Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

اكتشاف بروتين تفاعلات البروتين وتميز وظيفة عن طريق HaloTag تكنولوجيا

Published: July 12, 2014 doi: 10.3791/51553
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 2, 2, 2, 1
1Promega Corporation, 2MS Bioworks LLC

Summary

التكنولوجيا HaloTag هي تقنية متعددة الوظائف التي أظهرت نجاحا كبيرا في عزل المجمعات البروتين كل صغيرة وكبيرة من خلايا الثدييات. نحن هنا تسليط الضوء على مزايا هذه التكنولوجيا مقارنة بالبدائل القائمة وتثبت فائدتها لدراسة جوانب عديدة من وظيفة البروتين داخل الخلايا حقيقية النواة.

Abstract

وقد انفجرت البحث في البروتيوميات في السنوات الأخيرة مع التقدم في قدرات مطياف الكتلة التي أدت إلى توصيف العديد من proteomes، بما في ذلك تلك من الفيروسات والبكتيريا والخميرة. في المقارنة، وتحليل بروتيوم الإنسان متخلفة، ويرجع ذلك جزئيا إلى العدد الكبير من البروتينات التي يجب دراستها، ولكن أيضا مدى تعقيد شبكات والتفاعلات هذه الحاضر. للتصدي على وجه التحديد تحديات فهم بروتيوم الإنسان، وقد وضعنا التكنولوجيا HaloTag للبروتين العزلة، قوية بشكل خاص لعزل المجمعات multiprotein والسماح التقاط أكثر كفاءة من التفاعلات و / أو البروتينات ضعيفة أو عابرة في وفرة منخفضة. HaloTag هو المشفرة وراثيا علامة انصهار بروتين، والمصممة لالتساهمية، محددة، والشلل السريع أو وضع العلامات البروتينات مع مختلف بروابط. الاستفادة من هذه الخصائص، وقد وضعت العديد من التطبيقات لخلايا الثدييات إلى الطابعإيزي ظيفة البروتين وهنا نقدم المنهجيات بما في ذلك: البروتين سحب هبوطا تستخدم لاكتشاف التفاعلات رواية أو المقايسات الفنية، وتوطين الخلوية. نجد مزايا كبيرة في سرعة، والنوعية، والتقاط التساهمية من البروتينات الانصهار إلى السطوح لتحليل البروتين بالمقارنة مع الأساليب التقليدية الأخرى غير التساهمية. ونحن لشرح هذه الأداة المساعدة واسعة من التكنولوجيا باستخدام اثنين من البروتينات جينية مهمة كأمثلة، البروتين bromodomain الإنسان BRD4، وdeacetylase هيستون HDAC1. هذه الأمثلة تبرهن على قوة هذه التكنولوجيا في تمكين اكتشاف التفاعلات التي تميز الرواية وتوطين الخلوية في حقيقيات النوى، والتي سوف تزيد معا فهم البروتينات وظيفية الإنسان.

Introduction

وتعادل معقد فهم وظيفة الخلوية، والاستجابة للمؤثرات، والتغيرات في الدول تطوير و / أو المرض للتخلص من الإلتواء من بروتيوم طوال هذه الدول ديناميكية مختلفة 1،2. وقد تم فعل الكثير لفهم بروتيوم من الكائنات أقل، ومع ذلك، وبالنظر إلى عدد من البروتينات وجميع التفاعلات الممكنة، وقد كان هذا تحديا كبيرا في التصدي للبروتيوم الإنسان 1،3-7. التقدم في مطياف الكتلة قد مكنت كثيرا من القدرة على إجراء هذه الدراسات، وهنا نقدم على النهوض إضافية وهامة مع تطور التكنولوجيا HaloTag لكلا القبض على كفاءة من المجمعات البروتين وتوصيف وظيفي للبروتينات بشرية من خلايا الثدييات 8-10. وقد تم مؤخرا أظهرت هذه التكنولوجيا في العديد من الدراسات أن يكون عاملا حاسما لاكتشاف التفاعلات الهامة، والسماح لنظرة ثاقبة وظيفة البروتين الرواية وunderstandiنانوغرام من المرض 11-13.

وقد وضعت البروتين الانصهار HaloTag في البداية لمعالجة العديد من التحديات من الأكواد تقارب التقليدية والأجسام المضادة وعلاقتها التقاط البروتين، وتنقية، ووضع العلامات 8-10. في ما يقرب من جميع طرق لالتقاط البروتين وتنقية، وهناك خطوة التفاعل غير التساهمية التي تستخدم لتخصيب خاصة بروتين 14. خلال هذه الخطوة، يمكن للبروتين و / أو معقدة تنأى بسبب نشرها، خصوصا إذا كانت العملية تتطلب ساعات بدلا من دقائق لإكمال. لمعالجة هذا القلق، تم تصميم هذا البروتين الانصهار خصيصا للتفاعل بسرعة وبشكل لا رجعة فيه مع بروابط، والتي يمكن أن تكون إما الجزيئات، السطوح، أو fluorophores 9. ولمرة واحدة كان من المحتم أن يجند لها، إلا أنها تبقى ملزمة، والتي هي واحدة من أكثر العوامل التفريق بالمقارنة مع العلامات الأخرى تقارب. أظهرت أيضا هنا، هو القدرةلمعالجة المسائل البيولوجية المختلفة مع بناء واحد، وهو أمر ممكن بالتناوب بروابط 9 (الشكل 1). على سبيل المثال، لاستجواب تفاعلات البروتين أو وظيفة، وتستخدم بروابط السطح للقبض على البروتين أو المجمعات (الشكل 1). في تجربة منفصلة، ​​وهو نفس البروتين الانصهار يمكن fluorescently المسمى لدراسة توطين الخلوية، والاتجار، أو دوران البروتين (الشكل 1). من المهم أن نتذكر أنه بمجرد ولكن لا بد ليجند، سواء كان على سطح أو fluorophore، فإنه لا رجعة فيه، وبالتالي بروابط أخرى لا يمكن أن تكون ملزمة ثم في وقت لاحق في نفس التجربة.

تحليل التكنولوجيات القائمة لرسم خريطة التفاعلات البروتين تكشف عن صعوبة لعزل بكفاءة تفاعلات محددة، بما في ذلك تلك التي هي أكثر عابرة أو هي في انخفاض فرة 1،6،7،14،15. أيضا، والعمل مؤخرا من قبل العديد من مجموعةو يظهر القلق أنه في غضون أساليب العزلة التقليدية، وخاصة في مجال تحليل البروتينات البشرية، وهناك عدد كبير من الملوثات البروتين الذي قد يخفي إشارات من interactors صحيحا في تحليل الطيف الكتلي 16. الخصائص المتقدمة للبروتين HaloTag وعنوانه شارك في تطوير الراتنج جيدا هذه المخاوف. لا يمكن أن يتحقق في بروتوكول لpulldowns معقدة (الشكل 1)، ملزم المجمعات في 15 دقيقة، كل من تعزيز القبض المعقدة والحد من مستويات ملزم غير محددة 8. بالإضافة إلى ذلك، ملزم لا رجعة فيه يسمح لالتقاط كفاءة من البروتينات وفرة منخفضة ويسمح لاستخدام عدد أقل بكثير من الخلايا، ومرة أخرى تخفيض خلفية 8. مرة واحدة يتم تأسيس القبض على المجمعات، ويشمل البروتوكول الظروف غسل خفيفة للحفاظ على سلامة المعقدة. شطف من المجمعات استولت يمكن القيام بها من قبل اثنين من الأساليب واختيار أي تمليه الأسلوب هدف الشرج المصبysis. إذا كانت هناك رغبة في تحليل أو اكتشاف البروتينات التفاعل من قبل لطخة غربية أو مطياف الكتلة، ثم فمن المستحسن أن أزل المجمعات مع denaturants مثل SDS أو اليوريا (الشكل 1). هذا أمر مفيد لقياس الطيف الكتلي مثل البروتين تنصهر في الأصل لHaloTag، ووصف البروتين الطعم، سيظل وراء منضمة إلى الراتنج وبالتالي لن تهيمن على السكان من الببتيدات الكشف في مطياف الكتلة. وهذا يعني أيضا أن البروتين ولكن الطعم من المحتمل أن لا تكون واضحة في تحليل لطخة غربية، أي بفارق كبير بالمقارنة مع غيرها من التنقيات تقارب غير التساهمية أو زملاء immunoprecipitations. إذا كان الهدف هو لتنقية مجمع سليمة لاستخدامها في الدراسات وظيفية، شطف يمكن القيام بها باستخدام TEV (التبغ إحفر الفيروسات) البروتيني، الذي يعترف به تسلسل الانقسام وما شابه ذلك المشفرة بين انصهار بروتين والبروتين الطعم (الشكل 1). Tويمكن أيضا أن يتم تحليل العينات ذات المناظر بواسطة مطياف الكتلة، ولكن كما هو موضح في وقت لاحق، وسوف تحتوي على كمية كبيرة من البروتين الطعم التي قد تحول دون الكشف عن وفرة أقل، interactors محددة.

هنا نقدم المنسدلة والتصوير بروتوكولات تطبيقها على اثنين من البروتينات العلاجية الهامة، البروتين bromodomain BRD4 وdeacetylase هيستون، HDAC1 17. أظهرنا مع هذه الأمثلة، والتفاعل مع الشركاء المتوقع على النحو الذي يحدده قياس الطيف الكتلي، النشاط الأنزيمي بعد العزلة معقدة لHDAC1، وتوطين الخلوية المناسبة لكليهما. معا، وهذه النتائج تدل على طبيعة متعددة الوظائف وقوة التكنولوجيا لتوصيف التفاعلات البروتين وحيد الخلية ووظيفتها.

Protocol

ملاحظة: بروتوكول التالية يمكن استخدامها مع أي الانصهار HaloTag وعلى أي خط الخلية الاختيار ستابلي أو عابر. لهذه الأمثلة، وسنقدم بروتوكولات لترنسفكأيشن عابرة للاندماج HaloTag في الخلايا HEK293T أو هيلا. لجميع التجارب، ونحن نوصي استخدام عنصر التحكم البروتين فقط.

1. فيوجن التعبير البروتين اختبار

  1. الحصول على البروتين الانصهار بناء:
    1. الحصول مسبقة الصنع HaloTag الانصهار ناقلات أو إنشاء باستخدام ناقلات القائم. لمزيد من المعلومات حول ثوابت المتاحة، يرجى الاطلاع جدول الكواشف محددة.
    2. إذا جعل أي استنساخ، فمن المستحسن أن تسلسل التحقق من الحمض النووي.
  2. اختبار تعبير عن انصهار بروتين والسيطرة:
    1. لكل عينة، وإعداد 250 ميكرولتر من 1X SDS صبغ تحميل العازلة (60 ملي تريس pH6.8 HCL، برموفينول 0.75 ملي الأزرق، 12.5٪ الجلسرين، و 100 ملي dithiothreitol، 0.5٪ SDS).
    2. لكل انصهار بروتينوتحكم، لوحة 0.5 مل من HEK293T أو خلايا هيلا في وسائل الإعلام على النحو المناسب في مناطق ذات كثافة من 2-4 × 10 5 خلية / مل في معيار 24 لوحة جيدا.
    3. احتضان لمدة 18-24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2، ثم بالنقل النحو الموصى به.
    4. 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن، إضافة 0.5 ميكرولتر من 5MM رباعي الميثيل رودامين (TMR) يجند إلى وسائل الإعلام من كل بئر وتخلط بلطف لوحة.
    5. احتضان الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل تحتوي يجند لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
    6. نضح قبالة سائل الإعلام التي تحتوي يجند وغسل كل بئر من الخلايا برفق مع 1 مل PBS RT.
    7. نضح قبالة PBS وإجراء غسيل الثانية مع 1 مل PBS RT.
    8. إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 200 ميكرولتر من 1X العازلة SDS تحميل الصبغة مباشرة إلى الخلايا.
    9. ماصة المحللة من لوحة إلى 1.5 مل أنبوب إيبندورف.
    10. يغلي لمدة 5 دقائق المحللة في 95 درجة مئوية.
    11. إزالة 5-10 ميكرولتر من رد الفعل والحمل على هلام SDS-PAGE.
    12. استخدام الماسح الضوئي الكشف الفلورسنت(TMR الإثارة: 555 نانومتر، الانبعاث: 585 نانومتر) لكشف العصابات. استخدام علامات بروتين فلوري عن المعايير.
    13. إذا كان الماسح الضوئي الكشف الفلوري غير متوفر، أداء البقع الغربية باستخدام أجسام مضادة ضد بروتين إما الطعم أو انصهار بروتين علامة للكشف عن التعبير عن بروتين الانصهار.

2. Pulldowns البروتين

  1. إعداد الخلايا عابر:
    1. لكل الانصهار أو السيطرة إعداد واحد 15 سم الطبق مع 30 مل من الخلايا في 3-4 × 10 5 خلية / مل أو 1-1.2 × 10 7 خلايا الإجمالية لكل بناء.
    2. احتضان لمدة 18-24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2، ثم بالنقل بناء على النحو الموصى به.
    3. بعد 24-48 ساعة بعد ترنسفكأيشن، وإزالة وسائل الإعلام وغسل بلطف طبقة الخلايا مع 20-25 مل من برنامج تلفزيوني الباردة الجليد.
    4. إزالة برنامج تلفزيوني يغسل، ثم يضاف 25-30 مل من 4 ° C برود برنامج تلفزيوني وكشط بلطف خلايا قبالة لوحة.
    5. جمع الخلايا في أنابيب مخروطية وcentriFUGE لمدة 5-10 دقيقة في 2،000 x ج و 4 درجة مئوية.
    6. تجاهل طاف ووضع بيليه خلية في -80 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 30 دقيقة أو مدة أقصاها 6 أشهر.
  2. موازنة من الراتنج HaloLink:
    1. لكل الانصهار أو السيطرة العينة، وإعداد 12 مل من الراتنج موازنة / غسل العازلة (100 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.5، 150 مم كلوريد الصوديوم، و 0.005٪ IGEPAL CA-630) ملاحظة: من المهم جدا لجعل واستخدام الراتنج موازنة العازلة في غضون 12 ساعة كما المخفف IGEPAL CA-630 ليست مستقرة أو فعالة خارج هذا الإطار الزمني.
    2. بلطف يهز أو مزيج الراتنج للحصول على تعليق موحدة.
    3. لكل تجربة المنسدلة، الاستغناء 200 ميكرولتر من الراتنج إلى 1.5 مل أنابيب microcentrifuge.
    4. أجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 800 x ج (على سبيل المثال، 3،000 دورة في الدقيقة في microcentrifuge)، ثم إزالة بعناية وتجاهل طاف (الإيثانول) من دون إزعاج الراتنج في الجزء السفلي من الأنبوب.
    5. إضافة 800 ميكرولتر من الراتنج موازنة / واش العازلة ومزيج دقيق من قبل قلب الأنبوب عدة مرات.
    6. أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 800 x ج، ثم إزالة بعناية وتجاهل طاف.
    7. كرر الخطوات 2.2.5 2.2.6 ومرتين أخريين ليصبح المجموع 3 يغسل.
    8. لا تقم بإزالة غسل النهائي أو حتى طاف على استعداد لإضافة لست] الخلوية هو موضح أدناه (الخطوة 2.3.8) لمنع الراتنج من الجفاف.
  3. ملزمة وغسل المجمعات الانصهار:
    1. لكل عينة، وإعداد 500 ميكرولتر من الاحتياطي تحلل الثدييات (50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.5، 150 مم كلوريد الصوديوم، 1٪ تريتون X-100، 0.1٪ نا Deoxycholate) و 1 مل من 1X العازلة TBS (100 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.5 و 150 ملي مول كلوريد الصوديوم).
    2. ذوبان الجليد الكريات الخلايا و resuspend في 300 ميكرولتر من الثدييات الاحتياطي تحلل من قبل pipetting صعودا وهبوطا أو لفترة وجيزة vortexing ل.
    3. إضافة 6 ميكرولتر من 50X البروتياز كوكتيل المانع (800 ميكروغرام / مل benzamidine حمض الهيدروكلوريك، و 500 ميكروغرام / مل phenanthroline، 500 ميكروغرام / مل أبروتينين، 500 ميكروغرام / مل leupeptin، 500 & #181؛ ز / مل pepstatin A، 50MM PMSF) ملاحظة: الكوكتيلات البروتياز التي تشمل AEBSF لا يمكن أن تستخدم هذه تتداخل مع بروتين الانصهار علامة ملزمة.
    4. إضافة 3 ميكرولتر الدناز RQ1 وعكس لمدة 10 دقيقة في RT.
    5. Dounce مع الزجاج الخالط 2.0 مل حجم؛ 25-30 السكتات الدماغية على الجليد، أو تمرير الخلايا خلال 25 أو 27 إبرة G 5-10 مرات لاستكمال تحلل ملاحظة: لا ينصح صوتنة كما المجمعات قد ينهار والإفراط في التدفئة قد تؤثر على النشاط علامة البروتين الانصهار.
    6. أجهزة الطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية لمسح المحللة.
    7. نقل المحللة واضحة، ما يقرب من 300 الحجم الإجمالي ميكرولتر، إلى أنبوب جديد ومكان على الجليد.
    8. إضافة لمسح المحللة في 700 ميكرولتر من العازلة إضافية 1X TBS ومزيج جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا.
    9. تأخذ أنابيب الراتنج معايرتها أعدت في الخطوة 2.2.8 وإزالة النهائي غسل / طاف من دون إزعاج الراتنج الراتنج في الجزء السفلي من الأنبوب.
    10. إضافة إلى كل تويكون من الراتنج، و1 مل من المحللة المخفف.
    11. احتضان مع الخلط على محور دوار أنبوب (أو خلاط لطيف) لمدة 15 دقيقة في 22 درجة مئوية. ملاحظة: توطين من الراتنج خلال هذا الوقت يقلل من كفاءة ملزمة. إذا ملزمة في 4 درجات مئوية هو المطلوب، أن تفعل ذلك عن طريق خلط لمدة 1 ساعة.
    12. أنابيب الطرد المركزي الراتنج لمدة 2 دقيقة في 800 XG وتجاهل طاف.
    13. إضافة 1 مل من الراتنج موازنة / غسل العازلة التي قدمت في الخطوة 2.2.1 ومزيج دقيق من قبل قلب الأنبوب الراتنج باليد عدة مرات.
    14. أنابيب الطرد المركزي الراتنج لمدة 2 دقيقة في 800 XG وتجاهل غسيل.
    15. كرر الخطوات 2.3.12 2.3.14 تليها ثلاث مرات إضافية.
    16. إضافة 1 مل من الراتنج موازنة / غسل العازلة واحتضان عند 22 درجة مئوية لمدة 5 دقائق مع دوران مستمر.
    17. أنابيب الطرد المركزي الراتنج لمدة 2 دقيقة في 800 XG وتجاهل غسيل.
    18. تبعا التطبيق نهاية (انظر مقدمة لمزيد من التوضيح)، انتقل إلى القسم إما 2.4 أو 2.5.
  4. SDS شطف لتغيير طبيعة المواد الهلامية، والبقع الغربي، أو قياس الطيف الكتلي:
    1. resuspend والراتنج من كل عينة في 50 ميكرولتر العازلة SDS شطف (1٪ SDS و 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك pH7.5)
    2. يهز أنابيب في RT لمدة 30 دقيقة.
    3. أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 800 x ج ونقل eluates لأنابيب جديدة للتحليل.
    4. لطخة غربية أو هلام الفضة وصمة عار، تحميل 5-10 ميكرولتر على تغيير طبيعة هلام SDS.
    5. لمطياف الكتلة، حفظ 40 ميكرولتر من كل عينة في -20 درجة مئوية.
  5. TEV البروتياز شطف لفحوصات وظيفية، البقع الغربية، أو قياس الطيف الكتلي:
    1. بعد إزالة غسل الماضي، resuspend والراتنج في 50 ميكرولتر العازلة ProTEV الانقسام و 30 وحدة من TEV الانزيم.
    2. احتضان عند 25 درجة مئوية مع الهز لمدة 1 ساعة.
    3. أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 800 × ز.
    4. نقل شطافة لأنابيب جديدة.
    5. عينة تخزينها في 4 درجة مئوية لاستخدامها الفوري في المقايسات الفنية.

3.التصوير الخلوية من Fluorescently صفتها البروتينات الانصهار باستخدام السيتوبلازم والنووية نافذ يجند

  1. بالنقل، والتسمية، وخلايا الصورة:
    1. في 8 ساترة غرف جيدا لكل البروتين الانصهار أو سيطرتها، لوحة 400 ميكرولتر من خلايا هيلا في وسائل الإعلام المناسبة في كل بئر في مناطق ذات كثافة من 1-2 × 10 5 خلية / مل.
    2. احتضان لمدة 18-24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2، ثم بالنقل النحو الموصى به.
    3. 18-24 ساعة بعد ترنسفكأيشن، وتمييع 1:200 TMR يجند في وسائل الإعلام الخلوية المناسبة، ثم إضافة 100 ميكرولتر من هذا الحل إلى كل بئر وبلطف المزيج.
    4. احتضان الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل تحتوي يجند لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
    5. نضح قبالة سائل الإعلام التي تحتوي يجند واستبدالها مع 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام المناسبة التي تفتقر إلى البروتين الانصهار علامة يجند، الذي تم قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية.
    6. كرر مرتين ليصبح المجموع ثلاثة يغسل.
    7. وضع الخلايا مرة أخرى في حاضنة (376؛ مئوية و 5٪ CO 2) لمدة 30 دقيقة.
    8. نضح قبالة الإعلام واستبدالها مع 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام المناسبة، والتي تم قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية.
    9. الصورة على المجهر باستخدام المعلمات اقتناء المناسب (TMR الإثارة: 555 نانومتر، الانبعاث: 585 نانومتر).

Representative Results

عند العمل مع أي انصهار بروتين الجديدة، من المهم أن الاختبار الأول للتعبير عن أن بروتين بعد ترنسفكأيشن والتحقق من أن البروتين من الوزن الجزيئي المناسبة يتم إنتاجها أيضا. كما HaloTag البروتينات الانصهار fluorescently يمكن أن يكون وصفت تساهميا مع، بروابط كتيمة قابلة للاختراق أو تبعا التعريب، فمن الممكن لتحديد التعبير بسرعة من خلال تطبيق لست] الخلوية لتغيير طبيعة الكهربائي هلام تليها المسح على fluorimager. باستخدام بروتوكول موضح في القسم 1.2، التعبير عن هالو-BRD4 (189 دينار كويتي) وHaloTag وحده التحكم (السيطرة) ويلاحظ (34 دينار كويتي، الشكل 2A). كما ورد في البروتوكول، ويمكن أيضا أن يتم الكشف عن التعبير عن البروتينات الانصهار باستخدام البقع الغربية التقليدية مع الأجسام المضادة للHaloTag، أو إذا كانت متاحة، والأجسام المضادة للبروتين الطعم. إذا كان ذلك ممكنا، فمن المستحسن استخدام يجند الفلورسنت بدلا كما هو أكثر تحديدا وأسرع وأسهل رهان الكشف عن الأجسام المضادة، وكذلك كمية 10.

بعد أن يتم التحقق من التعبير السليم كامل طول البروتين الانصهار، pulldowns البروتين يمكن أن يؤديها. هو مبين في الشكل 2B هي الفضة الهلام الملون من مكررات البيولوجية من هالو-BRD4 والسيطرة pulldowns مزال بواسطة SDS (القسم بروتوكول 2.4) والتي تثبت استنساخ عالية. تظهر المواد الهلامية وصمة عار الفضة يتم العثور على عدد كبير من البروتينات للتفاعل مع البروتين ومنخفضة جدا BRD4 الخلفية في السيطرة (الشكل 2B). كما ذكر في المقدمة، في هذه العملية من شطف، لن يتم مزال هالو-BRD4 من الراتنج أنها لا تزال ملزمة تساهميا. وبالتالي، ليس هناك عصابة كبيرة في هذا الوزن الجزيئي يجري الكشف عنها في وصمة عار الفضة (الشكل 2B) أو لطخة غربية (لا تظهر البيانات). لتحديد ما إذا كانت هذه البروتينات هي محددة لBRD4، تم إجراء قياس الطيف اللوني السائل الشامل (LC-MS/MS) على جخليط omplex تم الحصول عليها بعد SDS شطف. هو مبين في الشكل 2C هي التهم الطيفية وتطبيع عامل وفرة الطيفية (NSAF) قيم interactors معروفة من BRD4 18-20 جدت في هالو-BRD4 تحليل الطيف الكتلي. وفرة عالية من المكونات من pTEFb 18،20 وكذلك البروتين BRD9 19 تأكيد القبض محددة من المجمعات BRD4. كما تنبأ الفضة وصمة عار المواد الهلامية (الشكل 2B)، كما تم تحديد العديد من البروتينات الأخرى كما interactors المحتملة للBRD4 التي لم تراع في التحكم (لا تظهر البيانات). لأن هذه هي لم تكن معروفة سابقا، وأنها بحاجة إلى التحقق بشكل مستقل من قبل منهجيات أخرى لتأكيد ما إذا كان البروتين هو interactor لصحيحا، وإذا كان الأمر كذلك، وإذا كان مباشر أو غير مباشر المرتبطة BRD4.

ويمكن أيضا أن تدرس مجمعات معزولة عن النشاط؛ أنه يوصي أزل المجمعات باستخدام البروتيني TEV (القسم بروتوكول 2.5) بحيث تحافظ functionaliتاي. في الشكل 3A، الفضة وصمة عار الجل المجمعات المنسدلة هالو-HDAC1 صدر من الراتنج باستخدام TEV البروتيني هو مبين. كما TEV البروتيني سوف يلتصق في منطقة رابط بين العلامة البروتين الانصهار والاندماج شريك له، كميات كبيرة من البروتين الطعم، في هذه الحالة HDAC1، ويلاحظ (الشكل 3A). لتحديد ما إذا كان هذا الكسر الواردة النشاط HDAC1، تم اختبار عينات TEV مزال في مقايسة HDAC الانارة، HDAC-جلو 21. كما هو مبين في الشكل 3B، وأظهرت عينات HDAC1 المنسدلة مستويات عالية من النشاط HDAC1 (العمود 1)، والتي كانت تحول دون وجه التحديد المانع HDAC المعروفة، ساها 22 (العمود 2). كما ضوابط لمزيد من إثبات خصوصية، لم يلاحظ أي تثبيط HDAC مع ذات الصلة المانع الأسرة sirtuin، EX-527 22 (العمود 3) وتم الكشف عن عدم وجود إشارة باستخدام العازلة وحدها دون العينة HDAC1 المنسدلة المضافة (العمود 4).

وثمة عنصر هام من وظيفةالبروتيوميات القاعدة والمجمعات فهم، ومن فهم أيضا البروتين التعريب و / أو الاتجار. لأن هذه ثوابت نفس الانصهار يمكن fluorescently المسمى داخل الخلايا، ونحن مراقبة توطين وذلك باستخدام التصوير متحد البؤر. بعد بروتوكول في القسم 3، خلايا هيلا عابر مع Halo-BRD4 (الشكل 4A) وهالو-HDAC1 (الشكل 4B) وfluorescently المسمى مع يجند TMR وتصويرها. كما هو مبين في الأرقام 4A و 4B، سواء المترجمة إلى النواة كما هو متوقع 17. تظهر هذه البيانات أن وجود علامة لم يغير توطين الخلوية الفسيولوجية للشركاء الانصهار فيها.

الشكل 1
الشكل 1. تخطيطي المنسدلة البروتين وتطبيقات التصوير متحد البؤر. طريق كما إنجل بناء العديد من التطبيقات لفهم وظيفة البروتين في خلايا الثدييات ممكنة. للجميع، وبناء هالة الانصهار إما ثابت أو عابر أعرب في خلايا الثدييات ملتصقة أو تعليق. لpulldowns البروتين معقدة، ثم يتم هي lysed الخلايا، يتم التقاطها المجمعات تساهميا على الراتنج، ومزال إما عن طريق شطف SDS (المسار الأيسر) أو انشقاق TEV (المسار الأيمن). ينصح SDS شطف للمضي قدما لتحليل الطيف الكتلي، في حين TEV انشقاق هو الأمثل لأداء التحليل الوظيفي. لتوصيف التعبير وتوطين الخلوية، والأحداث الاتجار، أو دوران البروتين، والخلايا الحية معربا عن البروتينات الانصهار وfluorescently المسمى ومزيد من التحليل على SDS PAGE المواد الهلامية أو باستخدام التصوير متحد البؤر. تتوفر كل من خلية بروابط الفلورسنت نفاذية أو غير منفذة تبعا للتوطين أو عرض تقديمي من البروتين الانصهار داخل الخلية.

igure 2 "FO: محتوى العرض =" 6in "سرك =" / files/ftp_upload/51553/51553fig2highres.jpg "العرض =" 600 "/>
الشكل 2. هالو-BRD4 البروتين التعبير، المنسدلة، وتحليل الطيف الكتلي. المواد الهلامية (A) A SDS PAGE يظهر التعبير عن هالو-BRD4 الانصهار البروتين، 189 دينار كويتي، وهالو انصهار بروتين علامة وحده، 34 دينار كويتي، والتحكم (السيطرة) في غضون المحللة الخلوية HEK293T المسمى مع TMR يجند (القسم بروتوكول 2.1). تم مسحها المواد الهلامية مع fluorimager للكشف، وكان يستخدم الفلورسنت الوزن الجزيئي علامة (B) والمواد الهلامية الفضة وصمة عار من مكررات البيولوجية لpulldowns من هالو-BRD4 والسيطرة عينات مزال مع SDS. يشار إلى الأحجام الوزن الجزيئي للهلام (C) التهم الطيفي (اللوحة اليسرى) وتطبيع العوامل فرة الطيفية (NSAF) القيم (اللوحة اليمنى) والتي تمثل البروتين الوزن الجزيئي للبروتينات التي تم تحديدها في تحليل الطيف الكتلي من مكررات البيولوجية من هالو- BRD4 والسيطرة. أظهرت هي بروتينات معروفة للتفاعل ثإيث BRD4، بما في ذلك مكونات pTEFb (CDK9 وأحذية ركوب T) 18،20، وكذلك BRD9 19. تم تحديد أي من هذه الببتيدات والبروتينات في السيطرة.

الرقم 3
الرقم 3. هالو-HDAC1 العزلة معقدة وتحليل النشاط. (أ) المواد الهلامية الفضة وصمة عار تبين عزل المجمعات هالو-HDAC1 والخلفية من السيطرة بعد انشقاق TEV (بروتوكول القسم 2.5). وصفت الفرقة البارزين HDAC1 (55 كيلو دالتون) والفرقة البروتيني TEV. يتم إنشاء HDAC1 مجانا من TEV انشقاق داخل رابط الأمثل بين HaloTag وHDAC1 تسلسل الانصهار بعد القبض على الراتنج (الشكل 1). (B) رسم بياني يبين نشاط HDAC1 العزلة معقدة العينات في الانارة الفحص deacetylase هيستون، HDAC- 21 بالشبكة. العمود 1 من الرسم البياني يبين عالية لevels النشاط HDAC الواردة مع عينات المنسدلة هالو-HDAC1 (HDAC1). العمود 2 يكشف هذا النشاط يمكن انخفضت تحديدا إضافة المانع HDAC، ساها 22، إلى عينات المنسدلة HDAC1. والضوابط، العمود 3 يوضح المانع deacetylase محددة لعائلة sirtuin، ولكن ليس HDACs، EX-527 22، لا تمنع النشاط HDAC1 والعمود 4 عروض لوحظ أي نشاط باستخدام العازلة وحدها.

الرقم 4
الشكل 4. هالو هالو-BRD4 و-HDAC1 التصوير متحد البؤر. يعيش خلية التصوير متحد البؤر من خلايا هيلا transfected مع هالو-BRD4 (A) أو هالو-HDAC1 (B) fluorescently المسمى مع TMR يجند. يقتصر (A) هالو BRD4 التعبير إلى النواة و (ب) هالو-HDAC1 التعبير هي في الغالب مجلس التوحيد الوطنىلير. الجانب الأيسر من لوحات هي قناة الفلورسنت والجانب الأيمن هو تراكب للقناة فلوري مع قناة مدينة دبي للإنترنت لكل منها. تم الحصول على الصور على المجهر متحد البؤر مجهزة 37 ° C + CO 2 غرفة البيئية باستخدام مجموعات التصفية المناسبة. أشرطة النطاق = 20 ميكرومتر.

Discussion

المقدمة هنا نوعان من البروتينات الانصهار، هالو هالو-BRD4 و-HDAC1، وتتميز في خلايا الثدييات حقيقية النواة للتعبير، والبروتين العزلة معقدة والنشاط، وتوطين الخلوية. في العمل من خلال هذه البروتوكولات المختلفة، وهناك العديد من الخطوات الهامة لنجاح كل تجربة. كما هو الحال مع أي انصهار بروتين، ومستوى التعبير ووضع العلامة نفسها يمكن أن تكون حاسمة للحفاظ على وظائف الأعضاء. ولذلك فمن المهم أن نرى أن N-و / أو اندماج-C محطة سوف تحتاج إلى أن تكون مصممة إذا لم يثبت علم مسبق أو العمل مع علامة أخرى للبروتين معين في الاختيار. بخصوص التعبير، إذا كان مستوى مرتفع جدا، التخفيف من الحمض النووي يمكن أن يؤديها خلال ترنسفكأيشن أو استخدام ناقلات مع المروجين أضعف وممكن لتحقيق المستوى المناسب. وقد تم العمل السابقة تظهر العزلة كفاءة من المجمعات الجزيئات أجريت في الذاتية جنيهVELS التعبير 8، مما يتيح العمل على مستويات منخفضة جدا من التعبير. إذا كان ذلك ممكنا، فإن الدراسات توطين الخلوية أيضا أن تكون قادرة على تقديم فكرة عن الموقف الأمثل موضع العلامة وكذلك مستوى التعبير النسبية اللازمة لعلم وظائف الأعضاء المناسبة.

مرة واحدة البروتينات الانصهار مستعدون للتجارب المنسدلة، للحصول على أقصى قدر من النجاح مع بروتوكول فمن المهم جدا اتباع الأطر الزمنية الموصى بها في تحلل، ملزمة، وأقسام الغسيل، باعتبارها واحدة من أكبر مزايا هي سرعة العزلة معقدة العملية. إذا تطول في الوقت المناسب أي من هذه الخطوات، مثل والمطلوبة لطريقة التقاط القائم على الضد، هناك خطر تفارق معقدة أو زيادة ملزمة 8 غير محددة. وبالمثل إذا تم تقصير مرات خلال تحلل الخلوية أو ملزمة، والخلايا قد لا تكون هي lysed تماما أو أسروا بكفاءة على التوالي. إذا كان عدد من يغسل هو decrخففت أو لا يحدث خلط جيدة من الراتنج خلال يغسل ملزمة أو، ثم سيتم زيادة مستويات الخلفية للبروتينات غير محددة. أيضا، وسيلة للتحلل من المهم جدا كما تتعلق كفاءة ملزمة لالراتنج. سوف محاولات ليصوتن العينات، وإزالة المنظفات الموصى بها، إضافة SDS أو المنظفات القوية الأخرى، و / أو تشمل AEBSF مثبط البروتياز يؤدي إلى انخفاض أو فقدان ملزم البروتينات الانصهار والمجمعات لالراتنج.

الأساليب القائمة لعزل معقدة من خلايا الثدييات والإنسان البروتين النضال التحليل مع التحدي المتمثل في الحد من خلفية في تحليل الطيف الكتلي 16. وقد كان هذا من الأهمية بمكان أن مستودع من البروتينات تلويث تم إنشاؤها من قبل العديد من الجماعات مطياف الكتلة 16. الخلفية في عينات مطياف الكتلة المنسدلة يمكن تعريفها بأنها أي شيء مما يمنع تحديدinteractors الحقيقي للبروتين الطعم. على هذا النحو، يمكن أن تنشأ من الخلفية تلويث البروتينات غير محددة أو أيضا على تركيزات كبيرة من البروتين الطعم أو الأجسام المضادة المستخدمة لترسيب بروتينات الطعم. وقد تم عمل كبير في تحسين كل من بروتوكول المنسدلة المقدمة هنا وكذلك الراتنج لتقليل مستوى البروتينات تلويث غير محددة في عملية المنسدلة. هذا هو واضح في المواد الهلامية وصمة عار الفضة وتحليل الطيف الكتلي لعنصر التحكم (الشكل 2). لمعالجة مستويات عالية من البروتين الطعم أو الأجسام المضادة التي يمكن أن تكون ضارة على قدم المساواة مع الملوثات ومع المنهجيات الأخرى التي النضال، ينصح المنسدلة مع SDS شطف (القسم بروتوكول 2.4). ويرجع ذلك إلى التعلق التساهمية إلى الراتنج، وهذه العملية سوف يترك الغالبية العظمى من البروتين الانصهار انطلاق المرفقة تساهميا إلى الراتنج. ويلاحظ وجود نسبة صغيرة من الطعم في تحليل الطيف الكتلي، الذي يعتقدأن يحدث من خلال التحلل، لكنه لا يمثل مشكلة للكشف عن التفاعلات الأخرى أضعف أو عابرة 8.

كما ذكر في المقدمة، تم تفعيل تقدما كبيرا في البروتينات بواسطة تقدما كبيرا في مطياف الكتلة 1،7. وبالتالي، فمن المهم تسليط الضوء على المعالم الهامة للاختيار تحليل الطيف الكتلي لdeconvolute خليط من البروتينات التي تم الحصول عليها في pulldowns. يجب أن تكون الأجهزة قوية وقادرة على روتيني وكفاءة تحليل العينات التي تحتوي على كمية صغيرة من البروتين، وغالبا ما تكون أقل من <1 ميكروغرام. وعادة ما تستخدم اللوني النانوية تنطوي 50-75 ميكرومتر أعمدة القطر HPLC الداخلية مع معدلات التدفق في 100-300 NL / دقيقة مجموعة من أجل التوافق مع أحجام عينة صغيرة وتعظيم حساسية مطياف الكتلة. لتحقيق أقصى قدر من المعلومات المكتسبة في حالة س تحليل واحدو في الطيف الشامل الفن قادر على الحصول على دقة عالية أطياف الشامل على نطاق الوقت متوافق مع فصل النانو المذكورة آنفا، ≥ 10 هرتز، وعادة ما يعملون. هذه الصكوك لديهم مستويات attomolar من الحساسية ويمكن الحصول على البيانات مع السلائف جزء في المليون الفرعية وايون المنتج التحمل الخطأ الشامل بشكل روتيني. تخدم هذه خصائص الأداء لزيادة الغلة من عدد من البروتينات التي تم تحديدها والثقة المرتبطة بتلك تحديد الهوية.

مع هذه البيانات التي تثبت التعريب الفسيولوجية الخلوية، وبروتين المناسبة: تفاعلات البروتين جنبا إلى جنب مع القدرة على اكتشاف التفاعلات الرواية، وعزل جميع مجمعات نشاطا باستخدام بناء واحد. التكنولوجيات البديلة في الواقع يمكن استخدامها لكل من هذه الجوانب المختلفة، ولكن من المحتمل أن لا لجميع 23،24. مع التكنولوجيا HaloTag، يمكن أن تستخدم نهجا متعدد الوظائف، والنهوض proteomICS الدراسات والحصول على فهم أكثر اكتمالا وظيفة البروتين في خلايا الثدييات.

Disclosures

وترعى رسوم النشر لهذه المادة من قبل شركة PROMEGA. دانيت L. دانيلز، جاكي منديز، هيلين Benink، أندرو نايلز، نانسي ميرفي وMarjeta Urh هم موظفون لشركة PROMEGA، صاحب التجارية بالتنازل عن براءات الاختراع للتكنولوجيا HaloTag وتطبيقاتها. مايكل فورد، ريتشارد جونز، رافي أمونوجاما، وديفيد ألين هم موظفون من MSBioworks، التي تقدم خدمات قياس الطيف الكتلي وصفها في هذه المخطوطة.

Acknowledgments

نشكر الدكتور مارتن روزنبرغ، الدكتور غاري تربلي، والدكتور كيث الخشب لدعم هذا العمل، والدكتور جيمس كالي لقراءة نقدية للمخطوطة. DLD، JM، HB، NM، AN، JC، وMU هم موظفون لشركة PROMEGA. MF، RJ، RA، وDA هم موظفون من MS Bioworks، LLC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HeLa Cells ATCC CCL-2 Adherent
HEK293T Cells ATCC CRL-11268 Adherent
Cellular growth media Invitrogen/Gibco
PBS - tissue culture certified Invitrogen/Gibco
FuGENE HD Transfection Reagent Promega E2311
HaloTag Control Vector Promega G6591
HaloTag-BRD4 Kazusa DNA Research Institute FHC11882 N-terminal HaloTag fusion
HaloTag-HDAC1 Kazusa DNA Research Institute FHC02563 N-terminal HaloTag fusion
HaloTag Clones containing content Promega Various http://www.promega.com/FindMyGene/
HaloTag Flexi Vectors for cloning (N- or C-terminal) Promega Various Choose based upon expression level and HaloTag orientation
HaloTag TMR Ligand Promega G8251
IGEPAL CA-630 Sigma 18896
HaloTag Mammalian Pull-Down and Labelling System Promega G6500 Contains HaloTag TMR ligand
HaloTag Mammalian Pull-Down System Promega G6504
Protease Inhibitor Cocktail, 50X Promega G6521
Mammalian Lysis Buffer Promega G9381
HaloTag Monoclonal Antibody Promega G9211
ProTEV Plus Promega V6101
RQ1 Dnase Promega M6101
HaloLink Resin Promega G1912
HDAC-Glo Promega G6420
PBS + 0.1% Triton X-100 For optional imaging
4% paraformaldehyde/0.2 M sucrose/PBS For optional imaging
Ethanol
Tissue culture vessels and dishes
Cell culture incubator
Disposable cell lifter Thermo Fisher Scientific 08-773-1
Glass homogenizer such as Kontes Dounce Tissue Grinder Thermo Fisher Scientific K885300-0002 25-27 G needle could also be used
Microcentrifuge
Tube rotator such as Labquake Thermo Fisher Scientific 4002110Q Ideal for binding and washing steps
Shaking platform such as Eppendorf Thermomixer Thermo Fisher Scientific 05-400-200 Ideal for SDS elution and TEV cleavage steps
Chambered cover glass Thermo Fisher Scientific 155409 For optional imaging
Fluorescent Microscrope (555 nm Ex/585 nm Em) For optional imaging

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Altelaar, A. F., Munoz, J., Heck, A. J. Next-generation proteomics: towards an integrative view of proteome dynamics. Nat Rev Genet. 14, 35-48 (2013).
  2. Tyers, M., Mann, M. From genomics to proteomics. Nature. 422, 193-197 (2003).
  3. Coulombe, B., et al. Interaction networks of the molecular machines that decode, replicate, and maintain the integrity of the human genome. Mol Cell Proteomics. 3, 851-856 (2004).
  4. Gavin, A. C., et al. Proteome survey reveals modularity of the yeast cell machinery. Nature. 440, 631-636 (2006).
  5. Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
  6. Sardiu, M. E., et al. Probabilistic assembly of human protein interaction networks from label-free quantitative proteomics. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 1454-1459 (2008).
  7. Domon, B., Aebersold, R. Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312, 212-217 (2006).
  8. Daniels, D. L., et al. Examining the complexity of human RNA polymerase complexes using HaloTag technology coupled to label free quantitative proteomics. J Proteome Res. 11, 564-575 (2012).
  9. Encell, L. P., et al. Development of a dehalogenase-based protein fusion tag capable of rapid, selective and covalent attachment to customizable ligands. Curr Chem Genomics. 6, 55-71 (2012).
  10. Ohana, R. F., et al. HaloTag-based purification of functional human kinases from mammalian cells. Protein Expr Purif. 76, 154-164 (2011).
  11. Black, J. C., et al. KDM4A Lysine Demethylase Induces Site-Specific Copy Gain and Rereplication of Regions Amplified in Tumors. Cell. 154, 541-555 (2013).
  12. Deplus, R., et al. TET2 and TET3 regulate GlcNAcylation and H3K4 methylation through OGT and SET1/COMPASS. EMBO J. 32, 645-655 (2013).
  13. Galbraith, M. D., et al. HIF1A Employs CDK8-Mediator to Stimulate RNAPII Elongation in Response to Hypoxia. Cell. 153, 1327-1339 (2013).
  14. Collins, M. O., Choudhary, J. S. Mapping multiprotein complexes by affinity purification and mass spectrometry. Curr Opin Biotechno. 19, 324-330 (2008).
  15. Collins, S. R., et al. Toward a comprehensive atlas of the physical interactome of Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Proteomics. 6, 439-450 (2007).
  16. Mellacheruvu, D., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nat Methods. 10, 730-736 (2013).
  17. Dawson, M. A., Kouzarides, T. Cancer epigenetics: from mechanism to therapy. Cell. 150, 12-27 (2012).
  18. Jang, M. K., et al. The bromodomain protein Brd4 is a positive regulatory component of P-TEFb and stimulates RNA polymerase II-dependent transcription. Mol Cell. 19, 523-534 (2005).
  19. Rahman, S., et al. The Brd4 extraterminal domain confers transcription activation independent of pTEFb by recruiting multiple proteins, including NSD3. Mol Cell Biol. 31, 2641-2652 (2011).
  20. Yang, Z., et al. Recruitment of P-TEFb for stimulation of transcriptional elongation by the bromodomain protein Brd4. Mol Cell. 19, 535-545 (2005).
  21. Halley, F., et al. A bioluminogenic HDAC activity assay: validation and screening. J Biomol Screen. 16, 1227-1235 (2011).
  22. Mack, G. S. To selectivity and beyond. Nat Biotechnol. 28, 1259-1266 (2010).
  23. Daniels, D. L., Urh, M. Isolation of intracellular protein--DNA complexes using HaloCHIP, an antibody-free alternative to chromatin immunoprecipitation. Methods Mol Biol. 977, 111-124 (2013).
  24. Urh, M., Rosenberg, M. HaloTag a Platform Technology for Protein Analysis. Curr Chem Genomics. 6, 72-78 (2012).

Tags

علم الأحياء الخلوية، العدد 89، البروتينات، HaloTag، تفاعلات البروتين، مطياف الكتلة، والبروتينات bromodomain، BRD4، deacetylase هيستون (HDAC)، HDAC المقايسات الخلوية، والتصوير متحد البؤر
اكتشاف بروتين تفاعلات البروتين وتميز وظيفة عن طريق HaloTag تكنولوجيا
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Daniels, D. L., Méndez, J.,… More

Daniels, D. L., Méndez, J., Benink, H., Niles, A., Murphy, N., Ford, M., Jones, R., Amunugama, R., Allen, D., Urh, M. Discovering Protein Interactions and Characterizing Protein Function Using HaloTag Technology. J. Vis. Exp. (89), e51553, doi:10.3791/51553 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter