrocytes are endogenous regulators of basal transmission at central synapses. Cell. 146, 785-798 (2011).
- Wang, X., et al. Astrocytic Ca2+ signaling evoked by sensory stimulation in vivo. Nat. Neurosci. 9, 816-823 (2006).
- Fiacco, T. A., Agulhon, C., McCarthy, K. D. Sorting out astrocyte physiology from pharmacology. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 49, 151-174 (2009).
- Agulhon, C., et al. Calcium Signaling and Gliotransmission in Normal vs Reactive Astrocytes. Front. Pharmacol. 3, 139 (2012).
- Nedergaard, M., Verkhratsky, A. Artifact versus reality--how astrocytes contribute to synaptic events. Glia. 60, 1013-1023 (2012).
- Nizar, K., et al. In vivo stimulus-induced vasodilation occurs without IP3 receptor activation and may precede astrocytic calcium increase. J. Neurosci. 33, 8411-8422 (2013).
- Sutton, M. A., et al. Miniature neurotransmission stabilizes synaptic function via tonic suppression of local dendritic protein synthesis. Cell. 125, 785-799 (2006).
- Ibata, K., Sun, Q., Turrigiano, G. G. Rapid synaptic scaling induced by changes in postsynaptic firing. Neuron. 57, 819-826 (2008).
- Xie, A. X., et al. Bidirectional scaling of astrocytic metabotropic glutamate receptor signaling following long-term changes in neuronal firing rates. PLoS ONE. 7, (2012).
- Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. Measurement of intracellular calcium. Physiol. Rev. 79, 1089-1125 (1999).
- Petravicz, J., Fiacco, T. A., McCarthy, K. D. Loss of IP3 receptor-dependent Ca2+ increases in hippocampal astrocytes does not affect baseline CA1 pyramidal neuron synaptic activity. J. Neurosci. 28, 4967-4973 (2008).
- Nett, W. J., Oloff, S. H., McCarthy, K. D. Hippocampal astrocytes in situ exhibit calcium oscillations that occur independent of neuronal activity. J. Neurophysiol. 87, 528-537 (2002).
- Garaschuk, O., Milos, R. I., Konnerth, A. Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo. Nat Protoc. 1, 380-386 (2006).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Kerr, J. N., Helmchen, F. Sulforhodamine 101 as a specific marker of astroglia in the neocortex in vivo. Nat. Methods. 1, 31-37 (2004).
- Prezeau, L., et al. Changes in the carboxyl-terminal domain of metabotropic glutamate receptor 1 by alternative splicing generate receptors with differing agonist-independent activity. Mol. Pharmacol. 49, 422-429 (1996).
- Shao, Y., McCarthy, K. D. Quantitative relationship between alpha 1-adrenergic receptor density and the receptor-mediated calcium response in individual astroglial cells. Mol. Pharmacol. 44, 247-254 (1993).
- Wang, S. S., Thompson, S. H. Measurement of changes in functional muscarinic acetylcholine receptor density in single neuroblastoma cells using calcium release kinetics. Cell Calcium. 15, 483-496 (1994).
- Ostasov, P., Krusek, J., Durchankova, D., Svoboda, P., Novotny, J. Ca2+ responses to thyrotropin-releasing hormone and angiotensin II: the role of plasma membrane integrity and effect of G11alpha protein overexpression on homologous and heterologous desensitization. Cell Biochem. Funct. 26, 264-274 (2008).
- Shelton, M. K., McCarthy, K. D. Hippocampal astrocytes exhibit Ca2+-elevating muscarinic cholinergic and histaminergic receptors in situ. J. Neurochem. 74, 555-563 (2000).
- Hermans, E., Challiss, R. A. Structural signalling and regulatory properties of the group I metabotropic glutamate receptors: prototypic family C G-protein-coupled receptors. Biochem. J. 359, 465-484 (2001).
- Zur Nieden, R., Deitmer, J. W. The Role of Metabotropic Glutamate Receptors for the Generation of Calcium Oscillations in Rat Hippocampal Astrocytes In Situ. Cortex. 16 (5), 676-687 (2005).
- de Ligt, R. A., Kourounakis, A. P., AP, I. J. Inverse agonism at G protein-coupled receptors: (patho)physiological relevance and implications for drug discovery. Br. J. Pharmacol. 130, 1-12 (2000).
- Kang, J., et al. Sulforhodamine 101 induces long-term potentiation of intrinsic excitability and synaptic efficacy in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Neuroscience. 169, 1601-1609 (2010).
- Tong, X., Shigetomi, E., Looger, L. L., Khakh, B. S. Genetically encoded calcium indicators and astrocyte calcium microdomains. Neuroscientist. 19, 274-291 (2013).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging. J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).
- Shigetomi, E., et al. Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses. J. Gen. Physiol. 141, 633-647 (2013).
- Ortinski, P. I., et al. Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition. Nat. Neurosci. 13, 584-591 (2010).
- Fiacco, T. A., et al. Selective stimulation of astrocyte calcium in situ does not affect neuronal excitatory synaptic activity. Neuron. 54, 611-626 (2007).
- Echegoyen, J., Neu, A., Graber, K. D., Soltesz, I. Homeostatic plasticity studied using in vivo hippocampal activity-blockade: synaptic scaling, intrinsic plasticity and age-dependence. PLoS One. 2, (2007).
- Aguado, F., Espinosa-Parrilla, J. F., Carmona, M. A., Soriano, E. Neuronal activity regulates correlated network properties of spontaneous calcium transients in astrocytes in situ. J. Neurosci. 22, 9430-9444 (2002).
- Takata, N., Hirase, H. Cortical layer 1 and layer 2/3 astrocytes exhibit distinct calcium dynamics in vivo. PLoS ONE. 3, e2525 (2008).
- Salahpour, A., et al. BRET biosensors to study GPCR biology, pharmacology, and signal transduction. Front. Endocrinol. 3 (105), (2012).
- Di Castro, M. A., et al. Local Ca2+ detection and modulation of synaptic release by astrocytes. Nat. Neurosci. 14, 1276-1284 (2011).
- Sun, W., et al. Glutamate-dependent neuroglial calcium signaling differs between young and adult. Science. 339, 197-200 (2013).
