In vitro-metod för att observera E-selektin-förmedlade interaktioner mellan Prostata cirkulerande tumörceller från patienter och humana endotelceller

Summary

Vår rapport beskriver en unik metod för att visualisera och analysera CTC / EC interaktioner i prostatacancer under fysiologiska flödesförhållanden.

Abstract

Metastas är en process vid vilken tumörceller skjul från den primära tumören intravasate blod vaskulära och lymfatiska systemet, varigenom, att få tillgång till extravasera och bildar en sekundär nisch. Kan studeras extravasation av tumörceller från blodet kärlsystemet med användning av endotelceller (ECS) och tumörceller erhållna från olika cellinjer. Initiala studier genomfördes med hjälp av statiska förhållanden, men det är väl dokumenterat att EC beter sig annorlunda under fysiologiska flödesförhållanden. Därför används olika flödeskammarpatroner som för närvarande används för att studera cancercellsinteraktioner med ECS. Nuvarande flöde kammar församlingar erbjuder reproducerbara resultat med hjälp av antingen olika cellinjer eller vätska vid olika skjuvning spänningsförhållanden. Men för att observera och studera interaktioner med sällsynta celler såsom cirkulerande tumörceller (CTCs) är vissa ändringar som behövs för att framställas med den konventionella flödeskammarenheten. CTCsär en sällsynt cellpopulation bland miljontals blodkroppar. Följaktligen är det svårt att erhålla en ren population av CTCs. Förorening av CTCs med olika typer av celler som normalt finns i cirkulationen är oundvikligt att använda nuvarande anrikning eller utarmning tekniker. I denna rapport beskriver vi en unik metod för att fluorescerande etikett cirkulerande prostatacancerceller och studera deras interaktioner med EC i en själv monterat flödeskammarsystem. Denna teknik kan tillämpas vidare att observera samspelet mellan prostata CTCs och något protein av intresse.

Introduction

Metastas är en komplex process i flera steg som förblir dåligt förstådda. Den E-selectin/selectin ligand-axeln har visat sig spela en viktig roll vid tumörmetastaser genom att främja primära adhesiva interaktioner mellan det vaskulära endotelet och cancerceller ^1,2. Endothelial (E)-selektin är ett transmembrant protein som uttrycks av aktiverade endotelceller, medan olika E-selektin-ligand (er) uttrycks av tumörceller ^3. Ett flertal in vitro-metoder har framgångsrikt använts för att modellera E-selectin/selectin ligand interaktioner mellan tumörceller och endotelceller (ECS) ^1. För att studera dessa interaktioner är olika flödeskammarsystem som tillämpas för att simulera blod kärlsystemet. Bland flödeskammarpatroner, är parallella plattor flödeskammaren (PPFC) jämförd med ECS användes rutinmässigt som en in vitro-modell som simulerar in vivo skjuvspänning betingelser. I dettametod, EC odlas på en 35-mm skålen och efter att åstadkomma ett monolager, är EC bifogas PPFC och skjuvspänningen baserade experiment utförs.

Men PPFC och andra aktuella system presentera många begränsningar att studera självhäftande interaktioner mellan cirkulerande tumörceller (CTCs) härrör från patienter och EC, i första hand, eftersom CTCs är en sällsynt population av celler, skjul från den primära tumören, som cirkulerar bland miljontals blodceller (1 CTC per 10 ⁹ blodkroppar) ^4. Därför, till skillnad obegränsat utbud av odlade cellinjer, låg CTC räknar leder till mycket få och sällsynta CTC / EG-interaktioner, som kräver korrekt flöde kanalbredd för att registrera interaktioner för uppspelning analys. Dessutom, eftersom patienten härledda CTCs är en oren befolkningen, alltså en identifikationsmarkör krävs för att spåra CTCs i specifika. För att lösa detta problem har vi utvecklat en ny metod för att identifiera prostatacancer (PCA) CTCs, genom att ta fördel av det faktum att praktiskt taget alla dessa CTCs uttrycka prostataspecifikt membranantigen (PSMA) på sin cellyta ^5,6. I denna rapport har vi använt prostatacancer cellinje, MDA PCa2b (MDA), för att visa potentialen nyttan av vårt nya system för att studera prostata CTC interaktioner med EC, så småningom att förstå mekanismen av metastaser.

Vår metod kan tillämpas för olika skjuvning baserade experiment som simulerar in vivo-kärlsystemet ^7-9. Förutom att undersöka PCa CTC / EC interaktioner, kan strömflödet kammarsystemet enkelt anpassas för analys av perifera mononukleära blodceller eller tumörcellernas interaktioner med EC. Lättheten att demontering och återmontering av flödet kammaren, en Micro III ^(0,1) (nedan kallat Micro), tillåter odling EC i perfusion och stimulerande EC med olika cytokiner att framkalla protein uttryck. Dessutom odlade EC, rekombinanta proteiner som E-och P-selektin kan beläggas på mikros och interaktion med tumörceller kan observeras under laminära flödesförhållanden ^10.

Protocol

1. Odling HUVECs på Microslides för observation CTC-endotel interaktioner

1. Under vävnadsodling huva, först skölja mikros, kanalbredd på 1 mm med PBS. Försiktigt belägga mikros med 200 ul av 50 ug / ml fibronektin (upplöst i PBS) med användning av en 1 ml luer-lockspruta.
2. Täck mikros med locket och hålla den inne i vävnadsodling huva i 30 min. Långsam avgivning av vätskan i mikros förhindrar bubbelbildning i kanalen.
3. BEGJUTA 200 pl av varm (37 ° C) HUVEC-odlingsmedium (M199 media, 1M HEPES, 20% FBS, 5 mg / ml heparin, 100 | ig / ml endotelcell-tillväxtfaktor och L-glutamin) över mikros och inkubera 20 min vid rumstemperatur. Under perfusionen, förbereda HUVEC cellsuspension.
4. Skölj HUVEC med PBS och tillsätt 0,05% trypsin-EDTA under 1-2 min vid rumstemperatur. Centrifugera HUVEC i 2 ml tillväxtmedium vid 180 xg under 5 min.
5. Mät cellkoncentrationen med hjälp av en neubaUER hemocytometer och förbereda 10 ⁷ HUVEC celler/100 pl odlingsmedium. Sedan försiktigt bort mediet från inloppet till mikros med hjälp av en 200-l pipettspetsen.
6. Ta med mikros till ögonhöjd och med hjälp av en 1-ml Luer-lock spruta försiktigt BEGJUTA 200 pl beredd koncentration av HUVECs i kanalen. Försiktighet krävs vid detta steg för att förhindra att bubblor bildas. Om bubblor, hålla perfusing för en något längre tid tills bubblor in i utloppskanalen.
7. Sätt en lika stor volym (~ 80 | il) av HUVEC-medier i både inloppet och utloppet hos mikros. Detta förhindrar flödet av celler i endera riktningen.
8. Täck bilden och hålla den i inkubatorn (37 ° C) under 1,5 timmar.

2. Beredning av Flow avdelningen Assembly for Overnight HUVEC kultur på en Micro

1. Placera en steril 20 ml-spruta, kvinnliga och manliga Luer anslutningar, slangar och en sprutpump i inkubatorn i 15 miln.
2. För minimal död volym, använd slang med innerdiameter på 0,04 inches. Mindre slangdiameter förhindrar bubbelbildning.
3. Fyll på 20 ml-spruta med varm (37 ° C) HUVEC-media (12 ml). Fäst slangen med kontakterna på sprutan. Ta bort bubblorna. Anslut den här enheten på mikros.
4. Helt fill inloppet hos mikros med HUVEC-media. Ta den fyllda 20-ml spruta kopplad till kontakten bredvid mikros. Fäst försiktigt kontakten till mikros.
5. Bring uppställningen i inkubatorn och ansluter den till sprutpumpen, inställd på 10 pl / min skjuvhastighet. Låt cellerna O / N i inkubatorn vid 37 ° C.
6. Nästa dag, ta isär den set-up genom att ta bort kontakten fäst vid inloppet till mikros.
7. För att uppreglera E-selektin-expression på ECS förbereda färskt tillväxtmedium innehållande IL-1β vid 10 ng / ml i 4 ml medium. Aspirera media i en 10 ml-spruta. Ta than media från inloppet till mikros och anslut sprutan till bilden.
8. Ställ in sprutpump vid 10 ul / min skjuvhastighet under 4 h i inkubatorn.

3. Beredning av anti-PSMA (J591-488) Märkta prostatacancerceller

1. Under IL-1β inkubation av HUVEC, förbereda anti-PSMA J591-Alexa488 märkt PCa celler. Addera 0,05% trypsin-EDTA till MDA-celler under 1 min. Utsätt inte cellerna för trypsin under längre tider eftersom det kan påverka de glykopeptider som är närvarande på cellytan. Enzym fri cell dissociation reagens kan också användas i stället för trypsin. Centrifugera vid 200 x g under 5 min.
2. Resuspendera MDA cellpelleten i 1 ml H / H-buffert (Hanks balanserade salt solution/0.1% HSA/10 mM HEPES / 1 mM _CaCl2). Lägg anti-PSMA J591-Alexa488 antikropp vid 20 ng / ml under 30 min vid RT på en mörk plats. Omsuspendera cellerna under inkubationen.
3. Efter 30 min, centrifugera cell lösningen vid 800 xg under 5 min. Aspiränta och suspendera pelleten i 1 ml H / H-buffert. Räkna de märkta MDA celler och bringa den slutliga koncentrationen till 1x10 ⁶ celler / ml. Fyll en 5-ml spruta med J591-488 märkta MDA celler och ta bort bubblorna.

4. Beredning av anti-PSMA (J591-488) Märkt CTCs Berikad från PCa Patienter

1. Samla 7,5 ml blod från patienter med prostatacancer i en blå mössa rör (som innehåller natriumcitrat). Späd försiktigt blod 1:1 i 0,1% BSA / 1 mM EDTA / PBS.
2. Lägg till 5,3 ml Ficoll-Paque plus i en 50-ml koniska rör. Layer utspädda blodet ovanpå Ficoll-Paque. Centrifugera vid 400 x g under 30 min.
3. Förbeläggning alla rör eller tips kommer i kontakt med CTCs med 2% FBS/RPMI-1640 / 1 mM _CaCl2 / 4 mm MgCl ₂ (R / S-buffert) för att förhindra icke-specifik bindning av CTCs till ytorna. Bibehåll 4 ° C temperatur av media och buffertar som kommer i kontakt med CTCs.
4. Samla upp den perifera mononukleära blodkroppar (PBMC)-fraktioninnehåller CTCs från gränssnittet i en annan 50 ml koniskt rör som innehåller 30 ml R / S-buffert. Centrifugera vid 400 x g under 8 min.
5. Suspendera pelleten och tvätta igen i R / S-buffert vid 400 xg under 8 minuter. Efter centrifugering återsuspendera pelleten i H / H-buffert. Lägg anti-PSMA J591-488 antikropp vid 20 ng / ml under 30 min vid RT på en mörk plats.
6. Efter 30 min, centrifugera PBMC innehållande J591-488 märkta CTCs vid 800 xg under 5 min. Resuspendera i H / H-buffert. Fyll en 1 ml-spruta (förbelagda med R / S-buffert) med provet.

5. Beredning av mikroskop, sprutpump och Flow avdelningen Assembly

1. Slå på inverterat mikroskop och ställ in Kohler belysning vid 10X objektiv. Bring sprutpumpen på samma nivå som prov skede av mikroskop och ställa in den på en dyn / cm ² skjuvspänning (~ 10 | il / min).
2. Öppna Zeiss AxioVision programvara. Välj målet på datorskärmen. Skapa ett nyttmapp under alternativet verktyg i programvaran.
3. Öppna alternativet smarta experiment i AxioVision och justera inställningarna för att spela in korta 30 sek filmer för 30 min.
4. För levande fluorescerande video, set-12 alternativ msek Exponering av bilden, 2 x 2 bin, 5 Gain. Dessa parametrar bidra till att uppnå videoklipp nära video bildhastighet (~ 23 bilder per sekund) med Zeiss MRM kamera.
5. För att visualisera hela bredden av flödeskanalen vid 10 X mål på datorskärmen, använd en C-mount adapter (0,63 xf/60 mm Interface).
6. Slå på kvicksilverlampa.
7. Placera sprutan och anslutningsdonet innehåller cellerna på sprutpumpen.
8. Bring IL-1β stimulerade HUVEC från inkubatorn. Anslut kontakten till den fyllda inloppskanalen i mikros innehåller HUVECs.
9. Anslut utloppskanalen med kontaktdonet fäst till slangen. Placera röret i en skål eller 15 ml koniska rör för att samla flödet genom.
10. Starta infusipå genom mikros vid 10 l / min. Observera samspelet mellan endotelceller och märkta MDA celler eller märkta CTCs härrör från patienter under 488-nm filter på epifluorescensmikroskop.
11. Starta inspelningen experimentet som 30 sek korta videor. Under uppspelningen analys, mäta rullhastigheten. Rullande hastighet mäts genom att dividera den sträcka av cellerna med tiden.

6. Immunfärgning av mikros

1. Ta bort materialet från inloppet och utloppet av mikros efter perfusing MDA celler på IL-1β-stimulerad HUVEC i 10 min.
2. Med hjälp av en 200-ul spets, sätta varmt (37 ° C) PBS innehållande kalcium och magnesium in i inloppet av mikros under 5 min. Luta mikros använda locket som rekvisita på bänken. Håll mikros i ett lutande läge för alla inkubationer under immunfärgning.
3. Fix HUVEC genom perfusion varm 2% formaldehyd i inloppet
4. Lägg Triton-X 100 (0,1%) i 5% BSA i PBS under 10 min vid rumstemperatur.
5. Skölj två gånger med PBS under 5 min vardera. Block med 5% BSA i PBS under 30 min.
6. Inkubera med primära antikroppen get-anti-VE-cadherin (1:100) i 2,5% BSA O / N vid 4 ° C.
7. Nästa dag, tvätta två gånger med PBS under 5 min vardera. Lägg sekundär åsna anti-get 647 antikropp under 45 min. Tvätta två gånger med PBS under 5 min vardera.
8. Inkubera vid RT med humaniserad J591-Alexa488-konjugerad antikropp under 1 timme.
9. Tvätta två gånger med PBS under 5 min vardera. Lägg DAPI under 5 min. Tvätta med destillerat vatten under 5 min.
10. Lägg till PBS (eller MOWIOL för långtidslagring). Visualisera mikros under konfokalmikroskop.

Representative Results

Figur 1 visar ett O / N kulturen i ett monoskikt av EC på mikros. De glödspån på Figur 1A visar att 100% av mikros är synlig med användning av 5X objektiv medan 70% är synlig med användning av ett 10X objektiv (Figur 1B). För E-selektin medierade interaktioner, celler rullande i kanterna inte betraktas som gör mer än 70% av mikros tillgängliga för video-inspelning och uppspelning analys. I vår erfarenhet, till en början denna set-up montering behöver lite praxis att odla ett monolager av EC i skjuvspänning. Efter upprättande av EG-tillväxt på mikros, märkt vi MDA, prostatacancerceller. Specificiteten av J591-488 anti-PSMA antikroppar testades med hjälp av MDA celler spetsade i friska givarblod och märkta med fluorescerande anti-PSMA J591-488 monoklonal antikropp. Ingen PSMA immunofärgning iakttogs i PBMC (data visas ej). För att utesluta möjligheten att J591-488-bindning och interna alters rullande beteende, märkt vi MDA celler med J591-488 och jämförde den rullande beteende med omärkta MDA celler vid skjuvspänningar som spänner från 1 till 10 dyn / cm ^2. Rutan tomt visar fördelningen av de rullande hastigheter av både omärkta och J591-488-märkta MDA-celler på IL-1β-stimulerad EC vid olika skjuv-spänningsförhållanden. Ingen signifikant skillnad observerades i de rullande hastigheter på 1 och 5 dyn / cm ^2, p = 0.634 och p = 0.601, respektive (figur 2). Vid högre skjuvspänning på 10 dyn / cm ^2, var en statistiskt signifikant skillnad observerades mellan de rullande hastigheter omärkt och J591-488-märkta MDA celler (p <0,05). Tidigare studier visar att vid högre skjuvspänning (> 3 dyn / cm ²⁾ förhållanden, färre tumörceller fastnar och rulla på EC jämfört med lägre skjuvning stressförhållanden ^11,12. Därför är studier som analyserar samspelet mellan tumörceller och EC fördes vid lägre skjuvspänningar. Thoss, tyder våra data att CTCs kan märkas med J591-488 och det fluorescerande märkning av CTCs påverkar inte signifikant den rullande beteende vid en lång rad skjuvspänning. Notera, vi inte upptäcka några CTC / EC interaktioner i frånvaro av IL-1β stimulering av EC (data visas ej). Dessutom, som ett bevis på princip, vi märkt också berikade CTCs isolerade från CRPC patienter med J591-488 och perfusion över IL-1β-stimulerad EC. En gång-sydd video visar de olika typer av interaktioner mellan prostata CTCs och EC (Video 1). Videon visar tre typer av interaktioner-stabila vidhäftning (CTCs inte lossna även efter 30 sek), tjudra (CTCs bifoga och sätt tillbaka), och inga interaktioner. Microslides lätt kan immunfärgades och fluorescerande bilder kan tas eftersom microslides har liknande optiska egenskaper som en 1,5-mm tjock täckglas ^7. Figur 3 visar fast adhesion av J591-488 inmärkta MDA celler akteruter perfusion över IL-1β-stimulerad EC.

Figur 1:. Ett monoskikt av endotelceller odlade på mikros HUVEC odlades O / N på ett fibronektin (50 | ig / ml) belagda mikros III ^(0,1) under skjuvspänning (1 dyn / cm ²⁾ A) vid 5X objektiv. (EG Plan Neofluar 5X/0.16), var komplett flödeskanalbredd med odlade EC observerats. Bredden på kanalen uppmättes till 1,545.95 xm. B) Vid 10X objektiv (Plan Neofluar 10X/0.3 Ph1), 1,065.79 xm av kanalen observerades. Detta tyder på att EC kan odlas O / N på mikros och 70% av mikros syns vid 10x förstoring. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2. Rullande hastighet av MDA celler på EC odlade på mikros. En miljon omärkta och J591-488 märkta MDA celler perfusion över IL-1β-stimulerad HUVEC. Tio filmer hos olika områden på mikros registrerades vid 1,5, och 10 dyn / cm ^2. Skjuvspänningen beräkningar som tillhandahålls av tillverkaren. Offline analys för rullning hastighet utfördes. n = antalet räknade celler för mätningarna rullhastigheten. Lådagram visar fördelningen av de rullande hastigheter och median skillnader mellan J591-488-märkta och omärkta MDA celler. p <0,05, Wilcoxon rank sum test. Cirklarna representerar extremvärden. Klicka här för att view en större version av denna figur.

Figur 3. Immunfärgning av MDA-celler interagerar med EC på mikros. En miljon MDA celler perfusion över IL-1β-stimulerad HUVEC vid 1 dyn / cm ² skjuvspänning. Efter perfusion var immunfärgning utfördes på mikros. De gula pilarna visar MDA celler fast följas ECS. PSMA = Röd, VE-cadherin = Grön, DAPI = blå. Den sammanslagna bilden visar alla färgerna. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.

Video 1. En video som visar samspelet mellan IL-1β-stimulerad HUVEC och anti-PSMA J591-488-märkta CTCs berikade från en prostatacancer patient. En monolager of HUVEC odlades på den mikros III ^(0,1) och anti-PSMA J591-488-märkta perifera mononukleära blodceller (PBMC) innehållande CTCs anrikad från en patient perfunderades på HUVEC vid en dyn / cm ^2. Under perfusion, var korta 30 sek filmer inspelade på olika områden på mikros. Förvärvet tiden för videon visas i nedre vänstra hörnet. Olika korta videor har sytt ihop för att sammanställa den här videon. Vid 2:16:36, en icke-interagerande CTC kommer in i övre vänstra synfältet; på 2:19:16, en annan icke-samverkande CTC in i vänstra hörnet synfältet; kl 02:23:12, är ett stabilt följs CTC i toppen mitt synfält sett. Vid 2:38:09, är en stabilt vidhäftad CTC visad på den högra sidan av synfältet ses. Denna video togs med både ljus-fält och fluorescerande kanal för att visa samspelet mellan PBMC också. Vid 2:40:18, stabilt vidhäftade CTCs observerats i den övre mitten synfält. Denna video togs med hjälp av ljusfältoch fluorescerande kanal för att visa den rullande beteende i PBMC. Från 02:51:39 till 02:51:49, var en CTC uppvisar tethering beteende observerades i det nedre synfältet. Klicka här för att se video.

Discussion

På grund av det låga antalet CTCs bland blodceller, är det svårt att isolera CTCs som en ren population av celler. För att studera CTC / EC interaktioner, den sällsynta och orena befolkning CTCs medför två stora utmaningar: a) Identifiering av CTCs bland blodceller; b) Observation av CTC / EG-interaktioner.

För att övervinna den första begränsningen att identifiera prostata CTCs bland blodkroppar, tog vi fördel av det faktum att nästan alla prostatatumörceller uttrycker PSMA ^6. Den monoklonala antikroppen J591-488 är internaliserad följande cellytebindande antyder att PCa CTCs kan märkas ex vivo och studerats för CTC / EG interaktioner ^13. För optimal internalisering av antikroppen och maximal immunofluorescens inkuberades vi MDA-celler med antikroppen vid antingen 4 ° C eller 37 ° C under antingen 30 min eller 1 tim. Vi observerade att maximal immunofluorescens observerades vid37 ° C i 30 min (data visas ej) och immunofluorescens märkning av prostataceller påverkade inte den rullande beteende jämfört med omärkta prostataceller.

För att övervinna den andra begränsningen, testade vi olika flödeskammaraggregat såsom PPFC, BioFlux mikrofluidik systemet, och Microslides ^7. Den PPFC har blivit en stöttepelare för att undersöka leukocyt och tumörcellsinteraktioner med EC under fysiologiska flödesförhållanden ^9. Denna flödessystem fungerar bra för att studera interaktioner mellan stort antal celler som cancer cellinjer, men inte idealiskt för att observera och undersöka samspelet mellan sällsynta celler såsom patientgenererade CTCs och EC. CTCs, som är sällsynta celler, kan interagera med EC slumpmässigt var som helst i flödeskanalen, därför är inspelning av hela bredden av flödeskanalen som krävs för att observera och analysera de sällsynta interaktioner händelse mellan CTCs / EC under uppspelning analys. The bredden av silastic packningen används i PPFC (2,5 mm) ger inte en fullständig synfält i 10x objektiv. Samtidigt, på en lägre förstoring än 10X objektiv, blir det svårt att tydligt observera CTC / EC interaktioner. Dessutom är väsentligt låg dödvolym i anslutningsrören för att undvika infångning av CTCs i anslutningsrören. De silastic anslutningsrören som följer med standard PPFC har en bred innerdiameter (0,16 tum). Tvärtom erbjuder BioFlux mikrofluidik system fullt synfält enligt 20X objektiv och är användbar för att studera skjuv-inducerade förändringar i EC ¹⁴ emellertid cancerceller börjar slå sig ner i kammarbrunnar som leder till icke-likformigt flöde. BioFlux mikrofluidik är användbar för att studera skjuv-inducerade förändringar i EC, dock är det tekniskt besvärliga att använda. Vår själv monterade flödeskammare med hjälp av Micro har en smal kanalbredd (1 mm) än standardkanalbredden i PPFC, vilket gör att mer observationstionella området. Även EC odlas under perfusion i mikros simulera fysiologiska blodflöde, till skillnad Ganguly et al. ^7, studier där EC odlas på microslides (med bredare kanalbredd) i statiska förhållanden. Den döda volymen inuti anslutningsrören minskas genom användning av en anslutningsslang med innerdiameter av 0,02 tum Kollektivt immunofluorescerande märkning av prostatatumörceller, lämplig flödeskanal bredd och mindre innerdiameter på anslutningsrören tillåter en att identifiera prostata CTCs och observera deras samspel med EC.

Det finns några viktiga steg i protokollet, men med rätt skötsel experimenten kan löpa smidigt. Förebyggande av bubblor är avgörande för alla flödesbaserade experiment. Enligt vår erfarenhet med användning av varm (37 ° C) odlingsmedium, kontakterna och spruta förhindrar bildandet av bubblor genom att minska de temperaturskillnader. I kompletten, bör man vara försiktig när du ansluter sprutan med mikros. Både kontaktdonet fäst i sprutan och inloppet hos mikros bör fyllas till brädden, och därigenom, förhindra bubbelbildning. En av begränsningarna i tekniken är att eftersom mikros kanal är 45 x 1 mm (längd x bredd), kan det bara ha 4,5 l av odlingsmedium. Därför kan Micro inte användas för statisk kultur och kräver kontinuerlig perfusion av tillväxtmedium för att förhindra försurning och upprätthålla god tillförsel av näringsämnen till HUVEC. Emellertid kan kontinuerlig tillförsel av mediet lätt uppnås genom användning av en sprutpump som är ansluten till mikros i inkubatorn. Samtidigt berikar CTCs från patienter med prostatacancer, bör man till pre-coat alla rör, tips, pipetter och sprutor som kommer i kontakt med CTCs med R / S-buffert för att förhindra icke-specifik bindning. Dessutom är alla stegen efter ficoll-Paque densitetscentrifugering, eXCEPT J591-488 antikropp inkubation bör utföras vid 4 ° C för att förhindra nedbrytning av CTCs.

Vår teknik är unik i jämförelse med olika metoder förstå CTC biologi. Den här rapporten beskriver livskraftig fluorescerande immunomärkning av prostata CTCs som gör att man kan följa de funktionella egenskaperna hos prostata CTCs, förutom bara de fenotypiska egenskaper. Dessutom kräver den beskrivna metoden låg prov / reagensvolym än andra metoder gör det ett idealiskt system för immunfluorescensstudier. Vår metodik ger en unik plattform för att studera interaktioner mellan prostata CTCs härrör från patienter och EC därmed hjälpa till att förstå de mekanismer som är involverade i utvecklingen av prostatacancermetastaser. Denna teknik har potential för flera applikationer med skjuvflöde baserade studier, såsom cell-cell interaktioner ^8, cell-proteininteraktioner ¹⁵ 16, och skjuvning-inducerade förändringar i EC ^14.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microslide	Ibidi	80331
Fibronectin	Millipore	FC010
Plastic tubing	Cole Parmer	EW-96115-08
Male Luer adapter	GlycoTech	31-001
Female Luer adapter	GlycoTech	31-001
Syringe pump	Chemyx Inc	Fusion 100
Luer-lock syringe	BD Biosciences	309628
M199 medium	Sigma	M7653
Endothelial Mitogen	Biomedical Technologies	BT-203
HBSS	Sigma	H9269
Anti-PSMA J591-488	Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology
Interleukin-1 beta	Peprotech	200-01B
Trypsin	Millipore	SM-2002-C
Heparin	Sigma	H-3149
HUVECs	Weill Cornell Medical College-Department of Surgery		provided by Marco Seandel
VE-Cadherin	Santa Cruz	sc-5648
10x objective	Zeiss Plan Neofluar
Enzyme free cell dissociation reagent	Millipore	S-004-C
RPMI-1640	Lonza	12-702-F
Ficoll-paque plus	GE healthcare	17-1440-02