In vitro metode for å observere E-selektin-medierte interaksjoner mellom Prostata sirkulerende tumorceller stammer fra pasienter og humane endotelceller

Summary

Vår rapport beskriver en unik metode for å visualisere og analysere CTC / EF interaksjoner i prostatakreft under fysiologiske strømningsforhold.

Abstract

Metastase er en prosess hvor tumorceller skur fra den primære tumor intravasate blod vaskulære og lymfatiske system, og dermed få tilgang til extravasate og danne en sekundær nisje. Den ekstravasering av tumorceller fra blod karsystemet kan studeres ved hjelp av endotelceller (ECS) og tumor celler oppnådd fra forskjellige cellelinjer. Innledende studier ble utført ved bruk av statiske forhold, men det har vært godt dokumentert at egenkapitalbevis oppfører seg annerledes under fysiologiske strømningsforhold. Derfor er forskjellige flyt kammer forsamlinger tiden blir brukt til å studere kreft celle interaksjoner med egenkapitalbevis. Nåværende flyt kammer forsamlinger tilbyr reproduserbare resultater ved hjelp av enten ulike cellelinjer eller væske ved ulike skjær stress forhold. Imidlertid, for å observere og studere interaksjoner med sjeldne celler slik som sirkulerende tumorceller (CTCS), er visse endringer som kreves for å gjøres til den konvensjonelle strømningskammermontasjen. CTCser et sjeldent cellepopulasjon blant millioner av blodceller. Følgelig er det vanskelig å oppnå en ren populasjon av CTCs. Forurensning av CTCs med ulike typer celler som normalt finnes i sirkulasjon er uunngåelig hjelp stede berikelse eller uttømming teknikker. I denne rapporten beskriver vi en unik metode for å fluorescently label sirkulerende prostatakreftceller og studere deres interaksjon med egenkapitalbevis i en egenmontert flyt kammer system. Denne teknikken kan bli ytterligere anvendt for å observere interaksjonene mellom prostata CTCs og en hvilken som helst protein av interesse.

Introduction

Metastasering er en kompleks prosess i flere trinn som fortsatt dårlig forstått. Den E-selectin/selectin ligand akse har vist seg å spille en viktig rolle i tumormetastase ved å fremme primære klebe interaksjoner mellom det vaskulære endotel og cancerceller ^1,2. Endotelial (E)-selektin er et transmembrant protein uttrykt av aktiverte endotelceller, mens forskjellige E-selektin-ligand (er) er uttrykt ved tumorceller ^3. Tallrike in vitro tilnærminger har blitt ansatt for å modellere E-selectin/selectin ligand interaksjoner mellom kreftceller og endotelceller (ECS) ^en. Å studere disse interaksjoner, er forskjellige flyt kammersystemer blir ansatt til å simulere blod karsystemet. Blant strømningskammersammenstillinger, er parallell-plate gjennomstrømningskammeret (PPFC) i forbindelse med EKB rutinemessig brukt som en in vitro-modell som simulerer in vivo skjærspenningsbetingelser. I dennefremgangsmåte, EKB er dyrket på en 35-mm fatet og etter å ha oppnådd et monosjikt, er EKB festet til PPFC og skjærspenning basert eksperimenter utføres.

Men PPFC og andre aktuelle systemer presentere mange begrensninger å studere selvklebende interaksjoner mellom sirkulerende tumorceller (CTCs) stammer fra pasienter og egenkapitalbevis, først og fremst, fordi CTCs er en sjelden populasjon av celler, kaster fra den primære svulsten, sirkulerte blant millioner av blodceller (1 CTC per 10 ⁹ blodceller) ^4.. Derfor, i motsetning til ubegrenset tilførsel av dyrkede cellelinjer, lave CTC teller føre til svært få og sjeldne CTC / EC interaksjoner, som krever skikkelig flyt kanalbredde for å registrere interaksjoner for avspilling analyse. I tillegg, siden pasient avledet CTCs er en uren befolkning, derfor et identifikasjonsmerke er nødvendig for å spore CTCs i spesifikke. For å løse dette problemet, har vi utviklet en ny metode for å identifisere prostatakreft (PCA) CTCs ved å utnytte det faktum at nesten alle disse CTCs uttrykke prostata spesifikt membran antigen (PSMA) på deres celleoverflaten ^5,6. I denne rapporten har vi brukt prostatakreft cellelinje, MDA PCa2b (MDA), for å demonstrere den potensielle nytten av vårt nye system for å studere prostata CTC interaksjoner med egenkapitalbevis, slutt å forstå mekanismen for metastasering.

Vår metodikk kan brukes for ulike skjær baserte forsøk simulerer in vivo karsystemet ^7-9. Foruten å undersøke PCA CTC / EC-interaksjoner, kan den aktuelle strømningskammeret systemet lett tilpasses for analyse av perifert blod mononukleære celler eller tumorceller 'interaksjoner med ECS. Den enkle demontering og remontering av flyten kammer, en microslide III ^(0,1) (heretter omtalt som microslide), tillater dyrking egenkapitalbevis i henhold perfusjon og stimulere egenkapitalbevis med ulike cytokiner å indusere protein uttrykk. Dessuten, kultivert EKB, rekombinante proteiner slik som E-og P-selectin kan være belagt på microslide og vekselvirkning med tumorceller kan observeres i henhold laminære strømningsforhold ^10.

Protocol

En. Culturing HUVECs på Microslides for Observing CTC-endothelial Interactions

1. Under panseret vev kultur, først skylle microslide, kanalbredde på 1 mm med PBS. Forsiktig belegge microslide med 200 pl av 50 pg / ml fibronectin (oppløst i PBS) under anvendelse av en 1 ml-Luer-lock sprøyte.
2. Dekk microslide med lokket, og holder det inne i vevskultur hette i 30 minutter. Langsom dispensering av væsken i microslide hindrer dannelse av bobler i kanalen.
3. Perfuse 200 ul varm (37 ° C) HUVEC vekstmedium (M199 medium, 1M HEPES, 20% FBS, 5 mg / ml heparin, 100 pg / ml endotelial cellevekstfaktor, og L-glutamin) over microslide og inkuber 20 min ved RT. Under perfusjon, forberede HUVEC cellesuspensjon.
4. Skyll HUVECs med PBS og tilsett 0,05% trypsin-EDTA i 1-2 min ved RT. Centrifuge HUVECs i 2 ml vekstmedium ved 180 x g i 5 min.
5. Mål cellekonsentrasjon ved hjelp av en neubauer hemocytometer og forberede 10 ⁷ HUVEC cells/100 mL vekstmedium. Deretter forsiktig fjerne mediet fra innløpet til microslide ved hjelp av en 200-mL pipette tips.
6. Ta med microslide til øyehøyde og bruke en 1-ml Luer-lock sprøyte, forsiktig perfuse 200 mL forberedt konsentrasjon av HUVECs inn i kanalen. Forsiktighet er nødvendig på dette trinnet for å hindre bobledannelse. Dersom bobler, holde perfusert for en litt lengre tid før bobler inn utløpskanalen.
7. Sett et likt volum (~ 80 mL) av HUVEC materiale i både innløpet og utløpet av microslide. Dette forhindrer strømning av celler i begge retninger.
8. Dekk til lysbilde og holde den i inkubatoren (37 ° C) for 1,5 hr.

2. Utarbeidelse av Flow Chamber Assembly for Night HUVEC kultur på en Microslide

1. Plasser en steril 20 ml sprøyte, kvinnelige og mannlige Luer kontakter, rør, og en sprøytepumpe i kuvøse for 15 kmn.
2. For minimal døde volum, kan du bruke rør med indre diameter på 0,04 inches. Mindre slange diameter hindrer bobledannelse.
3. Fyll 20 ml sprøyte med en varm (37 ° C) HUVEC media (12 ml). Fest slangen med kontaktene på sprøyten. Fjern boblene. Koble denne forsamlingen til microslide.
4. Fullstendig fylle innløpet av microslide med HUVEC media. Bring det fylt 20 ml sprøyte festet til koblingsstykket ved siden av microslide. Feste kontakten forsiktig til microslide.
5. Ta med oppsettet i inkubatoren og koble den til sprøytepumpen, satt til 10 mL / min skjærhastighet. La cellene O / N i inkubator ved 37 ° C.
6. Neste dag, demontere oppsettet ved å fjerne pluggen festet til innløpet av microslide.
7. Å oppregulere E-selectin uttrykk på egenkapitalbevis, forberede frisk vekst medium som inneholder IL-1β på 10 ng / ml i 4 ml media. Aspirer media i en 10-ml sprøyte. Fjern tHan media fra innløpet til microslide og koble sprøyten til lysbildet.
8. Sett sprøytepumpe ved 10 mL / min skjærhastighet i 4 timer i inkubatoren.

Tre. Utarbeidelse av Anti-PSMA (J591-488) Merket Prostate Cancer Cells

1. I løpet av IL-1β inkubasjon av HUVECs, forberede anti-PSMA J591-alexa488 merket PCA celler. Til 0,05% trypsin-EDTA i MDA-celler i 1 min. Ikke utsett cellene til trypsin for lengre tid som det kan påvirke glykopeptider stede på celleoverflaten. Enzyme ledig celle dissosiasjon reagens kan også brukes i stedet for trypsin. Sentrifuger ved 200 x g i 5 min.
2. Resuspender cellepelleten MDA i 1 ml H / H buffer (Hanks balanserte salt solution/0.1% HSA/10 mM HEPES / 1 mM CaCl _2). Til anti-PSMA J591-alexa488 antistoff ved 20 pg / ml i 30 minutter ved RT på et mørkt sted. Resuspender cellene i løpet av inkuberingen.
3. Etter 30 min sentrifuger celleløsningen ved 800 x g i 5 min. Aspisatsen og resuspender pelleten i 1 ml H / H buffer. Tell antall merkede celler og MDA bringe sluttkonsentrasjonen til 1x10 ⁶ celler / ml. Fyll en 5-ml sprøyte med J591-488 merket MDA celler og fjerne boblene.

4. Utarbeidelse av Anti-PSMA (J591-488) Merket CTCs Beriket fra PCA Pasienter

1. Samle 7,5 ml blod fra prostatakreftpasienter i en blå cap tube (som inneholder natriumsitrat). Forsiktig fortynnet blod 1:01 i 0,1% BSA / 1 mM EDTA / PBS.
2. Legg 5,3 ml Ficoll-Paque pluss i en 50-ml konisk tube. Layer fortynnet blod på toppen av Ficoll-Paque. Sentrifuger ved 400 xg i 30 min.
3. Pre-coat alle rør eller tips kommer i kontakt med CTCs med 2% FBS/RPMI-1640 / 1 mM CaCl _2/4 mM MgCl ₂ (R / S-buffer) for å forhindre ikke-spesifikk binding av CTCs til overflatene. Oppretthold 4 ° C temperatur for medier og buffere som kommer i kontakt med CTCs.
4. Samle perifert blod mononukleære celle (PBMC) fraksjoninnehold CTCs fra grensesnittet i en annen 50 ml konisk rør inneholdende 30 ml R / S-buffer. Sentrifuger ved 400 xg i 8 min.
5. Resuspender pelleten og vaskes på nytt i R / S-buffer ved 400 x g i 8 min. Etter sentrifugering, resuspender pelleten i H / H buffer. Til anti-PSMA J591-488-antistoff ved 20 pg / ml i 30 minutter ved RT på et mørkt sted.
6. Etter 30 minutter, sentrifuger PBMC som inneholder J591-488 merket CTCs ved 800 x g i 5 min. Suspender i H / H buffer. Fyll en 1 ml sprøyte (pre-coated med en R / S-buffer) med prøven.

5. Utarbeidelse av mikroskop, sprøytepumpe og Flow Chamber Assembly

1. Slå på invertert mikroskop og sett Kohler belysning på 10X objektiv. Bring sprøytepumpen på samme nivå som prøven stadium av mikroskopet og sette den på en dyn / cm ² skjærspenning (~ 10 mL / min).
2. Åpne Zeiss AxioVision programvare. Velg målet på dataskjermen. Lag en nymappen under verktøy i programvaren.
3. Åpne smarte eksperimenter alternativ i AxioVision og justere innstillingene for å spille inn korte 30 sek videoer for 30 min.
4. For levende fluorescerende video, angi bildealternativer-12 msek Exposure, 2 x 2 bin, 5 Gain. Disse parametrene hjelpe i å oppnå videoer nær video bildefrekvens (~ 23 bilder per sekund) med Zeiss MRM kameraet.
5. For å visualisere hele bredden av strømningskanal på 10 X objektiv på dataskjermen, bruke en C-mount adapter (0,63 xf/60 mm Interface).
6. Slå på kvikksølvlampe.
7. Plasser sprøyten og kontakten som inneholder cellene til sprøytepumpen.
8. Ta med IL-1β stimulert HUVECs fra inkubatoren. Fest kontakten til den fylt inntakskanalen til microslide inneholder HUVECs.
9. Koble utløpskanal med kontakten er festet til slangen. Plasser røret på en tallerken eller 15 ml konisk rør for å samle strømningen gjennom.
10. Start infusividere gjennom microslide ved 10 mL / min. Observere samspillet mellom endotelceller og merket MDA celler eller merket CTCs avledet fra pasienter under 488 nm-filter på epifluorescence mikroskop.
11. Start opptak eksperimentet som 30 sek korte videoer. Under avspilling analyse, måle rullende hastighet. Rolling hastighet måles ved å dividere avstanden som de celler over tid.

6. Immunostaining av Microslide

1. Fjern materialet fra innløpet og utløpet av microslide etter perfusert MDA celler på IL-1β stimulert HUVECs for 10 min.
2. Ved hjelp av en 200-mL spiss, settes varm (37 ° C) PBS inneholdende kalsium og magnesium inn i innløpet av microslide i 5 min. Vipp microslide bruker lokket som en rekvisitt på benken. Hold microslide i en skrå posisjon for alle inkubasjoner under farging.
3. Fix HUVECs ved perfusert varm 2% formaldehyd i innløpet
4. Legg triton-X 100 (0,1%) i 5% BSA i PBS i 10 min ved RT.
5. Skyll to ganger med PBS i 5 minutter hver. Blokker med 5% BSA i PBS i 30 min.
6. Inkuber med primært antistoff geit anti-VE-Cadherin (1:100) i 2,5% BSA O / N ved 4 ° C.
7. Neste dag, vask to ganger med PBS i 5 minutter hver. Legg sekundær esel anti-geit-antistoff 647 i 45 min. Vask to ganger med PBS i 5 minutter hver.
8. Inkuber ved RT med humanisert J591-alexa488 konjugert antistoff i 1 time.
9. Vask to ganger med PBS i 5 minutter hver. Legg DAPI i 5 min. Vask med destillert vann i 5 min.
10. Legg PBS (eller mowiol for langtidslagring). Visualiser microslide under konfokalmikroskop.

Representative Results

Figur 1 viser en O / N kultur av en monolayer av egenkapitalbevis på microslide. De glødeskall på Figur 1a viser at 100% av microslide er synlig ved 5X objektiv mens 70% er synlig ved hjelp av en 10X objektiv (Figur 1B). For E-selektin-medierte interaksjoner, er celler rullende ved kantene ikke betraktet som gjør mer enn 70% av den microslide tilgjengelig for video-opptak og avspilling analyse. I vår erfaring, først dette oppsettet monteringen krever litt øvelse for å kultur en monolayer av egenkapitalbevis i henhold til skjærspenning. Etter å etablere EC vekst på microslide, merket vi MDA, prostatakreftceller. Spesifisiteten av J591-488 anti-PSMA antistoffet ble testet ved hjelp av MDA celler piggete i frisk donor blod og merket med fluorescensmerkede anti-PSMA J591-488 monoklonalt antistoff. Ingen PSMA farging ble observert i PBMCs (data ikke vist). For å utelukke muligheten for at J591-488 binding og internalise alters rullende atferd, vi merket MDA celler med J591-488 og sammenlignet den rullende atferd med umerkede MDA celler på skjærspenninger som spenner 1-10 dyn / cm ^2. Boksplottet viser fordelingen av de rullende hastigheter på både umerkede og J591-488-merket MDA celler på IL-1β stimulert egenkapitalbevis på ulike skjær stress forhold. Ingen signifikant forskjell ble observert i de rullende hastigheter på 1 og 5 dyn / cm ^2, p = 0,634 og p = 0,601, henholdsvis (fig. 2). Ved høyere skjærspenning på 10 dyn / cm ² ble det gjennomført en statistisk signifikant forskjell observert mellom de rullende hastighetene av umerket og J591-488-merkede MDA-celler (p <0,05). Tidligere studier viser at ved høyere skjærspenning (> 3 dyn / cm ²⁾ forhold, færre kreftceller holder seg og rulle på egenkapitalbevis i forhold til lavere skjær stress forhold ^11,12. Derfor, er studier analyserer interaksjoner mellom tumorceller og EKB utført ved lavere skjærspenninger. Thoss, antyder våre data at CTCs kan merkes med J591-488 og at fluorescerende merking av CTCs ikke vesentlig påvirke rullende atferd på et bredt spekter av skjærspenning. Av notatet, det gjorde vi ikke merker noen CTC / EF interaksjoner i fravær av IL-1β stimulering av egenkapitalbevis (data ikke vist). I tillegg, som et bevis på prinsippet, vi også merket beriket CTCs isolert fra CRPC pasienter med J591-488 og perfusert løpet IL-1β stimulert egenkapitalbevis. En tids sydd videoen viser de ulike typer interaksjoner mellom prostata CTCs og egenkapitalbevis (Video 1). Videoen viser tre typer interaksjoner-stabile vedheft (CTCs ikke løsne selv etter 30 sek), tethering (CTCs feste og feste), og ingen interaksjoner. Microslides kan enkelt immunostained og fluorescerende bilder kan tas fordi de microslides har lignende optiske egenskaper som en 1,5-mm tykk dekkglass ^7. Figur 3 viser firmaet vedheft av J591-488 merket MDA celler akteruteh perfusjon løpet IL-1β stimulert egenkapitalbevis.

Figur 1:. Et monosjikt av endotel-celler dyrket på microslide HUVECs ble dyrket O / N på en fibronektin (50 ug / ml) belagt microslide III ^(0,1) i henhold til skjærspenning (1 dyn / cm ²⁾ A) Ved 5X objektiv. (EC Plan Neofluar 5X/0.16), ble fullstendig flytkanalbredde med kultivert egenkapitalbevis observert. Bredden av kanalen ble målt til å være 1,545.95 mikrometer. B) Ved 10X objektiv (Plan Neofluar 10X/0.3 Ph1), 1,065.79 mikrometer av kanalen ble observert. Dette tyder på at egenkapitalbevis kan dyrkes O / N på microslide og 70% av microslide er synlig på 10X forstørrelse. Vennligst klikk her for å se et større version av dette tallet.

Figur 2. Rolling hastighet av MDA celler på egenkapitalbevis dyrket på microslide. Én million umerkede og J591-488 merket MDA celler ble perfused løpet IL-1β stimulert HUVECs. Ti videoer på ulike felt på microslide ble registrert på 1,5, og 10 dyn / cm ^2. Skjærspenningsberegninger ble levert av produsenten. Offline analyse for den rullende hastighet ble utført. n = antall celler telles for valsehastighetsmålingene. Box plot viser fordelingen av de rullende hastigheter og median forskjeller mellom J591-488 merket og umerket MDA celler. p <0.05, Wilcoxon Rank Sum-testen. Sirklene representerer uteliggere. Vennligst klikk her for å view en større versjon av dette tallet.

Figur 3.. Immunostaining av MDA celler i samspill med egenkapitalbevis på microslide. Én million MDA celler ble perfused løpet IL-1β stimulert HUVECs på en dyn / cm ² skjærspenning. Etter perfusjon, ble farging utført på microslide. De gule pilspisser viser MDA cellene sitter godt til egenkapitalbevis. PSMA = Rød, VE-Cadherin = Grønn, DAPI = Blå. Den sammenslåtte bildet viser alle fargene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Video 1. En video som viser samspillet mellom IL-1β-stimulerte HUVECs og anti-PSMA J591-488-merket CTCs beriket fra en prostata kreft pasient. Et monolayer of HUVECs ble dyrket på microslide III ^(0,1) og anti-PSMA J591-488-merket i perifert blod mononukleære celler (PBMC) inneholder CTCs beriket fra en pasient ble perfundert på HUVECs på en dyn / cm ^2. Under perfusjon, ble kort 30 sek videoer innspilt, på ulike felt på microslide. Oppkjøpet tid på videoen vises på den nederste venstre hjørne. Ulike korte videoer ble sydd sammen for å kompilere denne videoen. På 02:16:36, går inn i en ikke-samspill CTC øvre venstre synsfelt; på 2:19:16, trer en annen ikke-samspill CTC venstre hjørne synsfelt; på 2:23:12, er et stabilt levd CTC i det øvre synsfelt sett. På 2:38:09, er et stabilt holdt CTC sees på høyre side av synsfeltet er sett. Denne videoen ble tatt med både lys-feltet og fluoriserende kanal for å vise interaksjoner av PBMCs også. På 02:40:18, ble stabilt følges CTCs observert i det øvre synsfelt. Denne videoen ble tatt ved hjelp av lys-feltetog fluoriserende kanal for å vise den rullende oppførsel i PBMCs. Fra 2:51:39 gjennom 2:51:49, ble en CTC stiller tethering atferd observert i bunnen synsfelt. Klikk her for å se video.

Discussion

På grunn av det lave antallet CTCs blant blodceller, er det vanskelig å isolere CTCs som en ren populasjon av celler. For å studere CTC / EC interaksjoner, utgjør den sjeldne og uren befolkning på CTCs to store utfordringer: a) Identifikasjon av CTCs blant blodceller; b) Observasjon av CTC / EF interaksjoner.

For å overvinne den første begrensning identifisere prostata CTCs blant blodceller, vi tok fordel av det faktum at nesten alle prostata kreftceller uttrykker PSMA ^seks. Monoklonalt antistoff J591-488 er internalisert etter celle-overflaten bindende som tyder på at PCA CTCs kan merkes ex vivo og studert for CTC / EF interaksjoner ^13. For optimal internalisering av antistoffet og maksimal immunfluorescens, vi inkubert MDA-celler med antistoff ved enten 4 ° C eller 37 ° C i enten 30 minutter eller en time. Vi har observert at maksimal immunfluorescens ble observert ved37 ° C i 30 min (data ikke vist), og immunofluorescent merking av prostata-celler ikke påvirker den rullende oppførsel sammenlignet med umerkede prostataceller.

For å overvinne den andre begrensningen, vi testet forskjellige flyt kammer forsamlinger som PPFC, BioFlux MicroFluidics system, og Microslides ^7. Den PPFC har blitt en bærebjelke for å undersøke leukocytter og svulst celle interaksjoner med egenkapitalbevis i henhold fysiologiske strømningsforhold ^ni. Denne strømnings systemet fungerer godt for å studere interaksjoner mellom stort antall celler slik som kreft-cellelinjer, men ikke ideell for å observere og studere interaksjoner mellom sjeldne celler slik som pasient-avledet CTCs og ECS. CTCs, å være sjeldne celler kan kommunisere med EKB tilfeldig på ethvert sted i strømningskanalen, og derfor blir opptak av hele bredden av strømningskanalen er nødvendig for å observere og å analysere de sjeldne tilfelle interaksjon mellom CTCs / ECS under avspilling analyse. The bredden av silastic pakning som brukes i PPFC (2,5 mm) gir ikke en fullstendig synsfelt henhold 10x objektiv. Mens, til en lavere forstørrelse enn 10X objektiv, blir det vanskelig å tydelig observere CTC / EC interaksjoner. I tillegg er lavt dødvolum i forbindelsesrørene vesentlig for å unngå overlapping av CTCs i forbindelsesrørene. De silastic forbindelsesrørene forsynt med standard PPFC har en bred indre diameter (0,16 tommer). Tvert i mot gir BioFlux MicroFluidics system fullt synsfelt i henhold 20X objektiv og er nyttig i å studere skjær-induserte endringer i ECS ¹⁴ imidlertid kreftceller begynner å slå seg ned i kammeret brønner som fører til ikke-ensartet strøm. BioFlux MicroFluidics er nyttig i å studere skjær-induserte endringer i ECS, er det imidlertid teknisk sett tungvint å bruke. Vår egenmontert flyt kammer ved hjelp microslide har en smal kanal bredde (1 mm) enn standard kanalbredden i PPFC, slik at mer observaelle området. Også, egenkapitalbevis er dyrket i henhold perfusjon i microslide simulere fysiologisk blodstrøm, i motsetning Ganguly et al. ^7, studier hvor egenkapitalbevis er dyrket på microslides (med bredere bredde kanal) i statiske forhold. Den dødvolum inne i forbindelsesrørene er redusert ved hjelp av et forbindelses rør med indre diameter på 0,02 tommer Kollektivt, immunofluorescent merking av prostatatumorceller, riktig strømningskanalbredde og mindre indre diameter av forbindelsesrørene gjør det mulig å identifisere og prostata CTCs observere deres samhandling med egenkapitalbevis.

Det er få kritiske trinn i protokollen, men med riktig pleie forsøkene kan kjøre problemfritt. Forebygging av bobler er avgjørende for eventuelle strømningsbaserte forsøk. I vår erfaring, ved hjelp av varme (37 ° C) vekst medium, kontakter, og sprøyten hindrer dannelse av bobler ved å redusere temperaturforskjeller. I addition, bør man være forsiktig mens du kobler sprøyten med microslide. Både koplingen festet til sprøyten og innløpet av microslide skal fylles til randen, og dermed hindre at bobledannelse. En av begrensningene i den teknikken er at siden microslide kanalen er 45 x 1 mm (lengde x bredde), kan det bare holder 4,5 ul vekstmedium. Derfor kan microslide ikke brukes for statisk kultur og krever kontinuerlig perfusjon av vekstmedium for å hindre at forsuring og opprettholde riktig tilførsel av næringsstoffer til HUVECs. Imidlertid kan kontinuerlig tilførsel av medium enkelt oppnås ved hjelp av en sprøytepumpe som er koblet til microslide i inkubatoren. Mens berikende CTCs fra prostata kreftpasienter, bør man sørge for å pre-coat alle rør, tips, pipetter og sprøyter som kommer i kontakt med CTCs med R / S buffer for å hindre ikke-spesifikk binding. I tillegg er alle trinnene etter Ficoll-Paque densitets-sentrifugering, except J591-488-antistoff inkubering bør gjennomføres ved 4 ° C for å hindre nedbrytning av CTCs.

Vår teknikk er unik i forhold til ulike metoder forståelse CTC biologi. Den foreliggende rapporten beskriver levedyktig fluorescerende immunolabeling av prostata CTCs som gjør det interessant å observere de funksjonelle egenskapene til prostata CTCs, foruten bare de fenotypiske egenskaper. I tillegg krever den beskrevne fremgangsmåte lav sample / reagens volum enn andre fremgangsmåter som gjør det til et ideelt system for immunfluorescens studier. Vår metodikk gir en unik plattform for å studere samspillet mellom prostata CTCs stammer fra pasienter og egenkapitalbevis, og dermed bidrar til å forstå de mekanismene som er involvert i utviklingen av prostatakreft metastaser. Denne teknikken har potensial for flere anvendelser som omfatter skjærstrømningsbaserte undersøkelser, for eksempel celle-celle interaksjoner ^8, celle-protein interaksjoner ¹⁵ 16, og skjær-induserte endringer i egenkapitalbevis ^14.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microslide	Ibidi	80331
Fibronectin	Millipore	FC010
Plastic tubing	Cole Parmer	EW-96115-08
Male Luer adapter	GlycoTech	31-001
Female Luer adapter	GlycoTech	31-001
Syringe pump	Chemyx Inc	Fusion 100
Luer-lock syringe	BD Biosciences	309628
M199 medium	Sigma	M7653
Endothelial Mitogen	Biomedical Technologies	BT-203
HBSS	Sigma	H9269
Anti-PSMA J591-488	Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology
Interleukin-1 beta	Peprotech	200-01B
Trypsin	Millipore	SM-2002-C
Heparin	Sigma	H-3149
HUVECs	Weill Cornell Medical College-Department of Surgery		provided by Marco Seandel
VE-Cadherin	Santa Cruz	sc-5648
10x objective	Zeiss Plan Neofluar
Enzyme free cell dissociation reagent	Millipore	S-004-C
RPMI-1640	Lonza	12-702-F
Ficoll-paque plus	GE healthcare	17-1440-02