Summary
Malattia mutazioni che causano in actina possono alterare la funzione del citoscheletro. Dinamica del citoscheletro vengono quantificati attraverso l'imaging di proteine con targhetta modo fluorescente utilizzando totale microscopia a fluorescenza interna. Come esempio, la proteina del citoscheletro, Aip1p, ha modificato la localizzazione e il movimento in cellule esprimenti l'isoforma actina mutante, R256H.
Abstract
Mutazioni in actina causare una serie di malattie umane dovute a cambiamenti molecolari specifici che spesso alterano la funzione del citoscheletro. In questo studio, l'imaging di fluorescenza tagged proteine mediante fluorescenza interna totale (TIRF) microscopio viene utilizzato per visualizzare e quantificare i cambiamenti nelle dinamiche del citoscheletro. Microscopia TIRF e l'uso di tag fluorescenti consente inoltre per la quantificazione dei cambiamenti nelle dinamiche del citoscheletro causata da mutazioni in actina. Usando questa tecnica, quantificazione della funzione del citoscheletro in cellule vive integra pregevolmente studi in vitro della funzione della proteina. Come esempio, mutazioni di senso influenzano il residuo actina R256 sono stati identificati in tre isoforme di actina umani suggerendo questo aminoacido svolge un ruolo importante nelle interazioni regolamentazione. Gli effetti della actina mutazione R256H sui movimenti del citoscheletro sono stati studiati utilizzando il modello di lievito. La proteina, Aip1, che è noto per assistere cofilin in actina depolimerizzazione, eraetichettati con la proteina fluorescente verde (GFP) al N-terminale e tracciati in vivo mediante microscopia TIRF. La velocità di movimento Aip1p sia wild type e mutanti è stata quantificata. Nelle cellule esprimenti mutante R256H actina, Aip1p movimento è limitata e la velocità di movimento è circa la metà della velocità misurata in cellule di tipo selvatico (0,88 ± 0,30 micron / sec in cellule R256H rispetto a 1,60 ± 0,42 micron / sec in cellule di tipo selvatico, p <0.005).
Introduction
Actina è la proteina dominante comprendente il citoscheletro e partecipa ai processi cellulari critici compresi divisione cellulare, movimento organello, la motilità cellulare, la contrazione e segnalazione. Negli ultimi dieci anni, le mutazioni che causano la malattia di actina sono stati scoperti in ciascuna delle sei isoforme di actina umani che portano a una serie di disturbi, da miopatie a malattia coronarica 1-7. I processi attraverso i quali le mutazioni di actina portano alla malattia continuano ad essere chiariti. Il modello di lievito resta il gold standard per studiare gli effetti biochimici di mutazioni sulla funzione actina causa dei vantaggi della singola isoforma actina essenziale, trattabilità genetica ed elevata conservazione di sequenza e funzione di actina. Gli studi dimostrano che le singole mutazioni di actina portano a specifiche disfunzioni molecolari con effetti negativi dominanti 8. Ad esempio, mutazioni che causano sordità in actina γ-non-muscolare che influenzano il residuo Lys-118 alterano regolamentazione da partela proteina di legame actina Arp2 / 3 9. Studi frequentemente utilizzano in vitro analisi di proteine: interazioni proteina. Indagini l'effetto di actina mutazioni in biologia cellulare e, in particolare, actina localizzazione delle proteine di legame nella cella sono limitati.
Studi del citoscheletro lievito in vivo convenzionalmente basano su immagini di cellule fissate da un microscopio invertito a fluorescenza 10. Questi esperimenti hanno fornito dati fondamentali sulla morfologia del citoscheletro actina. Le indagini hanno dato inserito tridimensionale confocale per visualizzare la complessa rete del citoscheletro 11, 12. Questa rappresentazione consente di quantificare l'abbondanza e la posizione relativa di patch di actina e filamenti. Sottile sezione tomografia elettronica è stato usato per l'immagine della morfologia delle reti filamentosi dense relativi alle strutture subcellulari conservate 13. S Crowded cellularipassi con una piccola sezione trasversale possono essere esaminate in dettaglio fine con questa tecnica. Studi di imaging sono stati estesi per le cellule viventi usando la microscopia a fluorescenza time lapse. Quando fotoindotto e fluorescenza di fondo possono essere moderato, imaging lasso di tempo permette indagini alla dinamica delle proteine citoscheletriche e la risposta alle condizioni ambientali 11, 14. Separatamente, la visualizzazione della dinamica dei filamenti di actina in vitro è stata avanzata dall'introduzione di riflessione interna totale fluorescenza (TIRF) microscopia. Rispetto alla microscopia campo ampio, TIRF ha il vantaggio di una ridotta fluorescenza di fondo e maggiore contrasto per monitorare singoli filamenti 15, 16. Con queste qualità, la microscopia TIRF è stato adattato da biologi cellulari per monitorare strutture cellulari a livello della membrana plasmatica 17, 18. Eventi cellulari, inclusi i cambiamenti nel citoscheletro, puòessere visualizzati in tempo reale con un basso fototossicità, contrasto massimo, e lo sfondo minimal fioritura 19.
Per comprendere meglio l'effetto di mutazioni actina sul movimento, localizzazione, e turnover di proteine citoscheletriche nella cellula, microscopia TIRF e proteina codifica sono stati utilizzati. Qui, sono descritti metodi per studiare gli effetti di una mutazione clinicamente rilevante sulla dinamica del citoscheletro di actina in Saccharomyces cerevisiae. Specificamente, la localizzazione e il movimento della proteina di legame actina, Aip1p, è stata visualizzata e quantificati in cellule che esprimono la mutazione R256H in actina. Queste tecniche si completano a studi biochimici in vitro e consentono una maggiore comprensione delle interazioni proteiche e funzioni.
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Protocol
1. Clonazione nella PB1996 plasmidi
- Progettazione e ordinare primer di DNA da un oligonucleotide società di produzione che fiancheggiano la sequenza bersaglio e contenere siti di restrizione unici nel plasmide principale selezionato. NOTA: In questo caso, i primer sono stati progettati per amplificare le 400 coppie di basi all'estremità 5 'della sequenza Aip1. Il sito di restrizione XhoI è stato incorporato nel fondo circa 20 bp prima sequenza Aip1, e XmaI era inclusa circa 20 bp dopo la sequenza bersaglio Aip1. Il plasmide usato per la clonazione era PB1996, che contiene un tag 3XGFP per fluorescenza, un gene URA per la selezione ceppo di lievito, e un gene di resistenza all'ampicillina per la selezione batterica.
- Purificare il DNA genomico da un Ura-ceppo di lievito aploidi. Nota: Fare riferimento alla Figura 1 per un diagramma di processo di clonazione.
- Eseguire una reazione di PCR standard utilizzando due primer e il DNA genomico di lievito per amplificare il gene Aip1p con i siti di restrizione su entrambi end. Digerire il prodotto PCR e il plasmide PB1996 con gli enzimi di restrizione in reazioni separate per fabbricante protocolli negativa. In questo caso XmaI e XhoI sono stati usati con il buffer di accompagnamento a 37 ° C per 1 ora.
- Eseguire un gel elettroforesi di agarosio 0,8% per separare i frammenti di DNA digeriti. In un pozzetto, caricare un DNA bassa scala di massa e, in pozzetti separati, caricare l'intera reazione da ciascuna digestione. Attivare il gel a 100 volt per circa 1 ora, finché il fronte del colorante è vicino alla fine del gel. Visualizzare il gel sotto una luce UV e purificare il segmento corrispondente al segmento proteina e il plasmide taglio.
- Legare il segmento Aip1 digeriti e PB1996 plasmide. Trasformare il prodotto in cellule DH5a utilizzando protocolli fabbricante (10 microlitri di DNA con 100 cellule microlitri per 30 min in ghiaccio, shock termico a 42 ° C per 2 min, crescere in mezzi SOC per 2 ore a 37 ° C) e la piastra su piastre di coltura che comprendono l'antibiotico per la selezione, in questo caso LB +Piatti Amp. Selezionare e crescere una colonia in coltura liquida. Purificare il plasmide di nuova concezione.
2. Mutant ceppo di lievito Generation
- Utilizzare un ceppo di lievito aploide in cui l'allele actina è stata soppressa per costruire un ceppo mutante di lievito. Nota: In questo caso, il ceppo è stato un dono generoso da Dr. Peter Rubenstein (University of Iowa) e la costruzione è stato descritto da Cook et al 20 Questo ceppo manca il gene cromosomico actina e contiene un plasmide che codifica tipo selvatico lievito. actina e uracile.
- Utilizzare il plasmide codificante PRS wild type lievito actina con una Trp + selezione come il plasmide base per mutagenesi 21.
- Eseguire mutagenesi sito-diretta sul plasmide PRS per progettare la mutazione missense in actina.
- Per la mutazione R256H in actina, rendere il primer 5 'ggtaacgaaagattccatgccccagaagc 3' per cambiare il Arg 256 alla sua 256. Eseguire un mutagenesi standard diReazione di PCR con il plasmide dal punto 2.2.
- Trasformare l'actina plasmide mutante dalla PCR in cellule DH5a. Isolare il DNA plasmidico e sequenziare il gene actina per verificare la mutazione.
- Trasforma il plasmide codificante mutante lievito actina nel ceppo di lievito aploidi dal punto 2.1.
- Cultura cellule trasformate su Trp piastre per selezionare il lievito contenente il Trp + contenente mutante di lievito actina plasmide.
- Selezionare per le celle manca il plasmide originale che codifica wild type actina e uracile (descritto in 2.1) da parte delle cellule sub-coltura di dei Trp-piastre su piastre contenenti 5-Fluoroorotic Acid (5-FOA). 5-FOA viene convertito nella forma tossica, 5-fluorouracile, in yeas ceppi che esprime il gene URA3 funzionale. Le cellule che crescono dopo la selezione stepwise conterranno solo l'actina plasmide mutante.
- Purificare il DNA plasmidico dal nuovo ceppo di lievito. Sequenziare il plasmide per garantire il gene mutante actina è presente. Utilizzare questo sallenarsi in ulteriori studi. Questo processo è schematizzata in figura 2.
3. Trasformare il plasmide in cellule di lievito
- Digerire il plasmide Aip1p-GFP con un enzima di restrizione per consentire l'integrazione nel cromosoma di lievito. NOTA: Il sito di restrizione deve essere al di fuori del blocco sequenza che contiene l'etichetta fluorescente, gene di interesse, e marcatore di selezione. In questo caso, utilizzare 1 ml di HpaI enzima di restrizione con 8 microlitri DNA e 1 ml di 10x buffer di accompagnamento per 1 ora a 37 ° C.
- Cultura S. cellule cerevisiae (dal punto 2.5) che sono in grado di sintetizzare uracile (Ura-deformazione) durante la notte in 5 ml in mezzi YPD (estratto di lievito 1%, 2% peptone, e 2% destrosio) su una ruota a 30 ° C. Centrifugare 1 ml delle cellule per 5 minuti a 1000 x g.
- Fai la miscela PLATE. Effettuare 10XTE aggiungendo 5 ml di 1 M Tris pH 7,5 e 2 ml di 250 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) a 43 ml di DDH 2 O. Aggiungi 00,204 g di acetato di litio a 20 ml di 1XTE, poi 8 g di polietilene glicole (PEG) (MW ~ 3.300) e filtro sterilizzare.
- Decantare il supernatante dalle cellule filate al passo 3.2 e risospendere le cellule nel liquido rimanente. Per le cellule sospese, aggiungere 2 ml di 10 mg / ml testicoli salmone vettore DNA. Aggiungere 10 ml di DNA plasmidico digerito dal punto 3.1 e vortice. Aggiungere 0,5 ml della piastra e vortex. Aggiungere 20 ml di 1 M DTT e vortex.
- Incubare la miscela per 6-8 ore a 25 ° C. Heat Shock le cellule in un bagno d'acqua a 42 ° C per 10 min. Piastre 100 microlitri di cellule dal fondo della provetta cui si sono stabiliti su un-Ura piastra. Incubare a 30 ° C per 2-3 giorni o fino a formare colonie.
- Selezionare singole colonie e realizzato su un-Ura piatto. NOTA: Queste cellule contengono il plasmide con il gene Aip1-GFP e Ura integrato nel cromosoma, consentendo la crescita. Queste cellule saranno poi utilizzati in microscopy.
4. Visualizzazione della proteina Movimento Aip1p Uso Total Internal Reflection microscopia a fluorescenza
- Coltivare una coltura delle cellule di lievito con il incorporato Aip1p-GFP in YPD durante la notte su una ruota a 30 ° C. Subculture 1 ml della cultura durante la notte in 9 ml di Ura-media. Crescere le cellule per un ulteriore 3-4 ore su un agitatore a 30 ° C per assicurare che siano in fase di crescita logaritmica.
- Aggiungere 3 ml di cellule di un vetrino da microscopio in vetro e aggiungere un vetrino. Permettono alle cellule di stabilirsi sul vetrino per 5 min. Porre il vetrino nella staffa del piattello.
- Osservare la proteina Aip1p-GFP con un totale fluorescenza a riflessione interna (TIRF) microscopio (488 nm) usando una immersione in olio 100X TIRF obiettivo e una camera CCD digitale. Utilizzando il software SlideBook 5.0, di ottenere immagini per 20 secondi ad una velocità di 5 fotogrammi / sec (frames individuali di immagini acquisite sono presentati nella Figura 2A).
- Per mettere a fuoco il cells, aperto software SlideBook 5.0 e fare clic sul pulsante Finestra di messa a fuoco nella barra degli strumenti per accedere ai controlli di messa a fuoco. Selezionare la scheda Ambito e selezionare l'obiettivo 100X-TIRF. Accendere la lampada e far scorrere la barra della lampada al 15%. Modificare l'impostazione Bin 2 x 2. Cambiare il filtro a campo chiaro.
- Al microscopio, usare il selettore di messa a fuoco fine per portare le cellule a fuoco come si è visto sullo schermo del computer.
- Utilizzando i controlli all'interno della finestra di messa a fuoco, spegnere la lampada, sostituire il filtro per vivere, e fare clic sul pulsante TIRFM.
- L'illuminatore TIRFM collegato alla porta lato destro del microscopio, ruotare l'emissione laser On.
- Selezionare la scheda flusso all'interno della finestra di messa a fuoco, selezionare la casella accanto per avviare la registrazione e quindi fare clic su pulsante di campo luminoso.
- L'illuminatore TIRFM, ruotare il micrometro per regolare l'angolo di incidenza del laser. Questo viene utilizzato per ottimizzare l'emissione di fluorescenza dai fuochi Aip1-GFP e minimizzare la fluorescenza di fondo dalcellule e scivolo.
- Quando viene visualizzata l'immagine desiderata, premere Start. Dopo 20 secondi, premere Stop. Salvare le immagini. Nella scheda File nella barra del menu principale, selezionare Salva presentazione come e inserire il percorso del file e il nome.
- Utilizzare il software ImageJ per analizzare le immagini. Utilizzare il plugin macro "Tracker manuale" per tracciare il movimento e la velocità del Aip1p foci fluorescente. Modificare il parametro intervallo di tempo di 0,2 sec.
- Utilizzando la selezione delle tracce add, selezionare e tenere traccia di una proteina fluorescente individuo attraverso 4-8 fotogrammi connettivi. Utilizzare il comando traccia finale e la velocità di movimento proteine tra ogni fotogramma viene visualizzata in una finestra dei risultati.
- Determinare il tasso medio tra ogni frame utilizzando un foglio di calcolo di Microsoft Excel. Utilizzare i valori per calcolare la velocità media di movimento Aip1p per ogni ceppo cellulare di interesse. NOTA: Un grafico a dispersione della velocità di movimento Aip1p e la velocità media non lineare è mostrato in Figuri 2B.
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Representative Results
Un metodo per immagine dinamica di proteine citoscheletriche nella cellula è presentato. La proteina-actina vincolante, Aip1p, è stato taggato con GFP. Il motivo per il plasmide codificante il prodotto etichettato è mostrato in Figura 1. Il plasmide è stato poi trasformato in cellule di lievito. Espressione dei fluorescente etichettato Aip1p permesso visualizzazione del comportamento proteina nella cellula. Aip1p localizza tipicamente a chiazze actina nei siti di endocitosi 22. Per quantificare movimento Aip1p, più di 50 focolai Aip1p fluorescenti sono stati monitorati in più di 10 celle, come mostrato nella Figura 2A. La velocità media è stata calcolata per ciascuna area Aip1p fluorescente (vedere la Figura 2B). Nelle cellule di tipo selvatico, movimenti Aip1p varia tra una cellula, e poi scompaiono. La velocità media del movimento di Aip1p in cellule di tipo selvatico è di 1,60 ± 0,42 micron / sec. Cellule che esprimono l'actina mutante R256H, noto per avere morfologia anormale del cy actinatoskeleton 23, hanno un fenotipo alterato Aip1p. Nel ceppo mutante, movimento Aip1p è limitato e più lento. La velocità media di movimento Aip1p è 0,88 ± 0,30 micron / sec (p <0.005). La migrazione Aip1p è limitata alla zona circostante, con focolai girando intorno all'altro piuttosto che attraversa la cella. Inoltre, Aip1p è visibile più suggerendo ricambio più lento di proteine Aip1.
Figura 1. Schema di costruzione plasmide. A) Il frammento Aip1 amplificato tramite PCR è mostrata essere digerito dagli enzimi di restrizione (bulloni giallo). B) Il plasmide, PB1996, viene digerito con enzimi di restrizione per rimuovere il gene Abp140. C) Il digerita frammenti Aip1 e PB1996 sono legatura to formare l'. D plasmide PB1996 Aip1) Il plasmide PB1996 Aip1 è linearizzato e trasformati in cellule di lievito in cui il DNA è integrato nel cromosoma.
Figura 2. Diagramma di mutante costruzione ceppo di lievito actina. Il plasmide codificante l'actina isoforma mutante viene poi trasformato in una linea cellulare e selezionati in base alla capacità di crescere sul terreno privo di triptofano. Le linee verdi indicano DNA cromosomico. Il cerchio nero è un plasmide. Il cerchio marrone rappresenta una cellula di lievito. Le caselle indicano ciascuno un gene specifico: il giallo è il actina, l'arancio è leucina, marrone è uracile, e il rosa è il triptofano. La X sulla casella indica gene è stato eliminato dal DNA cromosomico. Nei passi 2.3 e 2.4, la stella nera sulla i gene actinandicates la mutazione R256H.
Figura 3. Sono presenti movimento Aip1p-GFP in cellule di lievito vivo. A) Immagini di tipo selvatico e le cellule che esprimono GFP R256H-tagged Aip1p. Le cellule sono in fase di crescita log in anticipo e le immagini sono state acquisite ogni 0,2 sec per 15 sec. Le frecce indicano la posizione di un individuo fuoco fluorescente nel corso del tempo, blu per il tipo selvaggio e rosso per i ceppi mutanti di actina. L'ultimo fotogramma mostra il percorso dei fuochi Aip1 come una linea verde. Barra della scala puo '5 micron. B) La velocità di movimento Aip1p è stata misurata utilizzando ImageJ. Il grafico scatter plot visualizza la velocità di focolai fluorescente individuale. La barra orizzontale indica la velocità media di wild type (blu) e mutante (rosso) actina ceppi.Aip1p muove a 1.60 ± 0.42 micron / sec in cellule di tipo selvatico rispetto a 0,88 ± 0,30 micron / sec per cellule esprimenti mutante R256H actina (p <0.005).
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Discussion
Una strategia efficace per visualizzare la dinamica del citoscheletro e l'utilità nelle indagini sulle mutazioni patogene è stato descritto qui. Modalità di imaging avanzate hanno creato nuove opportunità per comprendere il movimento intracellulare di proteine nei pressi della membrana cellulare. Totale microscopia a fluorescenza di riflessione interna (TIRF) è una tecnica sensibile per studi funzionali in cellule viventi. TIRF utilizza un laser di eccitazione angolato che crea un campo evanescente a causa della differenza di indici di rifrazione del coprioggetto e mezzo acquoso. L'energia del campo evanescente eccita fluorofori ma diminuisce esponenzialmente con la distanza dell'interfaccia tra il coprioggetto e acqua. Ciò si traduce in un elevato rapporto segnale-rumore e la risoluzione potente 50-250 nm sopra l'interfaccia coprioggetto / medie. Queste qualità rendono la microscopia TIRF un potente strumento per visualizzare le proteine del citoscheletro a livello di singola molecola in cellule viventi con menofototossicità e un maggior contrasto rispetto ad altre tecniche di 24-26.
Il citoscheletro coinvolge numerose proteine che lavorano di concerto per adattarsi alle esigenze cellulari. L'effetto di vascolare malattia-causante mutazioni actina sulla regolazione da cofilin è stata recentemente studiata dal nostro gruppo 27. Sulla base dei nostri risultati iniziali, Aip1p, una proteina che facilita cofilin-dipendente actina rottura di legame actina, è stata studiata. In studi preliminari, le cellule che esprimono la mutazione R256H actina crescono male in assenza di Aip1p, soprattutto in condizioni di stress. Ciò suggerisce che il regolamento Aip1p del citoscheletro di actina mutante è alterato. Le nostre analisi del movimento e della localizzazione Aip1p nel ceppo R256H utilizzando marcatura fluorescente e microscopia TIRF corrobora le dinamiche anormali. In futuro, prevediamo di etichettare le proteine aggiuntivi, come cofilin, con differenti fluorofori per visualizzare il movimento delle proteine multiplecontemporaneamente per capire meglio le proteine: interazioni proteina.
Ci sono alcune limitazioni per la generazione di una proteina fluorescente taggato e alcuni casi in cui la tecnica non è fattibile. Un tag fluorescente può interrompere l'attività della proteina o alterare l'interazione con i partner di legame. Questo è stato riscontrato nel tentativo di etichettare cofilin, un'altra actina proteina legante. Espressione del costrutto targhetta è rimasta soccombente nel lievito aploidi grazie alla funzione cofilin perturbato. Cofilina è una proteina essenziale in lievito. Così, la cancellazione di cofilin senza concomitante reintroduzione è letale; Blocco successiva introduzione su un plasmide. Un modo per evitare questa limitazione è quello di utilizzare il lievito diploide. Una copia del gene cofilin è stato eliminato, una versione taggato stato esogeno introdotto un plasmide, e quindi la selezione di cellule figlie che mancano cofilin genomica, ma contengono il plasmide 22 La possibilità di codificare la proteina fluorescente eraottenuto aggiungendo il tag residui interni della proteina che in precedenza hanno mostrato di avere un impatto sulle sue interazioni proteina-proteina. Il C-terminale N-o sono siti preferibile aggiungere il tag a meno che le regioni sono noti per influenzare la proteina pertinente: interazioni proteina. Se questo non produce una proteina funzionale, il capolinea alternativo o residui interni possono essere tentate.
Ci sono alcuni punti critici in attuazione delle tecniche descritte. Uno è determinare la posizione appropriata per contrassegnare la proteina che conserva la funzione. Controlli robusti devono essere incluse per verificare che la funzione della proteina è conservata. In secondo luogo, il vetrino deve essere monitorata per garantire le cellule non essiccare durante l'imaging. Cera può essere utilizzata intorno ai bordi del vetrino per prevenire la disidratazione, se necessario. Questi passaggi per garantire il successo stanno facendo semplici questo approccio trattabili e vantaggioso per le strutture di immagine vicino alla membrana plasmatica. La capacità di qualocalizzazione delle proteine ntify e movimento in cellule vive possono migliorare la comprensione delle funzioni cellulari. Come vengono identificate mutazioni che interessano proteine citoscheletriche, espressione di proteine fluorescente etichettato e microscopia TIRF può essere utile indagare la malattia umana fisiopatologia sottostante.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Peter Rubenstein per una discussione utile e consulenza tecnica e David Pellman per il clone PB1996 originale. Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della March of Dimes e finanziamenti dal Ride for Kids.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | rpi | 9012-36-6 | |
| Bromophenol Blue | Amresco | 115-39-9 | |
| BSA | NEB | B9001S | |
| Change-IT Multiple Mutation Site Directed Mutagenesis Kit | USB Corporation | 4166059 | |
| CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
| DNA, single stranded from salmon testes | Sigma | 9007-49-2 | |
| EDTA pH 7.4 | Sigma | 93302 | |
| Ethidium bromide | Invitrogen | 15585-011 | Warning! Harmful irritation |
| Fungal/Bacterial DNA Kit | Symo Research | D6005 | |
| HpaI | NEB | R0105S | |
| Lithium acetate | AlfaAesar | 6108-17-4 | |
| Low DNA Mass Ladder | Invitrogen | 10068-013 | |
| NE Buffer #4 | NEB | B7004S | |
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | Invitrogen | 12532-016 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | Any kit will work |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
| Sodium azide | Sigma | 26628-22-8 | |
| PBS | Invitrogen | 10010-023 | |
| PEG | Amresco | 25322-68-3 | |
| Tris Base Ultrapure | rpi | 77-86-1 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | 1/6/2015 | |
| XhoI | NEB | R0146S | |
| XmaI | NEB | R0180S | |
| YPD media | LabExpress | 3011 | |
| -URA Media | LabExpress | 3010 | |
| PCR Machine | Invitrogen | 4359659 | Any PCR machine will work |
| TIRF Microscope | Olympus IX81 | ||
| Hamamatsu ORCA-R camera | Hamamatsu |
References
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