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Biology

प्रोटीन सहभागिता की खोज और HaloTag प्रौद्योगिकी का उपयोग प्रोटीन समारोह निस्र्पक

Published: July 12, 2014 doi: 10.3791/51553
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 2, 2, 2, 1
1Promega Corporation, 2MS Bioworks LLC

Summary

HaloTag प्रौद्योगिकी स्तनधारी कोशिकाओं से छोटे और बड़े दोनों प्रोटीन परिसरों के अलगाव में महत्वपूर्ण सफलता दिखाया गया है जो एक multifunctional प्रौद्योगिकी है. यहाँ हम मौजूदा विकल्पों की तुलना में इस तकनीक का लाभ पर प्रकाश डाला और कोशिकाओं के अंदर प्रोटीन समारोह के कई पहलुओं का अध्ययन करने के लिए अपनी उपयोगिता प्रदर्शित करता है.

Abstract

प्रोटिओमिक्स में रिसर्च वायरस, बैक्टीरिया और खमीर से उन सहित कई proteomes, के लक्षण वर्णन करने के लिए नेतृत्व किया है कि जन स्पेक्ट्रोमेट्री क्षमताओं के क्षेत्र में प्रगति के साथ हाल के वर्षों में विस्फोट किया है. इसकी तुलना में, मानव proteome के विश्लेषण के कारण आंशिक रूप से अध्ययन किया जाना चाहिए, जो प्रोटीन की सरासर संख्या है, लेकिन यह भी नेटवर्क और बातचीत के इन वर्तमान की जटिलता को, पीछे है. विशेष रूप से मानव proteome समझने की चुनौतियों का सामना करने के लिए, हम, प्रोटीन अलगाव के लिए HaloTag तकनीक विकसित multiprotein परिसरों के अलगाव के लिए विशेष रूप से मजबूत और कम बहुतायत में कमजोर या क्षणिक बातचीत और / या प्रोटीन की अधिक कुशल कब्जा इजाजत दी है. HaloTag एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग प्रोटीन संलयन सहसंयोजक के लिए डिजाइन टैग,, विशिष्ट, और तेजी से स्थिरीकरण या विभिन्न ligands के साथ प्रोटीन की लेबलिंग है. इन संपत्तियों का इस्तेमाल, स्तनधारी कोशिकाओं के लिए कई आवेदन चरित्र के लिए विकसित किए गएप्रोटीन समारोह ize और यहाँ हम सहित के तरीके मौजूद: प्रोटीन उपन्यास बातचीत या कार्यात्मक assays की खोज के लिए इस्तेमाल पुल चढ़ाव, और सेलुलर स्थानीयकरण. हम गति, विशिष्टता, और अन्य परंपरागत गैर सहसंयोजक दृष्टिकोण की तुलना में प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए सतहों के लिए संलयन प्रोटीन के सहसंयोजक कब्जे में महत्वपूर्ण लाभ पाते हैं. हम इन और उदाहरण, मानव bromodomain प्रोटीन BRD4, और histone deacetylase HDAC1 के रूप में दो महत्वपूर्ण epigenetic प्रोटीन का उपयोग प्रौद्योगिकी के व्यापक उपयोगिता प्रदर्शित करता है. ये उदाहरण उपन्यास बातचीत की खोज को सक्षम करने और eukaryotes में सेलुलर स्थानीयकरण निस्र्पक में इस तकनीक की शक्ति का प्रदर्शन है, जो मानव कार्यात्मक प्रोटिओमिक्स के साथ आगे समझ.

Introduction

सेलुलर समारोह, उत्तेजनाओं के जवाब, और विकास और / या रोग राज्यों में होने वाले परिवर्तनों को समझना जटिल इन विभिन्न गतिशील राज्यों 1,2 भर proteome के de-कनवल्शनफ़िल्टर्स से जुड़ा हुआ है. ज्यादा प्रोटीन की संख्या और सभी संभव बातचीत दिया, यह मानव proteome 1,3-7 के समाधान में बहुत चुनौतीपूर्ण हो गया है, हालांकि, कम जीवों के proteome को समझने के लिए किया गया है. मास स्पेक्ट्रोमेट्री में अग्रिम बहुत इन अध्ययन करने की क्षमता के लिए सक्षम है, और यहाँ हम प्रोटीन परिसरों और स्तनधारी कोशिकाओं 8-10 से मानव प्रोटीन के कार्यात्मक विशेषता के दोनों कुशल पकड़ने के लिए HaloTag प्रौद्योगिकी के विकास के साथ एक अतिरिक्त और महत्वपूर्ण प्रगति प्रस्तुत करते हैं. यह तकनीक हाल ही में उपन्यास प्रोटीन समारोह और understandi में अंतर्दृष्टि की अनुमति के लिए महत्वपूर्ण बातचीत की खोज के लिए एक महत्वपूर्ण कारक हो कई अध्ययनों में दिखाया गया हैरोग 11-13 के एनजी.

HaloTag प्रोटीन संलयन शुरू में परंपरागत आत्मीयता टैग और प्रोटीन पर कब्जा, शुद्धि, और लेबलिंग 8-10 के रूप में संबंधित एंटीबॉडी के कई चुनौतियों का सामना करने के लिए विकसित किया गया था. प्रोटीन पर कब्जा है और शोधन के लिए लगभग सभी तरीकों के भीतर, एक विशेष प्रोटीन 14 के संवर्धन के लिए प्रयोग किया जाता है जो एक गैर सहसंयोजक बातचीत कदम है. इस चरण के दौरान, प्रोटीन और / या जटिल प्रक्रिया को पूरा करने के घंटे के बजाय मिनट की आवश्यकता है, खासकर अगर प्रसार की वजह से अलग कर सकते हैं. इस चिंता पते, संलयन प्रोटीन विशेष रूप से तेजी से और अचल कणों, सतहों, या fluorophores 9 या तो किया जा सकता है जो अपने ligands के साथ बातचीत करने के लिए इंजीनियर था. इसलिए यह अपने ligand के लिए बाध्य है एक बार, यह अन्य आत्मीयता टैग की तुलना में सबसे अधिक फर्क कारक में से एक है, जो बाध्य बनी हुई है. इसके अलावा यहां का प्रदर्शन, क्षमता हैligands 9 (चित्रा 1) बारी से संभव है, जो एक भी निर्माण के साथ विभिन्न जैविक सवालों का पता करने के लिए. उदाहरण के लिए, प्रोटीन बातचीत या समारोह से पूछताछ की, सतह ligands प्रोटीन या परिसरों का कब्जा (चित्रा 1) के लिए उपयोग किया जाता है. एक अलग प्रयोग में, एक ही संलयन प्रोटीन fluorescently सेलुलर स्थानीयकरण, तस्करी, या प्रोटीन कारोबार (चित्रा 1) के अध्ययन करने के लिए लेबल किया जा सकता. यह एक ligand यह अपरिवर्तनीय है, यह एक सतह या एक fluorophore है, चाहे वह स्वाभाविक है और इसलिए अन्य ligands तो बाद में ही प्रयोग में बाध्य नहीं किया जा सकता हालांकि कि एक बार याद करने के लिए महत्वपूर्ण है.

प्रोटीन बातचीत मैप करने के लिए मौजूदा प्रौद्योगिकियों के विश्लेषण कुशलता से अधिक क्षणिक हैं या कम बहुतायत 1,6,7,14,15 में हैं जो उन सहित विशेष बातचीत, अलग करने के लिए कठिनाई का पता चलता है. कई समूह द्वारा इसके अलावा, हाल ही में कामपारंपरिक अलगाव तरीकों के भीतर, विशेष रूप से मानव प्रोटिओमिक्स के क्षेत्र में, मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण 16 में सच interactors से संकेत मुखौटा हो सकता है जो प्रोटीन contaminants की एक महत्वपूर्ण संख्या रहे हैं कि चिंता को दर्शाता है. HaloTag प्रोटीन और अच्छी तरह से अपनी सह विकसित राल पते इन चिंताओं के लिए विकसित गुण. में परिसरों के बंधन जटिल pulldowns के लिए प्रोटोकॉल (चित्रा 1), दोनों परिसर पर कब्जा को बढ़ावा देने और गैर विशिष्ट 8 बंधन के स्तर को कम करने, 15 मिनट में प्राप्त किया जा सकता है. इसके अलावा, अचल बाध्यकारी कम बहुतायत प्रोटीन के कुशल कब्जा करने के लिए अनुमति देता है और अब तक कम कोशिकाओं के उपयोग के लिए अनुमति देता है, फिर पृष्ठभूमि 8 को कम करने. परिसरों का कब्जा स्थापित हो जाने के बाद, प्रोटोकॉल जटिल अखंडता को बनाए रखने के लिए हल्के धोने शर्तें शामिल हैं. पर कब्जा कर लिया परिसरों की क्षालन विधि नीचे की ओर गुदा का लक्ष्य तय करती है जो दो तरीकों और चुनने के द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता हैysis. इच्छा विश्लेषण या पश्चिमी धब्बा या मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा बातचीत प्रोटीन की खोज है, तो यह इस तरह एसडीएस या यूरिया (चित्रा 1) के रूप में denaturants साथ परिसरों elute की सिफारिश की है. यह मूल रूप से HaloTag के लिए जुड़े हुए प्रोटीन, चारा प्रोटीन करार के रूप में, राल के लिए बाध्य पीछे रहेगा और इसलिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री में पाया पेप्टाइड्स की आबादी पर हावी नहीं होगा मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए विशेष रूप से लाभप्रद है. यह भी चारा प्रोटीन की संभावना पश्चिमी धब्बा, अन्य गैर सहसंयोजक आत्मीयता purifications या सह immunoprecipitations की तुलना में एक महत्वपूर्ण अंतर से विश्लेषण में दिखाई नहीं देगा हालांकि इसका मतलब है. लक्ष्य कार्यात्मक अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए एक जटिल बरकरार शुद्ध करने के लिए है, तो क्षालन संलयन प्रोटीन और चारा प्रोटीन (चित्रा 1) के बीच इनकोडिंग अपने आत्मीय दरार अनुक्रम जो पहचानता TEV (तंबाकू नक़्क़ाशी वायरस) प्रोटीज, का उपयोग किया जा सकता है. टीhese नमूने भी मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है, लेकिन बाद में पता चला, वे कम बहुतायत का पता लगाने, विशिष्ट interactors रोक सकता है कि चारा प्रोटीन का एक महत्वपूर्ण राशि शामिल होंगे.

यहाँ हम दो महत्वपूर्ण चिकित्सा संबंधी प्रोटीन, bromodomain प्रोटीन BRD4 और एक histone deacetylase, HDAC1 17 के लिए लागू pulldown और इमेजिंग प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. मास स्पेक्ट्रोमेट्री, HDAC1 के लिए जटिल अलगाव के बाद enzymatic गतिविधि, और दोनों के लिए उचित सेलुलर स्थानीयकरण द्वारा निर्धारित रूप में हम उम्मीद सहयोगियों के साथ इन उदाहरणों, बातचीत से पता चला है. साथ में, इन परिणामों यूकेरियोटिक प्रोटीन बातचीत और समारोह के लक्षण वर्णन के लिए प्रौद्योगिकी के multifunctional प्रकृति और ताकत का प्रदर्शन.

Protocol

नोट: निम्नलिखित प्रोटोकॉल किसी भी HaloTag फ्यूजन के साथ और चुनाव stably या क्षणिक ट्रांसफ़ेक्ट की किसी भी कोशिका लाइन में इस्तेमाल किया जा सकता है. इन उदाहरणों के लिए, हम HEK293T या HELA कोशिकाओं में HaloTag fusions के क्षणिक अभिकर्मक के लिए प्रोटोकॉल दे देंगे. सभी प्रयोगों के लिए, हम प्रोटीन केवल नियंत्रण के उपयोग की सलाह देते हैं.

1. फ्यूजन प्रोटीन एक्सप्रेशन जाँच

  1. संलयन प्रोटीन का निर्माण प्राप्त करें:
    1. पूर्व बनाया HaloTag फ्यूजन वेक्टर प्राप्त करने या मौजूदा वैक्टर का उपयोग निर्माण. उपलब्ध निर्माणों के बारे में अधिक जानकारी के लिए, विशिष्ट अभिकर्मकों की तालिका देखें.
    2. किसी भी क्लोन बनाने हैं, तो यह डीएनए सत्यापित अनुक्रम की सिफारिश की है.
  2. संलयन प्रोटीन और नियंत्रण की अभिव्यक्ति परीक्षण:
    1. प्रत्येक नमूना के लिए, 1X एसडीएस लोड हो रहा है डाई बफर के 250 μl तैयार (60 मिमी Tris एचसीएल pH6.8, 0.75 मिमी नीले, 12.5% ​​ग्लिसरॉल, 100 मिमी dithiothreitol, 0.5% एसडीएस bromophenol).
    2. प्रत्येक संलयन प्रोटीन के लिएऔर नियंत्रण, एक मानक 24 अच्छी तरह से थाली में 2-4 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर उनके उपयुक्त मीडिया में HEK293T या HELA कोशिकाओं के 0.5 मिलीलीटर थाली.
    3. सिफारिश के रूप में तो transfect, 37 डिग्री सेल्सियस पर 18-24 घंटे और 5% सीओ 2 के लिए सेते हैं.
    4. 24 घंटा बाद अभिकर्मक, अच्छी तरह से प्रत्येक के मीडिया के लिए 5mm टेट्रा मिथाइल rhodamine (TMR) ligand के 0.5 μl जोड़ने और धीरे थाली मिश्रण.
    5. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 के 15 मिनट के लिए ligand युक्त कोशिकाओं को सेते हैं.
    6. महाप्राण बंद मीडिया ligand युक्त और 1 मिलीलीटर आरटी पीबीएस के साथ धीरे कोशिकाओं की अच्छी तरह से प्रत्येक धोने.
    7. पीबीएस बंद महाप्राण और 1 मिलीलीटर आरटी पीबीएस के साथ एक दूसरे धोने प्रदर्शन करते हैं.
    8. पीबीएस निकालें और कोशिकाओं को सीधे डाई बफर लोड हो रहा है 1X एसडीएस के 200 μl जोड़ें.
    9. 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में थाली से पिपेट lysate.
    10. 95 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए lysate उबाल लें
    11. एसडीएस पृष्ठ जेल पर प्रतिक्रिया और लोड की 5-10 μl निकालें.
    12. एक फ्लोरोसेंट का पता लगाने स्कैनर का उपयोग(TMR उत्तेजना: 555 एनएम, उत्सर्जन: 585 एनएम) बैंड पता लगाने के लिए. मानकों के रूप में फ्लोरोसेंट प्रोटीन मार्कर का उपयोग करें.
    13. एक फ्लोरोसेंट का पता लगाने के स्कैनर उपलब्ध नहीं है, चारा प्रोटीन या संलयन प्रोटीन की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए प्रोटीन संलयन टैग या तो के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग पश्चिमी blots प्रदर्शन करते हैं.

2. प्रोटीन pulldowns

  1. Transiently ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की तैयारी:
    1. प्रत्येक फ्यूजन या नियंत्रण 3-4 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल या 1-1.2 10 x 7 कोशिकाओं कुल प्रति निर्माण में कोशिकाओं के 30 मिलीलीटर के साथ एक 15 सेमी पकवान तैयार करने के लिए.
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 18-24 घंटे के लिए सेते हैं और 5% सीओ 2, तो सिफारिश के अनुसार निर्माण transfect.
    3. 24-48 घंटा बाद अभिकर्मक के बाद मीडिया को हटाने और धीरे बर्फ ठंड पीबीएस के 20-25 मिलीलीटर के साथ सेल परत धो लो.
    4. पीबीएस धोने निकालें, तो 25-30 जोड़ने 4 डिग्री सेल्सियस की मिलीलीटर पीबीएस ठंडा और धीरे थाली से दूर परिमार्जन कोशिकाओं.
    5. शंक्वाकार ट्यूब और Centri में कोशिकाओं लीजिए2,000 XG पर 5-10 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए Fuge
    6. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 30 मिनट या 6 महीने की एक अधिकतम की एक न्यूनतम के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर सेल गोली जगह है.
  2. HaloLink राल का संतुलन:
    1. प्रत्येक फ्यूजन या नियंत्रण नमूना के लिए, राल संतुलन / धो बफर के 12 मिलीलीटर की तैयारी (100 मिमी Tris-एचसीएल 7.5 पीएच, 150 मिमी NaCl, और 0.005% IGEPAL CA-630) नोट:. यह राल बनाने और उपयोग करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है संतुलन बफर पतला IGEPAL CA-630 के रूप में 12 घंटे के भीतर इस समय सीमा के परे स्थिर या प्रभावी नहीं है.
    2. धीरे एक समान निलंबन प्राप्त करने के लिए राल हिला या मिश्रण.
    3. प्रत्येक पुल से नीचे प्रयोग के लिए, एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूबों में राल के 200 μl बांटना.
    4. 800 XG पर 1 मिनट (जैसे, एक microcentrifuge में 3,000 आरपीएम) के लिए अपकेंद्रित्र, तो ध्यान से हटाने और ट्यूब के नीचे राल परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला (इथेनॉल) त्यागें.
    5. राल संतुलन / वा के 800 μl जोड़ेंश बफर और ट्यूब कई बार inverting द्वारा अच्छी तरह मिक्स.
    6. 800 XG पर 2 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र, तो ध्यान से हटाने और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
    7. चरण 3 washes के एक कुल के लिए 2.2.5 और 2.2.6 दो बार दोहराएँ.
    8. बाहर सुखाने से राल को रोकने के लिए नीचे वर्णित सेलुलर lysates (चरण 2.3.8) जोड़ने के लिए तैयार है जब तक अंतिम धोने या सतह पर तैरनेवाला न निकालें.
  3. बाध्यकारी और फ्यूजन परिसरों की धुलाई:
    1. प्रत्येक नमूने लिए, 500 स्तनधारी lysis बफर (50 मिमी Tris-एचसीएल 7.5 पीएच, 150 मिमी NaCl, 1% ट्राइटन X-100, 0.1% ना Deoxycholate) की μl और 1X टीबीएस बफर के 1 मिलीलीटर की तैयारी (100 मिमी Tris-एचसीएल पीएच 7.5 और 150 मिमी NaCl).
    2. ऊपर और नीचे pipetting या संक्षेप में vortexing द्वारा स्तनधारी lysis बफर के 300 μl में सेल छर्रों और resuspend पिघलना.
    3. 50X protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल के 6 μl जोड़ें (800 माइक्रोग्राम / एमएल एचसीएल benzamidine, 500 माइक्रोग्राम / एमएल phenanthroline, 500 माइक्रोग्राम / एमएल aprotinin, 500 माइक्रोग्राम / एमएल leupeptin, 500 & #. 181, ग्राम / मिलीलीटर pepstatin ए, 50mm PMSF) नोट: ये प्रोटीन संलयन टैग बंधन के साथ हस्तक्षेप के रूप में AEBSF में शामिल हैं जो Protease कॉकटेल प्रयोग नहीं किया जा सकता है.
    4. 3 μl RQ1 DNase जोड़ें और आरटी पर 10 मिनट के लिए पलटना.
    5. कांच homogenizer 2.0 मिलीलीटर आकार के साथ Dounce; . 25-30 बर्फ पर स्ट्रोक, या एक 25 या 27 जी सुई के माध्यम से कोशिकाओं को पारित 5-10 बार सेल को पूरा करने के लिए नोट: Sonication परिसरों के अलावा गिर सकता है और अधिक हीटिंग प्रोटीन संलयन टैग गतिविधि को प्रभावित कर सकता के रूप में की सिफारिश नहीं है.
    6. Lysate खाली करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 14,000 XG पर अपकेंद्रित्र.
    7. बर्फ पर नया ट्यूब और जगह को स्पष्ट lysate, लगभग 300 μl कुल मात्रा स्थानांतरण.
    8. 1X टीबीएस बफर का एक अतिरिक्त 700 μl lysate स्पष्ट और ऊपर और नीचे pipetting और से अच्छी तरह से मिश्रण में जोड़ें.
    9. चरण 2.2.8 में तैयार equilibrated राल ट्यूब लें और ट्यूब के नीचे राल परेशान बिना राल से अंतिम धोने / सतह पर तैरनेवाला हटायें.
    10. प्रत्येक टीयू में जोड़ेंराल, पतला lysate के 1 मिलीलीटर की हो.
    11. 22 डिग्री सेल्सियस नोट पर 15 मिनट के लिए एक ट्यूब रोटेटर (या कोमल मिक्सर) पर मिश्रण के साथ सेते हैं: इस समय के दौरान राल के निपटाने के बंधन क्षमता कम कर देता. 4 डिग्री सेल्सियस पर बाध्यकारी वांछित है, 1 घंटे के लिए मिश्रण से ऐसा करते हैं.
    12. 800 XG पर 2 मिनट के लिए और सतह पर तैरनेवाला त्यागने अपकेंद्रित्र राल ट्यूबों.
    13. चरण 2.2.1 में बनाया राल संतुलन / धो बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ें और हाथ से कई बार राल ट्यूब inverting द्वारा अच्छी तरह मिक्स.
    14. 800 XG पर 2 मिनट के लिए और धोने त्यागें अपकेंद्रित्र राल ट्यूबों.
    15. 2.3.12 2.3.14 तीन अतिरिक्त टाइम्स द्वारा पीछा चरणों को दोहराएँ.
    16. राल संतुलन / धो बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ें और निरंतर रोटेशन के साथ 5 मिनट के लिए 22 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
    17. 800 XG पर 2 मिनट के लिए और धोने त्यागें अपकेंद्रित्र राल ट्यूबों.
    18. अंत आवेदन के आधार पर (आगे स्पष्टीकरण के लिए परिचय देखें), धारा 2.4 या 2.5 या तो आगे बढ़ें.
  4. एसDenaturing जैल, पश्चिमी blots, या मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए डी एस क्षालन:
    1. 50 μl एसडीएस क्षालन बफर में प्रत्येक नमूने से (1% एसडीएस और 50 मिमी Tris-एचसीएल pH7.5) राल Resuspend
    2. 30 मिनट के लिए आरटी पर ट्यूबों हिलाएँ.
    3. विश्लेषण के लिए ताजा ट्यूबों के लिए 800 XG और हस्तांतरण eluates पर 2 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र.
    4. पश्चिमी धब्बा या चांदी दाग ​​जेल के लिए, एक एसडीएस denaturing जेल पर लोड 5-10 μl.
    5. मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए, -20 डिग्री सेल्सियस पर प्रत्येक नमूने के 40 μl बचाने
  5. कार्यात्मक assays, पश्चिमी blots, या मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए TEV Protease क्षालन:
    1. पिछले धोने के हटाने के बाद, 50 μl ProTEV दरार बफर और TEV एंजाइम की 30 इकाइयों में राल resuspend.
    2. 1 घंटे के लिए झटकों के साथ 25 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
    3. 800 x जी पर 2 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र.
    4. ताजा ट्यूबों को eluate स्थानांतरण.
    5. कार्यात्मक assays में तत्काल उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर नमूना.

3.एक cytoplasmic और परमाणु पारगम्य Ligand का प्रयोग Fluorescently लेबल फ्यूजन प्रोटीन सेलुलर इमेजिंग

  1. Transfect, लेबल, और छवि कोशिकाओं:
    1. X 10 5 कोशिकाओं / एमएल 1-2 के घनत्व पर प्रत्येक संलयन प्रोटीन या नियंत्रण, प्रत्येक कुएं में उनके उपयुक्त मीडिया में HELA कोशिकाओं की थाली 400 μl के लिए एक 8 अच्छी तरह से संभाग coverglass में.
    2. सिफारिश के रूप में तो transfect, 37 डिग्री सेल्सियस पर 18-24 घंटे और 5% सीओ 2 के लिए सेते हैं.
    3. 18-24 घंटे बाद अभिकर्मक, तो अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए इस समाधान के 100 μl जोड़ने और धीरे मिश्रण, TMR ligand उपयुक्त सेलुलर मीडिया में 1:200 पतला.
    4. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 के 15 मिनट के लिए ligand युक्त कोशिकाओं को सेते हैं.
    5. Ligand और 37 डिग्री सेल्सियस के पूर्व गरम कर दिया गया है, जो प्रोटीन संलयन टैग ligand, कमी उपयुक्त मीडिया के 500 μl के साथ की जगह युक्त महाप्राण बंद मीडिया
    6. तीन washes के एक कुल के लिए दो बार दोहराएँ.
    7. (वापस इनक्यूबेटर में कोशिकाओं डाला 376; सेल्सियस और 5% सीओ 2) 30 मिनट के लिए.
    8. महाप्राण बंद मीडिया और 37 डिग्री सेल्सियस के पूर्व गरम किया गया है जो उचित मीडिया के 500 μl के साथ की जगह
    9. उचित अधिग्रहण पैरामीटर (: 555 एनएम, उत्सर्जन: 585 एनएम TMR उत्तेजना) का उपयोग कर एक खुर्दबीन पर छवि.

Representative Results

किसी भी नए संलयन प्रोटीन के साथ काम करते हैं, तो यह अभिकर्मक के बाद उस प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए पहला परीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण है और यह भी उचित आणविक वजन के एक प्रोटीन का उत्पादन किया जा रहा है जो मान्य है. HaloTag संलयन प्रोटीन fluorescently और covalently पारगम्य या स्थानीयकरण पर निर्भर करता है, अभेद्य ligands के साथ लेबल किया जा सकता है, यह जल्दी से एक fluorimager पर स्कैनिंग द्वारा पीछा जेल वैद्युतकणसंचलन denaturing सेलुलर lysates लगाने से अभिव्यक्ति निर्धारित करने के लिए संभव है. धारा 1.2, हेलो-BRD4 (189 केडी) की अभिव्यक्ति और HaloTag अकेले नियंत्रण (Ctrl) मनाया जाता है (34 केडी, 2A चित्रा) में वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग. प्रोटोकॉल में उल्लेख किया है, संलयन प्रोटीन की अभिव्यक्ति भी विरोधी HaloTag एंटीबॉडी के साथ परंपरागत पश्चिमी blots का उपयोग कर पाया जा सकता है, या अगर वे उपलब्ध हैं, चारा प्रोटीन के लिए एंटीबॉडी. यदि संभव हो तो, यह यह टी अधिक, विशिष्ट तेज, और आसान है बजाय फ्लोरोसेंट ligand उपयोग करने के लिए सिफारिश की हैहान एंटीबॉडी का पता लगाने, और 10 भी मात्रात्मक.

उचित पूर्ण लंबाई संलयन प्रोटीन की अभिव्यक्ति सत्यापित होने के बाद, प्रोटीन pulldowns किया जा सकता है. उच्च reproducibility दिखाना है जो एसडीएस (प्रोटोकॉल धारा 2.4) द्वारा eluted हेलो-BRD4 और Ctrl pulldowns की जैविक प्रतिकृति की चांदी दाग जैल चित्रा 2B में दिखाया गया. चांदी दाग जैल प्रोटीन की एक महत्वपूर्ण संख्या BRD4 प्रोटीन और नियंत्रण (चित्रा 2 बी) में बहुत कम पृष्ठभूमि के साथ बातचीत करने के लिए पाए जाते हैं दिखा. परिचय में उल्लेख किया है कि यह covalently बाध्य रहता है, क्षालन की इस प्रक्रिया में, हेलो-BRD4 राल से eluted नहीं किया जाएगा. इसलिए, एक महत्वपूर्ण बैंड चांदी दाग (चित्रा 2 बी) या वेस्टर्न ब्लॉट (नहीं दिखाया डेटा) में पता लगाया जा रहा है इस आणविक वजन पर वहाँ नहीं है. इन प्रोटीनों BRD4 के लिए विशिष्ट हैं, तो यह निर्धारित करने के लिए, तरल क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LC-MS/MS) सी पर प्रदर्शन किया गया थाएसडीएस क्षालन के बाद प्राप्त omplex मिश्रण. वर्णक्रमीय मायने रखता है और सामान्यीकृत वर्णक्रमीय बहुतायत कारक हेलो-BRD4 मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण में पाया BRD4 18-20 से जाना जाता interactors के लिए (NSAF) मूल्यों चित्रा -2 में दिखाया गया. pTEFb 18,20 से उपकरणों और भी BRD9 19 प्रोटीन की उच्च बहुतायत BRD4 परिसरों की विशिष्ट कब्जा की पुष्टि करें. चांदी दाग जैल (चित्रा 2 बी) ने भविष्यवाणी की, कई अन्य प्रोटीन भी नियंत्रण (नहीं दिखाया डेटा) में नहीं मनाया गया है कि BRD4 की संभावित interactors के रूप में पहचान की गई. ये पहले से अज्ञात हैं, वे प्रोटीन के लिए एक सच्चे interactor है कि क्या इस बात की पुष्टि करने के लिए स्वतंत्र रूप से अन्य तरीके से सत्यापित करने की आवश्यकता है, और यदि हां, तो यह सीधे या परोक्ष रूप से BRD4 साथ जुड़ा हुआ है.

पृथक परिसरों भी गतिविधि के लिए अध्ययन किया जा सकता है; यह वे functionali बनाए रखने के लिए इतना है कि TEV प्रोटीज (प्रोटोकॉल धारा 2.5) का उपयोग परिसरों elute करने की सिफारिश की हैTy. चित्रा 3 ए, TEV प्रोटीज का उपयोग राल से जारी हेलो-HDAC1 pulldown परिसरों की एक चांदी दाग जेल में दिखाया गया है. TEV प्रोटीज प्रोटीन संलयन टैग और उसके फ्यूजन साथी, चारा प्रोटीन की काफी मात्रा में, इस मामले में HDAC1, मनाया जाता है (चित्रा 3) के बीच एक linker क्षेत्र में फोड़ना होगा. इस अंश HDAC1 गतिविधि निहित निर्धारित करने के लिए, eluted TEV नमूने एक luminescent HDAC परख, HDAC-Glo 21 में परीक्षण किया गया. चित्रा 3 बी में दिखाया गया है, HDAC1 pulldown नमूने HDAC1 गतिविधि का उच्च स्तर विशेष रूप से एक ज्ञात HDAC अवरोध, साहा 22 (कॉलम 2) द्वारा हिचकते था जो (कॉलम 1), पता चला है. नियंत्रण आगे विशिष्टता का प्रदर्शन के रूप में कोई HDAC अवरोध एक संबंधित Sirtuin परिवार अवरोध करनेवाला, EX-527 22 (कॉलम 3) और कोई संकेत (स्तंभ 4) जोड़ा HDAC1 pulldown नमूना बिना अकेले बफर का उपयोग कर पाया गया था के साथ मनाया गया.

समारोह के एक महत्वपूर्ण घटकअल प्रोटिओमिक्स और समझने परिसरों, भी प्रोटीन स्थानीयकरण और / या अवैध व्यापार को समझने की है. ये वही फ्यूजन निर्माणों fluorescently कोशिकाओं के अंदर लेबल किया जा सकता है, हम confocal इमेजिंग का उपयोग कर अपने स्थानीयकरण पर नजर रखी. धारा 3 में प्रोटोकॉल के बाद क्षणिक हेलो-BRD4 (चित्रा -4 ए) और हेलो-HDAC1 (चित्रा 4 बी) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट HELA कोशिकाओं fluorescently TMR ligand के साथ लेबल और imaged थे. आंकड़े -4 ए और 4 बी में दिखाया गया है, दोनों 17 की उम्मीद के रूप में नाभिक के लिए स्थानीयकृत. इन आंकड़ों टैग की उपस्थिति अपने संलयन भागीदारों के शारीरिक सेलुलर स्थानीयकरण बदल नहीं किया था कि प्रदर्शित करता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. प्रोटीन pulldown और confocal इमेजिंग अनुप्रयोगों के योजनाबद्ध. के रूप में उपयोग करना चिमनी स्तनधारी कोशिकाओं में प्रोटीन समारोह को समझने के लिए कई आवेदन का निर्माण संभव हो रहे हैं. सभी के लिए, एक हेलो फ्यूजन का निर्माण या तो stably या क्षणिक अनुयायी या निलंबन स्तनधारी कोशिकाओं में व्यक्त किया है. प्रोटीन जटिल pulldowns के लिए, कोशिकाओं को फिर परिसरों covalently राल पर कब्जा कर रहे हैं, lysed रहे हैं, और एसडीएस क्षालन (बाएँ मार्ग) या TEV दरार (सही मार्ग) या तो के माध्यम से eluted. TEV दरार कार्यात्मक विश्लेषण के प्रदर्शन के लिए इष्टतम है, जबकि एसडीएस क्षालन, मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए आगे बढ़ने के लिए सिफारिश की है. अभिव्यक्ति, सेलुलर स्थानीयकरण, तस्करी की घटनाओं, या प्रोटीन कारोबार के लिए चिह्नित करना, संलयन प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं रहते fluorescently लेबल और आगे एसडीएस पृष्ठ जैल पर या confocal इमेजिंग का उपयोग विश्लेषण कर रहे हैं. दोनों सेल पारगम्य या अभेद्य फ्लोरोसेंट ligands कक्ष के भीतर संलयन प्रोटीन का स्थानीयकरण या प्रस्तुति के आधार पर उपलब्ध हैं.

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चित्रा 2. हेलो-BRD4 प्रोटीन अभिव्यक्ति, pulldown, और मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण. TMR ligand (प्रोटोकॉल धारा 2.1) के साथ लेबल एक HEK293T सेलुलर lysate भीतर हेलो-BRD4 संलयन प्रोटीन, 189 केडी, और अकेले हेलो प्रोटीन संलयन टैग, 34 केडी, नियंत्रण (Ctrl) की अभिव्यक्ति दिखा (ए) एक एसडीएस पृष्ठ जैल. जैल का पता लगाने के लिए fluorimager साथ स्कैन किया गया और एक फ्लोरोसेंट आणविक वजन मार्कर का इस्तेमाल किया गया था. (बी) एसडीएस के साथ eluted हेलो-BRD4 और Ctrl नमूनों की pulldowns के लिए जैविक प्रतिकृति के रजत दाग जैल. आण्विक वजन आकार जेल के लिए संकेत कर रहे हैं. (सी) स्पेक्ट्रल मायने रखता है (बाएं पैनल) और प्रोटीन के लिए हेलो के जैविक प्रतिकृति का मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण में पहचान प्रोटीन की आणविक भार किस खाते सामान्यीकृत वर्णक्रमीय बहुतायत कारकों (NSAF) मान (सही पैनल) BRD4 और Ctrl. दिखाया डब्ल्यू बातचीत करने के लिए जाना जाता है प्रोटीनpTEFb (CDK9 और Cyclin टी) के घटक 18,20, साथ ही BRD9 19 सहित ith BRD4,. इन प्रोटीनों से कोई पेप्टाइड्स Ctrl में पहचान की गई.

चित्रा 3
चित्रा 3. हेलो-HDAC1 जटिल अलगाव और गतिविधि विश्लेषण. (ए) TEV दरार के बाद Ctrl (प्रोटोकॉल धारा 2.5) से हेलो-HDAC1 परिसरों और पृष्ठभूमि के अलगाव दिखा रजत दाग जैल. प्रमुख HDAC1 बैंड (55 केडीए) और TEV प्रोटीज बैंड लेबल रहे हैं. मुफ्त HDAC1 राल (चित्रा 1). (बी) के ग्राफ एक luminescent histone deacetylase परख, HDAC में HDAC1 जटिल isolations नमूनों की गतिविधि दिखा पर कब्जा करने के बाद HaloTag और HDAC1 संलयन अनुक्रम के बीच एक अनुकूलित लिंकर भीतर TEV दरार से उत्पन्न होता है 21 Glo. ग्राफ का कॉलम 1 उच्च एल से पता चलता हैहेलो-HDAC1 pulldown नमूने (HDAC1) के साथ निहित HDAC गतिविधि का evels. कॉलम 2 इस गतिविधि विशेष रूप से HDAC1 pulldown नमूने लिए, HDAC अवरोध, साहा 22 के अलावा द्वारा कम किया जा सकता का पता चलता है. नियंत्रण के रूप में, स्तंभ 3 Sirtuin परिवार के लिए विशिष्ट एक deacetylase अवरोध करनेवाला दर्शाता है, लेकिन नहीं HDACs, पूर्व 527 22, HDAC1 गतिविधि और स्तंभ 4 से पता चलता है कोई गतिविधि अकेले बफर का उपयोग कर मनाया जाता है को बाधित नहीं करता है.

चित्रा 4
चित्रा 4. हेलो-BRD4 और हेलो-HDAC1 confocal इमेजिंग. हेलो-BRD4 (ए) या ​​हेलो-HDAC1 fluorescently TMR ligand के साथ लेबल (बी) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट HELA कोशिकाओं के सेल confocal इमेजिंग लाइव. (ए) हेलो-BRD4 अभिव्यक्ति प्रतिबंधित है नाभिक और (बी) हेलो-HDAC1 अभिव्यक्ति के लिए मुख्य रूप से NUC हैलेअर. पैनल के बाईं ओर फ्लोरोसेंट चैनल है और दाएं प्रत्येक के लिए डीआईसी चैनल के साथ फ्लोरोसेंट चैनल का ओवरले है. छवियाँ उपयुक्त फिल्टर सेट का उपयोग कर एक 37 डिग्री सेल्सियस + सीओ 2 पर्यावरण कक्ष के साथ सुसज्जित एक confocal खुर्दबीन पर हासिल किया गया. स्केल सलाखों 20 माइक्रोन =.

Discussion

दो संलयन प्रोटीन, हेलो-BRD4 और हेलो-HDAC1, अभिव्यक्ति के लिए यूकेरियोटिक स्तनधारी कोशिकाओं में विशेषता, प्रोटीन जटिल अलगाव और गतिविधि, और सेलुलर स्थानीयकरण पर बातचीत. इन विभिन्न प्रोटोकॉल के माध्यम से काम करने में, प्रत्येक प्रयोग की सफलता के लिए कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं. खुद को शरीर क्रिया विज्ञान को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है टैग के किसी भी संलयन प्रोटीन, अभिव्यक्ति के स्तर और नियुक्ति के मामले में है. यह पूर्व ज्ञान या किसी अन्य टैग के साथ काम पसंद की विशेष प्रोटीन के लिए प्रदर्शन किया गया है नहीं तो एन और / या सी टर्मिनल fusions से डिजाइन करने की आवश्यकता होगी कि विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है. स्तर बहुत अधिक है अगर अभिव्यक्ति के बारे में, डीएनए के कमजोर पड़ने उचित है कि स्तर को प्राप्त करने के लिए कमजोर प्रमोटरों के साथ वैक्टर के अभिकर्मक या प्रयोग के दौरान संभव हो रहे हैं प्रदर्शन किया जा सकता है. पिछला काम अंतर्जात Le में macromolecular परिसर के कुशल अलगाव दिखा प्रदर्शन किया गया हैअभिव्यक्ति की बहुत कम स्तर पर काम सक्रिय करने के अभिव्यक्ति 8 वी इ एल एस,. यदि संभव हो तो, सेलुलर स्थानीयकरण अध्ययनों से यह भी उचित शरीर क्रिया विज्ञान के लिए आवश्यक इष्टतम टैग प्लेसमेंट की स्थिति के साथ ही रिश्तेदार अभिव्यक्ति के स्तर के रूप में जानकारी प्रदान करने में सक्षम हो जाएगा.

संलयन प्रोटीन सबसे बड़ा लाभ में से एक के रूप में जटिल अलगाव की गति है, यह बाध्यकारी, सेल में सिफारिश की समय फ्रेम का पालन करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है प्रोटोकॉल, और वाशिंग वर्गों के साथ अधिकतम सफलता प्राप्त करने के लिए, पुलडाउन प्रयोगों के लिए तैयार हैं प्रक्रिया. इन कदमों से किसी भी समय में lengthened कर रहे हैं जैसे एक एंटीबॉडी आधारित कब्जा विधि के लिए आवश्यक है, एक जटिल विसंघटन का खतरा या 8 बाध्यकारी वृद्धि की गैर विशिष्ट है. टाइम्स सेलुलर सेल या बंधन के दौरान छोटा कर रहे हैं इसी तरह अगर, कोशिकाओं को पूरी तरह lysed या कुशलता क्रमशः कब्जा नहीं किया जा सकता है. Washes की संख्या decr है तोढील या राल का अच्छा मिश्रण बंधन या washes के दौरान उत्पन्न नहीं होती है, तो गैर विशिष्ट प्रोटीन की पृष्ठभूमि का स्तर बढ़ जाएगा. इसके अलावा, सेल के साधन राल के लिए बाध्य दक्षता के लिए संबंधित के रूप में बहुत महत्वपूर्ण है. , नमूने sonicate सिफारिश डिटर्जेंट हटाने, एसडीएस या अन्य मजबूत डिटर्जेंट जोड़ने, और / या protease अवरोध AEBSF शामिल करने के प्रयास कम या राल के लिए संलयन प्रोटीन और उनके परिसरों के बंधन का नुकसान होगा.

स्तनधारी कोशिकाओं और मास स्पेक्ट्रोमेट्री 16 से विश्लेषण में पृष्ठभूमि को कम करने की चुनौती के साथ मानव प्रोटिओमिक विश्लेषण संघर्ष से जटिल अलगाव के लिए मौजूदा तरीकों. इस contaminating प्रोटीन का भंडार कई मास स्पेक्ट्रोमेट्री समूहों 16 से बनाया गया है कि इतनी महत्वपूर्ण हो गया है. मास स्पेक्ट्रोमेट्री pulldown नमूनों में पृष्ठभूमि की पहचान रोकता है जो कुछ भी रूप में परिभाषित किया जा सकता हैचारा प्रोटीन का सच interactors. जैसे, पृष्ठभूमि गैर विशिष्ट प्रोटीन या भी चारा प्रोटीन या चारा प्रोटीन वेग के लिए इस्तेमाल किया एंटीबॉडी के बड़े सांद्रता contaminating से पैदा कर सकते हैं. महत्वपूर्ण कार्य यहाँ प्रस्तुत pulldown प्रोटोकॉल के साथ ही pulldown प्रक्रिया में गैर विशिष्ट contaminating प्रोटीन का स्तर कम करने के लिए राल दोनों के अनुकूलन में किया गया था. यह चांदी दाग जैल और नियंत्रण के मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण (चित्रा 2) में स्पष्ट है. चारा प्रोटीन या अन्य तरीके से संघर्ष के साथ जो contaminants और के रूप में समान रूप से हानिकारक हो सकता है कि एंटीबॉडी के उच्च स्तर का पता, एसडीएस क्षालन साथ pulldown (प्रोटोकॉल धारा 2.4) की सिफारिश की है. कारण राल को सहसंयोजक लगाव को, इस प्रक्रिया covalently राल से जुड़ी प्रारंभिक संलयन प्रोटीन का बहुमत छोड़ देंगे. चारा का एक छोटा सा प्रतिशत माना जाता है जो मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण में मनाया जाता हैहाइड्रोलिसिस के माध्यम से होती है, लेकिन यह अन्य कमजोर या क्षणिक बातचीत 8 का पता लगाने के लिए एक समस्या मौजूद नहीं है.

शुरूआत में उल्लेख किया है, प्रोटिओमिक्स में उल्लेखनीय प्रगति मास स्पेक्ट्रोमेट्री 1,7 में महत्वपूर्ण प्रगति से सक्षम किया गया है. इसलिए, यह pulldowns में प्राप्त प्रोटीन का मिश्रण deconvolute मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के चुनाव की महत्वपूर्ण मापदंडों को उजागर करने के लिए महत्वपूर्ण है. इंस्ट्रुमेंटेशन मजबूत और नियमित रूप से और कुशलता <1 ग्राम से अक्सर कम प्रोटीन की एक छोटी राशि है, जिसमें नमूनों का विश्लेषण करने में सक्षम होना चाहिए. 100-300 NL / मिनट रेंज में प्रवाह की दर के साथ 50-75 माइक्रोन आंतरिक व्यास HPLC कॉलम शामिल नेनो पैमाने क्रोमैटोग्राफी आम तौर पर छोटा सा नमूना आकार के साथ संगतता के लिए कार्यरत है और मास स्पेक्ट्रोमीटर की संवेदनशीलता को अधिकतम करने के लिए. एक विश्लेषण के राज्य ओ में प्राप्त जानकारी को अधिकतम करने के लिएच aforementioned nanoscale के विभाजन के साथ संगत एक समय के पैमाने, ≥ 10 हर्ट्ज पर उच्च संकल्प जन स्पेक्ट्रा प्राप्त करने में सक्षम कला मास स्पेक्ट्रोमीटर, आम तौर पर कार्यरत हैं. इन उपकरणों संवेदनशीलता का attomolar स्तर है और नियमित रूप से उप पीपीएम अग्रदूत और उत्पाद आयन जन त्रुटि tolerances के साथ डेटा प्राप्त कर सकते हैं. ये प्रदर्शन विशेषताओं पहचान प्रोटीन की संख्या की उपज और उन पहचान के साथ जुड़े आत्मविश्वास को बढ़ाने के लिए काम करते हैं.

उपन्यास बातचीत की खोज के लिए क्षमता के साथ प्रोटीन बातचीत, और सभी एक ही निर्माण का उपयोग कर सक्रिय परिसरों का अलगाव: इन आंकड़ों के साथ हम शारीरिक सेलुलर स्थानीयकरण, उचित प्रोटीन प्रदर्शित करता है. दरअसल वैकल्पिक तकनीकों लेकिन संभावना नहीं सभी 23,24 के लिए, इन विभिन्न पहलुओं में से प्रत्येक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. HaloTag तकनीक के साथ, एक multifunctional दृष्टिकोण proteom बढ़ते इस्तेमाल किया जा सकता हैआईसीएस पढ़ाई और स्तनधारी कोशिकाओं में प्रोटीन समारोह की एक और पूरी समझ प्राप्त करने.

Disclosures

इस लेख के लिए प्रकाशन फीस Promega निगम द्वारा प्रायोजित कर रहे हैं. Danette एल डेनियल, Jacqui मेंडेज़, हेलेन Benink, एंड्रयू नाइल्स, नैन्सी मर्फी और Marjeta Urh Promega निगम, HaloTag प्रौद्योगिकी और उसके आवेदन के पेटेंट के काम से वाणिज्यिक मालिक के कर्मचारी हैं. माइकल फोर्ड, रिचर्ड जोन्स, रवि Amunugama, और दाऊद एलन इस पांडुलिपि में वर्णित मास स्पेक्ट्रोमेट्री सेवाएं प्रदान करता है जो MSBioworks, के कर्मचारी हैं.

Acknowledgments

हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए डॉ. मार्टिन रोसेनबर्ग, डॉ. गैरी Tarpley, और डॉ. कीथ लकड़ी इस काम का समर्थन करने के लिए, और डॉ. जेम्स कैली धन्यवाद. DLD, जेएम, एचबी, समुद्री मील दूर, एक, जे.सी., और म्यू Promega निगम के कर्मचारी हैं. म्यूचुअल फंड, आरजे, आर ए, और डीए एमएस Bioworks, एलएलसी के कर्मचारी हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HeLa Cells ATCC CCL-2 Adherent
HEK293T Cells ATCC CRL-11268 Adherent
Cellular growth media Invitrogen/Gibco
PBS - tissue culture certified Invitrogen/Gibco
FuGENE HD Transfection Reagent Promega E2311
HaloTag Control Vector Promega G6591
HaloTag-BRD4 Kazusa DNA Research Institute FHC11882 N-terminal HaloTag fusion
HaloTag-HDAC1 Kazusa DNA Research Institute FHC02563 N-terminal HaloTag fusion
HaloTag Clones containing content Promega Various http://www.promega.com/FindMyGene/
HaloTag Flexi Vectors for cloning (N- or C-terminal) Promega Various Choose based upon expression level and HaloTag orientation
HaloTag TMR Ligand Promega G8251
IGEPAL CA-630 Sigma 18896
HaloTag Mammalian Pull-Down and Labelling System Promega G6500 Contains HaloTag TMR ligand
HaloTag Mammalian Pull-Down System Promega G6504
Protease Inhibitor Cocktail, 50X Promega G6521
Mammalian Lysis Buffer Promega G9381
HaloTag Monoclonal Antibody Promega G9211
ProTEV Plus Promega V6101
RQ1 Dnase Promega M6101
HaloLink Resin Promega G1912
HDAC-Glo Promega G6420
PBS + 0.1% Triton X-100 For optional imaging
4% paraformaldehyde/0.2 M sucrose/PBS For optional imaging
Ethanol
Tissue culture vessels and dishes
Cell culture incubator
Disposable cell lifter Thermo Fisher Scientific 08-773-1
Glass homogenizer such as Kontes Dounce Tissue Grinder Thermo Fisher Scientific K885300-0002 25-27 G needle could also be used
Microcentrifuge
Tube rotator such as Labquake Thermo Fisher Scientific 4002110Q Ideal for binding and washing steps
Shaking platform such as Eppendorf Thermomixer Thermo Fisher Scientific 05-400-200 Ideal for SDS elution and TEV cleavage steps
Chambered cover glass Thermo Fisher Scientific 155409 For optional imaging
Fluorescent Microscrope (555 nm Ex/585 nm Em) For optional imaging

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References

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सेलुलर जीवविज्ञान अंक 89 प्रोटिओमिक्स HaloTag प्रोटीन बातचीत मास स्पेक्ट्रोमेट्री bromodomain प्रोटीन BRD4 histone deacetylase (HDAC) HDAC सेलुलर assays और confocal इमेजिंग
प्रोटीन सहभागिता की खोज और HaloTag प्रौद्योगिकी का उपयोग प्रोटीन समारोह निस्र्पक
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