قناة واحدة الخلية المرفقة تسجيل التصحيح، المشبك
Summary
الموصوفة هنا هي إجراءات الحصول على فترات طويلة من التسجيل الحالي من قناة واحدة أيون مع تقنية التصحيح، المشبك الخلية المرفقة. يسمح هذا الأسلوب للمراقبة، في الوقت الحقيقي، ونمط التشكل قناة مفتوحة قريبة من التي تكمن وراء إشارة البيولوجية. هذه البيانات إعلام حول خصائص القناة في الأغشية البيولوجية دون عائق.
Abstract
أيون البروتينات القناة هي أجهزة عالمية للاتصال سريعة عبر الأغشية البيولوجية. التوقيع الزمني للتدفق الأيونية أنها تولد يعتمد على الخصائص الذاتية لكل قناة البروتين وكذلك الآلية التي يتم إنشاؤها والتحكم فيه، ويمثل مجالا هاما للأبحاث الحالية. يمكن الحصول على معلومات حول الديناميات التشغيلية من البروتينات القناة الايونية من خلال مراقبة فترات طويلة من الحالية التي تنتجها جزيء واحد. الموصوفة هنا هو بروتوكول للحصول على قناة واحدة الخلية المرفقة التصحيح، المشبك التسجيلات الحالية ليجند بوابات القناة الايونية، ومستقبلات NMDA، أعرب heterologously في الخلايا HEK293 أو أصلا في الخلايا العصبية القشرية. كما أنه تقدم إرشادات حول كيفية التكيف مع أسلوب لقنوات ايون الأخرى ذات الاهتمام من خلال تقديم المثال للقناة PIEZO1 الحساسة للميكانو. هذه الطريقة يمكن توفير البيانات المتعلقة بالخصائص تصرف القناة والتسلسل الزمني لمكتب مستشار رئيس الوزراءالتشكل مغلق ن التي تشكل آلية تفعيل القناة، مما يساعد على فهم وظائفها في الصحة والمرض.
Introduction
الاتصالات السريعة عبر الأغشية البيولوجية تعتمد بشكل شبه حصري على من oligomeric المسام تشكيل بروتينات الغشاء، يشار إلى القنوات. هذه البروتينات تختلف على نطاق واسع في إشارات التنشيط، آليات النابضة، وخصائص تصرف. تصنف البروتينات القناة التي المسام انتقائية لأيونات كقنوات أيون؛ تفعيلها تنتج التيارات الأيونية عبر الغشاء، ويمكن تسجيل إجاباتهم مع ارتفاع القرار في الوقت الحقيقي باستخدام تقنيات الكهربية. إشارات التنشيط تمتد مجموعة واسعة من المدخلات الكيميائية والفيزيائية بما في ذلك تدرجات التركيز، القوات الميكانيكية والكهربائية، ودرجة الحرارة؛ وبالتالي، المزيد من تصنيف القنوات الأيونية في يجند بوابات، mechanosensitive، والجهد مسور، أو أنواع حساسة للحرارة. في هذه المقالة، وصفت البروتوكولات لتسجيل نشاط قناة واحدة من قناة يجند بوابات، ومستقبلات NMDA، وقناة mechanosensitive، PIEZO1، وذلك باستخدام تقنية التصحيح، المشبك.0؛
التصحيح، المشبك الكهربية هو المنهج التجريبي الأول والأكثر استخداما على نطاق واسع حساسة بما فيه الكفاية للسماح مراقبة الجزيئات واحدة 1، 2. بالإضافة إلى هذه الحساسية رائعة، وتوسعت بشكل كبير الاستعدادات البيولوجية قابلة للتسجيل الكهربية وأيضا قد سمح مراقبة القنوات الأيونية في الأغشية سليمة. أولا، لأن كلا لقط الجهد والتسجيل الحالي يتم إنجاز مع نفس القطب، ويمكن استخدامه لتسجيل إشارات عبر أغشية خلايا صغيرة أو بقع. وكشفت هذه التقنية أن القنوات الأيونية لا تقتصر على الأغشية منفعل للعضلات الضفدع، electroplaques ثعبان البحر، أو المحاور العملاقة الحبار 3، 4، بل أنها تمثل المباريات في كل مكان من آليات يشير الغشاء والمتأصلة لجميع أنواع غشاء الخلوي للأحادي أو الكائنات الحية متعددة الخلايا، وأيضا لأغشية الخلايا. استيرادantly، شريطة القدرة على تسجيل التيارات عبر الغشاء ببساطة عن طريق ربط ماصة الزجاج لخلية سليمة فرصة غير مسبوقة لتسجيل النشاط من القنوات الأيونية في الأغشية undisrupted الأصلية الخاصة بهم. وبالتالي، الخلية المرفقة تقنية التصحيح، المشبك، والتي تم وصفها في هذا البروتوكول، ويسمح برصد نشاط القنوات الأيونية بشكل مستمر لعشرات دقيقة أو أكثر في بيئتها الأصلية.
تحت التقلبات الحرارية العادية، جميع البروتينات، بما في ذلك البروتينات القناة الايونية، تغيرات هيكلية على نطاق واسع الوقت، مع الأسرع والأكثر تواترا إعادة ترتيب تمثل على الأرجح من قبل الحركات الجانبية وسلسلة التغييرات أبطأ بكثير، أقل تواترا ممثلة ضعيتها كامل المجالات أو الوحدات الفرعية، أو في بعض الحالات بواسطة التعديلات بعد متعدية أو تفاعلات البروتين البروتين 5، 6. يمكن مراقبة فترات طويلة من النشاط الناتجة عن جزيء واحد يساعد على فهم وظائفهاالديناميات التقليدية للقنوات ايون في الأغشية الفسيولوجية سليمة ويوفر معلومات قيمة حول آلية تنفيذية للجزيء لوحظ.
وعلى النقيض من فهم متزايد للتنوع القنوات الأيونية عبر أنواع الخلايا ومراحل النمو والمعرفة حول التركيب الجزيئي من القنوات الأيونية في الأغشية الأم لا تزال محدودة. جميع القنوات الأيونية هي بروتينات multimeric وغالبية القنوات الأيونية الأصلي تجميع من عدة أنواع من مفارز إنتاج البروتينات الجزيئية واسعة التنوع، والتي غالبا ما ترافق مع تصرف والنابضة خصائص متنوعة. لهذا السبب، يتم دراسة قنوات الأيونات من التركيب الجزيئي محددة على التعبير في أنظمة مغايرة. على وجه الخصوص، اكتسبت خلايا HEK293، والتي هي خط نسيلي من الخلايا الجنينية البشرية خلد الكلى 7 والقبول على نطاق واسع كنظام المفضل للتعبير مغايرة من القنوات الأيونية المؤتلف. بين الرجلمزايا ذ أن ارتقى الخلايا HEK293 كنظام خيار لقناة أيون الكهربية هي السهولة والقدرة على تحمل تكاليف زراعة والحفاظ على ثقافتها مستقرة طويلة الأمد، وقدرتهم على تنفيذ ما بعد متعدية للطي، وتجهيز والاتجار من البروتينات الثدييات، وفي كثير من الحالات ، ومستوى منخفض أو حتى غياب التعبير الذاتية للقناة من الفائدة 7، 8. معربا عن القنوات الأيونية المؤتلف ودراسة الخصائص الوظيفية في الخلايا HEK293 يزال نهجا قيما للحصول على معلومات حول خصائص هيكل وظيفة من القنوات الأيونية فضلا عن خصائص محددة من الأشكال الإسوية القناة الايونية ودورها في أنسجة الأم. البروتوكولات الموضحة في هذه المقالة يمكن تطبيقها بشكل جيد على قدم المساواة لقنوات أيون المؤتلف وأعرب في الخلايا HEK293 والقنوات الأيونية الأصلية.
وباختصار، فإن تقنية التصحيح، المشبك، من خلال قدرته غير مسبوقة لحل إشارةق من جزيء واحد لا يزال، حتى الآن، الأسلوب الأكثر مباشرة لمراقبة سلوك الجزيئات واحدة. في وضع الخلية المرفقة به، وتسجيل التصحيح، المشبك يسمح فترات المراقبة الطويلة التي، عند القيام به لجزيء واحد، يمكن أن توفر نظرة استثنائية في تشغيل القنوات الأيونية. ويرد أدناه بروتوكول للحصول على تسجيلات عالية الدقة الحالية من خلية بقع المرفقة تحتوي على واحد من البروتين القناة الايونية.
Protocol
Representative Results
Discussion
في مجال القناة الايونية، وتكرس مجال هام من مجالات البحوث لفهم تسلسل الأحداث التي تؤدي إلى توجيه أو آلية النابضة افتتاح القناة. بالنسبة لمعظم القنوات، وهذه العملية هي عملية معقدة وتنطوي على عدة خطوات الحركية التي لا يمكن استنتاجها من العيانية إشارة متعدد القنوات. في …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل F31NS086765 (KAC)، F31NS076235 (MAP)، وR01 NS052669 (GKP) وEIA9100012. المؤلفين أشكر ايلين Kasperek للحصول على الخبرة والمساعدة مع البيولوجيا الجزيئية وزراعة الأنسجة؛ وجايسون مايرز لتبادل البيانات التي تم الحصول عليها في وقت مبكر من الخلايا العصبية القشرية الفص الجبهي.
Materials
| Chemicals | Sigma | Various | |
| Borosillicate Glass | Sutter | BF-150-86-10 | |
| Bright field inverted microscope | Olympus | 1×51 | Nikon also has similar microscopes |
| Fluroescent box | X-cite | Series 120 | |
| Liquid Light Guide | X-cite | OEX-LG15 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MP-225 | |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS1001 | |
| Amplifier | Molecular Devices | Axon Axopatch 200B | |
| Table | TMC | 63561 | |
| NIDAQ card | National Instruments | 776844-01 | |
| Puller | Narishige | PC-10 | |
| Polisher | Narishige | Microforge MF-830 | |
| Faraday Cage | TMC | 8133306 | |
| High Speed Pressure Clamp | ALA Scientific Instruments | ALA HSPC | |
| Pressue/Vaccuum Pump | ALA Scientific Instruments | ALA PV-PUMP | For HSPC-1 |
References
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).
- Piccolino, M. Animal electricity and the birth of electrophysiology: the legacy of Luigi Galvani. Brain Research Bulletin. 46, 381-407 (1998).
- Albright, T. D., Jessell, T. M., Kandel, E. R., Posner, M. I. Neural Science: A Century of Progress and the Mysteries that Remain. Neuron. 25, (2000).
- Popescu, G. K. Modes of glutamate receptor gating. The Journal of Physiology. 590, 73-91 (2012).
- Morimoto-Tomita, M., et al. Autoinactivation of Neuronal AMPA Receptors via Glutamate-Regulated TARP Interaction. Neuron. 61, 101-112 (2009).
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51, 187-200 (2005).
- Huang, Z., Li, G., Pei, W., Sosa, L. A., Niu, L. Enhancing protein expression in single HEK 293 cells. Journal of Neuroscience Methods. 142, 159-166 (2005).
- Raymond, L. A., Moshaver, A., Tingley, W. G., Huganir, R. L. Glutamate receptor ion channel properties predict vulnerability to cytotoxicity in a transfected nonneuronal cell line. Mol Cell Neurosci. 7, 102-115 (1996).
- Suchyna, T. M., Markin, V. S., Sachs, F. Biophysics and Structure of the Patch and the Gigaseal. Biophysical Journal. 97, 738-747 (2009).
- Qin, F. Restoration of single-channel currents using the segmental k-means method based on hidden Markov modeling. Biophys J. 86, 1488-1501 (2004).
- Colquhoun, D., Sigworth, F. J. . chapter in Single-channel recording. 2nd edn eds B. Sakmann and E Neher. , (1995).
- Popescu, G., Auerbach, A. Modal gating of NMDA receptors and the shape of their synaptic response. Nat Neurosci. 6, 476-483 (2003).
- Colquhoun, D., Hawkes, A. G. Stochastic properties of ion channel openings and bursts in a membrane patch that contains two channels: evidence concerning the number of channels present when a record containing only single openings is observed. Proc R Soc Lond B Biol Sci. 240, 453-477 (1990).
- Kussius, C. L., Kaur, N., Popescu, G. K. Pregnanolone Sulfate Promotes Desensitization of Activated NMDA Receptors. J. Neurosci. 29, 6819-6827 (2009).
- Amico-Ruvio, S., Popescu, G. Stationary gating of GluN1/GluN2B receptors in intact membrane patches. Biophysical Journal. 98, 1160-1169 (2010).
- Borschel, W. F., et al. Gating reaction mechanism of neuronal NMDA receptors. J Neurophysiol. 108, 3105-3115 (2012).
- Colquhoun, D., Hatton, C. J., Hawkes, A. G. The quality of maximum likelihood estimates of ion channel rate constants. The Journal of Physiology. 547, 699-728 (2003).
- Kussius, C. L., Kaur, N., Popescu, G. K. Pregnanolone Sulfate Promotes Desensitization of Activated NMDA Receptors. The Journal of Neuroscience. 29, 6819-6827 (2009).
- Popescu, G., Auerbach, A. Modal gating of NMDA receptors and the shape of their synaptic response. Nat Neurosci. 6, 476-483 (2003).
- Popescu, G., Robert, A., Howe, J. R., Auerbach, A. Reaction mechanism determines NMDA receptor response to repetitive stimulation. Nature. 430, 790-793 (2004).
- Prieto, M. L., Wollmuth, L. P. Gating Modes in AMPA Receptors. The Journal of Neuroscience. 30, 4449-4459 (2010).
- Poon, K., Nowak, L. M., Oswald, R. E. Characterizing Single-Channel Behavior of GluA3 Receptors. Biophysical Journal. 99, 1437-1446 (2010).
- Smith, T. C., Wang, L. -. Y., Howe, J. R. Heterogeneous Conductance Levels of Native AMPA Receptors. The Journal of Neuroscience. 20, 2073-2085 (2000).
- Coste, B., et al. Piezo1 and Piezo2 Are Essential Components of Distinct Mechanically Activated Cation Channels. Science. 330, 55-60 (2010).
- Coste, B., et al. Piezo proteins are pore-forming subunits of mechanically activated channels. Nature. 483, 176-181 (2012).
- Benndorf, K. . chapter in Single-channel recording. 2nd edn eds B. Sakmann and E Neher. , (1995).
