Il nostro rapporto descrive un metodo unico per visualizzare e analizzare le interazioni CTC / CE del cancro della prostata in condizioni di flusso fisiologiche.
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Articolo metodologico
Nel metodo in vitro per osservare le interazioni E-selectina-mediata Tra prostata cellule tumorali circolanti derivate da pazienti e Cellule endoteliali umane
In questo articolo
Sommario
Abstract
La metastasi è un processo in cui le cellule tumorali capannone dal tumore primario intravasate vascolare sangue e del sistema linfatico, in tal modo, l'accesso a estravasare e formare una nicchia secondaria. Il stravaso delle cellule tumorali dal sistema vascolare sanguigno può essere studiata utilizzando cellule endoteliali (EC) e cellule tumorali ottenute da linee cellulari differenti. Gli studi iniziali sono stati condotti utilizzando condizioni statiche, ma si è ben documentato che i CE si comportano in modo diverso in condizioni di flusso fisiologiche. Pertanto, diversi gruppi da camera di flusso sono attualmente utilizzate per studiare le interazioni delle cellule cancro con EC. Assemblee camera di flusso attuali offrono risultati riproducibili utilizzando sia linee cellulari diversi o fluido a differenti condizioni di stress di taglio. Tuttavia, per osservare e studiare le interazioni con cellule rare come cellule tumorali circolanti (CTC), sono necessarie alcune modifiche da apportare al gruppo di camera di flusso convenzionale. CTCsono una popolazione di cellule rare tra milioni di cellule del sangue. Di conseguenza, è difficile ottenere una popolazione pura di CTC. Contaminazione delle CTC con diversi tipi di cellule che normalmente si trovano in circolazione è inevitabile utilizzare presente arricchimento o tecniche di esaurimento. Nel presente rapporto, descriviamo un metodo unico per etichette circolanti cellule tumorali della prostata modo fluorescente e studiare le loro interazioni con EC in un sistema di camera di flusso auto-assemblati. Questa tecnica può essere ulteriormente applicato ad osservare le interazioni tra CTC prostata e qualsiasi proteina di interesse.
Introduzione
Metastasi è un complesso processo multi-step che rimane poco conosciuta. L'asse ligando E-selectin/selectin ha dimostrato di giocare un ruolo importante nella metastasi del tumore promuovendo interazioni adesive principali tra l'endotelio vascolare e cellule tumorali 1,2. Endoteliale (E)-selectina è una proteina transmembrana espressa dalle cellule endoteliali attivate, mentre differente ligando E-selectina (s) sono espressi dalle cellule tumorali 3. Numerosi approcci in vitro sono stati impiegati con successo per modellare interazioni ligando E-selectin/selectin tra cellule tumorali e cellule endoteliali (EC) 1. Per ....
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Protocollo
1. Coltura HUVECs su Microslides per interazioni Observing CTC-endoteliali
- Sotto il cofano di coltura tissutale, prima sciacquare la MicroSlide, larghezza del canale di 1 mm con PBS. Cappotto delicatamente il MicroSlide con 200 ml di 50 mg / ml fibronectina (sciolto in PBS) usando una siringa Luer-lock da 1 ml.
- Coprire il MicroSlide con il coperchio e tenerlo all'interno della cappa coltura tissutale per 30 min. Erogazione lenta del liquido nel MicroSlide impedisce la formazione di bolle nel canale.
- Profumato 200 ml di acqua calda (37 ° C) HUVEC mezzo di crescita (M199 media, 1M HEPES, 20% FBS, 5 mg / ml di eparina, 100 pg / ml di f....
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Risultati
La Figura 1 mostra una cultura O / N di un monostrato di cellule endoteliali sulla MicroSlide. I valori di scala sulla figura 1A mostra che il 100% del MicroSlide è visibile usando obiettivo 5X mentre il 70% è visibile usando un obiettivo 10X (Figura 1B). Per interazioni E-selectina mediata, cellule rotolamento ai bordi non sono considerati che rende più del 70% del MicroSlide disponibile per il video-registrazione e analisi riproduzione. Nella nostra esperienza, inizia.......
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Discussione
A causa del basso numero di CTC tra cellule del sangue, è difficile isolare CTC come una popolazione pura di cellule. Al fine di studiare le interazioni CTC / CE, la popolazione rara e impura delle CTC pone due sfide importanti: a) identificazione di CTC tra le cellule del sangue; b) Osservazione delle interazioni CTC / CE.
Per superare la prima limitazione di identificare CTC prostata tra le cellule del sangue, abbiamo approfittato del fatto che praticamente tutt.......
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Dichiarazioni
Dr. Bander è l'inventore di brevetti che vengono assegnati a Cornell Research Foundation ("CRF") per l'anticorpo J591 utilizzato in questo articolo. Dr. Bander è un consulente per e possiede azioni in BZL Biologics, la società a cui i brevetti sono stati concessi in licenza da CRF per ulteriore ricerca e sviluppo.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento del Dipartimento della Difesa prostatico Programma di Ricerca sul Cancro (W81XWH-12-1-0124), U54CA143876 dal National Cancer Institute, e il Robert McCooey Genitourinary Oncology Research Fund. Vorremmo ringraziare il Dott. Annarita Lorenzo (Dipartimento di Patologia) per fornire gli anticorpi VE-caderina, e il dottor Marco Seandel (Dipartimento di Chirurgia) per la fornitura di HUVECs.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Microslide | Ibidi | 80331 | |
| Fibronectina | Millipore | FC010 | |
| Tubo in plastica | Cole Parmer | EW-96115-08 | |
| Adattatore Luer maschio | GlycoTech | 31-001 | |
| Adattatore Luer femmina | GlycoTech | 31-001 | |
| Pompa a siringa | Chemyx Inc | Fusion 100 | |
| Siringa Luer-lock | BD Biosciences | 309628 | |
| M199 medium | Sigma | M7653 | |
| Mitogeno endoteliale | Tecnologie biomediche | BT-203 | |
| HBSS | Sigma | H9269 | |
| Anti-PSMA J591-488 | Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology | ||
| Interleuchina-1 beta | Peprotech | 200-01B | |
| Tripsina | Millipore | SM-2002-C | |
| Eparina | Sigma | H-3149 | |
| HUVECs | Weill Cornell Medical College-Dipartimento di Chirurgia | fornito da Marco Seandel | |
| VE-Cadherin | Santa Cruz | sc-5648 | |
| 10x obiettivo | Zeiss Plan Neofluar | ||
| Reagente di dissociazione cellulare libera da enzimi | Millipore | S-004-C | |
| RPMI-1640 | Lonza | 12-702-F | |
| Ficoll-paque plus | GE healthcare | 17-1440-02 |
Riferimenti
- Dimitroff, C. J., Lechpammer, M., Long-Woodward, D., Kutok, J. L. Rolling of human bone-metastatic prostate tumor cells on human bone marrow endothelium under shear flow is mediated by E-selectin. Cancer Res. 64, 5261-5269 (2004).
- Barthel, S. R., Gavino, J. D., Descheny, L., Dimitroff, C. J.
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Ristampe e permessi
