Summary
HaloTag teknologi er en multifunktionel teknologi, som har vist stor succes i isolering af både små og store protein-komplekser fra pattedyrceller. Her vil vi fremhæve fordelene ved denne teknologi i forhold til de eksisterende alternativer og vise sin nytte at studere mange aspekter af protein funktion inde eukaryote celler.
Abstract
Forskning i proteomics er eksploderet i de seneste år med fremskridt inden massespektrometri kapaciteter, der har ført til karakterisering af talrige proteomer, herunder fra vira, bakterier og gær. I sammenligning, analyse af den menneskelige proteom halter bagefter, dels på grund af det store antal af proteiner, som skal studeres, men også kompleksiteten af netværk og interaktioner disse tilstedeværende. Til specifikt at tage udfordringerne i at forstå den menneskelige proteom, har vi udviklet HaloTag teknologi for protein isolation, særligt stærke til isolering af multiprotein komplekser og muliggøre en mere effektiv opsamling af svage eller forbigående interaktioner og / eller proteiner i lav tæthed. HaloTag er et genetisk kodede protein fusion tag designet til covalent, specifikke og hurtige immobilisering eller mærkning af proteiner med forskellige ligander. Udnyttelse af disse ejendomme, blev adskillige applikationer til pattedyrceller udviklet karakterize proteinernes funktion og her præsenterer vi metoder herunder: protein pull-downs, der anvendes til opdagelse af nye interaktioner eller funktionelle assays og cellulær lokalisering. Vi finder betydelige fordele i den hastighed, specificitet og kovalente indfangning af fusionsproteiner til overflader for proteom analyse i forhold til andre traditionelle ikke-kovalente tilgange. Vi viser disse og den brede anvendelighed af teknologi ved hjælp af to vigtige epigenetiske proteiner som eksempler, den menneskelige bromodomain protein BRD4 og histondeacetylase HDAC1. Disse eksempler viser kraften i denne teknologi gøre det muligt for opdagelsen af nye interaktioner og karakterisere cellulære lokalisering i eukaryoter, som vil tilsammen yderligere forståelse af menneskelige funktionelle proteomics.
Introduction
Forståelse af cellulære funktion, respons på stimuli, og ændringer i udviklings-og / eller sygdomstilstande er uløseligt bundet til de-convolution af proteom gennem disse forskellige dynamiske tilstande 1,2. Der er gjort meget for at forstå proteom af lavere organismer imidlertid i betragtning af antallet af proteiner, og alle mulige interaktioner, har dette været meget udfordrende i håndteringen af menneskelige proteom 1,3-7. Fremskridt i massespektrometri i høj grad har gjort det muligt for evnen til at foretage disse undersøgelser, og her præsenterer vi en yderligere og betydelig fremgang med udviklingen af HaloTag teknologi til både effektiv opsamling af protein komplekser og funktionel karakterisering af humane proteiner fra pattedyrceller 8-10. Denne teknologi er for nylig blevet vist i adskillige undersøgelser at være en kritisk faktor for opdagelsen af vigtige interaktioner, giver mulighed for indblik i hidtil ukendt protein funktion og understanding sygdom 11-13.
Den HaloTag proteinfusion blev oprindeligt udviklet til at løse en række udfordringer for de traditionelle affinitetsmærker og antistoffer som relateret til protein capture, rensning, og mærkning 8-10. Inden for næsten alle metoder til protein-opsamling og rensning, der er en ikke-kovalent interaktion trin, som anvendes til berigelse af et bestemt protein 14. Under dette trin kan de proteiner og / eller komplekse adskille følge af diffusion, især hvis processen kræver timer i stedet for minutter. For at løse dette problem blev fusionsproteinet specielt udviklet til at hurtigt og irreversibelt interagere med dets ligander, som kan være enten partikler, overflader, eller fluoroforer 9. Derfor, når det er bundet til dets ligand, det forbliver bundet, som er en af de mest differentierende faktor i forhold til andre affinitetsmærker. Også vist her, er evnentil at løse forskellige biologiske spørgsmål med en enkelt konstruktion, hvilket er muligt ved skiftevis ligander 9 (fig. 1). For eksempel for at forespørge protein interaktioner eller funktion, overflade ligander anvendes til indfangning af protein eller komplekser (Figur 1). I et separat eksperiment, kan det samme fusionsprotein være fluorescens-mærkede til at studere cellulære lokalisering, menneskehandel eller protein omsætning (Figur 1). Det er vigtigt at huske dog, at når en ligand er bundet, om det er en overflade eller en fluorofor, er irreversibel, og derfor andre ligander kan derefter ikke efterfølgende er bundet i det samme eksperiment.
Analyse af eksisterende teknologier til at kortlægge protein interaktioner afslører vanskeligheden til effektivt at isolere specifikke interaktioner, herunder dem, som er mere forbigående eller er lavere overflod 1,6,7,14,15. Også seneste arbejde ved talrige gruppes viser bekymring for, at inden for de traditionelle isolation metoder, især på området for menneskelige proteomics, er der et betydeligt antal proteinkontaminanter der kan skjule signaler fra sande interaktionskandidater i massespektrometrianalyse 16. De egenskaber, der er udviklet til HaloTag protein og dets co-udviklet harpiks adresse godt disse bekymringer. I kan opnås protokollen for komplekse pulldowns (figur 1), binding af komplekser i 15 minutter, både fremme kompleks opsamling og mindske omfanget af ikke-specifik binding 8. Desuden irreversibelt bindende muliggør effektiv indfangning af lav hyppighed proteiner, og giver mulighed for anvendelse af langt færre celler, igen reducere baggrund 8. Når indfangning af komplekser er etableret, protokollen omfatter milde vaske betingelser for at opretholde komplekse integritet. Eluering af tilfangetagne komplekser kan udføres af to metoder og vælge, hvilke metode er dikteret af målet for den nedstrøms analradiokemiske analyser. Hvis ønsket er at analysere eller opdage interagerende proteiner ved Western blot eller massespektrometri, så anbefales det at eluere komplekser med denatureringsmidler, såsom SDS eller urinstof (figur 1). Dette er særligt fordelagtigt for massespektrometri som proteinet oprindeligt blev fusioneret til HaloTag, betegnet agn protein forbliver bag bundet til harpiksen, og derfor ikke vil dominere populationen af peptider detekteret i massespektrometri. Dette betyder imidlertid også, at lokkemaden proteinet sandsynligvis ikke vil være synlig i analyse ved western-blot, en væsentlig forskel i forhold til andre ikke-kovalente affinitet oprensninger eller co-immunfældninger. Hvis målet er at rense en kompleks intakt skal anvendes til funktionelle undersøgelser kan elueringen udføres under anvendelse af TEV (Tobacco Etch Virus) protease, som genkender dets kognate spaltning kodes mellem fusionsproteinet og agn protein (figur 1). Tisse prøver kan også analyseres ved massespektrometri, men som senere viser sig, vil de indeholde en betydelig mængde af lokkemad protein, der kan forhindre detektion af lavere overflod specifikke interaktionskandidater.
Her præsenterer vi pulldown og billedbehandling anvendte protokoller til to vigtige terapeutiske proteiner, den bromodomain protein BRD4 og en histondeacetylase, HDAC1 17.. Vi har vist med disse eksempler, interaktion med forventede partnere som bestemt ved massespektrometri, enzymatiske aktivitet efter komplekse isolation for HDAC1, og korrekt cellulær lokalisering for begge. Tilsammen viser disse resultater multifunktionelle natur og styrke af teknologien til karakterisering af eukaryote protein interaktioner og funktion.
Protocol
Bemærk: Følgende protokol kan bruges med alle HaloTag fusion og i alle cellelinje valg stabilt eller transient transficeret. For disse eksempler, vil vi give protokoller til transient transfektion af HaloTag fusioner i HEK293T eller HeLa-celler. For alle eksperimenter, anbefaler vi brug af protein, kontrol.
1. Fusion Protein Expression Test
- Opnå fusionsproteinkonstruktion:
- Opnå pre-made HaloTag fusion vektor eller konstruere anvendelse af eksisterende vektorer. For mere information om tilgængelige konstruktioner, se venligst tabel af specifikke reagenser.
- Hvis der gør enhver klon, anbefales det at sekventere kontrollere DNA.
- Test udtryk for fusionsprotein og kontrol:
- For hver prøve, forberede 250 pi 1X SDS Loading Dye buffer (60 mM Tris HCL pH 6,8, 0,75 mM bromphenolblåt, 12,5% glycerol, 100 mM dithiothreitol, 0,5% SDS).
- For hvert fusionsproteinog kontrol, tallerken 0,5 ml HEK293T eller HeLa-celler i deres passende medier med en tæthed på 2-4 x 10 5 celler / ml i en standard 24 brønde.
- Der inkuberes i 18-24 timer ved 37 ° C og 5% CO 2, så transficere som anbefalet.
- 24 timer efter transfektion, tilsættes 0,5 pi 5 mM tetra-methyl-rhodamin (TMR) ligand til medierne i hver brønd, og bland forsigtigt plade.
- Inkuber transficerede celler indeholdende ligand i 15 minutter ved 37 ° C og 5% CO2.
- Aspirer off medier indeholdende ligand og vask hver brønd af celler forsigtigt med 1 ml RT PBS.
- Aspirer off PBS og udføre en anden vask med 1 ml RT PBS.
- Fjern PBS og tilsættes 200 ul 1X SDS Loading Dye buffer direkte til cellerne.
- Pipette lysatet fra pladen i 1,5 ml Eppendorf-rør.
- Kog lysat i 5 minutter ved 95 ° C.
- Fjern 5-10 pi af reaktionen, og belastningen på SDS-PAGE-gel.
- Brug en fluorescenspåvisning scanner(TMR Excitation: 555 nm, emission: 585 nm) til at opdage bands. Brug fluorescerende protein markører som standarder.
- Hvis fluorescenspåvisning scanner er tilgængelig, udføre western blots under anvendelse af antistoffer mod enten lokkemad protein eller protein fusion tag til at påvise ekspression af fusionsproteinet.
2. Protein Pulldowns
- Fremstilling af transient transficerede celler:
- For hver fusion eller kontrol forberede en 15 cm skål med 30 ml celler ved 3-4 x 10 5 celler / ml eller 1 til 1,2 x 10 7 celler i alt pr konstruktion.
- Der inkuberes i 18-24 timer ved 37 ° C og 5% CO 2, så transficere konstruere som anbefalet.
- Efter 24-48 timer efter transfektion, fjerne medierne og forsigtigt vaske celle lag med 20-25 ml iskold PBS.
- Fjern vask med PBS, hvorefter der tilsættes 25-30 ml 4 ° C afkølet PBS og forsigtigt at skrabe cellerne fra pladen.
- Saml celler i koniske rør og centriFuge i 5-10 min ved 2.000 xg og 4 ° C.
- Supernatanten kasseres, og placere cellepellet ved -80 ° C i mindst 30 minutter eller maksimalt 6 måneder.
- Ækvilibrering af HaloLink harpiks:
- For hver fusion eller kontrolprøve, forberede 12 ml Resin Ligevægtsindstillingens / Wash buffer (100 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl og 0,005% IGEPAL CA-630) Bemærk:. Det er meget vigtigt at gøre og bruge Resin Ækvilibreringsbufferen indenfor 12 timer, som fortyndet IGEPAL CA-630 er ikke stabil eller effektiv ud over denne tidsramme.
- Forsigtigt rystes eller blandes harpiks for at opnå en ensartet suspension.
- For hver pull-down eksperiment, dispensere 200 pi harpiks ind i en 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Centrifugeres i 1 minut ved 800 xg (fx 3.000 rpm i en mikrocentrifuge), fjern derefter omhyggeligt og supernatanten (ethanol) uden at forstyrre harpiks ved bunden af røret.
- Tilføj 800 pi Resin Ligevægtsindstillingens / Wash buffer og bland grundigt ved at vende røret flere gange.
- Centrifuger i 2 minutter ved 800 xg, fjern derefter forsigtigt og kassér supernatanten.
- Gentag trin 2.2.5 og 2.2.6 to gange mere til i alt tre vaske.
- Fjern ikke den sidste vask eller supernatant indtil den er klar til at tilføje cellelysater beskrevet nedenfor (trin 2.3.8) for at forhindre, at harpiksen tørrer ud.
- Binding og vask af fusion komplekser:
- For hver prøve, forberede 500 pi Mammalian Lysis Buffer (50 mM Tris-HCI pH 7,5, 150 mM NaCI, 1% Triton X-100, 0,1% Na-deoxycholat) og 1 ml 1X TBS-buffer (100 mM Tris-HCI pH 7,5 og 150 mM NaCI).
- Optø cellepellets og resuspender i 300 pi Mammalian Lysis Buffer ved pipettering op og ned eller kort omhvirvling.
- Tilsæt 6 pi 50X Protease Inhibitor Cocktail (800 ug / ml benzamidin HCI, 500 ug / ml phenanthrolin, 500 ug / ml aprotinin, 500 ug / ml leupeptin, 500 & #. 181 g / ml pepstatin A, 50 mM PMSF) Bemærk: Protease cocktails, som omfatter AEBSF kan ikke anvendes, da disse forstyrrer proteinfusion tag bindende.
- Tilsæt 3 pi RQ1 DNase og vend i 10 min ved RT.
- Dounce med glashomogenisator 2,0 ml størrelse; . 25-30 slag på is, eller passere celler gennem en 25 eller 27 G kanyle 5-10 gange for at fuldføre lysis Bemærk: Sonikering anbefales ikke, da komplekser kan falde fra hinanden og over-opvarmning kan påvirke proteinfusionen tag aktivitet.
- Der centrifugeres ved 14.000 xg i 5 minutter ved 4 ° C for at fjerne lysatet.
- Overfør klart lysat, cirka 300 ul samlede volumen, til nye rør og sted på is.
- Tilføj til fjerne lysat yderligere 700 ul 1X TBS buffer og bland godt ved pipettering op og ned.
- Tag ækvilibreret harpiks rør fremstillet i trin 2.2.8 og fjerne sidste vask / supernatant fra harpiks uden at forstyrre harpiks ved bunden af røret.
- Føj til hver tuvære af harpiks, 1 ml fortyndet lysat.
- Inkuberes med blanding på et rør rotator (eller blid mixer) i 15 min ved 22 ° C. Bemærk: Bundfældning af harpiks i løbet af denne tid reducerer bindende effektivitet. Hvis binding ved 4 ° C er ønsket, gøres det ved blanding i 1 time.
- Centrifuge harpiks rør i 2 minutter ved 800 xg og kassér supernatanten.
- Der tilsættes 1 ml Resin Ligevægtsindstillingens / Wash buffer foretaget på trin 2.2.1 og blandes grundigt ved at vende harpiks røret ved hånden flere gange.
- Centrifuge harpiks rør i 2 minutter ved 800 xg og kassér vask.
- Gentag trin 2.3.12 efterfulgt af 2.3.14 yderligere tre gange.
- Tilsæt 1 ml Resin Ækvilibrering / Wash buffer og inkuberes ved 22 ° C i 5 minutter under konstant rotation.
- Centrifuge harpiks rør i 2 minutter ved 800 xg og kassér vask.
- Afhængig ende ansøgning (se Indledning for yderligere forklaring), gå videre til enten punkt 2.4 eller 2.5.
- SDS eluering for denatureringsgeler, western blots eller massespektrometri:
- Resuspender harpiks fra hver prøve i 50 gl SDS Elution buffer (1% SDS og 50 mM Tris-HCI pH 7,5)
- Ryst rør ved stuetemperatur i 30 minutter.
- Centrifuger i 2 minutter ved 800 xg og overføre eluaterne til friske rør til analyse.
- For western blot eller sølv plet gel, belastning 5-10 pi på en SDS denaturerende gel.
- For massespektrometri spare 40 ul af hver prøve ved -20 ° C.
- TEV Protease eluering for funktionelle assays, western blots eller massespektrometri:
- Efter fjernelse af den sidste vask resuspenderes harpiksen i 50 pi ProTEV spaltning buffer og 30 enheder af TEV-enzym.
- Inkuber ved 25 ° C med omrystning i 1 time.
- Centrifuger i 2 minutter ved 800 x g..
- Overfør eluatet til friske rør.
- Opbevar prøve ved 4 ° C til umiddelbar brug i funktionelle assays.
3.Cellular Imaging af fluorescens Labelled Fusion Proteiner hjælp af en Cytoplasmic og nuklear Permeable ligand
- Transficere, etiket, og billed-celler:
- I en 8 godt kammer dækglas for hvert fusionsprotein eller kontrol plade 400 pi af HeLa-celler i deres passende medier i hver brønd ved en tæthed på 1-2 x 10 5 celler / ml.
- Der inkuberes i 18-24 timer ved 37 ° C og 5% CO 2, så transficere som anbefalet.
- 18-24 timer efter transfektion, fortyndes TMR ligand 1:200 i passende cellulære medier, hvorefter der tilsættes 100 ul af denne opløsning til hver brønd, og bland forsigtigt.
- Inkuber transficerede celler indeholdende ligand i 15 minutter ved 37 ° C og 5% CO2.
- Aspirer off medier indeholdende ligand og erstatte med 500 pi passende medier, der mangler protein fusion tag ligand, som er blevet forvarmet til 37 ° C.
- Gentag to gange for i alt tre vaske.
- Sæt celler tilbage i inkubatoren (376, C og 5% CO2) i 30 min.
- Aspirer off medier og erstatte med 500 pi passende medier, som er forvarmet til 37 ° C.
- Billede på et mikroskop ved anvendelse af passende parametre erhvervelse (TMR excitation 555 nm, emission: 585 nm).
Representative Results
Når man arbejder med en ny fusionsprotein, er det vigtigt at første test for ekspression af dette protein efter transfektion, og også validere, at et protein af den korrekte molekylvægt, der produceres. Som HaloTag fusionsproteiner kan være fluorescerende og kovalent mærket med gennemtrængelige eller afhængigt lokalisering, uigennemtrængelige ligander, er det muligt hurtigt at bestemme ekspression ved anvendelse af cellelysater til denaturerende gelelektroforese efterfulgt af scanning på en fluorimager. Anvendelse af protokollen beskrevet i punkt 1.2, udtryk for Halo-BRD4 (189 kD), og alene HaloTag kontrol (Ctrl) er observeret (34 kD, figur 2A). Som nævnt i protokollen, kan ekspression af fusionsproteiner også påvises ved hjælp af traditionelle Western blots med anti-HaloTag antistoffer, eller hvis de er til rådighed, antistoffer til agn protein. Hvis det er muligt, anbefales det at bruge den fluorescerende ligand i stedet, da det er mere specifik, hurtigere og nemmere tHan antistofdetektering, og også kvantitativ 10.
Efter ekspression af korrekt fuldlængde fusionsproteinet er bekræftet, kan protein pulldowns udføres. Vist i figur 2B er sølv farvede geler biologiske gentagelser af Halo-BRD4 og Ctrl pulldowns elueret med SDS (Protokol afsnit 2.4), der viser høj reproducerbarhed. Sølvplet geler viser findes et betydeligt antal af proteiner til at interagere med BRD4 protein og meget lav baggrund i kontrolgruppen (figur 2B). Som nævnt i indledningen, i denne proces eluering Halo-BRD4 ikke vil elueres fra harpiksen, som det er kovalent bundet. Derfor er der ikke et signifikant bånd ved denne molekylvægt detekteres i sølvfarvning (figur 2B) eller Western blot (data ikke vist). At afgøre, om disse proteiner er specifikke for BRD4 blev væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS/MS) udføres på cOMPLEX blandingen opnået efter SDS-eluering. Vist i figur 2C er spektrale tæller og normaliserede spektrale overflod faktor (NSAF) værdier for kendte interaktionskandidater af BRD4 18-20 findes i Halo-BRD4 massespektrometrianalyse. Den høje overflod af komponenter fra pTEFb 18,20 og også BRD9 19 protein bekræfter specifik indfangning af BRD4 komplekser. Som forudsagt af sølvplet geler (figur 2b), blev en række andre proteiner også identificeret som potentielle interaktionskandidater af BRD4, der ikke blev observeret i kontrolgruppen (data ikke vist). Da disse er hidtil ukendte, skal de kontrolleres uafhængigt af andre metoder til at bekræfte, om proteinet er en sand interactor, og hvis ja, hvis det er direkte eller indirekte er forbundet med BRD4.
Isolerede komplekser kan også blive undersøgt for aktivitet; Det anbefales at eluere komplekser ved hjælp af TEV-protease (Protokol Section 2.5), således at de opretholder functionality. 3A, en sølvfarve gel Halo-HDAC1 pulldown komplekser frigives fra harpiksen ved anvendelse af TEV-protease vist. Som TEV protease vil spalte i et linker-region mellem proteinet fusion tag og dets fusionspartner, betydelige mængder af agn protein, i dette tilfælde HDAC1 observeres (figur 3A). At afgøre, om denne fraktion indeholdt HDAC1 aktivitet blev elueret TEV prøverne i en selvlysende HDAC assay, HDAC-Glo 21. Som vist i figur 3B HDAC1 pulldown prøver viste høje niveauer af HDAC1 aktivitet (Række 1), som blev specifikt inhiberet af en kendt HDAC-inhibitor, SAHA 22 (kolonne 2). Som kontroller for yderligere at vise specificitet blev der ikke HDAC inhibering observeret med en beslægtet sirtuin familie inhibitor, EX-527 22 (kolonne 3), og intet signal blev påvist under anvendelse puffer alene uden HDAC1 pulldown prøve tilsat (søjle 4).
En væsentlig bestanddel af funktional proteomics og forståelse komplekser er også forståelse protein lokalisering og / eller menneskehandel. Da disse samme fusionskonstruktioner kan fluorescensmærket i celler, monitorerede vi deres lokalisering ved hjælp af konfokal billeddannelse. Efter protokollen i afsnit 3 blev HeLa-celler transient transficeret med Halo-BRD4 (figur 4A) og Halo-HDAC1 (figur 4B) fluorescens mærket med TMR ligand og afbildet. Som vist i figur 4A og 4B, både lokaliseret til kernen som forventet 17. Disse data viser, at tilstedeværelsen af mærket ikke ændrer fysiologiske cellulære lokalisering af sine fusionspartnere.
Figur 1.. Skematisk af protein pulldown og konfokal billedbehandling. Anvendelse som Ingle konstruere flere ansøgninger for at forstå proteinernes funktion i pattedyrsceller er mulige. For alle, en Halo fusion konstruktion er enten stabilt eller transient udtrykt i vedhængende eller suspension pattedyrsceller. For protein-kompleks pulldowns, celler lyseres derefter, komplekser er kovalent fanget på harpiks, og elueres gennem enten SDS eluering (venstre vejen) eller TEV spaltning (højre bane). SDS eluering anbefales til videre til massespektrometrianalyse, mens TEV spaltning er optimal til at udføre funktionel analyse. At karakterisere udtryk, cellulær lokalisering, events menneskehandel, eller protein omsætning, er levende celler, der udtrykker fusionsproteiner fluorescensmærkes og yderligere analyseret på SDS PAGE geler eller ved hjælp af konfokal billedbehandling. Begge celle gennemtrængelige eller uigennemtrængelige fluorescerende ligander er tilgængelige afhængigt af lokalisering eller præsentation af fusionsproteinet i cellen.
igur 2 "fo: content-width =" 6in "src =" / files/ftp_upload/51553/51553fig2highres.jpg "width =" 600 "/>
Figur 2. Halo-BRD4 proteinekspression pulldown, og massespektrometri-analyse. (A) en SDS-PAGE-geler, der viser ekspressionen af Halo-BRD4 fusionsprotein, 189 kD, og Halo proteinfusion tag alene, 34 kD, kontrol (Ctrl) inden for en HEK293T cellelysat mærket med TMR-ligand (protokol afsnit 2.1). Geler blev scannet med fluorimager til påvisning og en fluorescerende molekylvægtmarkør blev brugt. (B) sølvplet geler af biologiske gentagelser for pulldowns af Halo-BRD4 og Ctrl prøver elueret med SDS. Molekylær vægt størrelser er indikeret til gelen. (C) Spectral tællinger (venstre panel) og normaliserede spektrale overflod faktorer (NSAF) værdier (højre panel), der tegner sig for protein molekylvægt af proteiner identificeret i massespektrometri analyse af biologiske gentagelser af Halo- BRD4 og Ctrl. Vist er proteiner kendt for at interagere wed BRD4, herunder komponenter af pTEFb (CDK9 og cyclin T) 18,20, samt BRD9 19. Ingen peptider fra disse proteiner blev identificeret i Ctrl.
Figur 3.. Halo-HDAC1 kompleks isolation og aktivitet analyse. (A) sølvplet geler viser isolering af Halo-HDAC1 komplekser og baggrund fra Ctrl efter TEV spaltning (Protokol afsnit 2.5). Den fremtrædende HDAC1 båndet (55 kDa) og TEV-protease-båndet er mærket. Den frie HDAC1 genereres af TEV spaltning inden for en optimeret linker mellem fusion sekvensen HaloTag og HDAC1 efter indfangning på harpiksen (figur 1). (B) Graf, der viser aktiviteten af HDAC1 komplekse isolations prøver i et luminescerende histondeacetylase assay HDAC- Glo 21. Kolonne 1 af grafen viser høj levels af HDAC-aktivitet, der er indeholdt med Halo-HDAC1 pulldown prøver (HDAC1). Kolonne 2 viser denne aktivitet kan reduceres specifikt ved tilsætning af HDAC-inhibitor, SAHA 22 til HDAC1 pulldown prøver. Som kontroller kolonne 3 viser en deacetylasehæmmer specifik for sirtuin familie, men ikke HDAC, EX-527 22, hæmmer ikke HDAC1 aktivitet og kolonne 4 viser ingen aktivitet observeret ved hjælp buffer alene.
Levende fig. 4. Halo-BRD4 og Halo-HDAC1 konfokal billeddannelse. Celle konfokal billeddannelse af HeLa-celler transficeret med Halo-BRD4 (A) eller Halo-HDAC1 (B) fluorescensmærket med TMR-ligand (A) Halo-BRD4 ekspression er begrænset. til kernen og (B) Halo-HDAC1 ekspression overvejende nuclear. Venstre side af paneler er fluorescerende kanal og højre side er en overlejring af det fluorescerende kanal med DIC kanal for hver. Billeder blev erhvervet på et konfokal mikroskop er udstyret med en 37 ° C + CO 2 miljøkammeret hjælp af passende filter sæt. Skalapanelerne = 20 um.
Discussion
Præsenteret her er to fusionsproteiner, Halo-BRD4 og Halo-HDAC1, kendetegnet ved eukaryote mammale celler til ekspression, protein kompleks isolation og aktivitet og cellulær lokalisering. I arbejdet gennem disse forskellige protokoller, der er flere vigtige skridt for succes i hvert forsøg. Som det er tilfældet med enhver fusionsprotein ekspressionsniveau og placering af etiketten i sig selv kan være kritisk for opretholdelse af fysiologi. Det er derfor vigtigt at overveje, at N-og / eller C-terminale fusioner skal udformes, hvis forudgående viden eller arbejde med et andet mærke ikke er påvist for det særlige protein valg. Med hensyn til udtryk, hvis niveauet er for højt, fortynding af DNA kan udføres under transfektion eller brug af vektorer med svagere initiativtagerne muligt at nå det niveau, der er passende. Tidligere arbejde har udført viser en effektiv isolering af makromolekylære komplekser på endogene leveauer udtryksformer 8, så arbejde på meget lave niveauer af udtryk. Hvis det er muligt, ville cellulære lokalisering undersøgelser også være i stand til at give indsigt i den optimale tag placering position samt relative udtryk niveau, der kræves for korrekt fysiologi.
Når fusionsproteineme er klar til pulldown eksperimenter, for at opnå maksimal succes med protokollen er det meget vigtigt at følge de anbefalede tidsrammer i lysis, binding og vask sektioner, som en af de største fordele er hastigheden af den komplekse isolation proces. Hvis nogen af disse trin er forlænget i tid, som er nødvendig for et antistof-baserede capture metode, er der en risiko for kompleks dissociation eller øget ikke-specifik binding 8. Tilsvarende hvis tiderne afkortes under cellelyse eller bindende celler kan ikke fuldstændigt lyseret eller effektivt fanget hhv. Hvis antallet af vaske er Decrlempet eller god blanding af harpiksen ikke forekommer i løbet af de bindende eller vasker, så baggrundsniveauer af ikke-specifikke proteiner vil blive øget. Også midler lysis er meget vigtigt som relateret til bindingen effektivitet til harpiksen. Forsøg på at sonikeres prøverne, fjerne det anbefalede rengøringsmiddel, tilføjer SDS eller andre stærke rengøringsmidler og / eller indeholder den proteasehæmmer AEBSF vil resultere i nedsat eller tab af binding af fusionsproteiner og deres komplekser til harpiksen.
Eksisterende metoder til komplekse isolation fra pattedyrceller og menneskelige proteom analyse kamp med den udfordring at reducere baggrunden i analyse ved massespektrometri 16.. Det har været så kraftig, at en samling af forurenende proteiner er skabt af talrige massespektrometri grupper 16. Baggrund i massespektrometri pulldown prøver kan defineres som noget, der forhindrer identifikation afsande interaktionskandidater af agn protein. Som sådan kan baggrund stammer fra kontaminerende non-specifikke proteiner eller også store koncentrationer af agn protein eller antistoffer, der anvendes til udfældning af bait-proteiner. Signifikant arbejde blev udført i at optimere både pulldown protokollen fremlagt her, såvel som harpiksen for at minimere størrelsen af de ikke-specifikke kontaminerende proteiner i pulldown proces. Dette er tydeligt i de sølvfarvning geler og massespektrometri-analyse af kontrollen (figur 2). For at imødegå de høje niveauer af agn protein eller antistoffer, der kan være lige så skadelig som forurenende stoffer og med hvilke andre metoder kæmper, er rullemenuen med SDS eluering anbefales (Protokol afsnit 2.4). På grund af den kovalente binding til harpiksen, vil denne proces lade hovedparten af udgangsmaterialet fusionsproteinet kovalent bundet til harpiksen. Der observeres en lille procentdel af lokkemad i massespektrometrianalyse, som menesat ske gennem hydrolyse, men det udgør ikke et problem for påvisning af andre svagere eller forbigående interaktioner 8.
Som nævnt i indledningen, har betydelige fremskridt i proteomics blevet aktiveret af betydelige fremskridt i massespektrometri 1,7. Derfor er det vigtigt at fremhæve vigtige parametre til valget af massespektrometrianalyse at deconvolute blandingen af proteiner opnået i pulldowns. Instrumentering skal være robust og i stand til rutinemæssigt og effektivt at analysere prøver indeholdende en lille mængde af protein, ofte mindre end <1 ug. Nanoscale kromatografi involverer 50-75 um interne diameter HPLC kolonner med flowhastigheder på 100-300 nl / min rækkevidde er typisk ansat for kompatibilitet med de små stikprøvestørrelser og for at maksimere følsomheden af massespektrometer. For at maksimere de oplysninger erhvervet i en enkelt analyse state of the art massespektrometre kan registrere Højopløsningsmassespektre på en tidsskala kompatibel med førnævnte nanoskala separationer, ≥ 10 Hz, er typisk ansat. Disse instrumenter har attomolar niveauer af følsomhed og kan rutinemæssigt erhverve data med sub ppm forløber og produkt ion masse tolerancerne. Disse egenskaber tjener til at forøge udbyttet af antallet af identificerede proteiner og tilliden forbundet med disse identifikationer.
Med disse data, vi demonstrere fysiologiske cellulære lokalisering, ordentlig protein: protein interaktioner sammen med potentiale for opdagelsen af nye interaktioner, og isolering af aktive komplekser der alle bruger en enkelt konstruktion. Faktisk alternative teknologier kan bruges til hver af disse forskellige aspekter, men sandsynligvis ikke for alle 23,24. Med HaloTag teknologi, kan en multifunktionel tilgang anvendes fremrykkende proteomics undersøgelser og opnå en mere fuldstændig forståelse af proteinfunktion i pattedyrceller.
Disclosures
Offentliggørelse gebyrer for denne artikel er sponsoreret af Promega Corporation. Danette L. Daniels, Jacqui Méndez, Hélène Benink, Andrew Niles, Nancy Murphy og Marjeta Urh er medarbejdere i Promega Corporation, den kommercielle ejer ved overdragelse af patenter i HaloTag teknologi og dens anvendelsesmuligheder. Michael Ford, Richard Jones, Ravi Amunugama, og David Allen er medarbejdere i MSBioworks, som giver massespektrometri tjenester, der er beskrevet i dette manuskript.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Martin Rosenberg, Dr. Gary Tarpley, og Dr. Keith Wood til støtte for dette arbejde, og Dr. James Cali for kritisk læsning af manuskriptet. DLD, JM, HB, NM, AN, JC, og MU er medarbejdere i Promega Corporation. MF, RJ, RA, og DA er ansat i MS Bioworks, LLC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HeLa Cells | ATCC | CCL-2 | Adherent |
| HEK293T Cells | ATCC | CRL-11268 | Adherent |
| Cellular growth media | Invitrogen/Gibco | ||
| PBS - tissue culture certified | Invitrogen/Gibco | ||
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| HaloTag Control Vector | Promega | G6591 | |
| HaloTag-BRD4 | Kazusa DNA Research Institute | FHC11882 | N-terminal HaloTag fusion |
| HaloTag-HDAC1 | Kazusa DNA Research Institute | FHC02563 | N-terminal HaloTag fusion |
| HaloTag Clones containing content | Promega | Various | http://www.promega.com/FindMyGene/ |
| HaloTag Flexi Vectors for cloning (N- or C-terminal) | Promega | Various | Choose based upon expression level and HaloTag orientation |
| HaloTag TMR Ligand | Promega | G8251 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | 18896 | |
| HaloTag Mammalian Pull-Down and Labelling System | Promega | G6500 | Contains HaloTag TMR ligand |
| HaloTag Mammalian Pull-Down System | Promega | G6504 | |
| Protease Inhibitor Cocktail, 50X | Promega | G6521 | |
| Mammalian Lysis Buffer | Promega | G9381 | |
| HaloTag Monoclonal Antibody | Promega | G9211 | |
| ProTEV Plus | Promega | V6101 | |
| RQ1 Dnase | Promega | M6101 | |
| HaloLink Resin | Promega | G1912 | |
| HDAC-Glo | Promega | G6420 | |
| PBS + 0.1% Triton X-100 | For optional imaging | ||
| 4% paraformaldehyde/0.2 M sucrose/PBS | For optional imaging | ||
| Ethanol | |||
| Tissue culture vessels and dishes | |||
| Cell culture incubator | |||
| Disposable cell lifter | Thermo Fisher Scientific | 08-773-1 | |
| Glass homogenizer such as Kontes Dounce Tissue Grinder | Thermo Fisher Scientific | K885300-0002 | 25-27 G needle could also be used |
| Microcentrifuge | |||
| Tube rotator such as Labquake | Thermo Fisher Scientific | 4002110Q | Ideal for binding and washing steps |
| Shaking platform such as Eppendorf Thermomixer | Thermo Fisher Scientific | 05-400-200 | Ideal for SDS elution and TEV cleavage steps |
| Chambered cover glass | Thermo Fisher Scientific | 155409 | For optional imaging |
| Fluorescent Microscrope (555 nm Ex/585 nm Em) | For optional imaging |
References
- Altelaar, A. F., Munoz, J., Heck, A. J. Next-generation proteomics: towards an integrative view of proteome dynamics. Nat Rev Genet. 14, 35-48 (2013).
- Tyers, M., Mann, M.
- Coulombe, B., et al. Interaction networks of the molecular machines that decode, replicate, and maintain the integrity of the human genome. Mol Cell Proteomics. 3, 851-856 (2004).
- Gavin, A. C., et al. Proteome survey reveals modularity of the yeast cell machinery. Nature. 440, 631-636 (2006).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
- Sardiu, M. E., et al. Probabilistic assembly of human protein interaction networks from label-free quantitative proteomics. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 1454-1459 (2008).
- Domon, B., Aebersold, R.
- Daniels, D. L., et al. Examining the complexity of human RNA polymerase complexes using HaloTag technology coupled to label free quantitative proteomics. J Proteome Res. 11, 564-575 (2012).
- Encell, L. P., et al. Development of a dehalogenase-based protein fusion tag capable of rapid, selective and covalent attachment to customizable ligands. Curr Chem Genomics. 6, 55-71 (2012).
- Ohana, R. F., et al. HaloTag-based purification of functional human kinases from mammalian cells. Protein Expr Purif. 76, 154-164 (2011).
- Black, J. C., et al. KDM4A Lysine Demethylase Induces Site-Specific Copy Gain and Rereplication of Regions Amplified in Tumors. Cell. 154, 541-555 (2013).
- Deplus, R., et al. TET2 and TET3 regulate GlcNAcylation and H3K4 methylation through OGT and SET1/COMPASS. EMBO J. 32, 645-655 (2013).
- Galbraith, M. D., et al. HIF1A Employs CDK8-Mediator to Stimulate RNAPII Elongation in Response to Hypoxia. Cell. 153, 1327-1339 (2013).
- Collins, M. O., Choudhary, J. S. Mapping multiprotein complexes by affinity purification and mass spectrometry. Curr Opin Biotechno. 19, 324-330 (2008).
- Collins, S. R., et al. Toward a comprehensive atlas of the physical interactome of Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Proteomics. 6, 439-450 (2007).
- Mellacheruvu, D., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nat Methods. 10, 730-736 (2013).
- Dawson, M. A., Kouzarides, T. Cancer epigenetics: from mechanism to therapy. Cell. 150, 12-27 (2012).
- Jang, M. K., et al. The bromodomain protein Brd4 is a positive regulatory component of P-TEFb and stimulates RNA polymerase II-dependent transcription. Mol Cell. 19, 523-534 (2005).
- Rahman, S., et al. The Brd4 extraterminal domain confers transcription activation independent of pTEFb by recruiting multiple proteins, including NSD3. Mol Cell Biol. 31, 2641-2652 (2011).
- Yang, Z., et al. Recruitment of P-TEFb for stimulation of transcriptional elongation by the bromodomain protein Brd4. Mol Cell. 19, 535-545 (2005).
- Halley, F., et al. A bioluminogenic HDAC activity assay: validation and screening. J Biomol Screen. 16, 1227-1235 (2011).
- Mack, G. S.
- Daniels, D. L., Urh, M. Isolation of intracellular protein--DNA complexes using HaloCHIP, an antibody-free alternative to chromatin immunoprecipitation. Methods Mol Biol. 977, 111-124 (2013).
- Urh, M., Rosenberg, M. HaloTag a Platform Technology for Protein Analysis. Curr Chem Genomics. 6, 72-78 (2012).
