Summary
מוטציות הגורמות למחלות ביקטינו יכולות לשנות את תפקוד cytoskeletal. דינמיקת Cytoskeletal הם לכמת באמצעות הדמיה של חלבונים מתויגים fluorescently באמצעות כולל מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפנימי. כדוגמא, חלבון cytoskeletal, Aip1p, שינה לוקליזציה ותנועה בתאים המבטאים את איזופורם אקטין המוטציה, R256H.
Abstract
מוטציות בתקטנה לגרום למגוון של מחלות בבני אדם כתוצאה משינויים מולקולריים ספציפיים, כי לעתים קרובות לשנות את תפקוד cytoskeletal. במחקר זה, הדמיה של חלבונים מתויגים fluorescently באמצעות הקרינה כוללת פנימית (TIRF) מיקרוסקופיה משמשת כדי לחזות ולכמת את השינויים בדינמיקת cytoskeletal. מיקרוסקופיה TIRF והשימוש בתגי ניאון גם מאפשר כימות של השינויים בדינמיקת cytoskeletal נגרמים על ידי מוטציות בתקטנה. באמצעות טכניקה זו, כימות של פונקצית cytoskeletal בתאים חיים באופן מועיל משלימה במחקרי מבחנה של תפקוד חלבון. כדוגמא, מוטציות missense משפיעות על השאריות אקטין R256 זוהו בשלושה isoforms אקטין אדם המצביע על חומצה אמינית זו משחקת תפקיד חשוב באינטראקציות רגולציה. ההשפעות של המוטציה R256H אקטין בתנועות cytoskeletal נחקרו תוך שימוש בשמרי המודל. החלבון, Aip1, אשר ידוע לסייע cofilin בdepolymerization אקטין, היהמתויג עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) בN-הסופית ומעקב in vivo באמצעות מיקרוסקופיה TIRF. קצב תנועת Aip1p סוג שני בר וזנים מוטנטים היה לכמת. בתאים המבטאים אקטין מוטציה R256H, תנועת Aip1p מוגבלת וקצב תנועה הוא כמעט מחצית מהמהירות שנמדדה בתאים מסוג בר (0.88 ± 0.30 מיקרומטר / sec בתאי R256H לעומת 1.60 ± 0.42 מיקרומטר / sec בתאים מסוג בר, עמ ' <0.005).
Introduction
אקטין הוא החלבון הדומיננטי המרכיב את שלד התא, ומשתתף בתהליכים תאיים קריטיים, כולל חלוקת תא, תנועת אברון, תנועתיות תא, התכווצות, ואיתות. במהלך העשור האחרון, מוטציות הגורמות למחלות בתקטנה התגלו בכל אחד מששת isoforms אקטין האדם המוביל למגוון של הפרעות, מmyopathies למחלת לב כלילית 1-7. התהליכים שבאמצעותם מוטציות אקטין להוביל למחלות ימשיכו להיות הובהר. שמרי המודל נשאר סטנדרטי כדי לחקור את ההשפעות ביוכימיות של מוטציות על תפקוד אקטין בשל היתרונות של איזופורם אחת החיוני אקטין, עקיבות גנטיות וגבוה שימור רצף אקטין ותפקוד זהב. מחקרים מראים כי מוטציות אקטין פרט להוביל לתפקוד ספציפי מולקולרי עם השפעות שליליות דומיננטיות 8. לדוגמא, מוטציות הגורמות לחירשות ביקטין γ הלא שרירים המשפיעות על השאריות ליס-118 לשנות רגולציה על ידיהחלבון אקטין מחייב Arp2 / 3 9. מחקרים לעתים קרובות להעסיק במבחנה ניתוחים של חלבון: אינטראקציות חלבון. חקירות ההשפעה יקטין מוטציות בביולוגיה של תא, ובפרט, יקטין לוקליזציה חלבון מחייבת בתא מוגבלות.
מחקרים של שלד תא שמרי in vivo מסתמכים כמקובל בתמונות של תאים קבועים ממיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך 10. ניסויים אלה סיפקו נתונים בסיסיים על המורפולוגיה של שלד התא אקטין. חקירות שכן שולבו שלוש הדמיה confocal ממדים כדי להמחיש את הרשת המורכבת cytoskeletal 11, 12. הדמיה זו מאפשרת כימות של השפע ומיקום יחסי של תיקונים אקטין וחוטים. טומוגרפיה אלקטרון סעיף דקה שמשה לתמונה את המורפולוגיה של רשתות פילמנטיות הצפופים ביחס למבני subcellular השתמרו 13. ים סלולארי צפוףצעדים עם חתך קטן יכולים להיבחן בפרטים עדינים עם טכניקה זו. מחקרי הדמיה שהורחבו לתאים חיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי זמן לשגות. כאשר ניתן להקהות הלבנת צילום וקרינת רקע, זמן לשגות הדמיה מאפשרת חקירה באשר לדינמיקה של חלבוני cytoskeletal והתגובה לתנאים סביבתיים 11, 14. בנפרד, להדמיה של הדינמיקה של סיבי אקטין במבחנה הייתה מתקדמת על ידי ההקדמה של הקרינה השתקפות הפנימית המוחלטת מיקרוסקופיה (TIRF). בהשוואה למיקרוסקופ שדה רחב, יש TIRF היתרון של הקרינה רקע ירידה ולעומת זאת משופר לפקח חוטים בודדים 15, 16. עם התכונות האלה, מיקרוסקופיה TIRF הותאמה על ידי ביולוגים תא כדי לפקח על מבנים הסלולר בקרום הפלזמה 17, 18. אירועים הסלולר, לרבות שינויים בשלד התא, יכוללהיות דמיינו בזמן אמת עם phototoxicity הנמוך, לעומת זאת מקסימאלי, ותפרחת רקע מינימאלית 19.
כדי להבין טוב יותר את ההשפעה של מוטציות אקטין בתנועה, לוקליזציה, ומחזור של חלבוני cytoskeletal בתיוג תא, מיקרוסקופיה TIRF והחלבון היו בשימוש. בזאת, שיטות כדי לחקור את ההשפעות של מוטציה רלוונטית קליני ביקטינו על דינמיקת cytoskeletal בשמר אפייה מתוארות. באופן ספציפי, הלוקליזציה והתנועה של החלבון קושר אקטין, Aip1p, הייתה דמיינו ולכמת בתאים המבטאים את המוטציה R256H ביקטין. טכניקות אלה משלימים במחקרים ביוכימיים מבחנה ולאפשר הבנה טובה יותר של אינטראקציות חלבון ופונקציות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. שיבוט לפלסמיד PB1996
- פריימרים DNA עיצוב והזמנה מחברת oligonucleotide הייצור כי האגף רצף היעד ומכיל אתרי הגבלה ייחודיים בפלסמיד ההורה שנבחר. הערה: במקרה זה, פריימרים נועדו להגביר את זוגות הבסיסים 400 בסוף "5 של רצף Aip1. אתר הגבלת XhoI שולב בפריימר על 20 נ"ב לפני רצף Aip1, וXmaI נכלל כ -20 נ"ב לאחר רצף Aip1 היעד. פלסמיד המשמש לשיבוט היה PB1996, המכיל תג 3XGFP לקרינה, גן URA לבחירת זן שמרים, וגן התנגדות אמפיצילין לבחירה בקטריאלי.
- לטהר את הדנ"א הגנומי מזן הפלואידים Ura-שמרים. הערה: עיין באיור 1 לתרשים של תהליך השיבוט.
- הפעל תגובת PCR סטנדרטית באמצעות שני פריימרים והדנ"א הגנומי שמרים כדי להגביר את גן Aip1p עם אתרי ההגבלה משני enד. לעכל את המוצר ה-PCR ופלסמיד PB1996 עם אנזימי ההגבלה בתגובות נפרדות לכל יצרן מומלץ פרוטוקולים. במקרה זה XmaI וXhoI שימשו עם החיץ הנלווה ב-C ° 37 במשך שעה 1.
- הפעל 0.8% ג'ל אלקטרופורזה agarose כדי להפריד את שברי DNA מתעכלים. באחד היטב, טען סולם המוני DNA נמוך, ובבארות נפרדות, טען את כל התגובה ממערכת עיכול. הרץ את הג'ל על 100 וולט כ 1 שעות, עד שחזית הצבע קרובה לסוף של הג'ל. דמיין את הג'ל תחת אור UV ולטהר את הקטע שמתאים למגזר חלבונים ואת הפלסמיד החתוך.
- ולקשור מגזר Aip1 מתעכל ופלסמיד PB1996. להפוך את המוצר לתאי DH5α באמצעות פרוטוקולי יצרן (10 DNA μl עם 100 תאי μl ל30 דקות על קרח, הלם חום על 42 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, לגדול בתקשורת SOC לשעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס) וצלחת על גבי צלחות תרבות הכולל אנטיביוטיקה לבחירה, במקרה זה LB +צלחות מגבר. בחר ולגדול מושבה אחת בתרבות נוזלית. לטהר את הפלסמיד החדש תוכנן.
2. דור הזנים שמרי Mutant
- השתמש בזן שמרי הפלואידים בי אלל אקטין נמחק לבנות זן שמרים שעבר מוטציה. הערה: במקרה זה, את המתח ההורי היה מתנה נדיבה של ד"ר פיטר רובינשטיין (אוניברסיטת איווה) והבנייה תוארה על ידי קוק ואח' 20 זן זה חסר את הגן אקטין כרומוזומליות ומכיל פלסמיד שמקודד שמרי סוג בר. אקטין ואורציל.
- השתמש בשמרים אקטין הסוג בר קידוד פלסמיד PRS עם TRP + בחירה כבסיס לפלסמיד mutagenesis 21.
- בצע מכוון mutagenesis אתר על פלסמיד PRS להנדס את המוטציה missense ליקטין.
- למוטצית R256H ביקטין, להפיק את פריימר 5 'ggtaacgaaagattccatgccccagaagc 3' כדי לשנות את Arg 256 256. הפעל mutagenesis סטנדרטיתגובת PCR עם פלסמיד משלב 2.2.
- להפוך את הפלסמיד אקטין מוטציה מPCR לתאי DH5α. לבודד את ה-DNA פלסמיד ולרצף את הגן אקטין כדי לאמת את המוטציה.
- לשנות את קידוד פלסמיד שמרים אקטין מוטציה לתוך זן שמרים הפלואידים משלב 2.1.
- תרבות התאים הפכו בTRP-צלחות כדי לבחור עבור שמרים המכילים TRP המכיל פלסמיד שמרים אקטין מוטציה +.
- בחר לתאים חסרי פלסמיד המקורי המקודד אקטין סוג בר ואורציל (מתואר ב2.1) על ידי תאים תת culturing מTRP-הצלחות על צלחות המכילות 5-Fluoroorotic חומצה (5-פואה). 5-פואה מומרת לצורה רעילה, 5-flurouracil, בעצירת זנים המבטאים את גן URA3 הפונקציונלי. התאים שגדלים לאחר הבחירה בשלבים יכילו רק את הפלסמיד אקטין מוטציה.
- לטהר DNA פלסמיד מזן השמרים החדש. רצף פלסמיד כדי להבטיח את הגן אקטין מוטציה הוא הווה. השתמש בזה זהלהתאמן במחקרים נוספים. תהליך זה נתח באיור 2.
3. הפיכת פלסמיד לתוך תאי שמרים
- לעכל את הפלסמיד Aip1p-GFP עם אנזים הגבלה כדי לאפשר השתלבות בשמרי כרומוזום. הערה: אתר ההגבלה חייב להיות מחוץ לגוש הרצף המכיל את תג הניאון, גן של עניין, וסמן בחירה. במקרה זה, להשתמש 1 μl של אנזים הגבלת HPAI עם 8-DNA μl וμl 1 של החיץ 10x הנלווה עבור שעה 1 ב 37 ° C.
- תרבות ס תאי cerevisiae (משלב 2.5) שאינם מסוגלים לסנתז אורציל (Ura-מתח) לילה ב 5 מיליליטר בתקשורת YPD (1% תמצית שמרים, peptone 2%, ודקסטרוז 2%) על גלגל ב30 ° C. ספין למטה 1 מיליליטר של התאים 5 דקות ב1,000 x גרם.
- הפוך תערובת PLATE. הפוך 10XTE ידי הוספת 5 מיליליטר של 1 M טריס pH 7.5 ו -2 מיליליטר של 250 מ"מ חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA) ל43 מיליליטר של DDH 2 O. הוסף 0.204 גרם של ליתיום אצטט 20 מיליליטר של 1XTE, אז 8 גרם של פוליאתילן גליקול (PEG) (MW ~ 3,300) ולסנן לעקר.
- למזוג supernatant מהתאים סובבים מטה בשלב 3.2 ו resuspend התאים בנוזל שנותר. לתאים מושעים, להוסיף 2 μl של 10 מ"ג / DNA ספק אשכים סלמון מיליליטר. הוסף 10 μl של פלסמיד דנ"א מתעכל משלב 3.1 ומערבולת. הוסף 0.5 מיליליטר של צלחת ומערבולת. הוסף 20 μl של 1 M DTT ומערבולת.
- דגירה את התערובת ל6-8 שעות ב25 ° C. Heat Shock התאים באמבט מים ב42 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. של תאים מהחלק התחתון של צינור microcentrifuge שבו הם התיישבו מתוך גבי-Ura צלחת הצלחת 100 μl. דגירה ב30 מעלות צלזיוס למשך 2-3 ימים או עד טופס מושבות.
- בחר מושבות ופס בודדים החוצה אל-Ura צלחת. הערה: תאים אלו מכילים את הפלסמיד עם גן Aip1-GFP ועורה ישולב בכרומוזום, המאפשרים צמיחה. תאים אלה לאחר מכן ניתן להשתמש בmicroscopy.
4. לדמיין את תנועת חלבון Aip1p באמצעות השתקפות סה"כ הפנימית מיקרוסקופ פלואורסצנטי
- לגדול תרבות של תאי שמרים עם Aip1p-GFP התאגד בYPD לילה על גלגל ב30 ° C. תת 1 מיליליטר של תרבות הלילה ל9 מיליליטר של-Ura תקשורת. לגדל את התאים ל3-4 שעות נוספות על שייקר ב30 ° C כדי לוודא שהם נמצאים בשלב צמיחת יומן.
- הוסף 3 μl של תאים לשקופית מיקרוסקופ זכוכית ולהוסיף coverslip. אפשר התאים להסתפק בשקופית למשך 5 דקות. מניחים את השקף בסוגר של צלחת הבמה.
- שים לב לחלבון Aip1p-GFP עם הקרינה כוללת פנימית השתקפות מיקרוסקופ (TIRF) (488 ננומטר) באמצעות טבילת שמן 100X TIRF אובייקטיבית ומצלמת CCD דיגיטלית. באמצעות תוכנת SlideBook 5.0, להשיג תמונות ל20 שניות בקצב של 5 פריימים / שנייה (מסגרות בודדות של תמונות שנרכשו מוצגות באיור 2 א).
- להתמקד בגאמות, תוכנת SlideBook 5.0 פתוחה ולחצו על לחצן פוקוס החלון בסרגל הכלים כדי לגשת לפקדי המיקוד. בחר בכרטיסייה היקף ובחר את מטרת 100X-TIRF. כבה את המנורה ובהחלק את סרגל המנורה 15%. לשנות את הגדרת סל ל2 x 2. שינוי מסנן לשדה בהיר.
- במיקרוסקופ, להשתמש בחיוג להתמקד בסדר להביא את התאים אל מוקד כפי שניתן לראות על מסך המחשב.
- שימוש בפקדים בתוך חלון הפוקוס, להפוך את המנורה כבויה, לשנות את המסנן לחיות, ולחץ על לחצן TIRFM.
- נורת ה TIRFM המחובר לצד הנמל הנכון של המיקרוסקופ, להפוך את פליטת הלייזר לאון.
- בחר בכרטיסייה הזרם בתוך חלון הפוקוס, סמן את התיבה הבאה כדי להתחיל בהקלטה ולאחר מכן לחץ על לחצן שדה בהיר.
- נורת ה TIRFM, להפוך מיקרומטר כדי להתאים את זווית האירוע של הלייזר. זה משמש כדי לייעל את פליטת הקרינה ממוקדי Aip1-GFP ולמזער את הקרינה רקע מתאים ושקופיות.
- כאשר התמונה הרצויה מוצגת, לחץ על 'התחל'. אחרי 20 שניות, עצירה לעיתונות. שמור את התמונות. בכרטיסיית הקובץ בשורת התפריט הראשית, בחר שקופיות שמירה ובלהזין את מיקום קובץ ואת השם.
- השתמש בתוכנת ImageJ לנתח את התמונות. השתמש בתוסף מאקרו "Tracker הידני" כדי לעקוב אחר התנועה ושיעור מוקדי Aip1p ניאון. שנה את פרמטר מרווח הזמן ל0.2 שניות.
- באמצעות בחירת מסלול תוספת, בחר ולעקוב אחר חלבון פלואורסצנטי פרט באמצעות ארבעה עד שמונה מסגרות חיבור. השתמש בפקודת מסלול הסוף ואת מהירות תנועה של חלבון בין כל מסגרת תציג בחלון תוצאות.
- לקבוע את השיעור הממוצע בין כל מסגרת באמצעות גיליון אלקטרוני של Microsoft Excel. השתמש בערכים כדי לחשב את המהירות של תנועת Aip1p הממוצעת עבור כל זן תא של עניין. הערה: עלילת פיזור של קצב תנועת Aip1p והמהירות שאינו ליניארי הממוצע מוצגת בfiguמחדש 2B.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שיטה לתמונת הדינמיקה של חלבוני cytoskeletal בתא מוצגת. החלבון אקטין מחייב, Aip1p, היה מתויג עם GFP. העיצוב לפלסמיד קידוד המוצר המתויג מוצג באיור 1. פלסמיד שהפך לאחר מכן לתאי שמרים. ביטוי של מתויג fluorescently Aip1p אפשר להדמיה של חלבון ההתנהגות בתא. Aip1p בדרך כלל localizes לתיקונים אקטין באתרים של אנדוציטוזה 22. כדי לכמת תנועת Aip1p, יותר מ 50 מוקדי Aip1p ניאון היו במעקב בלמעלה מ 10 תאים, כפי שמוצגים באיור 2 א. המהירות הממוצעת חושב לכל אזור Aip1p ניאון (ראה איור 2). בתאים מסוג בר, תנועות Aip1p נעות על פני תא, ולאחר מכן נעלמות. המהירות הממוצעת של תנועת Aip1p בתאים מסוג בר היא 1.60 ± 0.42 מיקרומטר / sec. תאים המבטאים את המוטציה אקטין R256H, ידועות כבעלי מורפולוגיה לא תקינה של CY אקטיןtoskeleton 23, יש פנוטיפ Aip1p השתנה. בזן מוטנטי, תנועת Aip1p היא מוגבלת ואיטית יותר. המהירות הממוצעת של תנועת Aip1p היא 0.88 ± 0.30 מיקרומטר / שניות (p <0.005). הגירת Aip1p מוגבלת לאזור המיידי, עם המוקדים שחגו סביב זה ולא חוצים את התא. בנוסף, Aip1p גלוי יותר המצביע על תחלופה איטית יותר של חלבון Aip1.
איור 1. תרשים של בניית פלסמיד.) שבר Aip1 המוגבר באמצעות PCR מוצג להיות מתעכל על ידי אנזימי הגבלה (ברגים צהובים). B) פלסמיד, PB1996, מתעכל עם הגבלת אנזימים כדי להסיר את גן Abp140. C) מתעכל ברי Aip1 וPB1996 הם ligated to יוצר פלסמיד PB1996 Aip1. ד) פלסמיד PB1996 Aip1 הוא לינארית ולהפוך לתאי שמרים שבו את ה-DNA משולב בכרומוזום.
איור 2. תרשים של בניית מתח אקטין שמרים שעברו מוטציה. קידוד פלסמיד איזופורם אקטין המוטציה הופך לאחר מכן לקו סלולרי ונבחר על סמך היכולת לגדול על טריפטופן תקשורת הלוקה בחסר. הקווים הירוקים מצביעים על הדנ"א בכרומוזומים. העיגול השחור הוא פלסמיד. העיגול בצבע חום מייצג תא שמרים. התיבות כל מצביעות גן ספציפי: צהוב היא אקטין, כתום הוא לאוצין, חום הוא אורציל, וורוד הוא טריפטופן. X על התיבה מצביע גן נמחק מהדנ"א בכרומוזומים. בצעדים 2.3 ו2.4, הכוכב השחור על i הגן אקטיןndicates המוטציה R256H.
איור 3. תנועת Aip1p-GFP בתאי שמרים חיים.) תמונות מסוג פרוע ותאי R256H להביע Aip1p GFP-tagged מוצגות. תאים נמצאים בצמיחה בשלב מוקדם יומן ותמונות נרכשו בכל שנייה 0.2 15 שניות. החיצים מציינים את מיקומו של מוקד ניאון בודד לאורך זמן, הכחול לסוג בר ואדום לזנים אקטין מוטציה. המסגרת האחרונה מציגה את הנתיב של מוקדי Aip1 כקו ירוק. סרגל קנה מידה שמוצג הוא 5 מיקרומטר. B) קצב תנועת Aip1p נמדד באמצעות ImageJ. גרף עלילת הפיזור מציג את השיעור למוקדי ניאון בודדים. הפס האופקי מציין את המהירות הממוצעת לסוג בר (כחול) ומוטציה (אדום) יקטין זנים.Aip1p נע ב1.60 ± 0.42 מיקרומטר / sec בתאים מסוג בר השוואה ל0.88 ± 0.30 מיקרומטר / שניות לתאים לבטא אקטין המוטציה R256H (p <0.005).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אסטרטגיה יעילה כדי להמחיש את הדינמיקה של שלד התא והשירות בחקירות על מוטציות פתוגניים שתוארה כאן. שיטות הדמיה מתקדמות יצרו הזדמנויות חדשות כדי להבין את התנועה תאית של חלבונים ליד קרום התא. מיקרוסקופיה סך הקרינה השתקפות הפנימית (TIRF) היא טכניקה רגישה ללימודים תפקודיים בתאים חיים. TIRF משתמש בליזר עירור זווית שיוצר שדה חלוף בשל ההבדל במדדי שבירה של coverslip והבינוני מימיים. האנרגיה של שדה חלוף מרגשת fluorophores אבל יורדת באופן אקספוננציאלי עם המרחק של הממשק בין coverslip והמים. התוצאה היא אות גבוהה יחס רעש והרזולוציה עוצמה 50-250 ננומטר מעל לממשק coverslip / בינוני. תכונות אלו הופכות מיקרוסקופיה TIRF כלי רב עוצמה כדי להמחיש חלבוני cytoskeletal ברמת המולקולה בודדת בתאים חיים עם פחותphototoxicity ומשופר לעומת זאת, ביחס לטכניקות אחרות 24-26.
שלד התא כרוך בחלבונים רבים הפועלים בתיאום כדי להתאים לצרכים של סלולריים. ההשפעה של כלי דם, מחלה גורמת מוטציות בתקטנה ברגולציה על ידי cofilin נחקרה לאחרונה על ידי הקבוצה שלנו 27. בהתבסס על הממצאים הראשוניים שלנו, Aip1p, אקטין חלבון מחייב המאפשר ניתוק אקטין cofilin תלוי, נחקר. במחקרים ראשוניים, תאים המבטאים את המוטציה אקטין R256H לגדול בצורה גרועה בהעדר Aip1p, במיוחד בתנאי לחץ. הדבר מצביע על כך הרגולציה Aip1p של שלד התא אקטין המוטציה משתנה. הניתוחים של התנועה והלוקליזציה של Aip1p במתח R256H באמצעות תיוג הניאון ומיקרוסקופיה TIRF שלנו מאשש את הדינמיקה חריגה. בעתיד, אנו מתכננים לתייג חלבונים נוספים, כגון cofilin, עם fluorophores שונה כדי לחזות את תנועתם של חלבונים רביםבו זמנית כדי להבין טוב יותר את החלבון: אינטראקציות חלבון.
ישנן מספר מגבלות ליצירת חלבון מתויג fluorescently וכמה מקרים שבם הטכניקה היא לא ריאלי. תג ניאון יכול לשבש את פעילותו של החלבון או לשנות את האינטראקציה עם שותפים מחייבים. זה כבר נתקל בניסיונות לתייג cofilin, אקטין עוד חלבון מחייב. ביטוי של המבנה מתויג כבר לא מוצלח בשמרי הפלואידים בשל תפקוד cofilin משובש. Cofilin הוא חלבון חיוני בשמרים. לפיכך, מחיקה של cofilin בלי מחדש הכנסה במקביל היא קטלנית; חסימת כניסתה הבאה על פלסמיד. אחת דרכים להימנע ממגבלה זו היא להשתמש בשמרי דיפלואידי. עותק אחד של גן cofilin הודחה מ, גרסה מתויגת הוצגה אקסוגני על פלסמיד, ולאחר מכן בחירה לתאים בת שאין לי cofilin הגנומי אבל מכילים פלסמיד 22 היכולת לתייג את חלבון fluorescently הייתהשנרכש על ידי הוספת התג לשאריות פנימיות בחלבון שהראו בעבר שיש מעט השפעה על האינטראקציות בין חלבונים שלה. N-או C-הסופית הם אתרים עדיפים להוסיף התג אלא אם האזורים ידועים להשפיע על חלבון רלוונטי: אינטראקציות חלבון. אם זה לא יניב חלבון פונקציונלי, יכולה להיות ניסיון הסופית החלופית או השאריות פנימיות.
יש כמה שלבים קריטיים ביישום הטכניקות מתוארות. אחת הוא לקבוע את המיקום המתאים כדי לתייג את החלבון שחוסך בתפקוד. בקרות חזקות חייבים להיות כלולות כדי לאמת שתפקוד חלבון נשמר. שנית, השקופיות חייבים להיות במעקב כדי להבטיח את התאים לא לייבש במהלך הדמיה. שעווה ניתן להשתמש בקצוות של להחליק את המכסה כדי למנוע התייבשות במידת צורך. צעדים אלה כדי להבטיח את ההצלחה הם פשוט קבלת גישה זו צייתנית ויתרון למבני תמונה ליד קרום הפלזמה. היכולת באשרלוקליזציה ntify חלבון ותנועה בתאי חיים יכולים לשפר את ההבנה של תפקודים תאיים. כמוטציות המשפיעות על חלבוני cytoskeletal מזוהים, ביטוי של חלבונים מתויגים fluorescently ומיקרוסקופיה TIRF יכולה להיות שימושית כדי לחקור את המחלה האנושית הבסיסית הפתופיזיולוגיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מודים לפיטר רובינשטיין לדיון מועיל וייעוץ טכני ודוד Pellman לשיבוט PB1996 המקורי. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהמצעד הפרוטות ומימון מהרכיבה לילדים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | rpi | 9012-36-6 | |
| Bromophenol Blue | Amresco | 115-39-9 | |
| BSA | NEB | B9001S | |
| Change-IT Multiple Mutation Site Directed Mutagenesis Kit | USB Corporation | 4166059 | |
| CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
| DNA, single stranded from salmon testes | Sigma | 9007-49-2 | |
| EDTA pH 7.4 | Sigma | 93302 | |
| Ethidium bromide | Invitrogen | 15585-011 | Warning! Harmful irritation |
| Fungal/Bacterial DNA Kit | Symo Research | D6005 | |
| HpaI | NEB | R0105S | |
| Lithium acetate | AlfaAesar | 6108-17-4 | |
| Low DNA Mass Ladder | Invitrogen | 10068-013 | |
| NE Buffer #4 | NEB | B7004S | |
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | Invitrogen | 12532-016 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | Any kit will work |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
| Sodium azide | Sigma | 26628-22-8 | |
| PBS | Invitrogen | 10010-023 | |
| PEG | Amresco | 25322-68-3 | |
| Tris Base Ultrapure | rpi | 77-86-1 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | 1/6/2015 | |
| XhoI | NEB | R0146S | |
| XmaI | NEB | R0180S | |
| YPD media | LabExpress | 3011 | |
| -URA Media | LabExpress | 3010 | |
| PCR Machine | Invitrogen | 4359659 | Any PCR machine will work |
| TIRF Microscope | Olympus IX81 | ||
| Hamamatsu ORCA-R camera | Hamamatsu |
References
- Lehtonen, H. J., et al. Segregation of a missense variant in enteric smooth muscle actin gamma-2 with autosomal dominant familial visceral myopathy. Gastroenterology. 143, e1483 1482-1491 (2012).
- Matsson, H., et al. Alpha-cardiac actin mutations produce atrial septal defects. Hum Mol Genet. 17, 256-265 (2008).
- Zhu, M., et al. Mutations in the gamma-actin gene (ACTG1) are associated with dominant progressive deafness (DFNA20/26). Am J Hum Genet. 73, 1082-1091 (2003).
- Nowak, K. J., et al. Mutations in the skeletal muscle alpha-actin gene in patients with actin myopathy and nemaline myopathy. Nat Genet. 23, 208-212 (1999).
- Olson, T. M., Michels, V. V., Thibodeau, S. N., Tai, Y. S., Keating, M. T. Actin mutations in dilated cardiomyopathy, a heritable form of heart failure. Science. 280, 750-752 (1998).
- Riviere, J. B., et al. De novo mutations in the actin genes ACTB and ACTG1 cause Baraitser-Winter syndrome. Nat Genet. 44, S441-442 440-444 (2012).
- Guo, D. C., et al. Mutations in smooth muscle alpha-actin (ACTA2) lead to thoracic aortic aneurysms and dissections. Nat Genet. 39, 1488-1493 (2007).
- Sparrow, J. C., et al. Muscle disease caused by mutations in the skeletal muscle alpha-actin gene (ACTA1). Neuromuscul Disord. 13, 519-531 (2003).
- Kruth, K. A., Rubenstein, P. A. Two deafness-causing (DFNA20/26) actin mutations affect Arp2/3-dependent actin regulation. J Biol Chem. 287, 27217-27226 (2012).
- Amberg, D. C. Three-dimensional imaging of the yeast actin cytoskeleton through the budding cell cycle. Mol Biol Cell. 9, 3259-3262 (1998).
- Pelham, R. J., Chang, F. Role of actin polymerization and actin cables in actin-patch movement in Schizosaccharomyces pombe. Nat Cell Biol. 3, 235-244 (2001).
- Vavylonis, D., Wu, J. Q., Hao, S., O'Shaughnessy, B., Pollard, T. D. Assembly mechanism of the contractile ring for cytokinesis by fission yeast. Science. 319, 97-100 (2008).
- Bertin, A., et al. Three-dimensional ultrastructure of the septin filament network in Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 23, 423-432 (2012).
- Senning, E. N., Marcus, A. H. Actin polymerization driven mitochondrial transport in mating S. cerevisiae. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 107, 721-725 (2010).
- Breitsprecher, D., Kiesewetter, A. K., Linkner, J., Faix, J. Analysis of actin assembly by in vitro TIRF microscopy. Methods Mol Biol. 571, 401-415 (2009).
- Popp, D., Narita, A., Iwasa, M., Maeda, Y., Robinson, R. C. Molecular mechanism of bundle formation by the bacterial actin ParM. Biochem Biophys Res Commun. 391, 1598-1603 (2010).
- Trache, A., Lim, S. M. Live cell response to mechanical stimulation studied by integrated optical and atomic force microscopy. J Vis Exp. (44), (2010).
- Spira, F., Dominguez-Escobar, J., Muller, N., Wedlich-Soldner, R. Visualization of cortex organization and dynamics in microorganisms, using total internal reflection fluorescence microscopy. J Vis Exp. (63), e3982 (2012).
- Manneville, J. B. Use of TIRF microscopy to visualize actin and microtubules in migrating cells. Methods Enzymol. 406, 520-532 (2006).
- Cook, R. K., Sheff, D. R., Rubenstein, P. A. Unusual metabolism of the yeast actin amino terminus. J Biol Chem. 266, 16825-16833 (1991).
- Feng, L., et al. Fluorescence probing of yeast actin subdomain 3/4 hydrophobic loop 262-274. Actin-actin and actin-myosin interactions in actin filaments. J Biol Chem. 272, 16829-16837 (1997).
- Lin, M. C., Galletta, B. J., Sept, D., Cooper, J. A. Overlapping and distinct functions for cofilin, coronin and Aip1 in actin dynamics in vivo. J Cell Sci. 123, 1329-1342 (2010).
- Malloy, L. E., et al. Thoracic Aortic Aneurysm (TAAD)-causing Mutation in Actin Affects Formin Regulation of Polymerization. J Biol Chem. 287, 28398-28408 (2012).
- Smyth, J. W., Shaw, R. M. Visualizing ion channel dynamics at the plasma membrane. Heart Rhythm. 5, S7-S11 (2008).
- Bhattacharya, R., et al. Recruitment of vimentin to the cell surface by beta3 integrin and plectin mediates adhesion strength. J Cell Sci. 122, 1390-1400 (2009).
- Hetheridge, C., et al. The formin FMNL3 is a cytoskeletal regulator of angiogenesis. J Cell Sci. 125, 1420-1428 (2012).
- Bergeron, S. E., et al. Allele-specific effects of thoracic aortic aneurysm and dissection alpha-smooth muscle actin mutations on actin function. J Biol Chem. 286, 11356-11369 (2011).
