Summary
Lineær-mediert amplifikasjon (LAM)-PCR er en fremgangsmåte utviklet for å identifisere de nøyaktige posisjoner av integrering av virale vektorer i genomet. Teknikken har utviklet seg til å bli den overlegne metoden for å studere clonal dynamikk i genterapi pasienter, biosikkerhet av nye vektorteknologier, T-celle mangfold, kreft stamceller modeller, etc.
Introduction
Lineær-mediert amplifikasjon PCR (LAM-PCR) gjør det mulig å identifisere og karakterisere ukjente flankerende DNA i tilknytning til kjente DNA fra hvilken som helst opprinnelse. Mer spesifikt, har LAM-PCR blitt utviklet for å lokalisere viral vektor integreringssteder (IS) i vertsgenomet 1,2. Genetiske elementer som retrovirus eller transposoner integrere deres genom i vertsgenomet i en (halv) tilfeldig måte 3-6. I mange tilfeller er det avgjørende å vite nøyaktig posisjonen hvor disse vektorer integrert. LAM-PCR har vist seg å være bedre enn alternative teknikker som ligation-mediert PCR 7 og dens varianter eller invers PCR åtte. Følsomheten og robusthet i denne metoden oppstår ved den innledende preamplification av vektor-genom veikryss og magnetisk utvalg av amplifiserte PCR-produkter. I likhet med de alternative fremgangsmåter som er nevnt, er avhengig LAM-PCR på bruk av restriksjonsenzymer, innføre en skjevhet i gjenfinning kapasitet IS 9-11. SåledesBare en undergruppe av IS repertoaret (den integrome) kan påvises i en reaksjon. Denne skjevhet blir minimalisert ved parallell analyse av en gitt prøve med optimale kombinasjoner av restriksjonsenzymer 9. Nylig ble en variant av teknologien betegnet ikke-begrensende LAM-PCR (nrLAM-PCR) er blitt utviklet som omgår bruken av restriksjonsenzymer og kan objektiv genom-wide-analyse av en prøve i en enkelt reaksjons 9,12.
I det siste har LAM-PCR blitt brukt til å identifisere den utløsende retroviral gir opphav til leukemi hos noen pasienter i kliniske genterapiforsøk 13-15. Siden da har LAM-PCR blitt tilpasset for å identifisere IS fra andre integrerende vektorer (lentiviral vektorer, transposon) og også for å identifisere integreringsmønstre passivt integrere vektorer som adeno-assosiert vektorer (AAV) eller integrasehemmere-defekt lentiviral vektorer (IDLV) 16 -21. Anvendelser av LAM-PCR er bred spredning: tradisjonellly, er teknikken mye brukt til å studere klonal sammensetningen av genmodifiserte celler hos pasienter som har gjennomgått genterapi eller å vurdere biosikkerhet av nye vektorsystemer ved å rakne deres integrering atferd 15,16,22-24. Nylig, aktivert LAM-PCR bestemme spesifisitet og off-target aktivitet av designer nukleaser av en IDLV fangst assay 25.
Videre tillater LAM-PCR for enkelt å følge skjebnen til en transduced celle over tid i en organisme. Dette gjør det mulig å identifisere proto-onkogener samt tumorsuppressorgener, og også for å studere hematopoiesis eller kreft stamcelle biologi 26-28. Sist men ikke minst, ble LAM-PCR tilpasset studere T-celle reseptor mangfold hos mennesker 29 (og upubliserte data).
Den iboende kraften i teknologien er forsterket ved å knytte metoden til dype sekvensering teknologier som gjør det mulig å karakterisere millioner av ukjent flankerer DNA med singel nucleotide resolution i hele genomer. I det følgende protokoll, vi beskriver trinnvis forsterkning og identifisering av flanke ukjent DNA exemplarily å identifisere lentiviral vektor IS. Oligonukleotider som benyttes i protokollen, er oppført i tabell 1. utpakkede DNA eller cDNA fra hvilken som helst kilde kan anvendes som DNA-templat for LAM-PCR og nrLAM-PCR..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Utarbeidelse av Linker Kassetter (LC)
- Bland 40 ul av LC1 oligonukleotid (tabell 1), 40 pl av LC2 oligonukleotid (tabell 1, med riktig restriksjonsenzym overheng), 110 pl tris-HCl (100 mM, pH 7,5), og 10 pl 250 mM MgCl2.
- Inkuber ved 95 ° C i 5 minutter, og lot reaksjonen avkjøles langsomt til romtemperatur. Tilsett 300 mL H 2 O og konsentrere dsLinker-DNA på en sentrifugefilter. Legg 80 pl H to O til eluatet og alikvot av 10 ul forberedt linker kassett i 0,2 PCR-rør.
2. Preamplification av Vector Genome Junctions
- For hver prøve som skal analyseres forberede en 50 pl PCR-reaksjon.
- Bestem konsentrasjonen av DNA-prøvene. Pipetter x mL (1-1,000 ng for LAM/100-1, 000 ng for nrLAM) av DNA inn i en 0,2 ml PCR rør. Volum av DNA bør være lik i hver prøve og i det løpge på 0,5 til 25 ^.
- Forbered PCR konsentrat-blanding som beskrevet i tabell 2 Mix (50 - x). Pl av konsentrat-blandingen med hver DNA-prøve i 0,2 ml PCR-rør.
- Preamplify vektor genom kryss ved hjelp av PCR-betingelsene som er eksemplifisert i Tabell 2. Etter fullførelse av PCR-legg til 0,5 ul Taq-polymerase til hvert PCR rør og kjøres på nytt PCR-programmet. PCR-produkter kan lagres ved 4 ° C i opp til 4 dager, eller lang sikt ved -20 ° C.
Tre. Magnetisk separasjon av PCR produktet
- Utarbeidelse av Magnetperler
- Pipetter 20 ul (200 pg) av streptavidin belagte magnetiske perler inn i et 1,5 ml rør og utsettes for 1 min på magnetpartikkelseparatoren (MPS) ved romtemperatur. Kast supernatant.
- Fjern røret fra MPS og resuspender magnetiske kuler i 40 mL PSB / 0,1% BSA (pH 7,5). Utsett til MPS for 1 min og kast supernatanten. Gjenta dette trinnet en gang.
- Vask perler with 20 pl av 3 M LiCl-oppløsning (3 M LiCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) utsettes for MPS i 1 min, og supernatanten kastes. Resuspender perler i 50 pl 6 M LiCl-oppløsning (6 M LiCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA).
- Bland hele PCR-reaksjon fra trinn 2.2 med 50 pl av preparerte magnetiske kuler. Inkuber på en horisontal rister (300 rpm) i det minste i 2 timer ved romtemperatur. Dette trinnet kan binding av biotinylated PCR produkt til streptavidin belagt perler (DNA-Bead komplekse). DNA perlekomplekset kan inkuberes på rister over natten eller lagret ved 4 ° C i inntil 4 dager.
- Eksponer DNA-Bead-komplekset til MPS i 1 min ved romtemperatur, fjernes supernatanten og resuspender DNA-Bead kompleks i 100 pl H2O Umiddelbart videre med trinn 4 for LAM eller trinn 5 for nrLAM.
4. LAM-prosedyre
- Double Strand DNA (dsDNA) Synthesis (LAM only)
- Expose DNA-Bead kompleks fra trinn 3,3 til MPS for 1 min og diskort supernatant. Legg 8,25 mL H 2 O, 1 mL 10x hexanucleotide buffer, 0,25 mL dNTPs (10 mm) og 0,5 mL (2 U) Klenow polymerase. Inkuber ved 37 ° C i 1 time.
- Legg 90 mL av H 2 O og utsett til MPS for 1 min. Kast supernatanten og resuspender DNA-Bead kompleks i 100 mL H 2 O.
- Begrensning Digest
- Expose DNA-Bead kompleks til MPS for 1 min og kast supernatanten. Til 8,5 pl H2O, 1 pl 10x restriksjonsenzym-buffer og 0,5 pl restriksjonsenzym og inkuber reaksjon i 1 time. Gjenta trinn 4.1.2.
MERK: Inkuber reaksjonen ved temperaturer som er anbefalt av produsenten av restriksjonsenzymet. Sørge for at det ikke er noen restriksjonssete til stede i, eller nedstrøms for primer bindingssete som brukes til forforsterk-ningen i DNA av interesse. For valg av passende restriksjonsenzymer / begrensning enzym kombinasjoner refererer til ni.
- Expose DNA-Bead kompleks til MPS for 1 min og kast supernatanten. Til 8,5 pl H2O, 1 pl 10x restriksjonsenzym-buffer og 0,5 pl restriksjonsenzym og inkuber reaksjon i 1 time. Gjenta trinn 4.1.2.
- Ligation av ds Linker (LK)
- Expose DNA-Bead kompleks til MPS for 1 min og kast supernatanten. Tilsett 5 mL H 2 O, 1 mL 10x FastLink buffer, 1 mL ATP (10 mm), 2 ul Linker kassett fra trinn 1.2, og en ul Fast-Link DNA ligase (2 U / mL). Inkuber ved romtemperatur i 5 min. Gjenta trinn 4.1.2.
- Denaturering av syntetisert dsDNA
- Expose DNA-Bead kompleks til MPS for 1 min og kast supernatanten. Resuspender DNA-Bead kompleks i 5 mL 0,1 N NaOH. Inkuber i 5 min ved romtemperatur på en horisontal riste.
- Expose DNA-Bead kompleks til MPS for 1 min og samle preamplified vektor-genom veikryss inneholder supernatant i nye 1,5 ml tube. Umiddelbart videre med trinn 6 eller butikken supernatant ved -20 ° C.
5. NrLAM-prosedyre
- Ligation av single strandet linker (ssLC) (nrLAM only)
- Expose DNA-Bead kompleks fra trinn 3,3 til MPS1 min og kast supernatanten. Til 6,5 pl H2O, 1 ul CircLigase 10x reaksjonsbuffer, 0,5 ul MnCl 2 (50 mM), 0,5 ul ATP (1 mM), 1 ul ssLinker oligonukleotid og 0,5 pl CircLigase (100 U / ul). Inkuber ved 60 ° C i 1 time.
- Legg 90 mL av H 2 O og utsett til MPS for 1 min. Kast supernatanten og vask DNA-Bead kompleks i 100 pl H2O Igjen utsett til MPS for en min, kast supernatanten og resuspender DNA-Bead kompleks i 10 mL H 2 O.
6. Eksponensiell Amplification jeg
- For hver prøve som skal analyseres forberede en 50 pl PCR-reaksjon.
- Pipetter 2 mL mal DNA (fra trinn 4.4.2 (LAM) eller 5.1.2 (nrLAM)) i en 0,2 ml PCR rør.
- Forbered PCR konsentrat-blanding som beskrevet i tabell 3.. Legg 48 mL av konsentrat-blanding til hver prøve fra trinn 6.1.1 og forsterke vektor genom veikryss ved PCR conditions eksemplifisert i tabell 3.. PCR-produkter kan lagres ved 4 ° C i opp til 4 dager, eller lang sikt ved -20 ° C.
7. Magnetisk separasjon av PCR produktet
- Forbered magnetiske kuler som eksemplifisert i trinn 3.1.1 - 3.1.3. Resuspender perler i 20 ul (for LAM) og 50 ul (for nrLAM) av 6 M LiCl-oppløsning (6 M LiCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA). Bland 20 ul (LAM) og 50 ul (nrLAM) av PCR-reaksjonen fra trinn 6.1.2 med forberedte magnetiske kuler (trinn 7.1) og inkuberes på en horisontal rister (300 rpm) i 2 timer ved romtemperatur. DNA perlekomplekset kan inkuberes på rister over natten eller lagret ved 4 ° C i inntil 4 dager.
- Expose DNA-Bead kompleks til MPS for en min, fjern supernatanten og resuspender DNA-Bead kompleks i 100 mL H 2 O. Expose DNA-Bead kompleks til MPS for 1 min og kast supernatanten.
- Resuspender DNA-Bead kompleks i 20 mL (LAM) eller 5 mL (nrLAM) 0,1 N NaOH. INCUbate i 10 minutter ved romtemperatur på en horisontal riste, utsettes for MPS i 1 min, og samle amplifisert DNA-inneholdende supernatant på nytt 1,5 ml rør. Umiddelbart videre med trinn 8.1 eller butikken supernatant ved -20 ° C.
8. Eksponensiell Amplification II
- For hver prøve som skal analyseres forberede en 50 pl PCR-reaksjon.
- Pipetter 2 pl templat DNA (fra trinn 7.3) i en 0,2 ml PCR-rør.
- Forbered PCR konsentrat-blanding som beskrevet i tabell 4. Legg 48 mL av konsentrat-blanding til hver prøve fra trinn 8.1.1 og forsterke vektor genom veikryss ved PCR-betingelser som er eksemplifisert i tabell 4.. PCR-produkter kan lagres ved 4 ° C i opp til fire dager eller lang sikt ved -20 ° C.
- For å visualisere (nr) LAM-PCR-produkter, last 10 pl av PCR-produktet fra trinn 8.1.2 på en 2% agarosegel. Hvis band er synlig, analysere 10 mL av LAM-PCR produktet på høy oppløsning gel. FORSIKTIG: Ethidium bromide er mutagene. Jobber veldig nøye og alltid ha egnede hansker.
9. Forberedelse for High-throughput sekvense
- Rensing av (NR) LAM-PCR-produkter
- Bland 40 mL PCR-produktet fra trinn 8.1.2 med 44 mL av romtemperatur AMPure XP Magnetperler. Inkuber 5 min ved romtemperatur og utsett til MPS for ytterligere 2 min.
- Kast supernatanten og vask to ganger med 200 mL 70% EtOH på MPS.
- Kast supernatanten og resuspender DNA-Bead kompleks i 30 mL H 2 O. Inkuber 1 min og overføre supernatant til frisk 0,2 ml tube. Bestem konsentrasjonen av renset DNA.
- Fusionprimer PCR å legge sekvense spesifikke adaptere.
- For hver prøve som skal analyseres forberede en 50 pl PCR-reaksjon.
- Pipetter x pl (40 ng) av DNA inn i en 0,2 ml PCR-rør. Volum av DNA bør være lik i hver prøve, og i området fra 0,5 til 25 mL.
- Forbered PCR konsentrat-blanding som beskrevet i tabell 5 til (50 - x). Pl av konsentrat-blanding til hver prøve fra trinn 9.2.2 og innføre Sekvense adaptere til (nr) LAM-PCR-produkter ved PCR-betingelser som er eksemplifisert i Tabell 5 PCR-produkter. kan lagres ved 4 ° C i opp til 4 dager, eller lang sikt ved -20 ° C.
- For å visualisere Fusionprimer-PCR-produkter belastning 10 pl av PCR-produktet fra trinn 9.2.3 på en 2% agarosegel. Rens rester PCR produktet som beskrevet i trinn 9.1.1 - 9.1.3. Analyser 1 mL renset PCR-produkt fra trinn 9.4 på en automatisert høy oppløsning elektroforese enhet til nøyaktig kvantifisere konsentrasjonen og fragmentstørrelse Fusionprimer-PCR-produkter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LAM-PCR resulterer i forsterkning av vektor genom veikryss med en definert fragment størrelse for hvert veikryss. Størrelsen av individuelle PCR-fragmenter er avhengig av avstanden mellom beliggenheten av de kjente DNA i genomet og den nærmeste restriksjonsenzym-gjenkjenningssete. Dette gjør det mulig å visualisere mangfoldet av forsterkede veikryss i analyserte prøvene ved gel elektroforese, f.eks., Hvis bare én (monoklonale), flere (oligoklonale), eller flere (polyklonale) band er til stede på gel. Resultatene av LAM-PCR vises best ved høy oppløsning elektroforese geler (figur 2A), men kan også visualiseres på 2% agarosegeler (figur 2B). nrLAM-PCR resulterer i PCR fragmenter av ulike lengde for hver enkelt veikryss. Dermed monoklonale, oligoklonale eller polyklonale prøver vises som en sverte ved elektroforese, og kan ikke skilles visuelt. Visualisering av nrLAM-PCR-produktet på 2% agarose-gel er tilstrekkelig til å fastslå suksessen av protokollen (figur 2C). Etter sekvensering av den gjen genomisk DNA kan bli justert i forhold til den respektive vertsgenomet for å identifisere nøyaktige posisjoner av plasseringen av vektoren (figur 3A). Annotering av genomet gjør det mulig å analysere IS repertoar for ulike vektor spesifikke funksjoner som preferanse for integrering i genet som koder regioner (Figur 3B) eller nær transkripsjonsstartsider (Figur 3C).
Figur 1. Skjematisk skisse av LAM-PCR og nrLAM-PCR. A) Begge fremgangsmåter starter med en innledende preamplification av vektor genom kryss ved hjelp av biotinylerte primere som hybridiserer like ved enden av den kjente DNA-sekvens (her lang terminal repeat (LTR) av et retroviral vektor). Preamplification resultater i biotinylatedssDNA av forskjellig størrelse for identiske eller forskjellige vektor genom veikryss. Biotinylert ssDNA blir tatt opp med magnetiske partikler. B) For PCR LAM, enzymatiske reaksjonstrinn sammensatt av dsDNA-syntese, restriksjons fordøye og ligering av en kjent linker DNA genererer produkter av forskjellig størrelse med kjente sekvenser på begge ender av produktet. På grunn av begrensning lengde polymorfisme hver forsterket krysset har en karakteristisk lengde. Etter denaturering LAM-PCR-produktet blir forsterket av nestede PCR med linker og vektorspesifikke primere. C) For nrLAM en ssDNA linkersekvens er direkte bundet til det ukjente ende av preamplified ssDNA fra A) slik at eksponensiell amplifikasjon ved PCR med nestede linker og vektor spesifikke primere. Dette tallet har blitt endret fra 2,12. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet. >
Figur 2. Representative resultater av LAM-PCR og nrLAM-PCR. A, B) LAM-PCR analyse av isolert DNA fra perifert blod av genterapi behandlede pasienter. Antallet bånd på gelen tilsvarer antallet er til stede i prøven. Høyoppløselige gels (B) er bedre egnet for å visualisere klonalitet analyserte prøvene enn 2% agarosegeler (A). C) nrLAM-PCR analyse av lentiviral vektor transduced enkeltcellekloner eller bulkceller. Uavhengig av antallet av amplifiserte innstikk en smøre ses på gelen etter elektroforese. M, 100 bp stigen; MC, monoklonalt; OC, oligoklonalt; PC, polyklonal. Dette tallet har blitt endret fra 2,9.
es/ftp_upload/51543/51543fig3highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 3. Representative eksempler for IS analyse av LAM-PCR og påfølgende high-throughput sekvensering. IS fordeling i to pasienter fra gammaretroviral (blå) eller lentiviral (grønn) kliniske genterapiforsøk. Etter sekvensering og kartlegging av LAM-PCR produktene til de respektive genomet er kan evalueres f.eks:.. A) Genome-wide distribusjon av IS B) Forskjell i henhold til preferanse for innsetting i genet som koder regioner mellom gammaretroviral og lentiviral vektorer og C) preferanse for innsetting nær transkripsjonsstartsider. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Formål | Navn | Sekvens (5'-3 ') |
| LK-universal | LC1 | GACCCGGGAGATCTGAATTCAGTGGCACAG CAGTTAGG |
| LK-AATT | LC2 (AATT) | AATTCCTAACTGCTGTGCCACTGAATTCA GATC |
| LK-CG | LC2 (CG) | CGCCTAACTGCTGTGCCACTGAATTCAGATC |
| LK-TA | LC2 (TA) | TACCTAACTGCTGTGCCACTGAAATCAGATC |
| LK-nrLAM-PCR | ssLC | (P) CCTAACTGCTGTGCCACTGAATTCAGATC TCCCGGGTddC |
| Preamplification | LTR-I (3'-retning) | (B) AGTAGTGTGTGCCCGTCTGT |
| LTR-I (5'-retning) | (B) TTAGCCAGAGAGCTCCCAGG | |
| Eksponentiell forsterkning jeg | LTR-II-(3'-retning) | (B) GTGTGACTCTGGTAACTAGAG |
| LTR-II (5'-retning) | (B) GATCTGGTCTAACCAGAGAG | |
| LC-I | GACCCGGGAGATCTGAATTC | |
| Eksponentiell forsterkning II | LTR-III (3'-retning) | GATCCCTCAGACCCTTTTAGTC |
| LTR-III (5'-retning) | CCCAGTACAAGCAAAAAGCAG | |
| LC-II | GATCTGAATTCAGTGGCACAG |
Tabell 1. Oligonukleotider for LAM-og nrLAM-PCR for å forsterke lentiviral IS. SsLC fosforyleres ved 5'-enden (P) og har ved 3 'didesoxycytidin (ddC) for å unngå multimerization av ssLC under ligering. Generelt, (nr) LAM-PCR-primere som bør bestå av 18 til 25 nukleotider, og skal ikke justeres til vertsgenomet. Grunning for preamplification bør plasseres så nær som mulig (≤ 120 bp) til 5 'eller 3' enden av vektoren. Ytterligere to primere for PCR eksponensiell I og II må plasseres mellom tennsatsenbrukes til forforsterk-ningen og vektoren ende. Primere for preamplification og eksponensiell PCR jeg trenger å være 5'-fosforylert (P).
| Reagens | Volum (mL) | Konsentrasjon | PCR Parametere | Temperatur | Tid | |
| H2O | 43 - x | Initial denaturering | 95 ° C | 5 min | ||
| Buffer | 5 | 10 x | Denaturering | 95 ° C | 45 sek | |
| dNTP | 1 | 10 mm (LAM); 0,5 mikrometer (nrLAM) | Annealing | 60 ° C | 45 sek | 2 x 50 sykluser |
| LTR-I | 0,5 | 0,17 mikrometer | Forlengelse | 72 ° C | 60 sek (LAM); 10 sek (nrLAM) | |
| TaqPolymerase | 0,5 | 2,5 U / mL | Endelig Forlengelse | 72 ° C | 5 min (bare LAM) |
PCR-betingelser for preamplification av vektor genom knutepunktene (trinn 2). Kolonnene 1-3 Tabell 2. Viser PCR-reagenser som benyttes for forsterkning av et enkelt DNA-prøve. Kolonner 4-6 eksemplifisere PCR-programmet til preamplify vektor genom veikryss.
| Reagens | Volum (mL) | Konsentrasjon | PCR Parametere | Temperatur | Tid | |
| H 2 O | 40,5 | Initial denaturering | 95 ° C | 5 min | ||
| Buffer | 5 | 10 x | Denaturering | 95 ° C | 45 sek | |
| dNTP | 1 </ Td> | 10 mM | Annealing | 60 ° C | 45 sek | 35 Cycles |
| LTR-II | 0,5 | 16,7 mikrometer | Forlengelse | 72 ° C | 60 sek (LAM); 5 sek (nrLAM) | |
| LC-I | 0,5 | 16,7 mikrometer | Endelig Forlengelse | 72 ° C | 5 min (bare LAM) | |
| Taq polymerase | 0,5 | 2,5 U / mL |
Tabell 3. PCR-betingelser for eksponentiell Amplification jeg (trinn 6). Kolonner 1-3 viser PCR reagenser som brukes for eksponentiell forsterkning av en enkelt DNA-prøve. Kolonner 4-6 eksemplifisere PCR-programmet brukes til eksponentielt forsterke en prøve etter Ligation av linker sekvens.
| Reagens | Volume (mL) | Konsentrasjon | PCR Parametere | Temperatur | Tid | |
| H 2 O | 40,5 | Initial denaturering | 95 ° C | 5 min | ||
| Buffer | 5 | 10 x | Denaturering | 95 ° C | 45 sek | |
| dNTP | 1 | 10 mM | Annealing | 60 ° C | 45 sek | 35 Cycles |
| LTR-III | 0,5 | 16,7 mikrometer | Forlengelse | 72 ° C | 60 sek (LAM); 5 sek (nrLAM) | |
| LC-II | 0,5 | 16,7 mikrometer | Endelig Forlengelse | 72 ° C | 5 min | |
| Taq polymerase | 0,5 | 2,5 U / mL |
Tabell 4. PCR-betingelser for eksponentiell Amplification jeg (trinn 8). Kolonner 1-3 viser PCR reagenser som brukes for nestet eksponentiell forsterkning av en enkelt prøve. Kolonner 4-6 eksemplifisere PCR program som brukes for nestet eksponentiell forsterkning av vektor genom veikryss fra én prøve.
| Reagens | Volum (mL) | Konsentrasjon | PCR Parametere | Temperatur | Tid | |
| H 2 O | 42.5 - x | Initial denaturering | 95 ° C | 2 min | ||
| Buffer | 5 | 10 x | Denaturering | 95 ° C | 45 sek | |
| dNTP | 1 | 10 mM | Annealing | 58 ° C | 45 sek | 12 Cycles |
| Fusionprimer A | 0,5 | 10 mikrometer | Forlengelse | 72 ° C | 60 sek | |
| Fusionprimer B | 0,5 | 10 mikrometer | Endelig Forlengelse | 72 ° C | 5 min | |
| Taq polymerase | 0,5 | 2,5 U / mL |
Tabell 5. PCR-betingelser for Fusionprimer-PCR (trinn 9.2). Kolonner 1-3 viser PCR reagenser som brukes for innføring av sekvense adaptere til (nr) LAM-PCR-produkter. Kolonner 4-6 eksemplifisere PCR program som brukes for Fusionprimer-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
LAM-PCR teknikken tillater identifisere ukjente DNA-sekvenser som flankerer et kjent DNA region. På grunn av den høye følsomhet som følge av preamplification av knutepunkter med spesifikke primere hybridiserer i den kjente DNA-sekvens, er det mulig å forsterke og detektere selv sjeldne veikryss ned til enkeltcelle-nivå. I motsetning, i et polyklonalt situasjon LAM-PCR er i stand til å forsterke tusenvis av forskjellige knutepunkter i en enkelt reaksjon.
Imidlertid, på grunn av bruk av restriksjonsenzymene bare en underfraksjon av integrome kan analyseres ved LAM-PCR for tilstedeværelse av kryss med hver bestemte restriksjonsenzym. Således gjentas analysen av den samme prøven med forskjellige enzymer anbefalte 9. Hvis ingen LAM-PCR-amplikoner er tilstede på gelen, mest sannsynlig avstanden mellom beliggenheten av de kjente DNA-fragment og det nærmeste gjenkjenningssete for den valgte restriksjonsenzym er for stor til å resultere i LAM-PCR-produktene9.. I dette tilfelle andre enzymer skal brukes for å forsterke krysset.
nrLAM er uavhengig av bruk av restriksjonsenzymer, og representerer derfor en høyst verdifull metode til å karakterisere omfattende sekvenser som flankerer en kjent DNA-sekvens. Utelate begrensning fordøye fra protokoll resulterer i tap av spesifikke begrensning fragment lengde polymorfisme karakteriserer hver forsterket veikryss. Istedenfor hver forsterket overgang blir representert av PCR-produkter av ulike størrelser som resulterer i en smøre på gelen etter elektroforese, uavhengig av mangfoldet av amplifiserte veikryss.
Både LAM-og nrLAM-PCR produktene er perfekt egnet for nedstrøms high-throughput sekvensering. Høy throughput sekvensering av (NR) LAM-PCR-produkter og kartlegging av hentede rå sekvenser til tilsvarende genomet gjør at karakter ukjent flankerer DNA eller identifisere den nøyaktige lokalisering av vektor-genom veikryss 30.Ved å innføre strekkode sekvenser inn i fusionprimers flere hundrevis av LAM-og nrLAM-PCR-produkter kan bli sekvensert i en sekvense løp 30.
På grunn av høy følsomhet, er LAM-PCR utsatt for forurensning hvis henrettet inattentively. Dermed er en PCR-grade miljø og spesiell oppmerksomhet for å rense håndtering av protokollen av største betydning for å lykkes forsterke ukjent flanke DNA uten forurensende prøver. Derfor er inkludert untransduced genomisk DNA, og en vann-kontroll for hver PCR-reaksjon som negative kontroller i den LAM-PCR protokoll som anbefales sterkt. Ved kontrollprøver indikerer at kryssforurensning skjedde under protokollen, kan produktene fra hver pause punkt benyttes til å gjenta deler av protokollen. Når band er fortsatt til stede, er det anbefalt å forkaste alle reagenser (f.eks., Primere, dNTPs, polymeraser, etc.) og gjenta (nr) LAM-PCR protokoll med nye mengdene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Taq DNA Polymerase | Genaxxon Bioscience GmbH | M3001.5000 | Alternative Taq Polymerases may be used |
| PCR Buffer | Qiagen | 201203 | Use of this buffer is recommended |
| dNTP-Mixture | Genaxxon Bioscience GmbH | M3015.4020 | or any other dNTPs |
| Oligonucleotides (Primers) | MWG Biotech | HPLC purified | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 11206D | |
| PBS | Gibco | 14190-086 | 0.1% wt/vol BSA |
| 6 M LiCl | Roth | 3739.1 | 10 mM Tris-HCl (pH 7.5)/1 mM EDTA |
| Tris-HCl, pH 7.5 | USB Corporation | 22637 | or any other supplier |
| EDTA | Applichem | A1103,0250 | or any other supplier |
| Klenow Polymerase | Roche Diagnostics | 10104523001 | |
| Hexanucleotide mixture | Roche Diagnostics | 11277081001 | |
| Restriction endonuclease | NEB | or any other supplier | |
| Fast-Link DNA ligation kit | Epicentre Biotechnologies | LK11025 | |
| CircLigase ssDNA Ligase Kit | Epicentre Biotechnologies | CL4111K | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 72068 | or any other supplier |
| Agarose LE | Roche Diagnostics | 11685660001 | or any other supplier |
| TBE buffer | Amresco | 0658 | or any other supplier |
| Ethidium bromide | Applichem | A2273,0005 | Ethidium bromide is mutagenic |
| 100 bp DNA Ladder | Invitrogen | 15628-050 | or any other DNA ladder |
| 20 mM NaCl | Sigma-Aldrich | 71393-1L | or any other supplier |
| Magna-Sep Magnetic Particle Separator | Life Technologies | K158501 | for use with 1.5 ml Tubes |
| Magna-Sep Magnetic Particle Separator | Life Technologies | K158696 | for use with 96-well plates |
| Amicon Ultra-0.5, Ultracel-30 membrane | Millipore | UFC503096 | |
| PerfectBlue Gelsystem Midi S | PeqLab | 40-1515 | or other electrophoresis system |
| TProfessional 96 | Biometra | 050-551 | or other Thermocycler for 96-well plates |
| Orbital shaker KS 260 basic | IKA | 2980200 | or other horizontal shaker |
| PCR softtubes 0.2 ml | Biozym Scientific GmbH | 711082 | or other 0.2 ml PCR tubes |
| 1.5 ml tubes | Eppendorf | 12682 | or other 1.5 ml tubes |
| Gel documentation system | PeqLab | or any other gel documentation system | |
| Nanodrop ND-1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Spreadex EL1200 precast gel | Elchrom Scientific | 3497 | |
| Submerged gel electrophoresis apparatus SEA 2000 | Elchrom Scientific | 2001E | |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA |
References
- Schmidt, M., et al. Detection and direct genomic sequencing of multiple rare unknown flanking DNA in highly complex samples. Hum Gene Ther. 12, 743-749 (2001).
- Schmidt, M., et al. High-resolution insertion-site analysis by linear amplification-mediated PCR (LAM-PCR). Nat Methods. 4, 1051-1057 (2007).
- Schroeder, A. R., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110, 521-529 (2002).
- Wu, X., Li, Y., Crise, B., Burgess, S. M. Transcription start regions in the human genome are favored targets for MLV integration. Science. 300, 1749-1751 (2003).
- Vigdal, T. J., Kaufman, C. D., Izsvak, Z., Voytas, D. F., Ivics, Z. Common physical properties of DNA affecting target site selection of sleeping beauty and other Tc1/mariner transposable elements. J Mol Biol. 323, 441-452 (2002).
- Lewinski, M. K., et al. Retroviral DNA integration: viral and cellular determinants of target-site selection. PLoS Pathog. 2, (2006).
- Mueller, P. R., Wold, B. In vivo footprinting of a muscle specific enhancer by ligation mediated PCR. Science. 246, 780-786 (1989).
- Silver, J., Keerikatte, V. Novel use of polymerase chain reaction to amplify cellular DNA adjacent to an integrated provirus. Journal of virology. 63, 1924-1928 (1989).
- Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nature medicine. 15, 1431-1436 (2009).
- Harkey, M. A., et al. Multiarm high-throughput integration site detection: limitations of LAM-PCR technology and optimization for clonal analysis. Stem Cells Dev. 16, 381-392 (2007).
- Wang, G. P., et al. DNA bar coding and pyrosequencing to analyze adverse events in therapeutic gene transfer. Nucleic acids research. 36, (2008).
- Paruzynski, A., et al. Genome-wide high-throughput integrome analyses by nrLAM-PCR and next-generation sequencing. Nat. Protocols. 5, 1379-1395 (2010).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1. J Clin Invest. , 3132-3142 (2008).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. LMO2-associated clonal T cell proliferation in two patients after gene therapy for SCID-X1. Science. 302, 415-419 (2003).
- Howe, S. J., et al. Insertional mutagenesis combined with acquired somatic mutations causes leukemogenesis following gene therapy of SCID-X1 patients. J Clin Invest. 118, 3143-3150 (2008).
- Cartier, N., et al. Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy. Science. 326, 818-823 (2009).
- Matrai, J., et al. Hepatocyte-targeted expression by integrase-defective lentiviral vectors induces antigen-specific tolerance in mice with low genotoxic risk. Hepatology. 53, 1696-1707 (2011).
- Penaud-Budloo, M., et al. Adeno-associated virus vector genomes persist as episomal chromatin in primate muscle. Journal of virology. 82, 7875-7885 (2008).
- Kaeppel, C., et al. A largely random AAV integration profile after LPLD gene therapy. Nature medicine. 19, 889-891 (2013).
- Voigt, K., et al. Retargeting sleeping beauty transposon insertions by engineered zinc finger DNA-binding domains. Mol Ther. 20, 1852-1862 (2012).
- Yanez-Munoz, R. J., et al. Effective gene therapy with nonintegrating lentiviral vectors. Nature medicine. 12, 348-353 (2006).
- Boztug, K., et al. Stem-Cell Gene Therapy for the Wiskott-Aldrich Syndrome. N Engl J Med. 363, 1918-1927 (2010).
- Deichmann, A., et al. Vector integration is nonrandom and clustered and influences the fate of lymphopoiesis in SCID-X1 gene therapy. J Clin Invest. 117, 2225-2232 (2007).
- Schwarzwaelder, K., et al. Gammaretrovirus-mediated correction of SCID-X1 is associated with skewed vector integration site distribution in vivo. J Clin Invest. 117, 2241-2249 (2007).
- Gabriel, R., et al. An unbiased genome-wide analysis of zinc-finger nuclease specificity. Nat Biotechnol. 29, 816-823 (2011).
- Dieter, S. M., et al. Distinct types of tumor-initiating cells form human colon cancer tumors and metastases. Cell Stem Cell. 9, 357-365 (2011).
- Montini, E., et al. Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration. Nature biotechnology. 24, 687-696 (2006).
- Zavidij, O., et al. Stable long-term blood formation by stem cells in murine steady-state hematopoiesis. Stem Cells. 30, 1961-1970 (2012).
- Martins, V. C., et al. Thymus-autonomous T cell development in the absence of progenitor import. J Exp Med. 209, 1409-1417 (2012).
- Arens, A., et al. Bioinformatic clonality analysis of next-generation sequencing-derived viral vector integration sites. Hum Gene Ther Methods. 23, 111-118 (2012).
