Summary
HaloTag teknik är en multifunktionell teknik som har visat betydande framgångar i isolering av både små och stora proteinkomplex från däggdjursceller. Här vi lyfta fram fördelarna med denna teknik jämfört med befintliga alternativ och visa dess användbarhet för att studera många aspekter av proteiners funktion inuti eukaryota celler.
Abstract
Forskning inom proteomik har exploderat de senaste åren med framsteg inom masspektrometri kapacitet som lett till karakteriseringen av många proteom, inklusive de från virus, bakterier och jäst. I jämförelse, analys av det mänskliga proteomet släpar efter, delvis på grund av det stora antal proteiner som måste studeras, men även komplexiteten i nätverk och interaktioner dessa nuvarande. För att specifikt behandla utmaningarna med att förstå den mänskliga proteomen, har vi utvecklat HaloTag teknik för proteinisolering, särskilt stark för isolering av multiproteinkomplex och möjliggör mer effektiv insamling av svaga eller transienta interaktioner och / eller proteiner i begränsad omfattning. HaloTag är en genetiskt kodade proteinfusion tag, designad för kovalent, specifik, och snabb immobilisering eller märkning av proteiner med olika ligander. Utnyttja dessa egenskaper, har ett stort antal ansökningar för däggdjursceller utvecklas till teckenize proteiners funktion och här presenterar vi metoder inklusive: protein rullgardinsmenyerna används för upptäckten av nya interaktioner eller funktionella analyser och cellulär lokalisering. Vi finner betydande fördelar i snabbhet, specificitet, och kovalent fångst av fusionsproteiner till ytor för proteomik analys jämfört med andra traditionella icke-kovalenta metoder. Vi visar dessa och den breda användbarheten av tekniken med hjälp av två viktiga epigenetiska proteiner som exempel, den mänskliga bromodomain protein BRD4 och histondeacetylas HDAC1. Dessa exempel visar kraften i denna teknik för att möjliggöra upptäckten av nya interaktioner och karakterisera cellulär lokalisering i eukaryoter, som kommer tillsammans ytterligare förståelse för mänskliga funktionell proteomik.
Introduction
Förståelse av cellfunktion, respons på stimuli, och förändringar i utvecklings-och / eller sjukdomstillstånd är intimt knuten till de-faltning av proteomet under dessa olika dynamiska stater 1,2. Mycket har gjorts för att förstå den proteomen av lägre organismer, men med tanke på det antal proteiner och alla möjliga interaktioner, har detta varit mycket utmanande att ta itu med den mänskliga proteomen 1,3-7. Framsteg inom masspektrometri har kraftigt aktiverat förmågan att genomföra dessa studier, och här presenterar vi en ytterligare och betydande framsteg med utvecklingen av HaloTag teknik för både effektiv insamling av proteinkomplex och funktionell karakterisering av humana proteiner från däggdjursceller 8-10. Denna teknik har nyligen visats i ett flertal studier för att vara en kritisk faktor för upptäckten av viktiga interaktioner, vilket möjliggör insyn i ny proteinfunktion och understanding av sjukdomen från 11 till 13.
Den HaloTag proteinfusion ursprungligen utvecklades för att hantera flera utmaningar för traditionella affinitets taggar och antikroppar relaterade till protein fånga, rening, och märkningen 8-10. Inom nästan alla metoder för protein avskiljning och rening, finns en icke-kovalent interaktion steg som används för anrikning av ett särskilt protein 14. Under detta steg kan proteinet och / eller komplex disassociate grund av diffusion, speciellt om processen kräver timmar i stället för minuter att slutföra. För att lösa detta problem, var fusionsproteinet specifikt konstruerad för att snabbt och irreversibelt interagera med sina ligander, som kan vara antingen partiklar, ytor, eller fluoroforer 9. Därför när det är bundet till dess ligand, fortfarande bunden, som är en av de mest särskiljande faktor jämfört med andra affinitetsmarkörer. Också visat här, är förmåganatt ta itu med olika biologiska frågor med en enda konstruktion, vilket är möjligt genom att växla ligander 9 (Figur 1). Till exempel, för att förhöra proteininteraktioner eller funktion, är yt-ligander som används för fångst av protein eller komplex (Figur 1). I ett separat experiment, kan samma fusionsprotein vara fluorescensmärkt för att studera cellulära lokaliseringen, trafficking, eller proteinomsättning (Figur 1). Det är viktigt att komma ihåg dock att när en ligand är bunden, oavsett om det är en yta eller en fluorofor, är irreversibla och därför andra ligander kan sedan inte senare bunden i samma experiment.
Analys av befintlig teknik för att kartlägga proteininteraktioner visar svårigheten att effektivt isolera specifika interaktioner, inklusive sådana som är mer övergående eller är i lägre överflöd 1,6,7,14,15. Även senaste arbete av många grupps visar oro för att inom traditionella isoleringsmetoder, särskilt inom området för mänskliga proteomik, det finns ett stort antal protein föroreningar som kan maskera signaler från sanna interagerande i masspektrometrianalys 16. De egenskaper som utvecklats för HaloTag proteinet och dess co-utvecklad harts adress väl dessa farhågor. I kan uppnås protokollet för komplexa pulldowns (Figur 1), bindning av komplex i 15 min, både främja komplex fånga och minska nivåerna av icke-specifik bindning 8. Dessutom oåterkalleligt bindande möjliggör effektiv insamling av låga förekomst proteiner och möjliggör användning av mycket färre celler, återigen minska bakgrund 8. När fånga komplex etableras, innehåller protokollet milda tvättbetingelser för att upprätthålla komplexa integritet. Eluering av fångade komplex kan utföras av två metoder och välja vilken metod som dikteras av målet för den nedströms anallys. Om önskan är att analysera och upptäcka interagerande proteiner med Western blot eller masspektrometri, är det rekommenderat att eluera komplex med denatureringsmedel som t.ex. SDS eller urea (Figur 1). Detta är särskilt fördelaktigt för masspektrometri som proteinet ursprungligen smält till HaloTag, benämnd betesprotein, förblir bakom bunden till hartset och därför inte kommer att dominera populationen av peptider som detekteras i masspektrometri. Det innebär emellertid också att betet protein sannolikt inte kommer att synas i analysen av western blot, en väsentlig skillnad jämfört med andra icke-kovalenta affinitets reningar eller co-immunoutfällningar. Om målet är att rena en komplex intakt för att användas för funktionella studier, kan utföras eluering med användning av TEV (Tobacco Etch Virus)-proteas, som känner igen dess besläktade klyvningssekvens som kodas mellan fusionsproteinet och den betesprotein (figur 1). Tessa prover kan även analyseras genom masspektrometri, men såsom senare visas, kommer de att innehålla en betydande mängd av betesprotein som kan förhindra detektering av lägre mängd, specifika interagerande.
Här presenterar vi neddragsvideokällor och avbildningsprotokoll tillämpas på två viktiga terapeutiska proteiner, det bromodomain protein BRD4 och en histonedeacetylase, HDAC1 17. Vi har visat att dessa exempel, interaktion med förväntade parter enligt bestämning med masspektrometri, enzymatisk aktivitet efter komplexa isolering för HDAC1 och lämplig cellulär lokalisering för båda. Tillsammans visar dessa resultat multifunktionella karaktär och styrka teknik för karakterisering av eukaryota proteininteraktioner och funktion.
Protocol
Obs: Följande protokoll kan användas med alla HaloTag fusion och i varje cellinje val stabilt eller transient. För dessa exempel ger vi protokoll för transient transfektion av HaloTag fusioner i HEK293T eller HeLa-celler. För alla experiment, rekommenderar vi användning av proteinet endast kontroll.
1. Fusionsprotein Expression Test
- Erhåll fusionsproteinkonstruktion:
- Skaffa färdiga HaloTag fusion vektor eller konstruera med hjälp av befintliga vektorer. För mer information om tillgängliga konstruktioner, se tabell av särskilda reagenser.
- Om du gör några klon, rekommenderas att sekvensera verifiera DNA.
- Testning expression av fusionsproteinet och kontroll:
- För varje prov förbereda 250 ul av 1X SDS laddningsfärg-buffert (60 mM Tris-HCl pH 6,8, 0,75 mM bromfenolblått, 12,5% glycerol, 100 mM ditiotreitol, 0,5% SDS).
- För varje fusionsproteinoch kontroll, platta 0,5 ml HEK293T eller HeLa-celler i sina lämpliga media med en täthet av 2-4 x 10 5 celler / ml i en standard 24 brunnar.
- Inkubera i 18-24 h vid 37 ° C och 5% CO2, då transfektera enligt rekommendation.
- 24 h efter transfektion, tillsätt 0,5 | il av 5 mM tetra-metyl-rodamin (TMR) ligand till medierna av varje brunn och blanda försiktigt plattan.
- Inkubera transfekterade celler innehållande ligand för 15 min vid 37 ° C och 5% CO2.
- Sug bort media innehållande ligand och tvätta varje brunn med celler försiktigt med 1 ml RT PBS.
- Sug bort PBS och utföra en andra tvätt med 1 ml RT PBS.
- Ta bort PBS och tillsätt 200 l av 1X SDS Laddar färgämne buffert direkt till celler.
- Pipett lysat från plattan i 1,5 ml Eppendorf-rör.
- Koka lysatet under 5 min vid 95 ° C.
- Avlägsna 5-10 pl av reaktionen och belastningen på SDS-PAGE-gel.
- Använd en fluorescerande detektions scanner(TMR Excitation: 555 nm Emission: 585 nm) för att detektera banden. Använd fluorescerande proteinmarkörer som standarder.
- Om en fluorescerande detektions scanner är tillgänglig, utföra Western-blottar med användning av antikroppar mot antingen betet protein eller proteinfusion taggen för att detektera uttryck av fusionsproteinet.
2. Protein pulldowns
- Framställning av övergående transfekterade celler:
- För varje fusion eller kontroll förbereda en 15 cm skål med 30 ml av celler vid 3-4 x 10 5 celler / ml eller 1 till 1,2 x 10 7 celler totalt per konstruktion.
- Inkubera i 18-24 h vid 37 ° C och 5% CO2, då transfektera konstruera enligt rekommendation.
- Efter 24-48 timmar efter transfektion, ta bort materialet och försiktigt tvätta cellagret med 20-25 ml iskall PBS.
- Ta bort PBS tvätt, tillsätt sedan 25-30 ml 4 ° C kylda PBS och försiktigt skrapa celler från plattan.
- Samla cellerna in i koniska rör och centrifuga för 5-10 min vid 2000 x g och 4 ° C.
- Kassera supernatanten och placera cellpelleten vid -80 ° C i minst 30 minuter eller maximalt 6 månader.
- Jämvikts av HaloLink harts:
- För varje fusion eller kontrollprov, bereda 12 ml Resin Jämvikts / Wash buffert (100 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, och 0,005% IGEPAL CA-630). Obs: Det är mycket viktigt att göra och använda Resin jämviktsbuffert inom 12 timmar som utspädd IGEPAL CA-630 är inte stabil eller effektivt bortom denna tidsram.
- Försiktigt skaka eller blanda harts för att erhålla en jämn suspension.
- För varje pull-down experiment, dosera 200 l av harts i en 1,5 ml mikrorör.
- Centrifugera under 1 min vid 800 xg (t.ex. 3000 varv per minut i en mikrocentrifug), sedan försiktigt bort och kassera supernatanten (etanol) utan att störa harts vid botten av röret.
- Lägg till 800 l av Harts Jämvikts / Wash buffert och blanda väl genom att vända röret flera gånger.
- Centrifugera i 2 min vid 800 xg, sedan försiktigt bort och kassera supernatanten.
- Upprepa steg 2.2.5 och 2.2.6 två gånger för totalt tre tvättar.
- Ta inte bort den sista tvätten eller supernatanten tills den ska lägga cellulära lysat som beskrivs nedan (steg 2.3.8) för att förhindra hartset från att torka ut.
- Bindning och tvättning av fusionskomplex:
- För varje prov bereds 500 pl av Mammalian Lysis Buffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% Na-deoxikolat) och 1 ml 1X TBS-buffert (100 mM Tris-HCl pH 7,5 och 150 mM NaCl).
- Tina cellen pellets och slamma i 300 l av däggdjur lyseringsbuffert genom att pipettera upp och ned eller kort vortexa.
- Lägg 6 pl av 50X Protease Inhibitor Cocktail (800 ^ g / ml bensamidin-HCl, 500 | ig / ml fenantrolin, 500 | ig / ml aprotinin, 500 | ig / ml leupeptin, 500 & #. 181, g / ml pepstatin A, 50 mM PMSF) Anmärkning: Proteas cocktails som inkluderar AEBSF kan inte användas eftersom dessa stör proteinfusionstaggen bindning.
- Lägg 3 l RQ1 DNas och vänd efter 10 min vid RT.
- Dounce med glashomogenisator 2,0 ml storlek; . 25-30 slag på is, eller passera celler genom en 25 eller 27 G nål 5-10 gånger för att slutföra lys OBS: Sonication rekommenderas inte som komplex kan falla sönder och överhettning kan påverka proteinfusions tag aktivitet.
- Centrifugera vid 14.000 xg under 5 min vid 4 ° C för att ta bort lysatet.
- Överför klart lysat, ca 300 l total volym, till nytt rör och placera på is.
- Lägg till noll lysatet ytterligare 700 ul av 1X TBS-buffert och blanda väl genom att pipettera upp och ned.
- Ta jämviktad harts rören som framställts i steg 2.2.8 och avlägsna slutliga tvätten / supernatant från hartset utan att störa harts vid botten av röret.
- Lägg till varje tuvara av harts, de 1 ml utspätt lysat.
- Inkubera med blandning på en tub rotator (eller mild mixer) under 15 min vid 22 ° C. Anmärkning: Avgörande av hartset under denna tid reducerar bindningseffektiviteten. Om bindning vid 4 ° C är önskvärd, så gör det genom att blanda under 1 timme.
- Centrifugera harts rör för 2 min vid 800 xg och kassera supernatanten.
- Tillsätt 1 ml Resin Jämvikts / tvättbuffert som görs i steg 2.2.1 och blanda väl genom att vända hartsröret för hand flera gånger.
- Centrifugera harts rör för 2 min vid 800 x g och kasta tvätt.
- Upprepa steg 2.3.12 följt av 2.3.14 tre ytterligare gånger.
- Tillsätt 1 ml harts Ekvilibrering / tvättbuffert och inkubera vid 22 ° C under 5 min med konstant rotation.
- Centrifugera harts rör för 2 min vid 800 x g och kasta tvätt.
- Beroende på slut ansökan (se Introduktion för ytterligare förklaring), gå vidare till antingen punkt 2.4 eller 2.5.
- SDS eluering för denaturerande geler, Western blotting eller masspektrometri:
- Återsuspendera hartset från varje prov i 50 | il SDS-elueringsbuffert (1% SDS och 50 mM Tris-HCl pH 7,5)
- Skaka rören vid RT under 30 min.
- Centrifugera i 2 min vid 800 xg och förflyttnings eluaten till nya rör för analys.
- För western blöt eller silver fläck gel, belastning 5-10 l på en SDS denaturering gel.
- För masspektrometri, spara 40 ul av varje prov vid -20 ° C.
- TEV proteas eluering för funktionella analyser, Western blotting eller masspektrometri:
- Efter avlägsnande av den sista tvätten, återsuspendera hartsen i 50 | il ProTEV klyvningsbuffert och 30 enheter av TEV enzym.
- Inkubera vid 25 ° C med skakning under en timme.
- Centrifugera i 2 min vid 800 x g..
- Överför eluat till nya rör.
- Affär prov vid 4 ° C för omedelbar användning i funktionella analyser.
3.Cellular avbildning av fluorescens Märkta fusionsproteiner med hjälp av en cytoplasmatisk och Nuclear Permeable ligand
- Transfektera, etikett, och bildceller:
- I en 8 väl chambered coverglass för varje fusionsprotein eller kontroll, tallrik 400 pl av HeLa-celler i sina lämpliga media i varje brunn vid en täthet av 1-2 x 10 5 celler / ml.
- Inkubera i 18-24 h vid 37 ° C och 5% CO2, då transfektera enligt rekommendation.
- 18-24 h efter transfektion, späd TMR ligand 1:200 i lämpliga cellulära media, tillsätt sedan 100 | il av denna lösning till varje brunn och blanda försiktigt.
- Inkubera transfekterade celler innehållande ligand för 15 min vid 37 ° C och 5% CO2.
- Sug bort media som innehåller ligand och ersätta med 500 l av lämpliga medier som saknar proteinfusion tag ligand, som har förvärmas till 37 ° C.
- Upprepa två gånger för totalt tre tvättar.
- Sätt cellerna tillbaka i inkubatorn (376, C och 5% CO2) under 30 min.
- Sug bort media och ersätta med 500 l av lämpliga medier, som har värmts upp till 37 ° C.
- Bild på ett mikroskop med hjälp av lämpliga förvärvsparametrar (TMR excitation: 555 nm, emission: 585 nm).
Representative Results
Vid arbete med alla nya fusionsproteinet, är det viktigt att först testet för expression av detta protein efter transfektion och också validera att ett protein med den korrekta molekylvikten framställs. Som HaloTag fusionsproteiner kan vara fluorescerande och kovalent märkta med genomsläppliga eller beroende på lokalisering, ogenomträngliga ligander, är det möjligt att snabbt avgöra uttryck genom att tillämpa cellulära lysat till denaturering gelelektrofores följt av skanning på en fluorimager. Med hjälp av det protokoll som beskrivs i avsnitt 1.2, uttryck av Halo-BRD4 (189 kD) och HaloTag ensam kontroll (Ctrl) observeras (34 kD, figur 2A). Som nämndes i protokollet kan expressionen av fusionsproteiner också detekteras med hjälp av traditionella Western blöts med anti-HaloTag antikroppar, eller om de är tillgängliga, antikroppar till betesprotein. Om möjligt är det rekommenderat att använda fluorescerande liganden istället eftersom det är mer specifik, snabbare och enklare tHan antikroppsdetektering, och även kvantitativa 10.
Efter verifieras uttryck av rätt fullängdsfusionsprotein, kan proteinpulldowns utföras. Visas i figur 2B är silver färgade geler av biologiska replikat av Halo-BRD4 och Ctrl pulldowns elueras med SDS (protokoll avsnitt 2.4) som visar hög reproducerbarhet. De silverfärgning geler visar ett betydande antal proteiner har befunnits interagera med BRD4 protein och mycket låg bakgrund i kontrollen (Figur 2B). Som nämnts i inledningen, i denna process av eluering, Halo-BRD4 kommer inte att elueras från hartset som den förblir kovalent bunden. Därför finns det inte en signifikant band vid denna molekylvikt detekterats i den silverfärgning (fig 2B) eller western blöt (data ej visade). För att bestämma om dessa proteiner är specifika för BRD4 ades vätskekromatografi-masspektrometri (LC-MS/MS) utförs på complex blandning som erhållits efter SDS eluering. I fig 2C är spektral räknas och normaliserad spektral överflöd faktor (NSAF) värden för kända interagerande av BRD4 18-20 hittat i Halo-BRD4 masspektrometri analysen. Den höga förekomsten av komponenter från pTEFb 18,20 och även BRD9 19 proteinet bekräftar specifik fånga BRD4 komplex. Som förutspåtts av silverfläck geler (figur 2B), har ett stort antal andra proteiner också identifierats som potentiella interagerande av BRD4 som inte observerades i kontrollen (data visas ej). Eftersom dessa är tidigare okänd, måste de vara oberoende verifierats av andra metoder för att bekräfta om proteinet är en sann påverkare, och i så fall, om det är direkt eller indirekt samband med BRD4.
Isolerade komplex kan också studeras för aktivitet; det är rekommenderar att eluera komplex med hjälp av TEV proteas (protokoll avsnitt 2.5), så att de upprätthåller functionaliTy. I figur 3A en silverfärgning gel av Halo-HDAC1 neddragsvideokällor komplex frisätts från hartset med användning av TEV-proteas visas. Såsom TEV-proteas spjälkar i en linkerregion mellan proteinfusion taggen och dess fusionspartner, betydande mängder av betesproteinet, i detta fall HDAC1, observeras (Figur 3A). För att bestämma om denna fraktion innehöll HDAC1 aktivitet eluerades TEV prover testades i en luminiscerande HDAC assay, HDAC-Glo 21. Såsom visas i figur 3B, HDAC1 neddragsvideokällor prover uppvisade höga nivåer av HDAC1 aktivitet (kolumn 1), som var specifikt inhiberad genom en känd HDAC inhibitor, SAHA 22 (kolumn 2). Som kontroller för att ytterligare demonstrera specificiteten ades ingen HDAC-inhibering observerades med en relaterad sirtuin familj inhibitor, EX-527 22 (kolumn 3) och ingen signal detekterades med användning av enbart buffert utan HDAC1 neddragnings prov tillsatt (kolumn 4).
En viktig del av funktionenal proteomik och förstå komplex, också förstå protein lokalisering och / eller handel. Eftersom dessa samma fusionskonstruktioner kan fluorescerande inuti celler, övervakade vi deras lokalisering med hjälp av konfokal avbildning. Efter protokollet i avsnitt 3, var HeLa-celler övergående transfekterade med Halo-BRD4 (Figur 4A) och Halo-HDAC1 (Figur 4B) fluorescerande med TMR-liganden och avbildas. Såsom visas i fig. 4A och 4B, båda lokaliserade till cellkärnan som förväntat 17. Dessa data visar att närvaron av etiketten inte ändrade fysiologiska cellulära lokaliseringen av dess fusionspartner.
Figur 1. Schematisk av proteinpulldown och konfokala bildprogram. Använda som ingle konstruera flera program för att förstå proteiners funktion i däggdjursceller är möjlig. För alla, är en Halo fusionskonstruktet antingen stabilt eller transient uttryckt i anhängare och upphängningsdäggdjursceller. För protein komplexa pulldowns, celler sedan lyseras, komplex kovalent fångas på harts, och elueras genom antingen SDS eluering (vänster bana) eller TEV klyvning (rätt väg). SDS eluering rekommenderas för vidare till masspektrometrianalys, medan TEV klyvning är optimal för att utföra funktionsanalys. För att karaktärisera uttryck, cellulär lokalisering, människohandel händelser, eller proteinomsättningen, är levande celler som uttrycker fusionsproteiner fluorescerande och ytterligare analyseras på SDS-PAGE geler eller använda konfokal avbildning. Båda cellpermeabla eller ogenomträngliga fluorescerande ligander är tillgängliga beroende på lokalisering eller presentationen av fusionsproteinet i cellen.
igure 2 "fo: innehåll-width =" 6in "src =" / files/ftp_upload/51553/51553fig2highres.jpg "width =" 600 "/>
Figur 2. Halo-BRD4 proteinuttryck, neddragning och masspektrometrianalys. (A) en SDS PAGE-geler som uppvisar expressionen av Halo-BRD4 fusionsprotein, 189 kD, och Halo proteinfusionstaggen ensam, 34 kD, kontroll (Ctrl) inom en HEK293T cellulärt lysat märktes med TMR-ligand (protokollenheten 2,1). Geler skannas med fluorimager för att upptäcka och en fluorescerande molekylviktsmarkör användes. (B) Silver fläck geler av biologiska replikat för pulldowns i Halo-BRD4 och Ctrl prov som elueras med SDS. Molekylvikts storlekar indikeras för gelén. (C) Spekt räknas (vänster panel) och normaliserade spektrala överflöd faktorer (NSAF) värden (höger panel) som står för proteinmolekylvikt av proteiner som identifieras i massanalys av biologiska replikat av Halo-spektrometri BRD4 och Ctrl. Visas är proteiner som är kända för att interagera wed BRD4, inklusive komponenter i pTEFb (Cdk9 och Cyclin T) 18,20 samt BRD9 19. Inga peptider från dessa proteiner identifierades i Ctrl.
Figur 3. Halo-HDAC1 komplexa isolering och aktivitetsanalys. (A) Silver fläck geler som visar isoleringen av Halo-HDAC1 komplex och bakgrund från Ctrl efter TEV klyvning (protokoll avsnitt 2.5). Den framträdande HDAC1 bandet (55 kDa) och TEV-proteas-bandet är märkta. Den fria HDAC1 genereras av TEV klyvning inom ett optimerat linker mellan HaloTag och HDAC1 fusionssekvensen efter avskiljning på hartset (Figur 1). (B) Diagram som visar aktiviteten för HDAC1 komplexa isolaprover på ett luminiscerande histondeacetylas assay, HDAC- Glo 21. Kolumn 1 i diagrammet visar hög levels av HDAC-aktivitet som finns med Halo-HDAC1 neddragsvideokällor prover (HDAC1). Kolumn 2 visar denna aktivitet kan minskas specifikt genom tillsats av den HDAC-inhibitor, SAHA 22, till de HDAC1 neddragsvideokällor prover. Som kontroller, Kolumn 3 visar en deacetylase hämmare specifika för sirtuin familjen, men inte HDAC, EX-527 22, inte hämmar HDAC1 aktivitet och Kolumn 4 visar ingen aktivitet observeras enbart med hjälp av buffert.
Figur 4. Halo-BRD4 och Halo-HDAC1 konfokal avbildning. Live cell konfokal avbildning av HeLa-celler transfekterade med Halo-BRD4 (A) eller halo-HDAC1 (B) fluorescensmärkt med TMR-ligand. (A) halo-BRD4 uttryck är begränsat till kärnan och (B) Halo-HDAC1 uttryck är övervägande nuclear. Vänster sida av panelerna är fluorescerande kanal och höger sida är en överlagring av det fluorescerande kanal med DIC-kanal för varje. Bilder förvärvades på ett konfokalt mikroskop utrustat med en 37 ° C + CO2 miljökammare med användning av lämpliga filteruppsättningar. Skalstrecken = 20 | im.
Discussion
Här presenteras två fusionsproteiner, Halo-BRD4 och Halo-HDAC1, kännetecknat av eukaryota däggdjursceller för expression, proteinkomplex isolering och aktivitet och cellulär lokalisering. I arbetet med dessa olika protokoll, finns det flera viktiga steg för att lyckas med varje experiment. Som fallet är med varje fusionsprotein, expressionsnivån och placering av etiketten i sig kan vara viktigt för att bibehålla fysiologi. Därför är det viktigt att tänka på att N-och / eller C-terminala fusioner måste utformas om förkunskaper eller arbeta med en annan tagg inte har visats för det speciella proteinet val. När det gäller uttryck, om nivån är för hög, kan utföras utspädning av DNA under transfektion eller användning av vektorer med svagare promotorer är möjligt att uppnå den nivå som är lämplig. Tidigare arbete har utförts som visar en effektiv isolering av makromolekylära komplex vid endogen levåer uttrycks 8, vilket gör att arbetet på mycket låga nivåer av uttryck. Om möjligt skulle cellulära lokaliseringsstudier också kunna ge insikt om den optimala tagg placering position samt relativ uttrycksnivå behövs för korrekt fysiologi.
När fusionsproteiner är redo för neddragsvideokällor experiment, för att få maximal framgång med protokollet är det mycket viktigt att följa de rekommenderade tidsramar i lys, bindande, och tvättsektioner, som en av de största fördelarna är hastigheten på den komplexa isolering processen. Om någon av dessa steg är förlängd i tid, såsom erfordras för en antikroppsbaserad infångningsmetod, finns det en risk för komplex disassociation eller ökad icke-specifik bindning 8. Likaså om tiderna förkortas under cellulär lys eller bindande, celler kanske inte helt lyseras eller effektivt fångas respektive. Om antalet tvättar är Decrlättat eller god blandning av hartset inträffar inte under de tvingande eller tvättar, då bakgrundsnivåer av icke-specifika proteiner ökas. Också, är mycket viktigt i relation till bindningseffektiviteten till hartsen hjälp av lys. Försök att låt ligga proverna, ta bort den rekommenderade rengöringsmedel, lägga SDS eller andra starka rengöringsmedel, och / eller innehåller proteashämmare AEBSF det kommer att leda till minskad eller förlorad bindning av fusionsproteiner och deras komplex med hartset.
Befintliga metoder för komplexa isolering från däggdjursceller och mänsklig proteomik analys kamp med utmaningen att minska bakgrund inom analys med masspektrometri 16. Detta har varit så betydande att ett slutförvar av förorenande proteiner har skapats av många masspektrometri grupperna 16. Bakgrund i masspektrometri neddragsvideokällor prover kan definieras som något som förhindrar identifiering avsanna interactmedlemmar av betesprotein. Som sådan kan bakgrund uppstå från förorenande icke-specifika proteiner eller också stora koncentrationer av betesprotein eller antikroppar som används för utfällning av betesproteiner. Betydande arbete gjordes optimera både rullgardins protokollet presenteras här liksom hartset för att minska nivån på de icke-specifika förorenande proteiner i neddragningsprocessen. Detta är uppenbart i de silverfärgning geler och massanalys av styr spektrometri (Figur 2). För att hantera de höga bete protein eller antikroppar som kan vara lika skadligt som föroreningar och med vilka andra metoder kämpar, är rullgardins med SDS eluering rekommenderas (protokoll avsnitt 2.4). På grund av den kovalenta bindningen till hartset, kommer denna process att lämna huvuddelen av startfusionsproteinet kovalent till hartset. En liten andel av bete observeras i analysen masspektrometri, som trosske genom hydrolys, men det är inte något problem för detektion av andra svagare eller transienta interaktioner 8.
Som nämndes i inledningen, har betydande framsteg inom proteomik aktiverats av betydande framsteg inom masspektrometri 1,7. Därför är det viktigt att belysa viktiga parametrar för val av masspektrometrianalys att deconvolute blandningen av proteiner som erhållits i pulldowns. Instrumentering måste vara robust och kan rutinmässigt och effektivt analys av prover som innehåller en liten mängd protein, ofta mindre än <1 mikrogram. Nanoscale kromatografi med 50-75 ìm interna HPLC diameter kolonner med flöden på 100-300 nl / min område är typiskt för kompatibilitet med de små provvolymer och för att maximera känsligheten för masspektrometer. För att maximera den information som förvärvats i en enda analys tillstånd of konsten masspektrometrar som kan förvärva hög upplösning mass spektra på en tidsskala kompatibel med tidigare nämnda nano separationer, ≥ 10 Hz, används typiskt. Dessa instrument har attomolar nivåer av känslighet och kan rutinmässigt skaffa data med sub ppm föregångare och produkt ion mass felmarginal. Dessa prestandaegenskaper tjänar till att öka utbytet av antalet identifierade proteiner och förtroendet associerad med dessa identifieringar.
Med dessa data visar vi fysiologisk cellulär lokalisering, ordentlig protein: protein interaktioner tillsammans med potential för upptäckten av nya interaktioner, och isolering av aktiva komplex allt med en enda konstruktion. Faktiskt alternativa tekniker kan användas för var och en av dessa olika aspekter, men troligen inte för alla 23,24. Med HaloTag teknik, kan man använda en multifunktionell tillvägagångssätt framflyttning proteomics studier och att få en mer fullständig förståelse av proteiners funktion i däggdjursceller.
Disclosures
Publiceringsersättningar för denna artikel är sponsrad av Promega Corporation. Danette L. Daniels, Jacqui Méndez, Hélène Benink, Andrew Niles, Nancy Murphy och Marjeta Urh är anställda i Promega Corporation, den kommersiella ägare genom överlåtelse av patent i HaloTag teknologin och dess tillämpningar. Michael Ford, Richard Jones, Ravi Amunugama, och David Allen är anställda i MSBioworks, vilket ger masspektrometri tjänster som beskrivs i detta manuskript.
Acknowledgments
Vi tackar Dr Martin Rosenberg, Dr Gary Tarpley, och Dr Keith Wood för att stödja detta arbete, och Dr James Cali för kritisk läsning av manuskriptet. DLD, JM, HB, NM, AN, JC, och MU är anställda i Promega Corporation. MF, RJ, RA, och DA är anställda i MS Bioworks, LLC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HeLa Cells | ATCC | CCL-2 | Adherent |
| HEK293T Cells | ATCC | CRL-11268 | Adherent |
| Cellular growth media | Invitrogen/Gibco | ||
| PBS - tissue culture certified | Invitrogen/Gibco | ||
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| HaloTag Control Vector | Promega | G6591 | |
| HaloTag-BRD4 | Kazusa DNA Research Institute | FHC11882 | N-terminal HaloTag fusion |
| HaloTag-HDAC1 | Kazusa DNA Research Institute | FHC02563 | N-terminal HaloTag fusion |
| HaloTag Clones containing content | Promega | Various | http://www.promega.com/FindMyGene/ |
| HaloTag Flexi Vectors for cloning (N- or C-terminal) | Promega | Various | Choose based upon expression level and HaloTag orientation |
| HaloTag TMR Ligand | Promega | G8251 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | 18896 | |
| HaloTag Mammalian Pull-Down and Labelling System | Promega | G6500 | Contains HaloTag TMR ligand |
| HaloTag Mammalian Pull-Down System | Promega | G6504 | |
| Protease Inhibitor Cocktail, 50X | Promega | G6521 | |
| Mammalian Lysis Buffer | Promega | G9381 | |
| HaloTag Monoclonal Antibody | Promega | G9211 | |
| ProTEV Plus | Promega | V6101 | |
| RQ1 Dnase | Promega | M6101 | |
| HaloLink Resin | Promega | G1912 | |
| HDAC-Glo | Promega | G6420 | |
| PBS + 0.1% Triton X-100 | For optional imaging | ||
| 4% paraformaldehyde/0.2 M sucrose/PBS | For optional imaging | ||
| Ethanol | |||
| Tissue culture vessels and dishes | |||
| Cell culture incubator | |||
| Disposable cell lifter | Thermo Fisher Scientific | 08-773-1 | |
| Glass homogenizer such as Kontes Dounce Tissue Grinder | Thermo Fisher Scientific | K885300-0002 | 25-27 G needle could also be used |
| Microcentrifuge | |||
| Tube rotator such as Labquake | Thermo Fisher Scientific | 4002110Q | Ideal for binding and washing steps |
| Shaking platform such as Eppendorf Thermomixer | Thermo Fisher Scientific | 05-400-200 | Ideal for SDS elution and TEV cleavage steps |
| Chambered cover glass | Thermo Fisher Scientific | 155409 | For optional imaging |
| Fluorescent Microscrope (555 nm Ex/585 nm Em) | For optional imaging |
References
- Altelaar, A. F., Munoz, J., Heck, A. J. Next-generation proteomics: towards an integrative view of proteome dynamics. Nat Rev Genet. 14, 35-48 (2013).
- Tyers, M., Mann, M.
- Coulombe, B., et al. Interaction networks of the molecular machines that decode, replicate, and maintain the integrity of the human genome. Mol Cell Proteomics. 3, 851-856 (2004).
- Gavin, A. C., et al. Proteome survey reveals modularity of the yeast cell machinery. Nature. 440, 631-636 (2006).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
- Sardiu, M. E., et al. Probabilistic assembly of human protein interaction networks from label-free quantitative proteomics. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 1454-1459 (2008).
- Domon, B., Aebersold, R.
- Daniels, D. L., et al. Examining the complexity of human RNA polymerase complexes using HaloTag technology coupled to label free quantitative proteomics. J Proteome Res. 11, 564-575 (2012).
- Encell, L. P., et al. Development of a dehalogenase-based protein fusion tag capable of rapid, selective and covalent attachment to customizable ligands. Curr Chem Genomics. 6, 55-71 (2012).
- Ohana, R. F., et al. HaloTag-based purification of functional human kinases from mammalian cells. Protein Expr Purif. 76, 154-164 (2011).
- Black, J. C., et al. KDM4A Lysine Demethylase Induces Site-Specific Copy Gain and Rereplication of Regions Amplified in Tumors. Cell. 154, 541-555 (2013).
- Deplus, R., et al. TET2 and TET3 regulate GlcNAcylation and H3K4 methylation through OGT and SET1/COMPASS. EMBO J. 32, 645-655 (2013).
- Galbraith, M. D., et al. HIF1A Employs CDK8-Mediator to Stimulate RNAPII Elongation in Response to Hypoxia. Cell. 153, 1327-1339 (2013).
- Collins, M. O., Choudhary, J. S. Mapping multiprotein complexes by affinity purification and mass spectrometry. Curr Opin Biotechno. 19, 324-330 (2008).
- Collins, S. R., et al. Toward a comprehensive atlas of the physical interactome of Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Proteomics. 6, 439-450 (2007).
- Mellacheruvu, D., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nat Methods. 10, 730-736 (2013).
- Dawson, M. A., Kouzarides, T. Cancer epigenetics: from mechanism to therapy. Cell. 150, 12-27 (2012).
- Jang, M. K., et al. The bromodomain protein Brd4 is a positive regulatory component of P-TEFb and stimulates RNA polymerase II-dependent transcription. Mol Cell. 19, 523-534 (2005).
- Rahman, S., et al. The Brd4 extraterminal domain confers transcription activation independent of pTEFb by recruiting multiple proteins, including NSD3. Mol Cell Biol. 31, 2641-2652 (2011).
- Yang, Z., et al. Recruitment of P-TEFb for stimulation of transcriptional elongation by the bromodomain protein Brd4. Mol Cell. 19, 535-545 (2005).
- Halley, F., et al. A bioluminogenic HDAC activity assay: validation and screening. J Biomol Screen. 16, 1227-1235 (2011).
- Mack, G. S.
- Daniels, D. L., Urh, M. Isolation of intracellular protein--DNA complexes using HaloCHIP, an antibody-free alternative to chromatin immunoprecipitation. Methods Mol Biol. 977, 111-124 (2013).
- Urh, M., Rosenberg, M. HaloTag a Platform Technology for Protein Analysis. Curr Chem Genomics. 6, 72-78 (2012).
