Summary
HaloTag teknologi er en multifunksjonell teknologi som har vist betydelig suksess i isolering av både små og store proteinkomplekser fra pattedyrceller. Her vi fremheve fordelene med denne teknologien i forhold til eksisterende alternativer og demonstrere sin nytteverdi for å studere mange aspekter av protein funksjon inne eukaryote celler.
Abstract
Forskning i proteomikk har eksplodert de siste årene med utviklingen innen massespektrometri evner som har ført til karakterisering av mange proteomes, inkludert de fra virus, bakterier og gjær. Til sammenligning, analyse av den menneskelige proteomet henger etter, delvis på grunn av det store antallet av proteiner som må utredes, men også kompleksiteten i nettverk og interaksjoner disse stede. Å spesifikt møte utfordringene i å forstå den menneskelige proteomet, har vi utviklet HaloTag teknologi for protein isolasjon, spesielt sterk for isolering av multiprotein komplekser og tillater mer effektiv fangst av svake eller forbigående interaksjoner og / eller proteiner i lav overflod. HaloTag er en genetisk kodet protein fusion tag, designet for kovalente, bestemt, og rask immobilisering eller merking av proteiner med ulike ligander. Utnytte disse egenskapene, ble en rekke bruksområder for pattedyrceller utviklet til karakterize protein funksjon og her presenterer vi metoder inkludert: protein pull-downs som brukes for oppdagelsen av nye interaksjoner eller funksjonelle analyser, og cellulær lokalisering. Vi finner betydelige fordeler i fart, spesifisitet, og kovalente fangst av fusjonsproteiner til overflater for proteomikk analyser i forhold til andre tradisjonelle ikke-kovalente tilnærminger. Vi viser disse og den brede nytte av teknologien ved hjelp av to viktige epigenetiske proteiner som eksempler, det menneskelige bromodomain protein BRD4, og histondeacetylase HDAC1. Disse eksemplene viser kraften i denne teknologien i muliggjør oppdagelsen av nye interaksjoner og karakter cellulær lokalisering i eukaryoter, som vil sammen videre forståelse av menneskelige funksjonelle proteomikk.
Introduction
Forståelse av cellulær funksjon, respons på stimuli, og endringer i utvikling og / eller sykdomstilstander er intrikat knyttet til de-konvolusjon av proteomet gjennom disse ulike dynamiske tilstander 1,2. Mye har blitt gjort for å forstå proteomet av lavere organismer, men gitt antall proteiner og alle mulige interaksjoner, har dette vært svært utfordrende i møte den menneskelige proteomet 1,3-7. Fremskritt innen massespektrometri har sterkt aktivert evnen til å gjennomføre disse studiene, og her presenterer vi en ekstra og betydelig fremskritt med utviklingen av HaloTag teknologi for både effektiv fangst av protein komplekser og funksjonell karakterisering av humane proteiner fra pattedyrceller 8-10. Denne teknologien har nylig blitt vist i flere studier for å være en kritisk faktor for oppdagelsen av viktige interaksjoner, noe som åpner for innsikt i romanen protein funksjon og understanding av sykdom 11-13.
Den HaloTag protein fusjon ble opprinnelig utviklet for å løse flere utfordringer av tradisjonelle affinitet koder og antistoffer som nærstående til protein fangst, rensing, og merking 8-10. Innenfor nesten alle metoder for protein fangst og rensing, er det en ikke-kovalent interaksjon trinn som anvendes for anrikning av et bestemt protein 14. Under dette trinn, kan proteinet og / eller kompleks atskille på grunn av diffusjon, særlig hvis prosessen krever timer i stedet for minutter. For å løse dette problem, ble fusjonsproteinet spesifikt konstruert for å hurtig og irreversibelt samhandle med sine ligander, som kan være enten partikler, overflater, eller fluoroforer 9. Derfor når det er bundet til sin ligand, forblir den bundet, noe som er en av de mest differensierende faktor i forhold til andre affinitet koder. Også vist her, er evnenå ta opp forskjellige biologiske spørsmål med en enkelt konstruksjon, noe som er mulig ved å veksle ligander 9 (figur 1). For eksempel, for å avhøre protein-interaksjoner eller funksjon, er overflate-ligander benyttes for fangst av protein eller komplekser (figur 1). I et separat eksperiment, kan den samme fusjonsprotein bli fluorescensmerkede å undersøke cellulær lokalisering, handel, eller protein omsetning (figur 1). Det er viktig å huske på er imidlertid at når en ligand er bundet, enten det er en overflate eller en fluorofor, er irreversible og derfor andre ligander kan da senere bli bundet i det samme eksperimentet.
Analyse av eksisterende teknologier for å kartlegge protein interaksjoner avsløre problemer med å effektivt isolere spesifikke interaksjoner, inkludert de som er mer forbigående eller er i lavere overflod 1,6,7,14,15. Også nyere arbeid av tallrike gruppens viser bekymring for at innenfor tradisjonelle isolasjonsmetoder, spesielt i området av menneskelige proteomikk, er det et betydelig antall protein forurensninger som kan maskere signaler fra sanne interactors i massespektrometri analyse 16. Eiendommene som er utviklet for HaloTag protein og dets co-utviklet harpiks adresse vel disse bekymringene. I kan oppnås protokollen for komplekse nedtrekk (figur 1), binding av komplekser i 15 min, som begge fremmer kompleks-fangst og redusere nivåer av ikke-spesifikk binding 8.. I tillegg er irreversibelt binding muliggjør effektiv fangst av lav overflod proteiner og gir mulighet for bruk av langt færre celler, igjen reduserer bakgrunns 8.. Når fangst av komplekser er etablert, protokollen omfatter milde vaskeforholdene for å opprettholde komplekse integritet. Eluering av fangede komplekser kan utføres av to metoder og velge hvilken metode er diktert av målet for den nedstrøms analysis. Hvis man ønsker å analysere eller oppdage samvirkende proteiner ved Western blot eller massespektrometri, så er det anbefalt å eluere komplekser med denatureringsmidler som SDS eller urea (figur 1). Dette er spesielt fordelaktig for massespektrometri som proteinet opprinnelig smeltet til HaloTag, betegnet agnet protein, vil bli tilbake bundet til harpiksen, og dermed vil ikke dominere populasjon av peptider detektert i massespektrometri. Dette betyr imidlertid også at agnet protein vil sannsynligvis ikke være synlig i analyse ved western blot, en signifikant forskjell sammenlignet med andre ikke-kovalente affinitet purifications eller co-immunoutfellinger. Dersom målet er å rense et kompleks intakt som skal brukes for funksjonelle studier, kan eluering utføres med TEV (Tobacco Etch Virus) protease, som gjenkjenner kognatreseptoren spalting sekvensen kodet mellom fusjonsproteinet og agnet protein (figur 1). These prøvene kan også analyseres ved massespektrometri, men som senere vist, vil de inneholder en betydelig mengde av agn protein som kan forhindre deteksjon av lavere mengder, spesifikke interactors.
Her presenterer vi pulldown og bildebehandling protokoller brukes på to viktige terapeutiske proteiner, den bromodomain protein BRD4 og en histondeacetylase, HDAC1 17. Vi har vist med disse eksempler, interaksjon med forventede partnere som bestemt ved massespektrometri, enzymatisk aktivitet etter kompliserte isolering for HDAC1 og riktig cellulær lokalisering for begge. Sammen utgjør disse resultatene viser det multifunksjonelle natur og styrke av teknologien for karakterisering av eukaryotiske proteininteraksjoner og funksjon.
Protocol
Merk: Den følgende protokoll kan anvendes med en hvilken som helst HaloTag smelting og i hvilken som helst cellelinje av valget stabilt eller transient transfektert. For disse eksemplene, vil vi gi protokoller for transient transfeksjon av HaloTag fusjoner i HEK293T eller HeLa celler. For alle forsøkene, anbefales det bruk av proteinet bare kontroll.
En. Fusion Protein Expression Test
- Skaff fusjonsprotein konstruere:
- Skaffe pre-laget HaloTag onsvektor eller konstruere bruke eksisterende vektorer. For mer informasjon om tilgjengelige konstruksjoner, kan du se tabell over spesifikke reagenser.
- Hvis du gjør noen klone, er det anbefalt å sekvensere verifisere DNA.
- Testing uttrykk for fusjonsprotein og kontroll:
- For hver prøve forberede 250 pl av 1X SDS Dye Loading buffer (60 mM Tris-HCL pH 6,8, 0,75 mM bromfenolblå, 12,5% glycerol, 100 mM ditiotreitol, 0,5% SDS).
- For hvert fusjonsproteinog kontroll, 0,5 ml porsjon av HEK293T eller HeLa-celler i deres passende medier ved en tetthet på 2-4 x 10 5 celler / ml i standard 24 brønn plate.
- Inkuber i 18-24 timer ved 37 ° C og 5% CO2, og deretter transfektere som anbefalt.
- 24 timer post-transfeksjon, tilsett 0,5 pl 5mM tetra-metyl-rhodamin (TMR) ligand til mediet fra hver brønn, og bland forsiktig plate.
- Inkuber transfekterte celler inneholdende ligand i 15 min ved 37 ° C og 5% CO2.
- Sug reduksjon i medier som inneholder ligand, og vaskes hver brønn av celler forsiktig med 1 ml PBS RT.
- Aspirer av PBS og utføre en andre vask med 1 ml PBS RT.
- Fjern PBS og tilsett 200 mL 1X SDS Loading dye buffer direkte til cellene.
- Pipette lysatet fra plate til 1,5 ml Eppendorf-rør.
- Koke-lysat i 5 min ved 95 ° C.
- Fjern 5-10 pl av reaksjonen og belastningen på SDS-PAGE gel.
- Bruk en fluoriserende oppdagelse skanner(TMR Eksitasjon: 555 nm, emisjon: 585 nm) for å oppdage band. Bruk fluorescerende protein markører som standarder.
- Hvis en fluorescerende deteksjon skanner er tilgjengelig, utføre vestlige blotter bruker antistoffer mot enten agn protein eller protein fusjon tag å oppdage uttrykk for fusjonsprotein.
2. Protein Pulldowns
- Utarbeidelse av forbigående transfektert celler:
- For hver blanding eller kontroll forberede en 15 cm skål med 30 ml av cellene ved 3-4 x 10 5 celler / ml, eller 1 til 1,2 x 10 7 celler totalt per konstruere.
- Inkuber i 18-24 timer ved 37 ° C og 5% CO2, og deretter transfektere konstruere som anbefalt.
- Etter 24-48 timer etter transfeksjon, fjerne media og forsiktig vaske celle laget med 20-25 ml iskald PBS.
- Fjern PBS vask, deretter legge 25-30 ml 4 ° C kjølt PBS og forsiktig skrape celler av platen.
- Samle cellene inn koniske rør og sentrifugeresfuge i 5-10 minutter ved 2000 x g og 4 ° C.
- Kast supernatanten og plassere cellepelleten ved -80 ° C i minst 30 min eller maksimalt 6 måneder.
- Ekvilibrering av HaloLink harpiks:
- For hver fusjon eller kontrollutvalget, forberede 12 ml Resin Ekvilibrering / vaskebuffer (100 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, og 0,005% IGEPAL CA-630). Merk: Det er svært viktig å lage og bruke Resin Ekvilibrering buffer innen 12 timer så utvannet IGEPAL CA-630 er ikke stabil eller effektiv utover denne tidsrammen.
- Rist eller bland-harpiks for å oppnå en jevn suspensjon.
- For hver rullegardin eksperiment, dispensere 200 pl av harpiks inn i et 1,5 ml mikrosentrifugerør.
- Sentrifuger i 1 min ved 800 xg (for eksempel 3000 rpm i en mikrosentrifuge), deretter forsiktig fjernes og kastes supernatanten (etanol) uten å forstyrre harpiks på bunnen av røret.
- Legg 800 mL av Resin Ekvilibrering / Wash buffer og blandes grundig ved å snu røret flere ganger.
- Sentrifuger for 2 min ved 800 xg, deretter forsiktig fjerne og kast supernatanten.
- Gjenta trinn 2.2.5 og 2.2.6 to ganger for totalt tre vasker.
- Ikke fjern den siste vask eller supernatanten til den er klar til å legge cellular lysates beskrevet nedenfor (Trinn 2.3.8) for å hindre at harpiks fra å tørke ut.
- Binding og vasking av fusion komplekser:
- For hver prøve forberede 500 pl av pattedyr Lysis-buffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% Na-deoksykolat) og 1 ml 1X TBS-buffer (100 mM Tris-HCl pH 7,5 og 150 mM NaCl).
- Tine cellen pellets og resuspender i 300 mL av pattedyr Lysis Buffer ved pipettering opp og ned eller kort virvling.
- Legg 6 mL av 50X proteasehemmer Cocktail (800 mikrogram / ml benzamidin HCl, 500 mikrogram / ml fenantrolin, 500 mikrogram / ml aprotinin, 500 mikrogram / ml leupeptin, 500 & #. 181 g / ml pepstatin A, 50 mM PMSF) Merk: Protease cocktails som inkluderer AEBSF kan ikke brukes da dette forstyrrer protein fusion tag bindende.
- Tilsett 3 mL RQ1 DNase og invertere i 10 min ved RT.
- Douce-homogenisator med glass 2,0 ml størrelse; . 25-30 slag på isen, eller passere cellene gjennom en 25 eller 27 G nål 5-10 ganger for å fulllyse Merk: Sonikering er ikke anbefalt som komplekser kan falle fra hverandre og overoppheting kan påvirke protein fusjon tag aktivitet.
- Sentrifuger ved 14.000 xg i 5 min ved 4 ° C for å fjerne lysatet.
- Overfør klart lysate, ca 300 mL totale volumet, til nye rør og legg på is.
- Legg til fjerne Lysate ytterligere 700 mL 1X TBS buffer og bland godt med pipettering opp og ned.
- Ta ekvilibrert harpiks rør fremstilt i trinn 2.2.8 og fjerne siste vask / supernatant fra harpiks uten å forstyrre harpiks på bunnen av røret.
- Legg til hver tuvære av harpiks, 1 ml av fortynnet lysat.
- Inkuber under blanding på en tube rotator (eller svak mikser) i 15 min ved 22 ° C. Bemerk: avsetning av harpiks i løpet av denne tiden reduserer bindingseffektivitet. Ved binding ved 4 ° C er ønskelig, gjør dette ved å blande i 1 time.
- Sentrifuger harpiks rør for 2 min ved 800 xg og kast supernatanten.
- Tilsett 1 ml av Resin Ekvilibrering / vaskebuffer gjort på Trinn 2.2.1 og bland godt ved å snu harpiks tube for hånd flere ganger.
- Sentrifuger harpiks rør for 2 min ved 800 xg og kast vask.
- Gjenta trinn 2.3.12 fulgt av 2.3.14 tre ekstra ganger.
- Tilsett 1 ml av Resin Ekvilibrering / vaskebuffer og inkuber ved 22 ° C i 5 min med konstant rotasjon.
- Sentrifuger harpiks rør for 2 min ved 800 xg og kast vask.
- Avhengig end programmet (se Introduksjon for nærmere forklaring), videre til enten punkt 2.4 eller 2.5.
- SDS eluering for denaturering gels, vestlige blotter, eller massespektrometri:
- Resuspender harpiks fra hver prøve i 50 ul SDS Eluering buffer (1% SDS og 50 mM Tris-HCl pH 7,5)
- Rist rør ved RT i 30 min.
- Sentrifuger i 2 min ved 800 xg og overføre eluater til ferske rør for analyse.
- For vestlige blot eller sølv flekken gel, last 5-10 mL på en SDS denaturering gel.
- For massespektrometri, lagre 40 ul av hver prøve ved -20 ° C.
- TEV Protease eluering for funksjonelle analyser, vestlige blotter, eller massespektrometri:
- Etter fjernelse av den siste vask, resuspender harpiksen i 50 ul ProTEV spalting buffer og 30 enheter TEV enzym.
- Inkuber ved 25 ° C med risting i 1 time.
- Sentrifuger i 2 min ved 800 x g.
- Overfør eluatet til ferske rør.
- Lagres prøven ved 4'C for øyeblikkelig bruk i funksjonelle analyser.
Tre.Cellular Imaging av fluorescently merkede Fusion Proteiner Ved hjelp av en Cytoplasmatisk og Nuclear Gjennomtrengelig Ligand
- Transfektere, etikett, og bildet celler:
- I en 8 godt kamret dekkglass for hvert fusjonsprotein eller kontroll, plate 400 ul av HeLa-celler i deres passende medier i hver brønn ved en tetthet på 1-2 x 10 5 celler / ml.
- Inkuber i 18-24 timer ved 37 ° C og 5% CO2, og deretter transfektere som anbefalt.
- 18-24 timer post-transfeksjon, fortynnes TMR ligand 1:200 i hensiktsmessige cellulære materiale, tilsett 100 pl av denne oppløsningen til hver brønn, og bland forsiktig.
- Inkuber transfekterte celler inneholdende ligand i 15 min ved 37 ° C og 5% CO2.
- Sug reduksjon i medier som inneholder ligand, og erstatt med 500 ul av passende media som mangler proteinfusjons tag ligand, som har blitt forvarmet til 37 ° C.
- Gjenta to ganger for totalt tre vaskinger.
- Sett cellene tilbake i inkubator (376, C og 5% CO2) i 30 min.
- Sug av media og erstatte med 500 mL av aktuelle mediene, som har blitt pre-varmet til 37 ° C.
- Bilde på et mikroskop ved hjelp av egnede oppkjøps parametere (TMR Eksitasjon: 555 nm, emisjon: 585 nm).
Representative Results
Når man arbeider med en hvilken som helst ny fusjonsprotein, er det viktig å først test for ekspresjon av det protein etter transfeksjon og også bekrefte at et protein med den riktige molekylvekt som produseres. Som HaloTag fusjonsproteiner kan være fluorescensmerket og kovalent merket med permeable, eller avhengig av lokalisering, ugjennomtrengelig ligander, er det mulig å raskt bestemme ekspresjon ved å anvende cellulære lysater å denaturerende gel elektroforese etterfulgt av scanning på en fluorimager. Ved hjelp av protokollen beskrevet i pkt. 1.2, uttrykk for Halo-BRD4 (189 kD) og HaloTag alene kontroll (Ctrl) er observert (34 kD, figur 2A). Som nevnt i protokollen, kan ekspresjonen av fusjonsproteiner også påvises ved hjelp av tradisjonelle Western-blots med anti-HaloTag antistoffer, eller hvis de er tilgjengelige, antistoffer til agn protein. Hvis mulig, anbefales det å bruke fluorescerende ligand i stedet som det er mer spesifikk, raskere og enklere tHan antistoffpåvisning, og også kvantitative 10.
Etter ekspresjon av de riktige full-lengde fusjonsprotein er bekreftet, kan protein nedtrekk utføres. Vist i figur 2B er sølv farget gels av biologiske kopier av Halo-BRD4 og Ctrl nedtrekk eluted av SDS (Protokoll § 2.4) som viser høy reproduserbarhet. Den sølvplett geler viser er funnet et stort antall av proteiner for å interagere med BRD4 protein og meget lav bakgrunn i kontrollgruppen (Figur 2B). Som nevnt i innledningen, i denne prosessen med eluering, halo-BRD4 vil ikke elueres fra harpiksen som den forblir kovalent bundet. Derfor er det ikke en signifikant bånd ved denne molekylvekt som blir detektert i sølvfarge (figur 2B) eller western blot (data ikke vist). For å finne ut om disse proteinene er spesifikke for BRD4, ble væskekromatografi massespektrometri (LC-MS/MS) utført på complex blanding oppnås etter SDS eluering. Vist i figur 2C er spektral-teller og normalisert spektral overflod faktor (NSAF)-verdier for kjente interactors BRD4 av 18 til 20 finner i Halo-BRD4 massespektrometri-analyse. Den høye overflod av komponenter fra pTEFb 18,20 og også BRD9 19 protein bekrefte spesifikk fangst av BRD4 komplekser. Som spådd av sølv beis gels (figur 2B), ble en rekke andre proteiner også identifisert som potensielle interactors av BRD4 som ikke ble observert i kontrollgruppen (data ikke vist). Ettersom disse er tidligere ukjent, de trenger å være uavhengig bekreftet av andre metoder for å bekrefte om proteinet er en sann Interactor, og i så fall, hvis det er direkte eller indirekte knyttet til BRD4.
Isolerte komplekser kan også bli utredet for aktivitet; det er anbefalt å eluere komplekser ved hjelp av TEV-protease (Protokoll § 2.5), slik at de opprettholder funksjonsty. I figur 3A, en sølv flekk gel av halo-HDAC1 mater komplekser som er frigjort fra harpiksen ved hjelp av TEV protease er vist. Som TEV protease, vil holde fast på en linker område mellom protein fusjonssignalet og dets fusjonspartner, betydelige mengder av agnet protein, i dette tilfelle HDAC1, er observert (figur 3A). For å finne ut om denne fraksjonen inneholdt HDAC1 aktivitet, ble eluted TEV prøver testet i en selvlysende HDAC analysen, HDAC-Glo 21. Som vist i figur 3B, HDAC1 mater prøvene viste høye nivåer av HDAC1 aktivitet (kolonne 1), som ble spesifikt inhibert av en kjent HDAC-inhibitor, SAHA 22 (kolonne 2). Som kontroller for å ytterligere demonstrere spesifisitet, ble ingen HDAC hemming observert med et beslektet sirtuin familie hemmer, EX-527 22 (kolonne 3) og ikke noe signal ble oppdaget ved hjelp av buffer alene uten HDAC1 pulldown prøven lagt (kolonne 4).
En betydelig del av funksjonal proteomikk og forståelse komplekser, er også å forstå protein lokalisering og / eller menneskehandel. Ettersom disse samme fusion konstruerer kan fluorescensmerkede inni cellene, overvåket vi deres lokalisering ved hjelp confocal bildebehandling. Etter protokollen i § 3, ble HeLa celler forbigående transfektert med Halo-BRD4 (Figur 4A) og Halo-HDAC1 (Figur 4B) fluorescensmerkede med TMR ligand og avbildes. Som vist på figurene 4A og 4B, som begge er lokalisert i kjernen som forventet 17. Disse data viser at nærværet av merkelappen ikke endret fysiologisk cellulær lokalisering av dets fusjonspartnere.
Figur 1. Skjematisk av protein pulldown og confocal bildebehandlingsprogrammer. Bruke som ingle konstruere flere programmer for å forstå protein funksjon i pattedyrceller er mulig. For det hele tatt, er et halo-fusjonskonstruert stykke, enten stabilt eller forbigående uttrykt i adherente eller suspensjon pattedyrceller. For protein komplekse nedtrekk, blir cellene deretter lysert, komplekser er kovalent fanget på harpiks, og eluert gjennom enten SDS eluering (venstre-veien) eller TEV cleavage (høyre-veien). SDS eluering anbefales videre til massespektrometri-analyse, mens TEV spalting er optimal for å utføre funksjonelle analyse. Å karakteruttrykk, cellulær lokalisering, trafficking hendelser, eller protein omsetning, er levende celler uttrykker fusjonsproteiner fluorescensmerkede og videre analysert på SDS PAGE geler eller bruke confocal bildebehandling. Begge cellepermeable, eller ugjennomtrengelige fluorescerende ligander er tilgjengelig avhengig av lokalisering eller presentasjon av fusjonsproteinet i cellen.
igure 2 "fo: content-width =" 6in "src =" / files/ftp_upload/51553/51553fig2highres.jpg "width =" 600 "/>
Figur 2. Halo-BRD4 protein uttrykk, pulldown, og massespektrometri analyse. (A) En SDS-PAGE-geler som viser ekspresjonen av halo-BRD4 fusjonsprotein, 189 kD, og Halo protein fusjonssignal alene, 34 kD, kontroll (Ctrl) innenfor en HEK293T cellulære lysatet merket med TMR ligand (Protocol avsnitt 2.1). Gels ble skannet med fluorimager for deteksjon og et fluorescerende molekylvekt markør ble brukt. (B) Silver beis gels av biologiske replikater for nedtrekk av Halo-BRD4 og Ctrl prøver eluted med SDS. Molekylære vektstørrelser er angitt for gelen. (C) Spektrale tellinger (venstre panel) og normaliserte spektrale overflod faktorer (NSAF) verdier (høyre panel) som står for proteinmolekylvekt av proteinene identifisert i massespektrometri-analyse av biologiske replikater av halo- BRD4 og Ctrl. Vist er proteiner kjent for å samhandle with BRD4, inkludert komponenter av pTEFb (CDK9 og Cyclin T) 18,20, samt BRD9 19. Ingen peptider fra disse proteinene ble identifisert i Ctrl.
Figur 3. Halo-HDAC1 kompleks isolasjon og aktivitetsanalyse. (A) Silver flekk gels som viser isolering av Halo-HDAC1 komplekser og bakgrunn fra Ctrl etter TEV cleavage (Protokoll punkt 2.5). Den fremtredende HDAC1 band (55 kDa) og TEV protease bandet er merket. Den frie HDAC1 genereres av TEV spalting i en optimalisert linkeren mellom HaloTag og HDAC1 fusjonssekvens etter fangst på harpiksen (figur 1). (B) graf som viser aktiviteten av HDAC1 komplekse isoleringer prøver i en luminescerende histone deacetylase assay HDAC- Glo 21. Kolonne 1 av grafen viser høy levels av HDAC aktivitet som finnes med Halo-HDAC1 pulldown prøver (HDAC1). Kolonne 2 viser denne aktiviteten kan være spesielt redusert ved tilsetning av HDAC-inhibitor, SAHA 22, til de HDAC1 mater prøvene. Som kontroller Kolonne 3 viser en deacetylase hemmer spesifikke for sirtuin familien, men ikke HDACs, EX-527 22, ikke hemmer HDAC1 aktivitet og kolonne 4 viser ingen aktivitet er observert ved bruk av buffer alene.
Fig. 4. Halo-BRD4 og Halo-HDAC1 konfokal avbildning. Lever celle confocal avbildning av HeLa celler transfektert med halo-BRD4 (A), eller halo-HDAC1 (B) fluorescensmerkede med TMR ligand. (A) Halo-BRD4 ekspresjon er begrenset til kjernen og (B) Halo-HDAC1 uttrykk er overveiende nuclear. Venstre side av paneler er fluorescerende kanal og høyre side er en overlapping av fluorescerende kanal med DIC kanal for hver. Bildene ble kjøpt på en konfokalmikroskop utstyrt med en 37 ° C + CO 2 miljø kammer ved hjelp av egnede filter sett. Scale barer = 20 mikrometer.
Discussion
Presenteres her er to fusjonsproteiner, Halo-BRD4 og Halo-HDAC1, karakterisert eukaryote pattedyrceller for uttrykk, protein kompleks isolasjon og aktivitet, og cellulær lokalisering. I arbeidet gjennom disse forskjellige protokoller, er det flere viktige trinnene for suksess for hvert forsøk. Som tilfellet er med alle fusjonsprotein, et uttrykk nivå og plassering av koden i seg selv kan være kritisk for å opprettholde fysiologi. Det er derfor viktig å tenke på at N-og / eller C-terminal fusjoner må være utformet hvis forkunnskaper eller arbeide med en annen kode ikke har blitt demonstrert for bestemt protein av valget. Når det gjelder ekspresjon, dersom nivået er for høyt, fortynning av DNA kan utføres ved transfeksjon eller bruk av vektorer med svakere promotorer er mulig å oppnå det nivå som er hensiktsmessig. Tidligere arbeid har blitt utført viser effektiv isolering av makromolekylære komplekser på endogent leVels uttrykks 8, slik at arbeid på svært lave nivåer av uttrykk. Hvis det er mulig, vil mobillokaliseringsstudier også være i stand til å gi innsikt med hensyn til den optimale tag plasseringsposisjonen, så vel som relative uttrykk som er nødvendig for riktig fysiologi.
Når fusjonsproteiner som er klare for mater eksperimenter, for å oppnå maksimal suksess med protokollen er det svært viktig å følge de anbefalte tidsrammer i lysis, binding, og vaskeseksjoner, som en av de største fordelene er at hastigheten av komplekset isolert prosess. Hvis noen av disse trinnene er forlenget i tid, slik som er nødvendig for et antistoff-basert fangst-metoden, er det en risiko for kompleks disassociation eller økt ikke-spesifikk binding 8.. Tilsvarende hvis tidene er forkortet under cellulær lyse eller bindende, celler kan ikke være helt lyseres eller effektivt fanget hhv. Hvis antall vasker er Decrlettet eller god blanding av harpiksen forekommer ikke ved de bindende eller vaskinger, så bakgrunnsnivåer av ikke-spesifikke proteiner vil bli økt. Dessuten er meget viktig som relatert til bindingseffektivitet til harpiksen midlene for lysis. Forsøk på å sonicate prøver, fjerne den anbefalte vaskemiddel, legger SDS eller andre sterke vaskemidler, og / eller omfatter protease inhibitor AEBSF vil resultere i redusert eller tap av binding av fusjonsproteiner og deres komplekser til harpiksen.
Eksisterende metoder for komplekse isolasjon fra pattedyrceller og menneske proteomikk analyser sliter med utfordringen om å redusere bakgrunn i analyse av massespektrometri 16. Dette har vært så betydelig at et oppbevaringssted for forurensende proteiner har blitt skapt av en rekke massespektrometri gruppene 16. Bakgrunn i masse-spektrometri materprøver kan defineres som noe som hindrer identifisering avsanne interactors av agnet protein. Som sådan kan bakgrunn oppstå fra forurensende ikke-spesifikke proteiner eller også store konsentrasjoner av agn protein eller antistoff som brukes til å utfelle agn proteiner. Betydelig arbeid ble gjort på å optimalisere både rullegardin protokoll er presentert her, i tillegg til harpiksen for å redusere nivået av de ikke-spesifikke forurensende proteiner i rullegardinprosessen. Dette er tydelig i de sølvplett geler og massespektrometri-analyse av kontrollen (fig. 2). For å møte de høye nivåer av agn protein eller antistoffer som kan være like skadelig som forurensninger og med hvilke andre metoder sliter, er nedtrekk med SDS eluering anbefalt (Protokoll § 2.4). På grunn av den kovalente tilknytning til harpiksen, vil denne prosess lar mesteparten av start fusion protein kovalent bundet til harpiksen. En liten andel av agnet er observert i massespektrometri-analyse, som antaså skje gjennom hydrolyse, men det gjør ikke presentere et problem for påvisning av andre svakere eller forbigående interaksjoner åtte.
Som nevnt i innledningen, har betydelige fremskritt innen proteomikk blitt aktivert av betydelige fremskritt innen massespektrometri 1,7. Derfor er det viktig å fremheve viktige parametre for valg av massespektrometri-analyse for å deconvolute blandingen av proteiner oppnådd i de nedtrekk. Instrumentering må være robust og i stand til rutinemessig og effektivt å analysere prøver som inneholdt en liten mengde protein, ofte mindre enn <1 pg. Nanoskala kromatografi involverer 50-75 mikrometer interne diameter HPLC kolonner med strømningsrater i 100-300 nl / min rekkevidde er vanligvis ansatt for kompatibilitet med de små utvalgsstørrelser og å maksimere følsomheten til massespektrometer. For å maksimere informasjon som erverves i en enkelt analyse stat of the art massespektrometre i stand til å skaffe høy oppløsning masse spektra på en tidsskala kompatibel med nevnte nanoskala separasjoner, ≥ 10 Hz, er typiske verdier. Disse instrumentene har attomolar nivåer av følsomhet og kan rutinemessig skaffe data med sub ppm forløper og produkt ion masse feiltoleranser. Disse kvalitetsparametere tjene til å øke utbyttet av antallet identifiserte proteiner og selvtilliten assosiert med disse identifikasjoner.
Med disse dataene viser vi fysiologisk cellulær lokalisering, riktig protein: protein interaksjoner sammen med potensial for funn av nye interaksjoner, og isolering av aktive komplekser alt ved hjelp av en enkel konstruksjon. Faktisk alternative teknikker kan anvendes for hver av disse forskjellige aspekter, men sannsynligvis ikke for alle 23,24. Med HaloTag teknologi, kan en multifunksjonell tilnærming brukes, fremme proteomics studier og å skaffe en mer fullstendig forståelse av proteinfunksjon i pattedyrceller.
Disclosures
Publiserings avgifter for denne artikkelen er sponset av Promega Corporation. Danette L. Daniels, Jacqui Méndez, Hélène Benink, Andrew Niles, Nancy Murphy og Marjeta Urh er ansatte i Promega Corporation, den kommersielle eieren ved tildeling av patenter i HaloTag teknologien og dens applikasjoner. Michael Ford, Richard Jones, Ravi Amunugama, og David Allen er ansatte i MSBioworks, som gir massespektrometri tjenestene som er beskrevet i dette manuskriptet.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Martin Rosenberg, Dr. Gary Tarpley, og Dr. Keith Wood for støtte i dette arbeidet, og Dr. James Cali for kritisk lesing av manuskriptet. DLD, JM, HB, NM, AN, JC, og MU er ansatte i Promega Corporation. MF, RJ, RA, og DA er ansatte i MS Bioworks, LLC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HeLa Cells | ATCC | CCL-2 | Adherent |
| HEK293T Cells | ATCC | CRL-11268 | Adherent |
| Cellular growth media | Invitrogen/Gibco | ||
| PBS - tissue culture certified | Invitrogen/Gibco | ||
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| HaloTag Control Vector | Promega | G6591 | |
| HaloTag-BRD4 | Kazusa DNA Research Institute | FHC11882 | N-terminal HaloTag fusion |
| HaloTag-HDAC1 | Kazusa DNA Research Institute | FHC02563 | N-terminal HaloTag fusion |
| HaloTag Clones containing content | Promega | Various | http://www.promega.com/FindMyGene/ |
| HaloTag Flexi Vectors for cloning (N- or C-terminal) | Promega | Various | Choose based upon expression level and HaloTag orientation |
| HaloTag TMR Ligand | Promega | G8251 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | 18896 | |
| HaloTag Mammalian Pull-Down and Labelling System | Promega | G6500 | Contains HaloTag TMR ligand |
| HaloTag Mammalian Pull-Down System | Promega | G6504 | |
| Protease Inhibitor Cocktail, 50X | Promega | G6521 | |
| Mammalian Lysis Buffer | Promega | G9381 | |
| HaloTag Monoclonal Antibody | Promega | G9211 | |
| ProTEV Plus | Promega | V6101 | |
| RQ1 Dnase | Promega | M6101 | |
| HaloLink Resin | Promega | G1912 | |
| HDAC-Glo | Promega | G6420 | |
| PBS + 0.1% Triton X-100 | For optional imaging | ||
| 4% paraformaldehyde/0.2 M sucrose/PBS | For optional imaging | ||
| Ethanol | |||
| Tissue culture vessels and dishes | |||
| Cell culture incubator | |||
| Disposable cell lifter | Thermo Fisher Scientific | 08-773-1 | |
| Glass homogenizer such as Kontes Dounce Tissue Grinder | Thermo Fisher Scientific | K885300-0002 | 25-27 G needle could also be used |
| Microcentrifuge | |||
| Tube rotator such as Labquake | Thermo Fisher Scientific | 4002110Q | Ideal for binding and washing steps |
| Shaking platform such as Eppendorf Thermomixer | Thermo Fisher Scientific | 05-400-200 | Ideal for SDS elution and TEV cleavage steps |
| Chambered cover glass | Thermo Fisher Scientific | 155409 | For optional imaging |
| Fluorescent Microscrope (555 nm Ex/585 nm Em) | For optional imaging |
References
- Altelaar, A. F., Munoz, J., Heck, A. J. Next-generation proteomics: towards an integrative view of proteome dynamics. Nat Rev Genet. 14, 35-48 (2013).
- Tyers, M., Mann, M.
- Coulombe, B., et al. Interaction networks of the molecular machines that decode, replicate, and maintain the integrity of the human genome. Mol Cell Proteomics. 3, 851-856 (2004).
- Gavin, A. C., et al. Proteome survey reveals modularity of the yeast cell machinery. Nature. 440, 631-636 (2006).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
- Sardiu, M. E., et al. Probabilistic assembly of human protein interaction networks from label-free quantitative proteomics. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 1454-1459 (2008).
- Domon, B., Aebersold, R.
- Daniels, D. L., et al. Examining the complexity of human RNA polymerase complexes using HaloTag technology coupled to label free quantitative proteomics. J Proteome Res. 11, 564-575 (2012).
- Encell, L. P., et al. Development of a dehalogenase-based protein fusion tag capable of rapid, selective and covalent attachment to customizable ligands. Curr Chem Genomics. 6, 55-71 (2012).
- Ohana, R. F., et al. HaloTag-based purification of functional human kinases from mammalian cells. Protein Expr Purif. 76, 154-164 (2011).
- Black, J. C., et al. KDM4A Lysine Demethylase Induces Site-Specific Copy Gain and Rereplication of Regions Amplified in Tumors. Cell. 154, 541-555 (2013).
- Deplus, R., et al. TET2 and TET3 regulate GlcNAcylation and H3K4 methylation through OGT and SET1/COMPASS. EMBO J. 32, 645-655 (2013).
- Galbraith, M. D., et al. HIF1A Employs CDK8-Mediator to Stimulate RNAPII Elongation in Response to Hypoxia. Cell. 153, 1327-1339 (2013).
- Collins, M. O., Choudhary, J. S. Mapping multiprotein complexes by affinity purification and mass spectrometry. Curr Opin Biotechno. 19, 324-330 (2008).
- Collins, S. R., et al. Toward a comprehensive atlas of the physical interactome of Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Proteomics. 6, 439-450 (2007).
- Mellacheruvu, D., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nat Methods. 10, 730-736 (2013).
- Dawson, M. A., Kouzarides, T. Cancer epigenetics: from mechanism to therapy. Cell. 150, 12-27 (2012).
- Jang, M. K., et al. The bromodomain protein Brd4 is a positive regulatory component of P-TEFb and stimulates RNA polymerase II-dependent transcription. Mol Cell. 19, 523-534 (2005).
- Rahman, S., et al. The Brd4 extraterminal domain confers transcription activation independent of pTEFb by recruiting multiple proteins, including NSD3. Mol Cell Biol. 31, 2641-2652 (2011).
- Yang, Z., et al. Recruitment of P-TEFb for stimulation of transcriptional elongation by the bromodomain protein Brd4. Mol Cell. 19, 535-545 (2005).
- Halley, F., et al. A bioluminogenic HDAC activity assay: validation and screening. J Biomol Screen. 16, 1227-1235 (2011).
- Mack, G. S.
- Daniels, D. L., Urh, M. Isolation of intracellular protein--DNA complexes using HaloCHIP, an antibody-free alternative to chromatin immunoprecipitation. Methods Mol Biol. 977, 111-124 (2013).
- Urh, M., Rosenberg, M. HaloTag a Platform Technology for Protein Analysis. Curr Chem Genomics. 6, 72-78 (2012).
