Summary
Il nostro rapporto descrive un metodo unico per visualizzare e analizzare le interazioni CTC / CE del cancro della prostata in condizioni di flusso fisiologiche.
Abstract
La metastasi è un processo in cui le cellule tumorali capannone dal tumore primario intravasate vascolare sangue e del sistema linfatico, in tal modo, l'accesso a estravasare e formare una nicchia secondaria. Il stravaso delle cellule tumorali dal sistema vascolare sanguigno può essere studiata utilizzando cellule endoteliali (EC) e cellule tumorali ottenute da linee cellulari differenti. Gli studi iniziali sono stati condotti utilizzando condizioni statiche, ma si è ben documentato che i CE si comportano in modo diverso in condizioni di flusso fisiologiche. Pertanto, diversi gruppi da camera di flusso sono attualmente utilizzate per studiare le interazioni delle cellule cancro con EC. Assemblee camera di flusso attuali offrono risultati riproducibili utilizzando sia linee cellulari diversi o fluido a differenti condizioni di stress di taglio. Tuttavia, per osservare e studiare le interazioni con cellule rare come cellule tumorali circolanti (CTC), sono necessarie alcune modifiche da apportare al gruppo di camera di flusso convenzionale. CTCsono una popolazione di cellule rare tra milioni di cellule del sangue. Di conseguenza, è difficile ottenere una popolazione pura di CTC. Contaminazione delle CTC con diversi tipi di cellule che normalmente si trovano in circolazione è inevitabile utilizzare presente arricchimento o tecniche di esaurimento. Nel presente rapporto, descriviamo un metodo unico per etichette circolanti cellule tumorali della prostata modo fluorescente e studiare le loro interazioni con EC in un sistema di camera di flusso auto-assemblati. Questa tecnica può essere ulteriormente applicato ad osservare le interazioni tra CTC prostata e qualsiasi proteina di interesse.
Introduction
Metastasi è un complesso processo multi-step che rimane poco conosciuta. L'asse ligando E-selectin/selectin ha dimostrato di giocare un ruolo importante nella metastasi del tumore promuovendo interazioni adesive principali tra l'endotelio vascolare e cellule tumorali 1,2. Endoteliale (E)-selectina è una proteina transmembrana espressa dalle cellule endoteliali attivate, mentre differente ligando E-selectina (s) sono espressi dalle cellule tumorali 3. Numerosi approcci in vitro sono stati impiegati con successo per modellare interazioni ligando E-selectin/selectin tra cellule tumorali e cellule endoteliali (EC) 1. Per studiare queste interazioni, diversi sistemi di camera di flusso vengono impiegati per simulare sistema vascolare sanguigno. Tra assembly camera di flusso, a piatti paralleli camera di flusso (PPFC) in combinazione con EC è abitualmente utilizzato come modello in vitro simulando in condizioni di stress taglio vivo. In questometodo, EC sono coltivate su un piatto da 35 mm e dopo aver ottenuto un monostrato, EC sono attaccati alla PPFC e gli esperimenti shear stress sulla base vengono eseguite.
Tuttavia, PPFC e altri sistemi attuali presentano molte limitazioni per studiare le interazioni adesive tra cellule tumorali circolanti (CTC) derivate da pazienti e EC, in primo luogo, perché CTC sono una rara popolazione di cellule, versato dal tumore primario, che circola tra milioni di cellule del sangue (1 CTC per 10 9 cellule ematiche) 4. Quindi, a differenza di fornitura illimitata di linee cellulari in coltura, bassa conta CTC portare ad interazioni molto poche e rare CTC / CE, che richiede un'adeguata larghezza di canale di flusso per registrare le interazioni per l'analisi di riproduzione. Inoltre, dal momento che pazienti CTC derivati sono una popolazione impura, quindi un marcatore di identificazione è necessaria per tenere traccia CTC in specifico. Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato un nuovo metodo per identificare il cancro alla prostata (PCA) CTCs approfittando del fatto che la quasi totalità di questi CTC esprimono prostatico specifico antigene di membrana (PSMA) sulla loro superficie cellulare 5,6. In questa relazione, abbiamo utilizzato la linea di cellule di cancro alla prostata, MDA PCa2b (MDA), per dimostrare la potenziale utilità del nostro nuovo sistema per lo studio della prostata interazioni CTC con EC, alla fine di capire il meccanismo di metastasi.
La nostra metodologia può essere applicata per vari esperimenti di taglio basato simulano nel sistema di vivo vascolare 7-9. Oltre ad esaminare le interazioni PCa CTC / CE, l'attuale sistema di camera di flusso potrebbe essere facilmente adattato per l'analisi di cellule mononucleari del sangue periferico o interazioni cellule tumorali "con EC. La facilità di smontaggio e rimontaggio della camera di flusso, un MicroSlide III (0,1) (in appresso MicroSlide), permette la coltura EC sotto perfusione e stimolante EC con differenti citochine di indurre protein espressione. Inoltre, colta EC, proteine ricombinanti come la P-selectina-E e possono essere rivestiti sul MicroSlide e le interazioni con le cellule tumorali possano essere rispettati in condizioni di flusso laminare 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Coltura HUVECs su Microslides per interazioni Observing CTC-endoteliali
- Sotto il cofano di coltura tissutale, prima sciacquare la MicroSlide, larghezza del canale di 1 mm con PBS. Cappotto delicatamente il MicroSlide con 200 ml di 50 mg / ml fibronectina (sciolto in PBS) usando una siringa Luer-lock da 1 ml.
- Coprire il MicroSlide con il coperchio e tenerlo all'interno della cappa coltura tissutale per 30 min. Erogazione lenta del liquido nel MicroSlide impedisce la formazione di bolle nel canale.
- Profumato 200 ml di acqua calda (37 ° C) HUVEC mezzo di crescita (M199 media, 1M HEPES, 20% FBS, 5 mg / ml di eparina, 100 pg / ml di fattore di crescita delle cellule endoteliali, e L-glutammina) sul MicroSlide e incubare per 20 min a RT. Durante la perfusione, preparare la sospensione di cellule HUVEC.
- Risciacquare HUVECs con PBS e aggiungere 0,05% tripsina-EDTA per 1-2 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare HUVEC in 2 ml di mezzo di crescita a 180 xg per 5 min.
- Misurare la concentrazione cellulare utilizzando un neubaUER emocitometro e preparare 10 7 HUVEC cells/100 microlitri mezzo di crescita. Poi, rimuovere con attenzione il mezzo dall'ingresso della MicroSlide utilizzando un puntale di 200 microlitri.
- Portare il MicroSlide a livello degli occhi e l'utilizzo di un 1 ml siringa Luer-lock, profumato delicatamente 200 ml di concentrazione preparata del HUVECs nel canale. Si richiede cautela in questa fase per evitare la formazione di bolle. Se compaiono le bolle, tenere perfusione per un tempo leggermente più lungo finché le bolle entrano nel canale di uscita.
- Mettere un volume uguale (~ 80 microlitri) di supporto HUVEC sia l'ingresso e l'uscita del MicroSlide. Ciò impedisce il flusso di celle in entrambe le direzioni.
- Coprire il vetrino e tenerlo in incubatore (37 ° C) per 1,5 ore.
2. Preparazione della camera di flusso dell'Assemblea per Overnight cultura HUVEC su un MicroSlide
- Inserire una siringa sterile da 20 ml, connettori maschio e femmina Luer, tubi e una pompa a siringa in incubatrice per 15 kmn.
- Per volume morto minimo, utilizzare il tubo con diametro interno di 0,04 pollici. Più piccolo diametro del tubo impedisce la formazione di bolle.
- Riempite la siringa da 20 ml con acqua calda (37 ° C) HUVEC supporto (12 ml). Fissare il tubo con i connettori sulla siringa. Rimuovere le bolle. Collegare questo gruppo alla MicroSlide.
- Riempire completamente l'ingresso della MicroSlide con i media HUVEC. Portare la siringa preriempita da 20 ml collegata al connettore vicino al MicroSlide. Applicare delicatamente il connettore al MicroSlide.
- Portare il set-up in incubatrice e collegarlo alla pompa siringa, fissato a 10 ml / min velocità di taglio. Lasciare le cellule O / N in incubatrice a 37 ° C.
- Il giorno dopo, smontare il set-up rimuovendo il connettore collegato all'ingresso del MicroSlide.
- Per aumentare l'espressione E-selectina sulle cellule endoteliali, preparare il terreno di coltura fresco contenente IL-1β a 10 ng / ml in 4 ml di media. Aspirare i media in una siringa da 10 ml. Rimuovere tegli materiale dal ingresso del MicroSlide e collegare la siringa al vetrino.
- Impostare la pompa a siringa 10 ml / min velocità di taglio per 4 ore in incubatrice.
3. Preparazione di Anti-PSMA (J591-488) con etichetta cellule tumorali della prostata
- Durante l'IL-1β incubazione di HUVECs, preparare anti-PSMA J591-alexa488 etichettati cellule APC. Aggiungere 0,05% tripsina-EDTA a cellule MDA per 1 min. Non esporre le cellule di tripsina per tempi più lunghi in quanto può influenzare i glicopeptidi presenti sulla superficie cellulare. Enzima reagente dissociazione cellulare libero può anche essere usato al posto di tripsina. Centrifugare a 200 xg per 5 min.
- Risospendere il pellet di cellule MDA in 1 ml di H / H tampone (Hanks salina bilanciata solution/0.1% HSA/10 mM HEPES / 1 mM CaCl 2). Aggiungi anticorpo J591-alexa488 anti-PSMA a 20 mg / ml per 30 min a RT in un luogo buio. Risospendere le cellule durante l'incubazione.
- Dopo 30 minuti, centrifugare la soluzione di cellule a 800 xg per 5 min. Aspivotare e risospendere il pellet in 1 ml di tampone H / H. Contare le cellule MDA etichettati e per portare la concentrazione finale di 1x10 6 cellule / ml. Riempire una siringa da 5 ml con J591-488 cellule MDA etichettati e rimuovere le bolle.
4. Preparazione di Anti-PSMA (J591-488) etichetta CTC arricchito da PCa pazienti
- Raccogliere 7,5 ml di sangue da pazienti affetti da cancro della prostata in un tubo tappo blu (contenente sodio citrato). Diluire delicatamente 1:01 sangue nel 0,1% BSA / 1 mM EDTA / PBS.
- Aggiungere 5.3 ml di Ficoll-Paque più in una provetta da 50 ml. Strato diluito sangue sopra il Ficoll-Paque. Centrifugare a 400 xg per 30 min.
- Pre-coat tutti i tubi o punte entrano in contatto con CTC con 2% FBS/RPMI-1640 / 1 mM CaCl 2/4 mM MgCl 2 (buffer R / S) per prevenire il legame non specifico delle CTC alle superfici. Mantenere 4 ° C di temperatura dei media e tamponi che vengono a contatto con CTC.
- Raccogliere il cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) frazionecontenente CTC dall'interfaccia in un'altra provetta conica da 50 ml contenente 30 ml di tampone di R / S. Centrifugare a 400 xg per 8 min.
- Risospendere il pellet e lavare di nuovo nel buffer di R / S a 400 xg per 8 min. Dopo centrifugazione, risospendere il pellet in tampone H / H. Aggiungere anti-PSMA J591-488 anticorpo a 20 ug / ml per 30 min a temperatura ambiente in un luogo buio.
- Dopo 30 minuti, centrifugare le PBMC contenenti J591-488 CTC etichettati a 800 xg per 5 min. Risospendere in tampone H / H. Riempire una siringa da 1 ml (pre-rivestite con tampone R / S) con il campione.
5. Preparazione del microscopio, pompa a siringa e della Camera di flusso Assembly
- Accendere il microscopio invertito e impostare l'illuminazione Kohler a 10X obiettivo. Portare la pompa a siringa allo stesso livello della fase del campione del microscopio e impostarlo a 1 dyn / cm 2 shear stress (~ 10 microlitri / min).
- Aprire il software Zeiss AxioVision. Selezionare l'obiettivo sullo schermo del computer. Creare un nuovocartella sotto l'opzione strumenti nel software.
- Aprire l'opzione esperimenti intelligenti in AxioVision e regolare le impostazioni di registrare brevi video di 30 secondi per 30 minuti.
- Per il video fluorescente dal vivo, impostare le opzioni-12 msec immagine di esposizione, 2 x 2 bin, 5 Gain. Questi parametri aiutano a raggiungere i video vicino al frame rate video (~ 23 fotogrammi al secondo) con la fotocamera Zeiss MRM.
- Per visualizzare tutta la larghezza del canale di flusso a 10 X obiettivo sullo schermo del computer, utilizzare un adattatore C-mount (0.63 xf/60 mm Interface).
- Accendere la lampada a mercurio.
- Porre la siringa e il connettore contenente le cellule sulla pompa siringa.
- Portare IL-1β stimolato HUVECs dal termostato. Collegare il connettore al canale di ingresso pieno della MicroSlide contenente HUVECs.
- Collegare il canale di uscita con il connettore collegato al tubo. Mettere il tubo in un piatto o tubo 15 ml conica per raccogliere il flusso attraverso.
- Avviare il Infusiattraverso il MicroSlide a 10 microlitri / min. Osservare le interazioni tra cellule endoteliali e cellule MDA etichettati o etichettati CTC derivati da pazienti al di sotto del filtro 488 nm sul microscopio a epifluorescenza.
- Avviare la registrazione l'esperimento come 30 sec brevi video. Durante l'analisi riproduzione, misurare la velocità di rotazione. Velocità di rotazione si misura dividendo la distanza percorsa dalle cellule nel tempo.
6. Immunocolorazione del MicroSlide
- Rimuovere il supporto dal ingresso e l'uscita del MicroSlide dopo perfusione cellule MDA su IL-1β-stimolata HUVEC per 10 min.
- Utilizzando una punta di 200 microlitri, mettere calda (37 ° C) PBS contenente calcio e magnesio nella presa del MicroSlide per 5 min. Inclinare il MicroSlide usando il coperchio come un puntello in panchina. Mantenere la MicroSlide in una posizione inclinata per tutte le incubazioni durante immunocolorazione.
- Fissare HUVECs mediante perfusione caldo 2% di formaldeide in ingresso
- Aggiungere triton X-100 (0,1%) in 5% BSA in PBS per 10 minuti a RT.
- Risciacquare due volte con PBS per 5 minuti ciascuno. Blocco con 5% BSA in PBS per 30 min.
- Incubare con anticorpo primario di capra anti-VE-caderina (1:100) nel 2,5% BSA O / N a 4 ° C.
- Il giorno dopo, lavare due volte con PBS per 5 minuti ciascuno. Aggiungi asino secondario anti-goat 647 anticorpo per 45 min. Lavare due volte con PBS per 5 min ciascuno.
- Incubare a RT con umanizzato anticorpo coniugato J591-alexa488 per 1 ora.
- Lavare due volte con PBS per 5 min ciascuno. Aggiungere DAPI per 5 min. Lavare con acqua distillata per 5 minuti.
- Aggiungi PBS (o Mowiol per la conservazione a lungo termine). Visualizza la MicroSlide sotto il microscopio confocale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La Figura 1 mostra una cultura O / N di un monostrato di cellule endoteliali sulla MicroSlide. I valori di scala sulla figura 1A mostra che il 100% del MicroSlide è visibile usando obiettivo 5X mentre il 70% è visibile usando un obiettivo 10X (Figura 1B). Per interazioni E-selectina mediata, cellule rotolamento ai bordi non sono considerati che rende più del 70% del MicroSlide disponibile per il video-registrazione e analisi riproduzione. Nella nostra esperienza, inizialmente questa assemblea set-up richiede una certa pratica per la cultura un monostrato di cellule endoteliali sotto sforzo di taglio. Dopo aver stabilito la crescita CE sulla MicroSlide, abbiamo etichettato MDA, le cellule tumorali della prostata. La specificità di J591-488 anticorpo anti-PSMA è stata testata utilizzando cellule MDA spillo nel sangue donatore sano e marcati con fluorescente anticorpo monoclonale anti-PSMA J591-488. Nessuna PSMA immunocolorazione è stata osservata in PBMC (dati non mostrati). Per escludere la possibilità che J591-488 legame e internalizzazione alters rotolamento comportamento, abbiamo etichettato cellule MDA con J591-488 e confrontato il comportamento di rotolamento con le cellule MDA senza etichetta a sforzi di taglio che vanno 1-10 dine / cm 2. Il diagramma a riquadri mostra la distribuzione delle velocità di rotolamento di entrambe le cellule MDA senza etichetta e J591-488-etichettati su IL-1β-stimolata EC a diverse condizioni di stress di taglio. Nessuna differenza significativa è stata osservata nelle velocità di laminazione a 1 e 5 dyn / cm 2, p = 0,634 ep = 0,601, rispettivamente (Figura 2). A più alto sforzo di taglio di 10 dine / cm 2, una differenza statisticamente significativa è stata osservata tra le velocità di rotolamento di non marcato e cellule J591-488-etichettati MDA (p <0,05). Precedenti studi mostrano che a più alto sforzo di taglio (> 3 dyn / cm 2) condizioni, meno cellule tumorali aderiscono e rotolo su EC inferiori rispetto a condizioni di stress di taglio 11,12. Pertanto, studi che hanno analizzato le interazioni tra cellule tumorali e cellule endoteliali sono condotte a sforzi di taglio inferiore. Thnoi, i nostri dati suggeriscono che CTC possono essere etichettati con J591-488 e che l'etichettatura fluorescente dei CTC non influisce in modo significativo il comportamento di rotolamento ad una vasta gamma di shear stress. Da notare, non abbiamo rilevato alcuna interazione CTC / CE, in assenza di IL-1β stimolazione della ECS (dati non riportati). Inoltre, come prova di principio, abbiamo anche etichettato CTC arricchiti isolati da pazienti CRPC con J591-488 e perfusi su IL-1β-stimolata EC. Un video-tempo cucita mostra i diversi tipi di interazioni tra prostata CTC e EC (Video 1). Il video mostra tre tipi di interazioni stabili-adesione (CTC non si staccano anche dopo 30 sec), tethering (CTC attaccano e riattaccano), e interazioni. Microslides possono essere facilmente immunomacchiate e immagini fluorescenti possono essere prese perché le microslides hanno caratteristiche ottiche simili a quelli di un coprioggetti di spessore 1,5 mm 7. Figura 3 mostra la ferma adesione di J591-488 etichettati cellule MDA poppaer perfusione over IL-1β-stimolata EC.
Figura 1:. Un monostrato di cellule endoteliali coltivate sul MicroSlide HUVEC sono state coltivate O / N su un fibronectina (50 mcg / ml) MicroSlide rivestito III (0.1) sotto sollecitazione di taglio (1 dyn / cm 2) A) verso l'obiettivo 5X. (Piano CE Neofluar 5X/0.16), è stata osservata completa larghezza del canale di flusso con colta EC. La larghezza del canale è stato misurato essere 1,545.95 micron. B) verso l'obiettivo 10X (Piano Neofluar 10X/0.3 Ph1), 1,065.79 micron del canale è stata osservata. Ciò suggerisce che i CE può essere coltivato O / N sulla MicroSlide e il 70% del MicroSlide è visibile a 10X di ingrandimento. Cliccare qui per vedere un grande versione di questa figura.
Figura 2. Velocità di rotolamento delle cellule MDA su EC coltivato sul MicroSlide. Un milione di cellule MDA etichettati senza etichetta e J591-488 sono stati perfusi su IL-1β-stimolata HUVECs. Dieci video su diversi campi sul MicroSlide sono stati registrati a 1,5, e 10 dine / cm 2. Calcolare le sollecitazioni di taglio sono stati forniti dal produttore. Stata eseguita l'analisi offline per la velocità di laminazione. n = numero di cellule contate per le misure di velocità di rotolamento. Box grafico mostra la distribuzione delle velocità di rotolamento e le differenze tra i mediani J591-488 cellule MDA etichettati e senza etichetta. p <0,05, Wilcoxon rank test somma. I cerchi rappresentano i valori anomali. Cliccate qui a view una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Immunocolorazione delle cellule MDA interagiscono con EC sulla MicroSlide. Un milione di cellule MDA sono stati perfusi su IL-1β-stimolata HUVECs a 1 dyn / cm 2 shear stress. Dopo perfusione, immunocolorazione è stata eseguita sulla MicroSlide. Le frecce gialle indicano le cellule MDA saldamente aderito alla EC. PSMA = Rosso, VE-Caderina = Verde, DAPI = blu. L'immagine risultante dalla fusione mostra tutti i colori. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Video 1. Un video che mostra le interazioni tra HUVECs IL-1β-stimolata e anti-PSMA CTC J591-488-etichettati arricchite da un malato di cancro alla prostata. Un monostrato of HUVECs è stato coltivato sul MicroSlide III (0.1) e anti-PSMA J591-488-etichettati cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) contenente CTC arricchito da un paziente è stato perfuso su HUVECs a 1 dine / cm 2. Durante la perfusione, sono stati registrati 30 video brevi secondi, a campi diversi sul MicroSlide. Il tempo di acquisizione del video viene mostrata nell'angolo in basso a sinistra. Brevi video differenti sono stati cuciti insieme per compilare questo video. Alle 2:16:36, un CTC non interagenti entra nel campo in alto a sinistra della vista; in 2:19:16, un altro non interagenti CTC entra nel campo nell'angolo sinistro della vista; in 2:23:12, un CTC stabilmente aderito nel campo superiore metà di vista si vede. Alle 2:38:09, un CTC stabilmente aderito è visto sul lato destro del campo di vista è visto. Questo video è stata presa utilizzando sia in campo chiaro e il canale fluorescente per mostrare le interazioni di PBMC pure. Alle 02:40:18, CTC stabilmente aderito sono stati osservati nel campo superiore metà di vista. Questo video è stata scattata con campo chiaroe il canale fluorescente che mostra il comportamento di laminazione in PBMC. Dal 02:51:39 tramite 02:51:49, una CTC esibendo un comportamento tethering è stato osservato nel settore inferiore della visualizzazione. Clicca qui per vedere il video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A causa del basso numero di CTC tra cellule del sangue, è difficile isolare CTC come una popolazione pura di cellule. Al fine di studiare le interazioni CTC / CE, la popolazione rara e impura delle CTC pone due sfide importanti: a) identificazione di CTC tra le cellule del sangue; b) Osservazione delle interazioni CTC / CE.
Per superare la prima limitazione di identificare CTC prostata tra le cellule del sangue, abbiamo approfittato del fatto che praticamente tutte le cellule tumorali della prostata esprimono PSMA 6. Anticorpo monoclonale J591-488 è interiorizzato seguente vincolante suggerendo che PCa CTC può essere etichettato ex vivo e studiata per le interazioni CTC / EC 13 superficie cellulare. Per internalizzazione ottimale dell'anticorpo e immunofluorescenza massima si incubate cellule MDA con l'anticorpo sia a 4 ° C o 37 ° C sia per 30 min o 1 ora. Abbiamo osservato che la massima immunofluorescenza è stata osservata a37 ° C per 30 min (dati non mostrati) e l'etichettatura immunofluorescenza di cellule della prostata non ha influenzato il comportamento di rotolamento rispetto alle cellule non marcate prostata.
Per superare la seconda limitazione, abbiamo provato diversi gruppi cameristici flusso come PPFC, sistema di microfluidica BioFlux, e Microslides 7. Il PPFC è diventato un pilastro per esaminare leucociti e cellule tumorali interazioni con cellule endoteliali in condizioni di flusso fisiologiche 9. Questo sistema a flusso funziona bene per studiare le interazioni di gran numero di cellule, come linee cellulari tumorali, ma non ideale per osservare e studiare le interazioni tra cellule rare come CTC derivati da pazienti e EC. CTC, essendo cellule rare, può interagire con EC casualmente in qualsiasi posizione nel canale di flusso, e la registrazione di tutta la larghezza del canale di flusso è necessario per osservare e analizzare le interazioni tra eventi rari CTC / EC analisi durante la riproduzione. The larghezza della guarnizione silastic utilizzato nella PPFC (2,5 mm) non fornisce un campo visivo sotto obiettivo 10x. Mentre, con un ingrandimento inferiore obiettivo 10X, diventa difficile osservare chiaramente interazioni CTC / CE. Inoltre, volume morto nei tubi di collegamento è essenziale per evitare intrappolamento delle CTC nei tubi di collegamento. I tubi di collegamento silastic fornito con standard PPFC hanno un ampio diametro interno (0,16 pollici). Al contrario, il sistema di microfluidica BioFlux fornisce pieno campo visivo sotto obiettivo 20X ed è utile nello studio modifiche shear-indotte nel EC 14, tuttavia, le cellule tumorali iniziano stabilirsi nei pozzetti camera conducono a flusso non uniforme. Microfluidica BioFlux è utile nello studio modifiche shear-indotte nel EC, tuttavia, è tecnicamente complicato da utilizzare. La nostra camera di flusso auto-assemblati utilizzando MicroSlide ha una larghezza di canale stretto (1 mm) della larghezza canale standard in PPFC, consentendo una maggiore osservazioneArea zionale. Inoltre, EC sono coltivate sotto perfusione in MicroSlide simulazione fisiologico flusso di sangue, a differenza Ganguly et al. 7, studi nei quali EC sono coltivate su microslides (con larghezza di canale più largo) in condizioni statiche. Il volume morto all'interno dei tubi di collegamento viene diminuita utilizzando un tubo di raccordo con diametro interno di 0,02 trovi Collettivamente, etichettatura immunofluorescenza di cellule tumorali della prostata, adeguata larghezza del canale di flusso, e più piccolo del diametro interno dei tubi di collegamento consente di identificare CTC prostata e osservare le loro interazioni con EC.
Ci sono alcuni passaggi critici nel protocollo, però, con la cura adeguata gli esperimenti possono eseguire senza problemi. La prevenzione delle bolle è fondamentale per qualsiasi esperimento flow-based. Nella nostra esperienza, utilizzando caldo (37 ° C) mezzo di crescita, connettori, e la siringa previene la formazione di bolle, riducendo le differenze di temperatura. In supplen, occorre prestare attenzione durante il collegamento la siringa con l'MicroSlide. Sia il connettore attaccato alla siringa e l'ingresso del MicroSlide deve essere riempito fino all'orlo, in tal modo, evitando la formazione di bolle. Uno dei limiti della tecnica è che, poiché il canale è MicroSlide 45 x 1 mm (lunghezza x larghezza), esso può contenere solo 4,5 ml di mezzo di crescita. Pertanto, MicroSlide non può essere utilizzato per la coltura statica e richiede perfusione continua di terreno di crescita per prevenire l'acidificazione e mantenere corretto apporto di sostanze nutritive per HUVECs. Tuttavia, continuo di terreno può essere facilmente ottenuto utilizzando una pompa a siringa collegata alla MicroSlide nell'incubatore. Mentre arricchendo CTC di pazienti affetti da cancro alla prostata, la cura dovrebbe essere presa a pre-coat tutti i tubi, punte, pipette, siringhe ed entrano in contatto con CTC con tampone R / S per prevenire legame non specifico. Inoltre, tutti i passaggi dopo Ficoll-Paque centrifugazione densità, eXCept J591-488 anticorpo incubazione, dovrebbe essere condotta a 4 ° C per evitare la degradazione delle CTC.
La nostra tecnica è unica rispetto a diversi metodi comprensione CTC biologia. La presente relazione descrive immunomarcatura fluorescente vitale delle CTC prostata che permette di osservare le caratteristiche funzionali di CTC prostata, oltre che solo le proprietà fenotipiche. Inoltre, il metodo descritto richiede basso volume campione / reagente di altri metodi che lo rende un sistema ideale per studi di immunofluorescenza. La nostra metodologia fornisce una piattaforma unica per studiare le interazioni tra CTC prostata derivati da pazienti e EC, quindi, aiutando a comprendere i meccanismi coinvolti nello sviluppo delle metastasi del cancro alla prostata. Questa tecnica ha il potenziale per molteplici applicazioni che richiedano studi di flusso basato taglio, quali le interazioni cellula-cellula 8, interazioni cellula-proteina 15 16, e le modifiche di taglio indotte EC 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr. Bander è l'inventore di brevetti che vengono assegnati a Cornell Research Foundation ("CRF") per l'anticorpo J591 utilizzato in questo articolo. Dr. Bander è un consulente per e possiede azioni in BZL Biologics, la società a cui i brevetti sono stati concessi in licenza da CRF per ulteriore ricerca e sviluppo.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento del Dipartimento della Difesa prostatico Programma di Ricerca sul Cancro (W81XWH-12-1-0124), U54CA143876 dal National Cancer Institute, e il Robert McCooey Genitourinary Oncology Research Fund. Vorremmo ringraziare il Dott. Annarita Lorenzo (Dipartimento di Patologia) per fornire gli anticorpi VE-caderina, e il dottor Marco Seandel (Dipartimento di Chirurgia) per la fornitura di HUVECs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microslide | Ibidi | 80331 | |
| Fibronectin | Millipore | FC010 | |
| Plastic tubing | Cole Parmer | EW-96115-08 | |
| Male Luer adapter | GlycoTech | 31-001 | |
| Female Luer adapter | GlycoTech | 31-001 | |
| Syringe pump | Chemyx Inc | Fusion 100 | |
| Luer-lock syringe | BD Biosciences | 309628 | |
| M199 medium | Sigma | M7653 | |
| Endothelial Mitogen | Biomedical Technologies | BT-203 | |
| HBSS | Sigma | H9269 | |
| Anti-PSMA J591-488 | Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology | ||
| Interleukin-1 beta | Peprotech | 200-01B | |
| Trypsin | Millipore | SM-2002-C | |
| Heparin | Sigma | H-3149 | |
| HUVECs | Weill Cornell Medical College-Department of Surgery | provided by Marco Seandel | |
| VE-Cadherin | Santa Cruz | sc-5648 | |
| 10x objective | Zeiss Plan Neofluar | ||
| Enzyme free cell dissociation reagent | Millipore | S-004-C | |
| RPMI-1640 | Lonza | 12-702-F | |
| Ficoll-paque plus | GE healthcare | 17-1440-02 |
References
- Dimitroff, C. J., Lechpammer, M., Long-Woodward, D., Kutok, J. L. Rolling of human bone-metastatic prostate tumor cells on human bone marrow endothelium under shear flow is mediated by E-selectin. Cancer Res. 64, 5261-5269 (2004).
- Barthel, S. R., Gavino, J. D., Descheny, L., Dimitroff, C. J. Targeting selectins and selectin ligands in inflammation and cancer. Expert Opin. Ther. Targets. 11, 1473-1491 (2007).
- Konstantopoulos, K., Thomas, S. N. Cancer cells in transit: the vascular interactions of tumor cells. Annu. Rev. Biomed. Eng. 11, 177-202 (2009).
- Nagrath, S., Sequist, L. V., Maheswaran, S., Bell, D. W., Irimia, D., Ulkus, L., et al. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
- Mannweiler, S., Amersdorfer, P., Trajanoski, S., Terrett, J. A., King, D., Mehes, G. Heterogeneity of prostate-specific membrane antigen (PSMA) expression in prostate carcinoma with distant metastasis. Pathol. Oncol. Res. 15 (2), 167-172 (2009).
- Tagawa, S. T., Milowsky, M. I., Morris, M. J., Vallabhajosula, S., Christos, P. J., Akhtar, N. H., et al. Phase II study of lutetium-177 labeled anti-prostate-specific membrane antigen (PSMA) monoclonal antibody J591 for metastatic castration-resistant prostate cancer. Cancer Res. , (2013).
- Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions. J. Vis. Exp. (66), 10-3791 (2012).
- Moss, M. A., Zimmer, S., Anderson, K. W. Role of metastatic potential in the adhesion of human breast cancer cells to endothelial monolayers. Anticancer Res. 20, 1425-1433 (2000).
- Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium. J Vis Exp. 24, (2009).
- Gebauer, F., Wicklein, D., Stubke, K., Nehmann, N., Schmidt, A., Salamon, J., et al. Selectin binding is essential for peritoneal carcinomatosis in a xenograft model of human pancreatic adenocarcinoma in pfp--/rag2-- mice. Gut. 62 (5), 741-750 (2013).
- Giavazzi, R., Foppolo, M., Dossi, R., Remuzzi, A. Rolling and adhesion of human tumor cells on vascular endothelium under physiological flow conditions. J. Clin. Invest. 92 (6), 3038-3044 (1993).
- Remuzzi, A., Giavazzi, R. Adhesion of tumor cells under flow. Adhesion Protein Protocols. Dejana, E., Corada, M. 96, Humana Press. 153-157 (1999).
- Liu, H., Moy, P., Kim, S., Xia, Y., Rajasekaran, A., Navarro, V., et al. Monoclonal antibodies to the extracellular domain of prostate-specific membrane antigen also react with tumor vascular endothelium. Cancer Res. 57 (17), 3629-3634 (1997).
- Jung, B., Obinata, H., Galvani, S., Mendelson, K., Ding, B. S., Skoura, A., et al. Flow-regulated endothelial S1P receptor-1 signaling sustains vascular development. Dev. Cell. 23 (3), 600-610 (2012).
- Yin, X., Rana, K., Ponmudi, V., King, M. R. Knockdown of fucosyltransferase III disrupts the adhesion of circulating cancer cells to E-selectin without affecting hematopoietic cell adhesion. Carbohydr. Res. 345 (16), 2334-2342 (2010).
- Carman, C. V., Springer, T. A. A transmigratory cup in leukocyte diapedesis both through individual vascular endothelial cells and between them. J Cell Bio. 167 (2), 377-388 (2004).
