Summary
Aktin hastalığa neden olan mutasyonların sitoskeletal işlevini değiştirebilir. Sitoskeletal dinamikleri toplam iç floresan mikroskobu kullanarak floresan etiketli proteinlerin görüntülenmesi ile ölçülür. Bir örnek olarak, hücre iskeleti protein, Aip1p, mutant aktin izoformu, R256H ifade eden hücrelerde lokalizasyonu ve hareket değişmiş bulunmaktadır.
Abstract
Aktin mutasyonlar, sık sık hücre iskeleti işlevini değiştirebilir spesifik moleküler değişiklikleri nedeniyle insan hastalıklarının bir dizi yol açar. Bu çalışmada, Floresan görüntüleme toplam iç floresan (TIRF) mikroskopi sitoskeletal dinamikleri değişiklikleri görselleştirmek ve ölçmek için kullanılan kullanılarak proteinler etiketledi. TIRF mikroskopi ve floresan etiketleri kullanımı da aktin mutasyonların neden sitoskeletal dinamikleri değişikliklerin ölçümü sağlar. Bu teknik kullanılarak, canlı hücrelerde hücre iskeleti fonksiyonun ölçümü rıyla protein fonksiyonunun in vitro çalışmalarda tamamlar. Bir örnek olarak, aktin tortu, R256 etkileyen yanlış anlamlı mutasyonlar, bu amino asit düzenleyici etkileşimlerinde önemli bir rol oynadığı öne üç insan aktini izoformu tespit edilmiştir. Sitoskeletal hareketlere aktin mutasyon R256H etkileri maya modeli kullanılarak incelenmiştir. Aktin depolimerizasyon in cofilin yardımcı olmak için bilinen protein, Aip1, olduN-terminalinde, yeşil floresan proteini (GFP) ile etiketlendi ve TIRF mikroskopi kullanılarak in vivo takip etti. Vahşi tip ve mutant suşları hem de Aip1p hareketinin hızı ölçülmüştür. R256H mutant aktin eksprese eden hücrelerde, Aip1p hareket sınırlı ve hareketin hızı 1,60 ile karşılaştırıldığında R256H hücrelerde 0.88 ± 0.30 mm / saniye (vahşi tür hücrelerinde ölçülen yaklaşık yarısı hızda olduğunu ± 0.42 vahşi tür hücrelerinde mm / sn, p <0.005).
Introduction
Aktin hücre iskeletinin içeren dominant protein ve hücre bölünmesi, organel hareketi, hücre hareketi, kasılma, ve sinyalizasyon gibi kritik hücresel süreçleri katılır. Geçtiğimiz on yıl içinde, aktin hastalığa neden olan mutasyonlar miyopatiler koroner arter hastalığı 1-7 için, hastalıkların bir dizi yol açan altı insan aktin izoformlarının her keşfedilmiştir. Aktin mutasyonları hastalığa yol hangi süreçlerin araştırılmasına devam etmektedir. Maya modeli tek temel aktin izoformuna, genetik tractability ve aktin dizi ve fonksiyon yüksek koruma avantajları sayesinde aktin fonksiyonu üzerindeki mutasyonların biyokimyasal etkilerini incelemek için altın standart olmaya devam etmektedir. Çalışmalar bireysel aktin mutasyonları baskın olumsuz etkileri 8 ile moleküler belirli disfonksiyonlara yol olduğunu göstermektedir. Örneğin, Lys-118 artık madde etkiler γ-non-kas aktin sağırlık neden olan mutasyonlar tarafından düzenleme değiştirebiliraktin bağlayıcı protein Arp2 / 3 9. Çalışmalar sıklıkla in vitro olarak istihdam protein analiz: protein etkileşimleri. Mutasyon üzerine, hücre biyolojisi, aktin ve, özellikle de, hücre içinde bağlayıcı protein lokalizasyonu aktin etkisine araştırmalar sınırlıdır.
In vivo olarak maya hücre iskeletinin çalışmalar geleneksel bir ters flüoresan mikroskop 10 sabit hücre görüntüleri kullanır. Bu deneyler, aktin hücre iskeletinin morfolojisi hakkında temel girdi sağlamıştır. Araştırmalar bu yana karmaşık sitoskeletal ağı 11, 12, görselleştirmek için üç boyutlu konfokal görüntüleme dahil etmişlerdir. Bu görüntüleme aktin yamalar ve filamentler bolluğu ve göreli konumu kantifikasyonunu izin verir. Ince kesit elektron tomografi korunmuş hücre içi yapılarda 13 göreli olarak yoğun lifli ağların morfolojisi görüntü için kullanılmıştır. Kalabalık hücresel sküçük bir kesit ile adım bu tekniği ile ince ayrıntılı incelenebilir. Görüntüleme çalışmaları zaman atlamalı floresan mikroskopi kullanılarak canlı hücreler için uzatılmıştır. Beyazlatma fotoğraf ve arka plan floresan yönetilir olabilir zaman, zaman atlamalı görüntüleme incelemeleri sitoskeletal proteinlerin dinamikleri ve çevre koşulları 11, 14 yanıt olarak verir. Ayrı, in vitro aktin filamentler dinamikleri görselleştirme toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskopi tanıtımı tarafından ortaya atılmıştır. Geniş alan mikroskobu ile karşılaştırıldığında, TIRF azalmış eşiğe yararlanmak ve bireysel filamanlar 15, 16 izlemek için geliştirilmiş kontrast vardır. Bu nitelikleri ile, TIRF mikroskopi plazma zarı 17, 18, hücresel yapıları izlemek için hücre biyologlar tarafından adapte edilmiştir. Hücre iskeletinin değişiklikler dahil olmak üzere hücresel olaylar, canDüşük fototoksisite, maksimum kontrast ve en az arka plan çiçeklenme 19 gerçek zaman görünür.
Daha iyi hareket, lokalizasyonu ve hücre, TIRF mikroskopi ve protein etiketleme hücre iskeleti proteinleri ciro aktin mutasyonların etkisini anlamak için kullanılmıştır. Burada, Saccharomyces cerevisiae 'de hücre iskeleti dinamikleri üzerinde aktin klinik olarak anlamlı bir mutasyon etkilerini incelemek için yöntemler tarif edilmiştir. Özel olarak, aktin bağlayıcı proteinin, Aip1p lokalizasyonu ve hareket, görsel ve aktin R256H mutasyonu ifade eden hücrelerde ölçülmüştür. Bu teknikler vitro biyokimyasal araştırmalarda tamamlayıcı ve protein etkileşimleri ve fonksiyonları daha iyi anlaşılması için izin verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. PB1996 plazmide Klonlama
- Tasarım ve DNA sırası hedef sekansını kuşatan ve seçilen ana plasmidde tek restriksiyon sitelerini içeren bir oligonükleotid imalatçı şirketten primerler. Not: Bu durumda, primerler, Aip1 dizisinin 5 'ucunda 400 baz çifti yükseltmek için tasarlanmıştır. Xhol kısıtlama alanı, yaklaşık 20 bp dizisi Aip1 önce primerin içerisine dahil edildi, ve Xmal, hedef dizinin Aip1 sonra yaklaşık 20 bp'lik dahil edilmiştir. Klonlama için kullanılan plazmid floresan bir 3XGFP etiket, maya suşu için bir seçim geni, bir URA ve bakteriyel seçim için bir ampisilin direnç genini ihtiva PB1996, oldu.
- Bir Ura-maya haploid suşundan genomik DNA arındırın. Not: klonlama sürecinin bir diyagram için Şekil 1'e bakınız.
- Ya da en üzerindeki kısıtlama siteleri ile Aip1p genini çoğaltmak için iki primer ve maya genomik DNA kullanılarak, standart bir PCR reaksiyonud. PCR ürünü sindirimi ve üretici için ayrı reaksiyonlarda kısıtlama enzimleri ile PB1996 plazmid protokolleri tavsiye edilir. Bu durumda, Xmal ve Xhol 1 saat boyunca 37 ° C 'de, ekteki tamponu ile kullanıldı.
- Sindirilmiş DNA fragmanlarının ayrılması için% 0.8 agaroz jel elektroforez çalıştırın. Bir kuyu, düşük bir kütle DNA merdiveni yük ve, ayrı kuyularda, her bir sindirimden olan bütün reaksiyon yükleyin. Boyanın önü jelin sonuna kadar, yaklaşık 1 saat boyunca 100 voltta jel çalıştırın. Bir UV ışık altında jel görselleştirme ve protein segmente karşılık gelen segmenti ile kesilmiş plazmid üzerinden saflaştırılması.
- Sindirilmiş Aip1 segment ve PB1996 plazmid Arter. Kültür plakaları üzerine ve plaka (2, 37 ° C de saat boyunca SOC ortamında büyür, 2 dakika boyunca 42 ° C 'de buz, ısı şoku 30 dakika boyunca 100 ul hücre 10 ul DNA) üretici protokolleri kullanarak DH5a hücrelerine ürünü Transform bu durumda LB + olarak, seçim için antibiyotik içerirAmp plakaları. Seçip sıvı kültür içinde bir koloni büyür. Yeni tasarlanan plazmid arındırmak.
2.. Mutant Maya Gerilme Üretimi
- Aktin alel bir mutant maya suşu oluşturmak için silinmiş olduğu bir haploid maya suşu kullanın. Not: Bu soy kromozomal aktin geni yoktur ve yabani tip maya kodlayan bir plasmidi ihtiva eden bu durumda, ana suş Dr Peter Rubenstein (University of Iowa) bir cömert bir hediye idi ve inşaat Cook et al, 20 tarafından tarif edilmiştir. aktin ve urasil.
- 21 mutagenez için temel plazmiti gibi bir Trp + seçim ile plazmid kodlayan pRS yabani tip maya aktin kullanın.
- Aktin içine yanlış anlamlı mutasyonun mühendis pRS plazmid üzerinde yer yönlendirmeli mutagenez gerçekleştirin.
- Aktin R256H mutasyonu için, astar 5 O'nun 256 Arg 256 değiştirmek için 'ggtaacgaaagattccatgccccagaagc 3' yapmak. Standart mutajenezini çalıştırınAdım 2.2 'den plazmidi ile PCR reaksiyonu.
- DH5a hücreleri içine PCR gelen mutant aktin plazmid dönüşümü. Plazmid DNA izole ve mutasyon doğrulamak için aktin geni sırası.
- Adım 2.1 'den haploid mutant maya suşu içine maya aktin kodlayan plazmid dönüşümü.
- Kültür Trp-plakalar üzerinde dönüştürülmüş hücreler mutant maya aktin plazmidi içeren Trp + içeren bira mayası için seçin.
- Hücreler 5-fluoroorotik asit (5-FOA) içeren plakalar üzerinde Trp-plakalardan alt-kültür hücreleri tarafından yabani tip aktin ve urasil (2.1 'de tarif edilmiştir) kodlayan orijinal plazmid eksik için seçin. 5-FOA evetler fonksiyonel URA3 geni ifade suşları, toksik formu, 5-fluorourasil dönüştürülür. Adım adım seçimden sonra büyüme Hücreler sadece mutant aktin plazmidi içerecektir.
- Yeni maya suşunda gelen plazmid DNA arındırın. Mutant aktin geninin mevcut olduğundan emin olmak için plazmidi dizisi. Bu s kullanınBundan sonraki çalışmalarda, tren. Bu işlem, Şekil 2'de diyagram olarak.
3.. Maya Hücre içine plasmidi Dönüşümü
- Maya kromozomu içine entegrasyon sağlamak üzere bir sınırlandırma enzimi ile Aip1p-GFP plazmidi Digest. Not: kısıtlama alanı floresan etiket, ilgi konusu geni, seçim işaretleyicisini içeren sekans bloğunun dışında olması gerekir. Bu durumda, 37 ° C de 8 ul DNA ve 1 saat boyunca birlikte 10x tampon 1 ul Hpal restriksiyon enzimi 1 ul kullanımı
- Kültür S. 30 ° C de bir tekerlek üzerinde YPD ortamı içinde, 5 ml (% 1 maya özü,% 2 pepton ve% 2 dektroz) içinde gece boyunca urasil (Ura-soyu) sentezleme yeteneğine sahip değillerdir (aşama 2.5 'dan itibaren) cerevisiae hücreleri 1,000 x g de aşağı 5 dakika için hücreler 1 ml Spin.
- PLAKA karışım yapmak. GKD 2 O'dan 43 ml 1 M Tris pH 7.5, 5 ml 250 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) içinde bir 2 ml eklenerek 10XTE olun Ekle 00,204 1X TE 20 ml polietilen glikol, daha sonra 8 g (PEG) (MW ~ 3300) ve filtre ile sterilize lityum asetat g.
- Adım 3.2 'de döndürülmüştür hücrelerden süpernatant süzün ve kalan sıvı içinde tekrar süspansiyon hücreleri. Süspansiyon hücreleri için, 10 mg / ml salmon testis taşıyıcı DNA, 2 ul ekle. Adım 3.1 ve girdap gelen sindirilmiş plasmid DNA 10 ul ekle. PLAKA ve vorteks 0.5 ml ekleyin. 1 M DTT ve vorteks 20 ul ekle.
- 25 ° C'de 6-8 saat süreyle inkübe karışımı Sıcaklık 10 dakika boyunca 42 ° C'de bir su banyosu içinde hücreleri şok. Onlar-Ura plaka üzerine yerleşmiştir mikrosantrifüj tüp dibinden hücrelerin plaka 100 ul. 2-3 gün boyunca veya koloniler oluşana kadar 30 ° C'de inkübe edin.
- Bir-Ura plaka üzerine tek tek koloniler ve çizgi seçin. NOT: Bu hücreler büyüme sağlayan, kromozoma entegre Aip1-GFP ve Ura gen ile plazmid içerir. Bu hücreler daha sonra microsco kullanılacakpy.
4. Toplam İç Yansıma floresan mikroskobu kullanarak Aip1p Protein Hareketi görselleştirme
- 30 ° C de bir gece bir tekerlek üzerinde YPD dahil Aip1p-GFP ile maya hücre kültür büyütün Of-Ura ortam 9 ml, gece boyunca kültürün Alt kültür 1 mi. Bu log büyüme fazında olduğundan emin olmak için 30 ° C sıcaklıkta bir çalkalayıcı üzerinde ilave bir 3-4 saat boyunca hücrelerin büyümesine.
- Cam mikroskop lamı hücrelerinin 3 ul ekleyin ve bir lamel ekleyin. Hücreler 5 dakika boyunca slayt üzerinde yerleşmek için izin verin. Sahne plaka dilimindeki slayt yerleştirin.
- Nesnel bir yağ daldırma 100X TIRF ve dijital CCD kamera kullanarak bir toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskop (488 nm) ile Aip1p-GFP proteini gözlemlemek. Slidebook 5.0 yazılımı kullanılarak, (elde edilen görüntülerin bireysel çerçeveleri Şekil 2A'da sunulmuştur) 5 kare / sn 'lik bir hızda 20 saniye boyunca görüntüler elde.
- C odaklanmakarşın, açık Slidebook 5.0 yazılım ve odak kontrolleri erişmek için araç çubuğundaki Odak Penceresi düğmesini tıklatın. Kapsam sekmesini seçin ve 100X-TIRF hedefi seçin. Lambayı açın ve% 15 lamba çubuğunu kaydırın. 2 x 2 Bin ayarı değiştirin. Parlak alanına filtresini değiştirin.
- Mikroskop, bilgisayar ekranında görüldüğü gibi odak noktası haline hücreleri getirmek için ince odak düğmesini kullanın.
- Odak Penceresi içinde denetimlerini kullanarak, lambayı kapatmak Canlı filtreyi değiştirmek ve TIRFM düğmesini tıklatın.
- Mikroskop sağ tarafında noktasına bağlı TIRFM aydınlatıcı, Açık, lazer emisyonu çevirin.
- Odak Penceresi içinde Akış sekmesini seçin, bir sonraki Kaydı başlatın ve sonra parlak bir alan düğmesini tıklatın onay kutusunu.
- TIRFM ışığını, lazer olay açısını ayarlamak için mikrometre açmak. Bu Aip1-GFP odaklarından fluoresans emisyonunun optimize etmek ve gelen arka plan floresan en aza indirmek için kullanılırhücreleri ve slayt.
- İstenen görüntü görüntülendiği zaman, Başlat düğmesine basın. 20 sn, basın Durdur sonra. Görüntüleri kaydedin. Ana menü çubuğunda Dosya sekmesinde, Kaydet Slayt seçeneğini seçin ve dosya konumu ve adını girin.
- Görüntüleri analiz etmek ImageJ yazılımı kullanın. Floresan Aip1p odaklarının hareketini ve hızını izlemek için makro eklenti "Manuel Tracker" kullanın. 0.2 saniye zaman aralığı parametresini değiştirin.
- Eklenti parça seçimi kullanarak, seçmek ve 4-8 bağ çerçeveler aracılığıyla bireysel floresan proteini izleyebilirsiniz. Uç parça komutunu kullanın ve her kare arası protein hareketin hızı bir sonuç penceresinde görüntülenir.
- Microsoft Excel kullanarak her çerçeve arasındaki ortalama hızını belirleyin. Ilgi her hücre türü için Aip1p hareketinin ortalama hızının hesaplanması için değerleri kullanın. Not: Aip1p hareket ve ortalama doğrusal olmayan hız oranının bir saçılma grafiğidir Figu gösterilmektedir2B yeniden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Görüntünün bir yöntem olup, bir hücrede hücre iskeleti proteinlerin dinamikleri sunulmuştur. Aktin bağlayıcı protein, Aip1p, GFP ile etiketlendi. Etiketli ürününü kodlayan plazmidin için tasarım, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Plazmit daha sonra, maya hücreleri içine transforme edildi. Floresan ekspresyonu Aip1p hücrede protein davranış gözlenmesine imkan etiketli. Aip1p tipik endositozun 22 sahalarında aktin yamalar lokalize. Şekil 2A'da gösterildiği gibi, Aip1p hareketini ölçmek için, 50'den floresan Aip1p odak fazla 10 hücrelerinde takip edilmiştir. Ortalama hız her floresan Aip1p alanda (Şekil 2B) için hesaplanmıştır. Vahşi tip hücrelerde, Aip1p hareketler bir hücre arasında değişir, ve sonra kaybolur. Vahşi tip hücrelerde Aip1p hareketinin ortalama hızı / sn 1.60 ± 0.42 mm. Aktin cy anormal bir morfolojiye sahip olduğu bilinen R256H mutant aktin ifade eden hücreler23 toskeleton, bir değiştirilmiş Aip1p fenotipe sahiptir. Mutant suşu içinde, Aip1p hareket sınırlı ve daha yavaştır. Aip1p hareketinin ortalama hızı 0.88 ± 0.30 mm / sn (p <0.005) olduğunu. Aip1p göç odak birbirlerinin etrafında dönen yerine geçen hücreyi ile hemen alanına sınırlıdır. Buna ek olarak, Aip1p Aip1 protein yavaş ciro düşündüren uzun görünür.
Plasmid yapı Şekil 1.. Diyagramı. A) PCR yoluyla amplifiye Aip1 fragmanı restriksiyon enzimleri (sarı cıvataları). B) plasmid, PB1996, kısıtlama enzimleri ile sindirilmiş olan gösterilmiştir Abp140 genini çıkarmak için enzimler. C) ile sindirilmiş Aip1 ve PB1996 fragmanları t ligate ediliro) plazmid PB1996 Aip1. D formu PB1996 Aip1 linearize plazmid DNA ile kromozoma entegre edilmiş maya hücreleri içine transforme edilir.
Mutant maya suşu aktin inşaat Şekil 2.. Diyagramı. Mutant aktin izoformunu kodlayan plazmid, bundan sonra, bir dönüştürülmüş hücre hattı ve medya eksik triptofan büyümeye yeteneğine göre seçilir. Yeşil çizgiler kromozomal DNA gösterir. Siyah bir daire, bir plazmiddir. Daire kahverengi bir maya hücreyi temsil eder. Kutular, her biri belirli bir gen gösterir: sarı aktin olup, turuncu kahverengi bir urasil, lösin, triptofan ve pembe bir. Kutusunun üzerine X geni, kromozom DNA'sından silindi gösterir. Adımda 2.3 ve 2.4, aktin geni i üzerinde siyah yıldızR256H mutasyonu ndicates.
Şekil 3,. Canlı maya hücrelerinde GFP-etiketli Aip1p ifade eden vahşi tip ve R256H hücre. A) Görüntüler Aip1p-GFP hareket gösterilir. Hücreler ilk log fazı büyümesinde ve görüntüler 15 saniye boyunca her 0.2 saniye elde edildi. Oklar mutant suşlar aktin için yabani tip ve kırmızı mavi zamanla bireysel floresan odak konumunu göstermektedir. Son kare yeşil bir çizgi olarak Aip1 odaklarının yolunu gösterir. Gösterilen Ölçek çubuğu Aip1p hareket hızı ImageJ kullanılarak ölçülmüştür 5 um. B) 'dir. Dağılım çizim grafik bireysel floresan odaklar için hızını gösterir. Yatay çubuk vahşi tip (mavi) ve mutant (kırmızı) suşları, aktin için ortalama hız gösterir.Aip1p 0.88 ile karşılaştırıldığında, yabani tip hücrelerde 1.60 ± 0.42 mm / saniye hızında hareket eder ± 0.30 R256H mutant aktin (p <0.005) sentezleyen hücreler için mikron / saniye.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Patojenik mutasyonlara araştırmalarda iskeleti ve yarar dinamiklerini görselleştirmek için etkili bir strateji burada tarif edilmiştir. Gelişmiş görüntüleme yöntemleri, hücre zarı yakın proteinlerin hücre içi hareketini anlamak için yeni fırsatlar yaratmıştır. Toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRF) canlı hücrelerin fonksiyonel çalışmalar için hassas bir tekniktir. TIRF lamel ve sulu ortamın kırılma indeksleri arasındaki fark nedeniyle genliği azalan bir alan yaratan bir açılı bir uyarım lazer kullanır. Fani alanın enerji florofor uyarır, ancak lamel ve su arasındaki ara mesafe ile katlanarak azalır. Bu gürültü oranı ile lamel / orta arayüzü üzerinde 50-250 nm güçlü çözünürlüğü yüksek bir sinyal ile sonuçlanır. Bu nitelikler TIRF mikroskopisi az yaşayan hücrelerde tek molekül düzeyinde sitoskeletal proteinleri görselleştirmek için güçlü bir araç yapmakfototoksisitenin ve diğer tekniklerin 24 kontrastlı göreli - 26.
Sitoskeleton hücresel ihtiyaçlarına adapte konser çalışan çok sayıda proteinleri içerir. Cofilin tarafından düzenlenmesi üzerine aktin mutasyonlara yol açan vasküler-hastalığın etkisi son zamanlarda bizim grup 27 tarafından incelenmiştir. Bizim ilk bulgulara göre, Aip1p, cofilin bağımlı aktin kopardıklarını kolaylaştıran bağlayıcı protein aktin, araştırılmıştır. Ön çalışmalarda, aktin mutasyon R256H, özellikle stres şartları altında, Aip1p yokluğunda zayıf ifade eden hücreler büyür. Bu mutant aktin hücre iskeletinin Aip1p düzenleme değiştirilmiş olduğunu göstermektedir. Floresan etiketleme ve TIRF mikroskopi kullanılarak R256H suşunda hareket ve Aip1p lokalizasyonu Analizimize anormal dinamikleri doğrular. Gelecekte, birden proteinlerin hareketini görselleştirmek için farklı flüoroforlar böyle cofilin gibi ek proteinler, etiketlemek için planıprotein etkileşimleri: Aynı anda daha iyi protein anlamak için.
Bir floresan etiketli protein üreten bazı sınırlamalar ve teknik mümkün olmayan bazı durumlar vardır. Bir floresan etiket proteinin aktivitesini bozacak ya da bağlayıcı ortaklarıyla etkileşimini değiştirebilir. Bu başka bir aktin bağlayıcı protein, cofilin etiketlemek için girişimlerde karşılaşılan olmuştur. Etiketli yapının ekspresyonu kesintiye cofilin işlevi nedeniyle haploid maya başarısız olmuştur. Cofilin maya önemli bir proteindir. Böylece, eşlik eden yeniden giriş olmadan cofilin silinmesi öldürücü; bir plazmid üzerinde sonraki giriş engelleme. Bu sınırlama önlemek için bir yolu diploit maya kullanmaktır. Cofilin genin bir kopyasının bir etiketli versiyonu Eksojen bir plazmid üzerinde tanıtıldı, dışarı çaldı ve genomik cofilin eksikliği ancak floresan proteini etiketlemek için yeteneği oldu plazmid 22 içeren kızı hücreler daha sonra seçim olduDaha önce bu protein-protein etkileşimleri üzerinde çok az etkisi olduğu gösterilmiştir proteinin iç kalıntısı elde etmek, etiket ekleyerek kazandı. Protein etkileşimleri: N-ya da C-terminal bölgeleri ilgili proteinin etkilediği bilinmektedir sürece etiketi eklemek tercih siteleri bulunmaktadır. Bu fonksiyonel bir protein vermezse, diğer ucu ya da iç artıkları teşebbüs olabilir.
Anlatılan teknikleri uygulayarak birkaç önemli adım vardır. Bir işlevini koruyan proteini etiketlemek için uygun bir konum belirliyor. Sağlam kontrolleri protein işlevi korunmuş olduğunu doğrulamak için dahil edilmelidir. İkincisi, slayt hücreler görüntüleme sırasında kurumak yok sağlamak için izlenmesi gerekir. Wax gerekirse su kaybını önlemek için kapak kayma kenarlarında kullanılabilir. Başarı sağlamak için bu adımlar plazma zarı yakın görüntü yapılara bu yaklaşım uysal ve avantajlı basit yapım vardır. Adugit yeteneğicanlı hücrelerde ntify protein yerelleştirme ve hareket hücresel fonksiyonları anlayış geliştirebilir. Sitoskeletal proteinleri etkileyen mutasyonların tespit edilir gibi, Floresan ifadesi etiketli proteinlerin ve TIRF mikroskopi patofizyolojisi altta yatan insan hastalığını araştırmak için yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar orijinal PB1996 klon için yararlı bir tartışma ve teknik danışmanlık için Peter Rubenstein ve David Pellman teşekkür ederim. Bu çalışma Dimes Mart hibe ve Çocuklar için Ride fon tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | rpi | 9012-36-6 | |
| Bromophenol Blue | Amresco | 115-39-9 | |
| BSA | NEB | B9001S | |
| Change-IT Multiple Mutation Site Directed Mutagenesis Kit | USB Corporation | 4166059 | |
| CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
| DNA, single stranded from salmon testes | Sigma | 9007-49-2 | |
| EDTA pH 7.4 | Sigma | 93302 | |
| Ethidium bromide | Invitrogen | 15585-011 | Warning! Harmful irritation |
| Fungal/Bacterial DNA Kit | Symo Research | D6005 | |
| HpaI | NEB | R0105S | |
| Lithium acetate | AlfaAesar | 6108-17-4 | |
| Low DNA Mass Ladder | Invitrogen | 10068-013 | |
| NE Buffer #4 | NEB | B7004S | |
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | Invitrogen | 12532-016 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | Any kit will work |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
| Sodium azide | Sigma | 26628-22-8 | |
| PBS | Invitrogen | 10010-023 | |
| PEG | Amresco | 25322-68-3 | |
| Tris Base Ultrapure | rpi | 77-86-1 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | 1/6/2015 | |
| XhoI | NEB | R0146S | |
| XmaI | NEB | R0180S | |
| YPD media | LabExpress | 3011 | |
| -URA Media | LabExpress | 3010 | |
| PCR Machine | Invitrogen | 4359659 | Any PCR machine will work |
| TIRF Microscope | Olympus IX81 | ||
| Hamamatsu ORCA-R camera | Hamamatsu |
References
- Lehtonen, H. J., et al. Segregation of a missense variant in enteric smooth muscle actin gamma-2 with autosomal dominant familial visceral myopathy. Gastroenterology. 143, e1483 1482-1491 (2012).
- Matsson, H., et al. Alpha-cardiac actin mutations produce atrial septal defects. Hum Mol Genet. 17, 256-265 (2008).
- Zhu, M., et al. Mutations in the gamma-actin gene (ACTG1) are associated with dominant progressive deafness (DFNA20/26). Am J Hum Genet. 73, 1082-1091 (2003).
- Nowak, K. J., et al. Mutations in the skeletal muscle alpha-actin gene in patients with actin myopathy and nemaline myopathy. Nat Genet. 23, 208-212 (1999).
- Olson, T. M., Michels, V. V., Thibodeau, S. N., Tai, Y. S., Keating, M. T. Actin mutations in dilated cardiomyopathy, a heritable form of heart failure. Science. 280, 750-752 (1998).
- Riviere, J. B., et al. De novo mutations in the actin genes ACTB and ACTG1 cause Baraitser-Winter syndrome. Nat Genet. 44, S441-442 440-444 (2012).
- Guo, D. C., et al. Mutations in smooth muscle alpha-actin (ACTA2) lead to thoracic aortic aneurysms and dissections. Nat Genet. 39, 1488-1493 (2007).
- Sparrow, J. C., et al. Muscle disease caused by mutations in the skeletal muscle alpha-actin gene (ACTA1). Neuromuscul Disord. 13, 519-531 (2003).
- Kruth, K. A., Rubenstein, P. A. Two deafness-causing (DFNA20/26) actin mutations affect Arp2/3-dependent actin regulation. J Biol Chem. 287, 27217-27226 (2012).
- Amberg, D. C. Three-dimensional imaging of the yeast actin cytoskeleton through the budding cell cycle. Mol Biol Cell. 9, 3259-3262 (1998).
- Pelham, R. J., Chang, F. Role of actin polymerization and actin cables in actin-patch movement in Schizosaccharomyces pombe. Nat Cell Biol. 3, 235-244 (2001).
- Vavylonis, D., Wu, J. Q., Hao, S., O'Shaughnessy, B., Pollard, T. D. Assembly mechanism of the contractile ring for cytokinesis by fission yeast. Science. 319, 97-100 (2008).
- Bertin, A., et al. Three-dimensional ultrastructure of the septin filament network in Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 23, 423-432 (2012).
- Senning, E. N., Marcus, A. H. Actin polymerization driven mitochondrial transport in mating S. cerevisiae. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 107, 721-725 (2010).
- Breitsprecher, D., Kiesewetter, A. K., Linkner, J., Faix, J. Analysis of actin assembly by in vitro TIRF microscopy. Methods Mol Biol. 571, 401-415 (2009).
- Popp, D., Narita, A., Iwasa, M., Maeda, Y., Robinson, R. C. Molecular mechanism of bundle formation by the bacterial actin ParM. Biochem Biophys Res Commun. 391, 1598-1603 (2010).
- Trache, A., Lim, S. M. Live cell response to mechanical stimulation studied by integrated optical and atomic force microscopy. J Vis Exp. (44), (2010).
- Spira, F., Dominguez-Escobar, J., Muller, N., Wedlich-Soldner, R. Visualization of cortex organization and dynamics in microorganisms, using total internal reflection fluorescence microscopy. J Vis Exp. (63), e3982 (2012).
- Manneville, J. B. Use of TIRF microscopy to visualize actin and microtubules in migrating cells. Methods Enzymol. 406, 520-532 (2006).
- Cook, R. K., Sheff, D. R., Rubenstein, P. A. Unusual metabolism of the yeast actin amino terminus. J Biol Chem. 266, 16825-16833 (1991).
- Feng, L., et al. Fluorescence probing of yeast actin subdomain 3/4 hydrophobic loop 262-274. Actin-actin and actin-myosin interactions in actin filaments. J Biol Chem. 272, 16829-16837 (1997).
- Lin, M. C., Galletta, B. J., Sept, D., Cooper, J. A. Overlapping and distinct functions for cofilin, coronin and Aip1 in actin dynamics in vivo. J Cell Sci. 123, 1329-1342 (2010).
- Malloy, L. E., et al. Thoracic Aortic Aneurysm (TAAD)-causing Mutation in Actin Affects Formin Regulation of Polymerization. J Biol Chem. 287, 28398-28408 (2012).
- Smyth, J. W., Shaw, R. M. Visualizing ion channel dynamics at the plasma membrane. Heart Rhythm. 5, S7-S11 (2008).
- Bhattacharya, R., et al. Recruitment of vimentin to the cell surface by beta3 integrin and plectin mediates adhesion strength. J Cell Sci. 122, 1390-1400 (2009).
- Hetheridge, C., et al. The formin FMNL3 is a cytoskeletal regulator of angiogenesis. J Cell Sci. 125, 1420-1428 (2012).
- Bergeron, S. E., et al. Allele-specific effects of thoracic aortic aneurysm and dissection alpha-smooth muscle actin mutations on actin function. J Biol Chem. 286, 11356-11369 (2011).
