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Immunology and Infection

評価するために制限酵素ベースのクローニング方法 doi: 10.3791/51506 Published: August 31, 2014
* These authors contributed equally

Introduction

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HIV-1病因および疾患の進行に影響を与える宿主およびウイルス両方の特性を決定することは、合理的なワクチン設計のために最も重要である。細胞性免疫応答は、HIV-1感染に対するヒトの免疫応答の重要な構成要素である。細胞傷害性Tリンパ球(CTL)は、急性ウイルス血症の初期制御のために必要であり、ホストが定常状態(セットポイント)ウイルス量1,2を確立すること可能にする。これらのエフェクター細胞の実験的な枯渇は、ウイルスコントロール3,4の損失をもたらす。これにもかかわらず、エスケープ変異は、ウイルス感染細胞5-9のCTL認識を覆すウイルスゲノム内で発生する。

特定のHLA対立遺伝子は、より低いウイルス負荷およびB * 57、B * 27、B * 81の10-15を含む遅い疾患進行と関連している。 HLAクラスI対立遺伝子の保護の利益の一部は、彼らがそのようなGagのようなゲノムの機能的に制約された領域を標的とするという事実に帰することができる及びインビトロ 16-21 複製するウイルスの能力を減少させ、エスケープ突然変異を選択します。細胞性免疫系からの脱出は、私は対立の選択HLAクラスとの関連でウイルスに有益であるが、これらの変異の効果は、HLAミスマッチ22,23の個人に送信時にホストの差分結果をもたらす可能性がある。そのため、ウイルス複製能力に送信されたHLA-関連したエスケープ変異の影響を理解することは、初期のHIV-1の病因の理解を促進するために重要であろう。

多くの進歩は、私が24〜29の対立遺伝子特異的HLAクラスに関連付けられた個別のエスケープ変異の適応度の欠陥を特定し、特徴づけるために作られているが、天然に存在するHIV-1分離株は、おそらく、HLAから生じる、HLA関連多型のユニークで複雑 ​​な足跡を持っている別の免疫遺伝学的背景30の媒介免疫圧力。 apにrevious分析、Goepfert 。 88急性感染ザンビアに由来して送信ギャグ配列におけるHLA関連変異の蓄積がセットポイントウイルス量31の減少と関連していることを示した。これは、HLA-ミスマッチの受信者へのGag特異的で有害なエスケープ突然変異の送信は、臨床的利点を提供し、そしてウイルス複製を弱毒化することによるものであり得ることを示唆した。今後、このような複製能力、および早期の複製が今度は、HIV-1臨床パラメータと後期に影響を与える可能性のある方法として、送信されたウイルスの特性を定義するために協調してどのように動作するか、複雑なギャグ多型の組み合わせ、天然に存在する分離株の中勉強することが不可欠です病因。

ブロックマンらは、最初のサブタイプCとBの感染の両方で慢性期の感染とウイルス量の間に単離さギャグ-プロ配列の複製能力の間のリンクを実証した32-35。これらの研究で示された実験的なアプローチは、慢性的に感染した個体に由来する配列のin vitro複製能力を調べるための適切なものの、困難なサブタイプC急性感染した個体におけるHIV-1複製の能力を研究するいくつかの技術的な注意事項や制限事項があります。この方法は、研究室では、ウイルスストック36を適応、LAVの一部が元になって、サブタイプB NL4-3プロウイルスの中に人口ベースのPCR増幅された配列の組換えに依存しています。ウイルス産生は、PCRアンプリコンとCEM系T細胞株37の同時トランスフェクションによって達成し、デルタのgag-プロ NL4-3 DNAを消化し ​​た。この方法は、潜在的に生体内でのウイルス準種に関連して回収されたウイルス株の本質をゆがめるため、in vitroでの複製能力の測定を変えること、数週間から数ヶ月の期間にわたってウイルスの増殖を必要とします。このメソッドは、私それが効果的に最も高い複製能力を持つウイルスのために選択され、ここで、慢性感染者が多数から多数の異なるウイルス変異株のクローンを作成すると、非常に労働集約的であるため現実的ではない場合には、慢性的に感染した個体を研究するためのより適切だ。しかし、急性感染個体内の、一般的に一から二の変種が存在であり、従って、 インビトロ選択圧を通じて回収されたウイルス株の本質をゆがめる危険性を排除し、in vitroでの複製能力をより正確に評価することができます。第二に、この方法では、サブタイプB派生バックボーンにサブタイプC ギャグ-プロ配列が再結合が必要であり、分析にバックボーンの非互換性の偏りをもたらす可能性があります。により、これらの制限のために、配列の大きな番号が導入された潜在的なバイアスを克服するために分析しなければならない。

ここでは、代替実験的アプロを記述サブタイプC急性感染した個体に由来する配列を研究するための適切なACH。私たちは、サブタイプCプロウイルス骨格、MJ4へのHIV-1サブタイプC感染者の急性感染時点から派生gag遺伝子を導入するために、制限酵素ベースのクローニング戦略を使用しています。 ギャグの遺伝子をクローニングすることで一般的なバックボーンとしてMJ4の使用は、サブタイプC由来配列の分析のために重要である。 MJ4は、一次分離株38から導出され、したがって、原因バックボーンおよびgag遺伝子間のサブタイプの非互換性にバイアスを導入する可能性が低いであろう。また、酵素に基づく制限クローニングを使用してのアプローチは、293T細胞に直接トランスフェクトするプロウイルス構築物について、およびクローン化されたgag配列と同一のクローン性ウイルスストックの回収を可能にする。

以下に提示された方法は、派生ギャグ-MJ4サブタイプCの複製能力を評価するためのハイスループット法であるキメラウイルス。 293T細胞へのトランスフェクションは、簡単であり、ウイルスの回収は、わずか3日かかります。 インビトロ複製能力は、ブロックマンによって作成された同じCEM-CCR5ベースのT細胞株でアッセイされる。37が、成功した複製に必要な重要なプロトコルの変更を使用して、サブタイプC MJ4キメラウイルスの。むしろPBMCをより適切なT-細胞株の使用は、高いアッセイ再現性試験すべきサブタイプC MJ4-キメラウイルス多数のを可能にする。最後に、上清中のウイルスの定量化のために放射性標識逆転写酵素アッセイを使用して、市販のp24 ELISAキットを使用するよりもコスト効率である。また、同じアッセイ内および分離株の間でのレプリケーションの微妙な違いを検出するためのウイルスを複製し、両方の悪い、高度を検出するために重要であった、より高いダイナミックレンジを与える。

結論として、ここで紹介する方法が可能にしたザンビアからの急性感染した個体のHIV-1サブタイプCから派生ギャグ配列複製能力の詳細な調査、および書かれたように、他のサブタイプC感染集団を研究するために拡張することができる。異なる分離株のGag間の複製能力のばらつき度が高いが観察された。さらに、当社は送信されたギャグの複製能力とセットポイントウイルス量だけでなく、3年間で39以上のCD4 +の減 ​​少との間の統計的関連性を示すことができた。このような結果は、そのような複製能力としてどのように、送信さウイルスの特性を研究することの重要性を強調初期感染時に病原性に影響を与えるために、宿主の免疫系と相互作用して、効果的なワクチンの介入だけでなく、治療を開発するための一体化されています。

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Protocol

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感染からのHIV-1 gag遺伝子 1の増幅、凍結血漿

  1. 抽出キットを用いて、HIV-1に感染したプラズマを解凍し、140μlのからウイルスRNAを抽出します。
    1. 可能な場合、直ちにRNA抽出として凍結していないウイルスRNAが最良の増幅結果が得られた後、cDNA合成に進みます。可能な場合は、事前のウイルスRNA抽出を、4℃で第一ラウンドのDNA増幅およびストアのPCRマスターミックスを設定します。
  2. RNAからcDNAを逆転写および逆転写酵素およびワンステップRT-PCRにおける熱安定性DNAポリメラーゼを用いて第一ラウンドのDNA産物を増幅する。
    1. (凍結が必要であった場合)℃の冷凍庫-80℃からRNAを取り出し、簡単に冷たいブロックに配置した後、室温で解凍。マスターミックス45μLを含む各PCRチューブへのRNAの5μlの移転を、50μlの最終容量を得た。直後℃の冷凍庫-80℃に残りのRNAサンプルを置く。
    2. 酵素である後所望の反応の数、各薄壁PCR増幅チューブにアリコート45μlを、1回目のPCRマスターミックス( 表1A)にdded。サンプル間最小の交差汚染を確実にするために個別のキャップでPCRチューブを使用し、キャップを取り除かないようにしてください。温度感受性RT酵素とRNA鋳型を保護するために、コールドブロックにPCRチューブを配置します。注:サンプルは、適切なウイルス準種をサンプリングするために三連で実行する必要があります。これは、PCR導入誤取り込みを最小限にするために、高忠実度DNAポリメラーゼ酵素を有する生成物を利用することも重要である。推奨される製品のための試薬リストを参照してください。
    3. RNAテンプレートは、すべての反応チューブに添加した後、 表1Bに記載サイクラープログラムを使用して増幅のためのサーモサイクラーにPCRチューブに移す。注:この増幅産物は、2回目のネステッドPCRに使用される。
  3. ネストされたSEを実行しますDNAテンプレートとして最初のラウンドのPCR増幅1μlの(1.2)を使用して、指揮回目のPCR増幅、。
    1. 希望反応の数は、各薄壁PCRチューブに分注し第二回目のPCRマスターミックス( 表2A)の49μlの。転送各反応チューブに第一ラウンドのPCR増幅からの1μlを50μlの最終体積を得た。注:これは、第二ラウンドの増幅のためのテンプレートとしてのDNAを提供します。これは、PCR導入誤取り込みを最小限にするために、非常に高い忠実度と校正機能を有するDNAポリメラーゼを利用することも重要である。推奨される製品のための試薬リストを参照してください。
    2. 表2Bに記載されたプログラムをサーモして実行するために2回目のPCR反応混合物を転送します。注:プログラムの完了後、この反応の生成物は、生成物の生成を確認するために、アガロースゲル上で泳動される。
  4. 5&#に5倍ローディングダイの3μLを追加181;50μlの第二ラウンドの反応体積lのバンドが解決されるまで、UV蛍光DNA染色を含む1%アガロース-TAEゲル上、120Vで動作します。 ( 図1Aを参照)、青色光照明での1.6kbのバンドを可視化。
  5. DNA染色を含む1%アガロース-TAEゲル上の残り45μlの反応量を実行して、きれいなカミソリの刃で、適切なバンドを切除。
    1. 、ヌクレアーゼを含まない水で溶出し、ゲル精製キットを用いてゲルスライスからDNAを抽出する個体ごとに3つの陽性反応を組み合わせ、そしてその後の使用のために-20℃で生成物を凍結する。

必要な制限部位の導入によるクローニングのための2。準備ギャグアンプリコン

  1. ロングターミナルリピート(LTR)MJ4プラスミド/ 5 'UTRの一部を増幅し( 表3参照)。
  2. 照明装置で1.3キロバイトのPCR産物を可視化、消費税正アンプリコンは、ゲルは、以前のように精製し、凍結記載され(1.4,1.5; 図1Bを参照)。
  3. 「スプライスオーバーラップ伸長「PCR( 表4参照)を介して融合MJ4 LTR- ギャグアンプリコンを作成します。
  4. 図1C参照) 可視化し、消費税、精製し、及び1.4,1.5のように、3.2キロバイトアンプリコンを凍結する。

MJ4、サブタイプC、感染性分子クローンに3クローニング増幅ギャグ遺伝子

  1. 50℃( 表5aを参照)で、1.5時間のBclI(メチル化感受性)制限エンドヌクレアーゼでMJ4プラスミド1.5μgの精製LTR- ギャグ PCR産物1.5μgのダイジェスト。
  2. 消化反応にNgoMIVでの1μlを加え、1時間、37℃でインキュベートする。
  3. 5倍のローディング色素が反応を消化し、ゆっくりと100 Vの視覚化、消費税で1〜2時間、DNAゲル染色を含む1%アガロース-TAEゲル上で全量を電気泳動すると、以前にDESCとしてクローニングのため、示されたバンドを精製し、制限に追加ribed( 図2を参照)。
  4. ベクトルの比が1のインサート:3の精製LTR- ギャグインサートとMJ4ベクターDNAを用いて、連結反応を準備します。 4℃で一晩連結反応をインキュベートする( 表5Bを参照こと)。
  5. 連結産物をJM109化学的にコンピテント細菌を形質転換および100μg/ mlのアンピシリンを含むLB寒天プレート上に広げ、22+時間、30℃で成長する。
    1. 15分間氷上でコンピテント細胞を解凍する。氷上の1.5ml微量チューブと寒さにラベルを付けます。
    2. JM109細胞の一定分量50〜100μlを予備冷却する1.5mlのマイクロチューブ。軽く混合するチューブを軽くはじく、すぐに氷上に戻って、JM109細胞への連結反応の2.5-5を添加する。氷上で30分間ライゲーション産物でコンピテント細胞をインキュベートします。
    3. 熱ショックコンピテントセルと45秒間、42℃のヒートブロック中連結反応を含有し、少なくとも3分間、氷上に戻って1.5mlのマイクロチューブ。
    4. 各マイクロチューブにSOC培地を50μlを追加し、アンピシリン100μg/ mlのを補充し、室温LB-寒天プレート上に全変換反応をめっきする。
    5. 30℃のインキュベーターに20時間放置する、またはコロニー鮮明に形成されるまで転送プレート。
  6. 分離したコロニーをピックアップし、22+時間、30℃で100μg/ mlのアンピシリンを含むLB 4mlに成長する。
  7. 15分間3,200×gで文化をスピンダウンスープを捨てる、プラスミドDNAを抽出します。
  8. 忠実度をクローニングを確認するには、2時間37℃で消化し、二重にNgoMIVでおよびHpaI制限酵素でミニプレップDNAを切断。 1%アガロース-TAEゲル上で分析する( 表5Cを参照)。
  9. 配列同一性を確認するためにGagInnerF1、GagF2、Rev1は、REV3、およびGagR6( 表6):以下のプライマーを用いて、各プラスミドの配列LTR-gagポリ挿入領域。
  10. 人口配列デルで得られたクローニングされた配列を比較する1.5.1からの初期の精製アンプリコンからived。注:これは、最終的に任意のインビトロ複製表現型をクローニングプロセスの間に導入バックボーン誤差に起因しないことを確実にするために、2つの独立したクローンの複製能力を評価することが重要である。

4。発生と複製能力ギャグ-MJ4キメラウイルスの力価測定

  1. プリンス 39によって記載されているようでFugene HDの1の比率:4を使用して293T細胞に、キメラMJ4プラスミドミニプレップDNAを1.5μgのトランスフェクションすることにより、複製能力のあるウイルスを生成します。
  2. 39以下および王子に記載されているようにTZM-BL細胞上で力価収穫ウイルスストック。
    1. プレートTZM-BL細胞次の日には30〜40%コンフルエントな細胞単層を有するためにウイルス感染の24時間前。これは、通常、24ウェルプレートにウェルあたり800μlの総体積で5×10 4個の細胞を添加することによって達成することができる。
    2. ウェルにセルを追加した後、静かにそして側は効率的に細胞を分配するために左右に、前後に24ウェルプレートを移動させる。渦巻く決して - これはプレートの中心に蓄積細胞になります。
    3. 次の日、DMEM中に1%のFBSを準備。これは、DEAE-デキストランを希釈するために、ウイルスストックを希釈するために使用される。在庫DEAE-デキストランは、10mg / mlまたは125×であり、80 / mlのまたは1xの最終濃度が所望される。
    4. ウイルスストックを取り出しは、室温で解凍するシェーカー上、-80℃の冷凍庫や場所からテストする。
    5. マルチチャンネルピペットを使用して、直列に蓋をし、96ウェルプレートを処理した丸底組織培養においてウイルスストックを希釈する。これは、3倍希釈プロトコルである。希釈スキームについては、表7を参照してください。
    6. 細胞単層を乱さわからないこと、真空吸引器を使用して、播種TZM-BL 24ウェルプレートから培地を除去。一つだけ24ウェルプレートから培地を除去し、細胞がないように、乾燥しない。
    7. 各ウェル千μlのピペットを使用して、DMEM混合物中の1×DEAE-デキストラン+1%FBS150μlのを追加します。これは単分子層を破壊としてリピートピペットを使用しないでください。
    8. 適切なウェルに、各ウイルス希釈の150μlのを追加します。ウェルの中央にウイルスを追加し、均等に細胞単層全体にウイルスを配布するために穏やかに旋回。 37℃で組織培養インキュベーター中で2時間感染細胞をインキュベートし、5%CO 2。
    9. 2時間のインキュベーション後、各ウェルに0.5mlのDMEM、10%FBSを追加し、さらに48時間インキュベーターにプレートを戻す。
    10. 48時間後、細胞を100%コンフルエントであるべきである。 MJ4は、複製コンピテントウイルスであるため、そこにいくつかの細胞死であるが、これは予想されるであろう。
    11. (レシピは、表8Aを参照)、各ウェルから培地を除去し、400 /ウェルの溶液を固定を追加します。一度に一つのプレートに固定してください。千μlのピペットを用いて、定着液を追加し、5分間放置します室温。
    12. 定着液を取り外しおよびCa 2 + / Mg 2+を含むPBSで3回洗浄する。単層の中断を避けるために穏やかにウェルの側にPBSを追加するために噴出ボトルを使用してください。 3回目の洗浄の後、吸収紙にプレートを乾燥ブロット。
    13. 24ウェルプレートの各ウェルに(レシピは、表8B参照 )を400μl/ウェルの染色溶液を追加し、少なくとも2時間37℃でインキュベートする。より長いインキュベーション時間は許容されますが、インキュベーション時間は、滴定の実験間の一貫性が維持されるべきである。
    14. ウォッシュ2 + / 2 +はMgのCaを含むPBSで2回、感染に得点、以降得点、4℃で、PBSおよびストアを追加。プレートは限り単層が水和維持されるように、最大​​4日間4℃で保持することができる。
    15. 感染のために得点するためには、四分円に24ウェルプレートのウェルを分割する恒久的なマーカーを使用しています。一度で、200倍の総合倍率を使用して、視野内の全ての青色細胞を計数ウェルの四つの象限の各。
    16. 次のように1μl当たりの感染単位を計算します[(#ブルーセル/ 4)67 X] /(μlのウイルスが追加された)IU /μlの=。各ウェルに加え、ウイルスμlのボリュームについては、表8Cを参照してください。一緒に平均いくつかの井戸。数字は正確な滴定のために比較的類似していなければならない。

インビトロ複製アッセイのためのGXR25細胞の培養培地と伝播の5。準備

  1. GXR25細胞の増殖のために完全RPMI(cRPMI中)を準備します。注:それは少なくとも4ヶ月前に計画された複製実験と文化GXR25細胞にとって非常に重要である( 表9を参照)。
  2. 分割セル1時10分週2回および1×10 5〜2×10細胞/ mlの間の細胞密度を維持する。

GXR25におけるGag特異MJ4キメラ(CEM-CCR5-GFP)細胞の試験管内複製6.

  1. 私の前日2-3×10 5細胞/ mlの濃度にnfection、分割細胞をそれらが感染の日に対数増殖期にあるように。
  2. 感染当日、℃の冷凍庫解凍-80℃からウイルスストックを取り外します。式を使用して、0.05の感染多重度で5×10 5 GXR25細胞を感染させるためにTZM-BL細胞アッセイからIU /μlの力価に基づいて、各ストックから必要とされるウイルスの量を計算します。
    感染症(μl)のためのウイルスの体積=1μL/ X IUのx 0.05のx50万
    注:これは私たちがテストしたウイルスのすべてのための対数増殖期になるように私たちは、0.05のMOIを選択しました。これは、試験されるウイルス対数増殖をキャプチャするために最適なMOIを決定するために、最初の実験を行うことが重要である。
  3. 及びV-底組織培養のウェルに加える(0.05 MOIを達成するために)を100μlの体積にcRPMI中でウイルスを希釈し、96ウェルプレートを処理した。注:POSITI両方を含める複製実験の各セット内(MJ4 WT感染)と負(モック感染細胞)コントロールをVEの。他のすべての列がウェル間の相互汚染を制限する場合は空白であるように、プレートを設定します。それは、実験の繰り返しの複製速度の尺度である複製の斜面を、正規化するために後で標準として使用されるように、ポジティブコントロールは、不可欠です。
  4. 自動細胞カウンターを用いてGXR25細胞を数える。すべての感染症(5×10 5×#感染症)の合計に必要な細胞の数を計算します。細胞をペレットに50ミリリットルコニカルチューブと遠心分離機に必要なボリュームを分注し。必要以上に常に25%以上の感染症のために計算します。
  5. 培地を吸引慎重かつ5×10 5個 / 100μlの濃度でcRPMI中での再懸濁。
  6. ピペット細胞無菌トラフへと完全に混合する。マルチチャンネルピペットを用いて、希釈したウイルスを含む96ウェルプレートの各ウェルに細胞100μlを加える。ミX徹底的に。
  7. それぞれにポリブレンの5 mg / mlの(100倍)溶液2μlをうまく追加し、徹底的に細胞を混ぜる。
  8. 3時間、5%CO 2で組織培養インキュベーターにおいて37℃でインキュベートする。
  9. 感染した細胞を洗浄するために、遠心分離機96ウェルV底プレートに細胞をペレット化する。その後、慎重に培地を150μlを除去し、細胞ペレットを乱すことなく、cRPMI中の新鮮な150μlのと交換してください。十分に細胞を洗浄する(遠心分離を含む)をさらに2回繰り返します。
  10. 最後の遠心分離および150μlのcRPMI中の添加後、マルチチャンネルピペットを用いて細胞ペレットを再懸濁し、24ウェルの組織のウェル内のcRPMIの各ウェル独立して800μlのからセル全体/ウイルス混合物(約200μl)を追加培養プレート。
  11. 37℃、5%CO 2組織培養インキュベーター中でプレートを置き。
  12. 毎年二日間、培養ウェルの表面から上清100μlを除去し、96ウェルUに転送-bottomプレート及びストアはウイルス定量アッセイを実行するまで-80℃で凍結した。 NOTE:96ウェルプレート中の上清を注意深く配置は、放射性標識、逆転写酵素(RT)アッセイを介してビリオンの定量時の培養上清のマルチチャンネルピペットの転送を可能にする。すべてのプレートをRTアッセイの読み出しにプレート間の変動を正規化するために、感染症の標準からのサンプルが含まれている必要があります。
  13. 徹底的に細胞を再懸濁し、残りの容量(450μl)をの半分を除去することにより、2:各100μlのサンプル、スプリットセル1を除去した後。各ウェルに新鮮なcRPMI中の550を添加することにより、元のボリューム(1ミリリットル)を復元します。

細胞培養上清中の逆転写酵素(RT)の7分析

議定書は、オストロウスキー 40から適応。

  1. 放射性物質で使用するためのBSL-3施設で生物学的安全フードをセットアップします。
    1. ホーに吸収紙を置きます放射性の使用のために指定された吸引器のための吸引器を開発し、交換してください。注:すべての放射性廃棄物が適切に安全規則に従って一緒に廃棄しなければなりません。
  2. RTマスターミックスの各1ミリリットルアリコートに[33 Pα-]のdTTP 10 mCiの/ mlおよび1 Mジチオスレイトール(DTT)の4μlと1-2μlを添加した( 表10およびオストロウスキー 40を参照)。
  3. 慎重に無菌トラフ1,000μlのピペットと転送にRTマスターミックス、DTT、および[33 Pα-] dTTPをそれぞれ1.5mlのマイクロチューブを混ぜる。
  4. 標識されたRTの25μlを96ウェル薄壁PCRプレートの各ウェルに分注する混ぜる。注:ポジティブコントロール(MJ4 WT感染症)および陰性対照(モック感染症)のためのスペースを含めます。
  5. RTマスターミックスを含むPCRプレートに各上清の5を添加する。
  6. 接着ホイルカバー付きPCRプレートを密封し、サーモサイクラー中で37℃で2時間インキュベートする。安全上の理由から、りんAmphylとSEピペットチップおよびそれ以降の放射性廃棄物で処分されるAmphyl廃棄物を含む小さなコンテナ内のヒントを、廃棄してください。
  7. インキュベーション後、200μlのマルチチャンネルピペットを用いてホイルカバーに小さな穴を作る。注:ピペットチップは、ウェル内の液体に触れた場合は、次の列または行に移動する前にチップを交換してください。
  8. DE-81紙にサンプルを5倍、転送の各サンプルを5μlのを混ぜる。空気を10分間乾燥する。
  9. ウォッシュブロットを1×SSC(塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム)した後、洗浄あたり5分間で90%エタノールで2回で5倍。空気乾燥させます。
    1. そのようなサンドイッチ収納ボックスとして、別個の洗浄容器内の各ブロットを置き、ブロットをカバーし、5分間振とうするのに十分な洗浄バッファー(1×SSCまたは90%エタノール)を添加する。
    2. 別の容器繰り返しに洗浄バッファーをオフに注ぐ。注:最初の3回の洗浄が放射性であると考えられ、適切に処分する必要があります。最後の2回の洗浄を定期的に処分することができる。
  10. 乾燥したら、車efullyサランにおけるブロットラップし、室温で一晩密閉カセットにphosphoscreenに公開折り返す。
  11. ホスホイメージャとphosphoscreensを分析し、放射性転写産物を定量化する。
  12. OptiQuantソフトウェアを使用して、各放射性シグナルの周りに円を描きます。複製曲線を生成するためにデジタルライトユニット(DLU)の値をグラフ化。
  13. 複製能力のスコアを生成するために、DLUの値はログ10 -transformedであり傾きが2,4、および6の時点曜日を用いて計算した。レプリケーションの斜面は、その後複製能力スコアを生成するために、WT MJ4の傾きで割る。これは、アッセイ内変動性を低減するために、同じRTプレートから得MJ4 WT値に基づいて正規化することが重要である。

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Representative Results

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適切に完全に機能する、感染性のギャグ-MJ4キメラを組み立てることのできるプロウイルスプラスミドを作成し、このプロトコルを、実行するために、細心の注意は、適切なPCRアンプリコンを生成するように注意しなければならない。 PCRは適切なサイズのギャグアンプリコンを生成したかどうかを決定することは非常に重要です。製品は、 図1(a)に示した約1700 bpのアンプリコンの100塩基対(bp)の範囲内である必要があります。この断片の正確な長さは、研究中のgag遺伝子に依存して変化する。次に、MJ4分子クローンの5 '末端反復配列(LTR)の部分は、その後のクローニングに適するようにするために増幅され、 ギャグリコンにスプライスされている必要があります。 MJ4 LTRアンプリコンは長さが1474塩基対であるべきである。 図1Bは、正しいバンドサイズが適応される代表的なゲル画像を示す。スプライスオーバーラップ伸長PCRの41後、合わせLTR- ギャグの製品は次のようになります図1Cに示すように、長さ約3,200塩基対、。

gag遺伝子はNgoMIVで必要な制限部位を含むMJ4から5 'LTR、ベクターおよびgag挿入の両方に融合によってクローニングに適し行われるとNgoMIVでのBclI及び制限酵素で消化し ​​、電気泳動後にアガロースゲルから切除しなければならない分離。これは、適切なベクターを切除し、バンドを挿入することが不可欠です。代表的なゲルを図2に示されている。制限部位の最端部に配置されているようLTR- ギャグインサートは、長さが約3,000 bpのままであるべきである一方MJ4プラスミドのベクター部分は、長さが約10,000塩基対であるべきであるアンプリコン。サイズはいずれも有意な減少が、研究中のgag遺伝子内の追加カットサイトが表示されます。

二つの断片のライゲーションに続いて、細菌の形質転換において、aNDプラスミドDNAの単離は、ギャグ-MJ4キメラはダブルNgoMIVでおよびHpaI制限酵素で消化し実行することで、適切な大きさのためにチェックする必要があります。細菌の複製中に削除イベントを発生していない完全長Gag特異MJ4キメラは約8,700と4300 bpの2つのバンドを有する図3に示したものと同様の制限パターンを持っている必要があります。

従来のアプローチと比較して、このプロトコルの重要な違いは、HIV-1サブタイプC感染性分子クローンで、MJ4のではなく、より一般的な実験室適応NL4-3ウイルスの使用である。しかし、前のセクションで説明されるアプローチは、pNL4-3にサブタイプB のgag配列クローニングのために変更することができる。

その後の実験で使用するための感染効率(MOI)の最適化は、試験されたウイルスの大半の対数増殖を示した理想的なMOIを選択するために実施した。図4は、MJ4(図4A)のためだけでなく、NL4.3( 図4B)3つの異なるのMOI(0.01、0.05、0.25)からの代表的な複製曲線を示す。 NL4-3複製のためのMOIの適切な可能性が高い、効率的なMJ4複製を検出するためには低すぎるだろうとしてMJ4は、考慮に入れることが重要ですNL4-3、よりGXR25細胞でははるかに少ない効率的に複製。 図4A、0.01または0.25とは対照的に、0.05のMOIで見られるように対数増殖はMJ4日数2-6の間で観察されたため、理想的な選択だった。低いMOI、0.01の場合は、6日目DLU値はほとんど検出され、私たちはMJ4より低い複製されたギャグ-MJ4キメラウイルスの生成を予想した。したがって、このMOIは、ほとんどの生物学的に重要であり得る、より弱毒化されたギャグ-MJ4キメラの成長をキャプチャしないだろう。ウイルス複製の迅速な動態が実質的な天羽を殺したので、さらに、0.25のMOIは、理想的ではありませんでした偶数日4による細胞のヌクレオチドは、これがプラトーに複製曲線を生じ、このような曲線に基づいて傾きを計算することは、複製能力を過小評価するであろう。 NL4-3用に生成曲線に基づいて、でも、0.01のMOIで、利用可能な細胞標的が著しく感染後6日目で排気されています。結論として、0.05のMOIは、多様なGagの配列及び複製のさまざまな程度を有していたこれらの全てのGag-MJ4キメラウイルスの大きなパネルに最適であることが判明した。

急性サブタイプCギャグ配列に由来する149ギャグ-MJ4キメラウイルスの総数は、このアッセイ用いたin vitro複製のためにテストされています。正規化されたRCの値は、いくつかのウイルスは、より効率的に、野生型MJ4より100倍以上を複製して、0.01〜3.5以上の範囲であった。 図5に、野生型MJ4は赤で示されていると、9代表ギャグ-MJ4キメラウイルスからの複製曲線を示すおよび複製cの広い範囲を示してapacitiesを観察した。このように、単独のgag遺伝子内の配列の多様性が大幅にin vitroで複製するウイルスの能力に影響を与えることができる。これは急性感染ザンビアから派生したGag-MJ4キメラウイルスの代表であるが、他のサブタイプC配列が広範囲にテストされておらず、別の複製動態を示すことができる。従って、異なるHIV-1バックボーン間の複製のレベルの広い範囲が存在し得るので、細心の注意は、特定の研究のウイルスの特定の複製に適合するようにMOIを最適化するように注意しなければならないおよびGagを分離する。

そのようなMJ4のレプリケーションをサポートGXR25細胞株などのT細胞株を使用する利点の1つは、再現性のレベルを使用してレプリケーション実験に対して観察される対象として、末梢血単核細胞を刺激した。最初の最適化実験では、MJ4野生型は8.7%のアッセイ内変動性を示し、differe同じギャグ-MJ4キメラウイルスのクローンは8.5%の複製の変動を示したヌクレオチド。異なるマスターミックスやphosphoscreenエクスポージャーの大きさが多少異なるDLU値を与える可能性があり、アッセイ内変動性が、さらに、各RTアッセイプレートに同じウイルス標準(この場合、野生型MJ4)を実行することによって制御することができるからです。 図6はグラフDLU値は、8つの異なるRTプレートで定量、同じMJ4感染から派生。すべてのRTアッセイに共通するウイルスを正規化すると、アッセイの間の信号の大きさのこれらのわずかな変化によって誘発される潜在的なエラーを軽減するのに役立ちます。

アッセイ間を可変にもテストされた、高度に相関していた別の日に繰り返さ複製します。7のプロットを 2つの独立した実験からの正規のRCスコア値は、約1年離れて行った。主要な外れ値が存在しない場合(R 2 = 0.873)との相関度が高いbetw観察された二つの独立した反復実験をEEN。

高い相関が、いくつかの変動は、2つの独立した実験間の複製動態の全体的な大きさである。これは、各実験に用いGXR25細胞株の間の通路の数の差に部分的に帰することができる。一般的には、6ヶ月よりも長い時間の間、継代されたGXR25細胞株はギャグ-MJ4キメラのより効率的なレプリケーションをサポートする傾向がある。したがって、一ヶ月の時間枠内でキメラのグループ間の複製能力を評価することが望ましい。前のステップが密接に従っている場合、このアッセイは、研究の広い範囲に適用可能であり、高度に堅牢で再現性のある結果を生成することができる。

図1
図1:代表的なゲルIMAGPCR産物の電気泳動分離を描いたエス。全てのPCR産物については、各50μl反応を5μl1X SYBRセーフDNAゲル染色を補足し、1%アガロース-TAEゲルにロードし、5×ローディングダイの3μlの混合した45分間、120Vで電気泳動により分離した。 Promega社1kbのDNAラダー(レーン1)アンプリコンサイズを近似するために使用した。A)gag遺伝子は、ネステッドPCRアプローチを用いてウイルスRNAから増幅した。挿入と削除のために、 ギャグアンプリコンの長さは1,600-1,700 bpのとは異なる場合があり、1500 bpのDNAラダーマーカーの上にわずかに見える。レーン2-5は、MJ4の5 'LTRは、野生型MJ4プラスミドから増幅し、電気泳動分離を介して可視化した。B)成功したgag遺伝子の増幅を示す。レーン2-5は、わずかに1500 bpのDNAラダーマーカーの下に表示される1474 bpのLTR産物の増幅の成功を示している。C)5Rを17; LTRは、野生型MJ4から誘導され、患者の血漿から増幅gag遺伝子はスプライスオーバーラップ伸長PCRにより互いに融合し、電気泳動による分離を経由して可視化する。レーン2-5描写が正常に大きさが約3,200塩基対であるアンプリコンを融合させて、わずかに3000塩基対のDNAラダーマーカーの上に表示されます。

図2
制限の電気泳動分離を描いた図2の代表ゲルイメージは、MJ4に患者ギャグ遺伝子をクローニングするためのダイジェスト。野生型MJ4プラスミドおよびLTR- ギャグ融合産物を37℃で1時間、50℃、NgoMIVでで1.5時間、BclIで消化し ​​たC.ベクターと挿入断片を、1X SYBRセーフDNA gを補充した1%アガロース-TAEゲル上で電気泳動分離を経由して可視化したエル2時間、100 Vでの染色およびUV-誘発性DNA損傷を低減するために、青色光照明装置を用いた。ベクトルおよびその後のクローニング工程のために好適な断片を挿入して、それぞれ約10,000 bpおよび2,900 bpのに表示されます。

図3
精製されたギャグ-MJ4キメラプラスミドDNAの制限消化物の電気泳動分離を描いた図3。代表ゲルイメージ。精製ギャグ-MJ4キメラプラスミドDNAを37℃で2時間、NgoMIVでおよびHpaI制限酵素で二重消化し ​​た。制限消化物を45分間120 Vで1X SYBRセーフDNAゲル染色を補足し、1%アガロース-TAEゲル上の電気泳動分離を経由して可視化した。大きな欠失のないプラスミドは、約8,700と4300 bpの2つの異なるバンドに解決されます。


MJ4とNL4-3の図4の複製は、感染の異なる多重度(MOI)でのGXR25細胞株におけるHIV-1単離物。×10 5 5 GXR25法プロトコールに記載されているように、細胞を5倍のMOIの増加に伴って感染させ、各ウイルスストック。上清を2日目、4、6上に収集し、8感染後およびビリオン産生は、放射性標識、逆転写酵素アッセイによって定量した。感染は三連で行った、エラーバーは、三重反復の標準偏差。(A)MJ4(B)NL4-3を示す。

図5
別のギャグ-MJ4キメラのための複製図5代表範囲。 5 GXR25細胞は、0.05のMOIで野生型MJ4またはGag特異MJ4キメラを感染させ、上清を感染後2日間隔で回収し、そしてビリオン産生は、放射性標識することによって定量RTアッセイ。さまざまなサブタイプCの導出ギャグ遺伝子挿入は、MJ4の複製能力に劇的な影響を与える可能性があります。野生型MJ4の複製は赤で示されている。

図6
放射性標識された逆転写酵素(RT)定量化アッセイにおいてアッセイ内変動の図6の比較。グラフは、8つの異なるRTアッセイにおいて単一の野生型MJ4感染からの同じ上清のDLU値をプロットすることにより固有のアッセイ内変動性を示しているプレート。曲線の変化は信号の大きさの賭けのわずかな変化を反映続いて、同じプレート上でアッセイのGag-MJ4キメラの勾配を正規化するために使用することができ、各RTプレート上での標準を実行することによって補正することができる予期するプレート。

図7
図GXR25細胞株における経時的な複製アッセイの再現性7。同一のGag-MJ4キメラウイルスは、2つの独立した実験でGXR25細胞を感染するために使用された一年間離れて約行う。複製スコアは、対数変換DLU値の傾きを計算し、野生型MJ4への勾配を正規化することによって生成した。野生型MJ4よりも効率的に複製するギャグ-MJ4キメラは、1より大きく、レプリケーションのスコアを持っており、野生型MJ4より少ない効率的に複製するものは、(2つの独立した測定値が強く相関している1未満のレプリケーションのスコアを持っているR 2 = 0.87、線形回帰)と異なる時間に、異なる継代の細胞を用いて行ったアッセイの再現性を強調する。

A)

試薬 1×反応用の容量(μL)
2X反応ミックス(Invitrogen社) 25
ヌクレアーゼフリーH 2 O 17
フォワードプライマーのGOF(20μM濃度) 1
リバースプライマーVifOR(20μMの濃度) 1
スーパースクリプトIIIワンステップ酵素ミックス 1
RNAテンプレート 5
全容積 50

B)

サイクル数 時間(時間:分:秒) 温度(℃)
1 一時00分00秒 50
1 2:00 94
10 0時15分 94
0時30分 56
五時 68
40 0時15分 94
0時30分 56
五時+5秒/サイクル 68
1 午前12時 68
1 4
END

表1 A)マスターミックスおよびB) ギャグ増幅のための強力な>サーマルサイクラー条件。 *注:GOFプライマー配列:5'-ATTTGACTAGCGGAGGCTAGAA-3 '。 VifORプライマー配列:5'-TTCTACGGAGACTCCATGACCC-3 '。

A)

試薬 1×反応用の容量(μL)
ヌクレアーゼフリーH 2 O 35.5
5倍のPhusion HFバッファー 10
のdNTP(40 mMのデオキシヌクレオチド) 1
フォワードプライマーGagInnerF1(20μMの濃度) 1
リバースプライマーBclIDegRev2(20μMの濃度) 1
のPhusionホットスタートポリメラーゼII 0.5
テンプレートとして、1回目のPCR 1
全容積 50

B)

サイクル数 時間(時間:分:秒) 温度(℃)
1 0時30分 98
29 0時10分 98
0時30分 53
午前一時 72
1 10時 72
1 4
END

表2 A)マスターミックスおよびB)、ネストされた第二ラウンドのギャグ増幅のためのサーモ条件。 * N注意GagInnerF1プライマー配列:5'-AGGCTAGAAGGAGAGAGATG-3 '。 BclIDegRev2プライマー配列:5'-AGTATTTGATCATAYTGYYTYACTTTR-3 '。

A)

試薬 1×反応用の容量(μL)
ヌクレアーゼフリーH 2 O 35.5
5倍のPhusion HFバッファー 10
のdNTP(40 mMのデオキシヌクレオチド) 1
フォワードプライマーMJ4For1b(20μMの濃度) 1
リバースプライマーMJ4Rev(20μMの濃度) 1
のPhusionホットスタートポリメラーゼII 0.5
テンプレートとしてMJ4プラスミド(10 ngの/ UL) 1
全容積 50

B)

サイクル数 時間(時間:分:秒) 温度(℃)
1 0時30分 98
29 0時10分 98
0時30分 58
午後12時45分 72
1 10時 72
1 4
END

表3 A)マスターミックスおよびB)5 'MJ4 LTR増幅のためのサーモ条件。 *注:MJ4For1bプライマー配列:5'-CGAAATCGGCAAAATCCC-3 '。 MJ4Revプライマー配列:5 '-CCCATCTCTCTCCTTCTAGC-3 '。

A)

試薬 1×反応用の容量(μL)
ヌクレアーゼフリーH 2 O 34.5
5倍のPhusion HFバッファー 10
のdNTP(40 mMのデオキシヌクレオチド) 1
フォワードプライマーMJ4For1b(20μMの濃度) 1
リバースプライマーBclIRev(20μMの濃度) 1
MJ4 LTR 1.3kbのアンプリコン(ゲル精製し、〜50ngの) 1
のPhusionホットスタートポリメラーゼII 0.5
ギャグアンプリコン(ゲル精製、〜100ngの) 1
全容積 50

B)

サイクル数 時間(時間:分:秒) 温度(℃)
1 0時30分 98
29 0時10分 98
0時30分 58
午前1時30 72
1 10時 72
1 4
END

表4 A)マスターミックスおよびB)スプライスオーバーラップ伸長PCRのサーマルサイクラー条件はLTR- ギャグインサートを生成する。 *注:BclIRevプライマー配列:5'-TCTATAAGTATTTGATCATACTGTCTT-3 '

A)

試薬 1×反応用の容量(μL) インキュベーション時間(時間) インキュベーション温度(℃)
3キロバイトLTR- ギャグアンプリコン または MJ4プラスミド1.5μgの 1.5μgのためのxμlの
NEB CutSmartバッファ(以前はNEBバッファー#4) 2
のBclI制限酵素 1
ヌクレアーゼフリーH 2 O X
全容積 19 1.5 50
NgoMIVで制限酵素 1
全容積 20 1 37

B)

試薬 1×反応用の容量(μL) インキュベーション時間(時間) インキュベーション温度(℃)
50 ngのカットMJ4プラスミドベクター 50 ngのためのXμlの
45 ngのカットLTR- ギャグインサート (3:1の比率) 45 ngに関するXμlの
ロシュ10倍リガーゼ緩衝液 2
ロシュT4 DNAリガーゼ(5 U /μl)を 1
ヌクレアーゼフリーH 2 O
全容積 20 18歳以上(一晩) 4

C)

試薬 1×反応用の容量(μL) インキュベーション時間(時間) インキュベーション温度(℃)
ギャグ-MJ4プラスミド450 ngの 450 ngに関するXμlの
NEB CutSmartバッファ(以前はNEBバッファー#4) 2
NgoMIVで制限酵素 0.5
のHpaI制限酵素 0.5
ヌクレアーゼフリーH 2 O X
全容積 20 2 37

ギャグ-MJ4クローニング忠実性を確保するために、表5 A)制限ギャグ-MJ4キメラプロウイルスの生成のためのライゲーション反応をマスターミックスとBを消化。C)診断制限消化。

プライマー名 塩基配列(5 ' - 3')
GagInnerF1 AGGCTAGAAGGAGAGAGATG
GagF2 GGGACATCAAGCAGCCAT
For3 CTAGGAAAAAGGGCTGTTGGAAATG
GagR6 CTGTATCATCTGCTCCTG
REV3 GACAGGGCTATACATTCTTACTAT
REV1 AATTTTTCCAGCTCCCTGCTTGCCCA

ギャグ-MJ4キメラプロウイルスの5 'LTRおよびgag配列同一性を確認するために必要な配列決定プライマーの表6のリスト。

さてA 8μlのウイルス+ DMEM中の232μlの1%のFBS
さてB さて、A + DMEM中の160μlの1%のFBSから80μlの
ウェルC さてB + 160から80μlのDMEM中の100μlの1%FBS
さてD ウェルC + DMEM中の160μlの1%のFBSから80μlの
ウェルE さてD + 160μlの1%DMEM中でFBSから80μlの
さて、F ウェルE + DMEM中の160μlの1%のFBSから80μlの

表7希釈スキーム(3 -TZM-BL細胞に感染性ウイルスを滴定するため)をまとめておきます。

A)

試薬 ボリューム
のCa 2 +またはMg 2 +を含まないPBS 500ミリリットル
グルタルアルデヒド 4ミリリットル
ホルムアルデヒド 11ミリリットル

*注:4℃で保存する。

B)

試薬 ボリューム
のCa 2 +またはMg 2 +を含まないPBS 4.75ミリリットル
フェリシアン化カリウム(0.2M) 100μlの
フェロシアン化カリウム(0.2M) 100μlの
塩化マグネシウム(1 M) 20μlの
X-galを(50 mg / ml)を 40μlの

*注:新鮮な作り、使用するまで光から離れて保管してください。


C.

オリジナル希釈井戸 A B C言語 D E F
ウイルスの量(μl)を24ウェルプレートの列のウェルに添加 5 1.6667 0.5556 0.1852 0.06173 0.02057

表8 A) 。C)感染単位/μlを計算するためのウェルに加え、ウイルスのボリューム上のGag-MJ4キメラウイルスの力価測定のための強力な>染色およびB)定着液。

試薬 ボリューム
ウシ胎児血清(FBS)、定義された 55ミリリットル
ペニシリン、ストレプトマイシン、グルタミン(100×) 6ミリリットル
HEPES緩衝液(1 M) 6ミリリットル

GXR25細胞の増殖のための完全RPMI培地用の表9のレシピ。

試薬 容量(ml)
ヌクレアーゼフリーH 2 O 419.5
トリス塩酸、pHが7.8(1 M) 30
塩化カリウム(1 M) 37.5
塩化マグネシウム(1 M) 2.5
ノニデットP-40(10%) 5
EDTA(0.5M) 1.02
ポリアデニル酸、カリウム塩(2 mg / ml)を 1.25
オリゴdTプライマー(25μg/ ml)を 3.25
全容積 500

放射性標識された逆転写酵素アッセイマスターミックスのための表10のレシピ。 *注意:-20℃で1mlアリコートとして保管してください。

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Discussion

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により長さとこのプロトコルの技術的な性質のために、キメラギャグ-MJ4プラスミドの構築の成功の両方のためだけでなく、ウイルス複製能力の定量化のために重要である、いくつかのステップがあります。このプロトコルで概説MJ4への外来ギャグ遺伝子の導入のための制限酵素ベースのクローニング戦略は以前に使用され再結合に基づく方法に対して多くの利点を有しているが、重要なステップを正確に従わない場合、プロトコルは、技術的に挑戦することができます。

まず、DCMおよびダムDNAメチラーゼを欠くコンピテント細菌株において生成されたMJ4プラスミドDNAを使用することが必要不可欠である。 MJ4骨格にギャグの遺伝子をクローニングするために使用されているのBclI制限エンドヌクレアーゼの酵素活性は、敏感なダム/ DCMのメチル化であるとして、これが必要です。 JM110及びSCS110(endAの負JM110誘導体)E.大腸菌株非メチル化MJ4プラスミドDNAを生成するのに適して再。さらに、ベクターおよびインサートバンドの切除のために、それは非常に青色光照明装置は視覚化のために使用することをお勧めします。これは、UV波長依存性DNA損傷を低減し、大幅にクローニング効率を増加させる。青色光照明装置が使用できない場合、クローニング効率は、SYBR Safe DNAゲル染色の代わりに臭化エチジウムでDNAを可視化し、UV照射時間を最小にすることによって最大化することができる。

最後に、MJ4の大(> 10キロバイト)および/またはレトロウイルスプラスミドによる分子クローニングは、伝統的に、さまざまな理由で困難であった。大規模なプラスミドは、有能な細菌株を42の形質転換効率を低下させる一方で、長い末端反復(LTR)配列、レトロウイルスゲノム43の欠失につながる細菌宿主内でのプラスミドDNAのプラスミドと妥協複製忠実度の安定性を低下させるが含まれているレトロウイルス挿入、 大腸菌を使用する場合に加えて、MJ4プラスミドの複製がより安定である私たちの手の中にDH5α株以上の大腸菌株。によるプラスミドの不安定な性質のために、精製されたプラスミドの製品は常に制限酵素消化により正しいプラスミドのサイズをチェックするべきである。ここで、二重の2時間、37℃でNgoMIVでおよびHpaI制限エンドヌクレアーゼで消化する。

キメラのGag-MJ4プラスミドの一回の成功生成が達成されている、ウイルスは2のトランスフェクションを介して生成される指標細胞株、TZM-blを細胞、および複製能力に力価測定93T細胞は、CEMベースのT細胞株を用いて測定される。これらの複製研究のために使用CEMベースGXR25細胞株は、HIV-1のCCR5向性株の侵入および複製を支持することができるいくつかの確立されたT細胞株の一つである。これは、ヒトCCR5 37の安定な発現を可能にするためにレトロウイルス形質導入によって達成された。この細胞株は、自然に、CXCR4を発現し、そのような実験室適応株をNL4-3としてCXCR4指向性HIV-1の複製をサポートします。しかし、そのようなMJ4などのCCR5向性株の効率的な複製をサポートするために、GXR25細胞が感染前に劣らず4ヶ月以上伝播しなければなりません。適切に継代培養はあっても、最大1年間の継代後にレプリケーションをサポートすることができます。継代を通じてCCR5向性複製の注意深い監視が成功した実験のために不可欠である。

任意の技術と同様に、プロの限界がある考慮されなければならないトコール。原因MJ4プラスミド中の制限部位の位置だけでなく、自然のHIV-1単離発生中の保存制限部位の利用可能性、3 '末端制限部位、BclIでは、 ギャグ終止コドンから137ヌクレオチドに位置しています。これは、キメラプロテアーゼ遺伝子を生成しているが、この領域は、このコホートにおいて保存96.5%であり、私たちは死んでいるか、欠陥キメラウイルスの存在量を観察しなかった。

サブタイプC由来の配列とMJ4亜型Cの感染性分子クローンを使用する利点の1つは、それがギャグ遺伝子および異なるサブタイプの骨格ベクトル間の次善の遺伝子ペアリングの危険性を減少させることである。しかし、内·クレードの多様性のある量の同じサブタイプ31内で見た場合であっても、国や地域によるHIV-1配列のクラスタリングによって証明されるように存在しています。これは遺伝子がデアギャグの間次善のペアリングに寄与しうる急性感染ザンビアとボツワナ38から慢性的に感染した個体に由来したMJ4感染性分子クローンバックボーンからived。しかし、分析さ構築物の大部分は、感染性の子孫ウイルスを産生した。などの異なるHIV-1サブタイプC感染性分子クローンは、より広く利用できるようになるには、さらに原因導入された最小の偏りがあることを確実にするために、他の主鎖へのこれらのHIV-1クレードC ギャグ遺伝子にクローニングすることによって、このシステムを検証することが重要になりますバックボーンの非互換性に。

GXR25細胞株は、特にによるCXCR4およびCCR5向性の株及びそのHIV-1誘導性GFPレポーター37の両方をサポートするその能力のために、固有の細胞株である。しかし、いくつかの制限があり、慎重にこのプロトコルから適合実験のために、この細胞株を使用する前に考慮すべきである。 GXR25細胞株は、サブタイプCまたはA、CCR5指向性、広報の大多数のエントリをサポートしていないようimaryは、私たちがテストしている分離します。さらに、親CEM細胞株GXR25細胞株は、2ジャーカット細胞株44より4倍高い発現まで、シクロフィリンAの展示高レベルの誘導された。によるシクロフィリンA、通常、サイクロフィリンAと結合するキャプシドの能力の低下に起因する正規HLA-B * 57に関連するエスケープ突然変異、T242N、関連付けられた複製欠損の高いレベルに、簡単にこの特定の細胞株で検出することができない25。このように、CEMベースGXR25細胞株は、HIV-1キャプシドシクロフィリン結合ループ中の変異に関連複製欠陥を研究するための理想的ではない。

このプロトコルは、急性の時点から派生ギャグ配列複製能力を分析するための理想的であるが最終的に、修正が慢性的に感染した個体由来の遺伝子をギャグの複製能力を研究するためになされなければならない。このプロトコルは、午前が関与急性時点から人口配列のplificationウイルスの多様性が限られている場合(中央値45日、感染の予定日後)。各キメラからのgag遺伝子を配列決定し、忠実度をクローニングすることを保証するために初期集団のPCRアンプリコンと比較される。急性の時点で制限された配列の多様性に、人口PCR産物からのクローニングが可能です。しかし、配列の多様性は、慢性的に感染者のウイルス準種内に存在する;従って、正確に慢性準種の複製能力を評価するために、単一ゲノム増幅は、いくつかの代表的な変異体を捕捉するために使用されなければならない。これらの変異体のそれぞれは、その後のin vitro複製についてアッセイしなければならない。

この技術は、既存の方法に比べてその利点から生じるいくつかのより広範な用途を有する。このプロセスは、クローン性増殖性アデノプラスミドをもたらすので、追加のmについての構築物を使用することが簡単であるウイルス複製に特定の残基の寄与を解明するのに役立つutagenesis研究、。また、長手方向の時点からのgag遺伝子においてクローニングすることによって、人は時間をかけてウイルス複製能力の進化を評価することができる方法と、これらの変化はHIV-1感染個体における病因に影響を与え得る。

この技術は、異なるアプリケーションのためにその有用性を拡大するために修飾することができる。追加のHIV-1ウイルスタンパク質は、ウイルス複製または宿主タンパク質との相互作用に対する効果を評価するためにMJ4プラスミドに操作することができる。これは、サイレントなヌクレオチド変化を導入することにより、ゲノム中の所望の領域に追加の制限部位を設計することによって達成することができる。しかし、特別な配慮がHIV-1ゲノムの3 '半分に小説の制限部位を設計するときのような多くのアクセサリータンパク質が代替リーディングフレームでエンコードされて撮影し、いずれかのサイレント変化しなければならないタンパク質は、他の中のアミノ酸置換につながる可能性があります。この例では、制限酵素部位などダドリーによって議論されるような独立したクローニング方法。45この制限を克服することができる。異なる集団に由来するウイルス配列は、複製能力の変化範囲を有していてもよく、MOIは、成長のそれらの対数期内でのウイルス分離株の大部分を捕捉するために応じて調整することができる。最後に、GXR25細胞株を安定LTR駆動型のTat誘導性プロモーター下にGFPでトランスフェクトされ、ウイルスの拡散は、ここに記載またはRTアッセイの代替として37を、フローサイトメトリーを介して、GFP陽性細胞の関数として測定することができる伝統的なp24をELISA。

結論として、このプロトコルは、適切なビリオン形成のために必要な保存された構造タンパク質をコードするgag遺伝子によって付与されるように、HIV-1ウイルス複製を評価するための効率的かつ強力な手法を提供、出芽、成熟、および分解46-48。さらに、この技術は、突然変異誘発研究に理想的であり、従って、ウイルスのフィットネスの特定のアミノ酸の決定因子を解明するための方法を提供し、複製コンピテントクローンのプラスミドを生成する。このような研究は、免疫主導型ウイルスの進化は、HIV-1に感染した個体では病因および疾患の進行にどのように影響するかの理解を向上させることが不可欠である。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
PCR Reagents
GOF: 5' ATTTGACTAGCGGAGGCTAGAA 3' IDT DNA Custom Oligo 25 nmol, standard desalt
VifOR: 5' TTCTACGGAGACTCCATGACCC 3' IDT DNA Custom Oligo 25 nmol, standard desalt
GagInnerF1: 5' AGGCTAGAAGGAGAGAGATG 3' IDT DNA Custom Oligo 25 nmol, standard desalt
BclIDegRev2: 5' AGTATTTGATCATAYTGYYTYACTTTR 3' IDT DNA Custom Oligo 25 nmol, standard desalt
MJ4For1b: 5' CGAAATCGGCAAAATCCC 3' IDT DNA Custom Oligo 25 nmol, standard desalt
MJ4Rev: 5' CCCATCTCTCTCCTTCTAGC 3' IDT DNA Custom Oligo 25 nmol, standard desalt
BclIRev: 5' TCTATAAGTATTTGATCATACTGTCTT 3' IDT DNA Custom Oligo 25 nmol, standard desalt
GagF2: 5' GGGACATCAAGCAGCCAT 3' IDT DNA Custom Oligo 25 nmol, standard desalt
For3: 5' CTAGGAAAAAGGGCTGTTGGAAATG 3' IDT DNA Custom Oligo 25 nmol, standard desalt
GagR6: 5' CTGTATCATCTGCTCCTG 3' IDT DNA Custom Oligo 25 nmol, standard desalt
Rev3: 5' GACAGGGCTATACATTCTTACTAT 3' IDT DNA Custom Oligo 25 nmol, standard desalt
Rev1: 5' AATTTTTCCAGCTCCCTGCTTGCCCA 3' IDT DNA Custom Oligo 25 nmol, standard desalt
CoolRack PCR 96 XT Biocision BCS-529
CoolRack M15 Biocision BCS-125
Nuclease free water Fisher SH30538FS Manufactured by Hyclone
QIAamp Viral RNA Mini Kit Qiagen 52906
Simport PCR 8 Strip Tubes, Blue (Flat Cap) Daigger EF3647BX
SuperScript III one-step RT-PCR system Life Technologies/Invitrogen 12574035
Phusion Hot-start II DNA polymerase Fisher F-549L
PCR Nucleotide Mix Roche 4638956001
Agarose, high gel strength Fisher 50-213-128
TAE 10X Life Technologies/Invitrogen AM9869
Promega 1 kb DNA ladder Fisher PRG5711 Manufactured by Promega
Sybr Safe DNA Gel Stain, 10,000x Life Technologies/Invitrogen S33102
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System Promega A9282
Razor blades, single-edged Fisher 12-640 Manufactured by Surgical Design
Thermocycler, PTC-200 MJ Research
Microbiology & Cloning Reagents
LB Agar, Miller Fisher BP1425-2
LB Broth, Lennox Fisher BP1427-2
Sterile 100 x 15 mm polystyrene Petri dishes Fisher 08-757-12
Ampicillin sodium salt Sigma-Aldrich A9518-5G
Falcon 14 ml Polypropylene round-bottom tubes BD Biosciences 352059
NgoMIV restriction endonuclease New England BioLabs R0564L
BclI restriction endonuclease New England BioLabs R0160L
HpaI restriction endonuclease New England BioLabs R0105L
T4 DNA Ligase, 5 U/μl Roche 10799009001
JM109 competent cells, >108 cfu/μg Promega L2001
PureYield plasmid miniprep system Promega A1222
Safe Imager 2.0 Blue Light Transilluminator Invitrogen G6600
Microfuge 18 centrifuge Beckman Coulter 367160
Cell Culture Reagents
Amphyl cleaner/disinfectant Fisher 22-030-394
Fugene HD, 1 ml VWR PAE2311 Manufactured by Promega
Hexadimethrine bromide (Polybrene) Sigma-Aldrich H9268-5G
Costar Plates, 6-well, flat Fisher 07-200-83 Manufactured by Corning Life
Costar Plates, 24-well, flat Fisher 07-200-84 Manufactured by Corning Life
Costar Plates, 96-well, round Fisher 07-200-95 Manufactured by Corning Life
Flasks, Corning filter top/canted neck, 75 cm2 Fisher 10-126-37
Flasks, Corning filter top/canted neck, 150 cm2 Fisher 10-126-34 Manufactured by Corning Life
Conical Tubes, 50 ml, blue cap Fisher 14-432-22 Manufactured by BD Biosciences
Conical Tubes, 15 ml, blue cap Fisher 14-959-70C Manufactured by BD Biosciences
Trypsin-EDTA Fisher MT25052CI Manufactured by Mediatech
RPMI, 500 ml Life Technologies/Invitrogen 11875-119
DMEM, 500 ml Life Technologies/Invitrogen 11965-118
Penicillin/Streptomycin/Glutamine, 100x Life Technologies/Invitrogen 10378-016
PBS with magnesium and calcium, 500 ml Life Technologies/Invitrogen 14040-133
PBS without magnesium and calcium Life Technologies/Invitrogen 20012-050
Sarstedt tubes, assorted colors Sarstedt 72.694.996
Reservoir Trays for Multichannel, 55 ml Fisher 13-681-501
DEAE-Dextran Fisher NC9691007
Corning 96 well clear V bottom tissue culture treated microplate Fisher 07-200-96 Manufactured by Corning Life
HEPES, 1 M Buffer Solution Life Technologies/Invitrogen 15630-080
FBS, Defined, 500 ml Fisher SH30070 03
X-gal VWR PAV3941 Manufactured by Promega
Glutaraldehyde, Grade II, 25% in H2O Sigma-Aldrich G6257-100ML
1 M Magnesium chloride solution Sigma-Aldrich M1028-100ML
Formaldehyde solution, for molecular biology, 36.5% Sigma-Aldrich F8775-500ML
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate Sigma-Aldrich P9387-100G
Potassium hexacyanoferrate(III) Sigma-Aldrich P8131-100G
Allegra X15-R centrifuge Beckman Coulter 392932
TC10 automated cell counter Bio-Rad 1450001
VistaVision inverted microscope VWR
Reverse-Transcriptase Quantification Assay Reagents
dTTP, [α-33P]- 3000 Ci/mmol, 10 mCi/ml, 1 mCi Perkin-Elmer NEG605H001MC
1 M Tris-Cl, pH 8.0 Life Technologies/Invitrogen 15568025 Must be adjusted to pH 7.8 with KOH
2 M Potassium chloride (KCl) Life Technologies/Invitrogen AM9640G Adjust to 1 M solution
0.5 M EDTA Life Technologies/Invitrogen 15575-020
Nonidet P40 Roche 11333941103
Polyadenylic acid (Poly rA) potassium salt  Midland Reagent Co. P-3001
Oligo d(T) primer Life Technologies/Invitrogen 18418-012
Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich 43815-1G
SR, Super Resolution Phosphor Screen, Small Perkin-Elmer 7001485
Corning Costar Thermowell 96-well plate model (M) Polycarbonate Fisher 07-200-245 Manufactured by Corning Life
Corning 96-well Microplate Aluminum Sealing Tape, Nonsterile Fisher 07-200-684 Manufactured by Corning Life
DE-81 anion exchange paper Whatman 3658-915
Trisodium citrate dihydrate Sigma-Aldrich S1804-1KG
Sodium Chloride Fisher S671-3
Autoradiography cassette Fisher FB-CA-810
Cyclone storage phoshpor screen Packard

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References

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評価するために制限酵素ベースのクローニング方法<em&gt;インビトロ</em&gt; HIV-1サブタイプC Gag特異MJ4キメラウイルスの複製能力
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Claiborne, D. T., Prince, J. L., Hunter, E. A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses. J. Vis. Exp. (90), e51506, doi:10.3791/51506 (2014).More

Claiborne, D. T., Prince, J. L., Hunter, E. A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses. J. Vis. Exp. (90), e51506, doi:10.3791/51506 (2014).

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