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Biology

单通道细胞贴附膜片钳记录

Published: June 9, 2014 doi: 10.3791/51629

Summary

这里描述的是获得当前记录的很长一段距离与细胞贴附膜片钳技术一种离子通道的过程。这种方法允许观察,实时的背后的生物信号开闭通道构象的图案。这些数据的通知关于在不受干扰的生物膜通道属性。

Abstract

离子通道蛋白是通过生物膜快速通信的通用设备。离子通量它们产生的瞬时签名取决于固有的每个通道蛋白,以及由其所产生和控制的机制的属性和表示当前研究的重要领域。关于离子通道蛋白的经营动态信息,可通过观察当前很长一段由单个分子制造来获得。这里描述的是一种协议,用于获取一条通道细胞贴附膜片钳记录电流为配体门控离子通道,NMDA受体,异源表达在HEK293细胞中或在本地皮层神经元。本发明还提供关于如何通过呈现在机械性敏感通道PIEZO1的例子中,方法适应其他感兴趣的离子通道的指示。这种方法可以对于该通道的电导特性和氧化聚乙烯的时间序列数据提供正封闭构象组成通道的激活机制,从而有助于了解他们在健康和疾病的功能。

Introduction

过生物膜的快速通信几乎完全依赖于低聚孔形成的膜蛋白,通常被称为信道。这些蛋白质在活化信号,门控机制,传导性能有很大的出入。通道蛋白的毛孔是有选择性的离子被列为离子通道;它们的活化产生的离子电流穿过细胞膜,并且它们的响应可以使用电生理技术来记录具有高分辨率的实时性。激活信号跨越的化学和物理输入,包括浓度梯度,机械和电气的力量和温度浩如烟海;因此,进一步的分类离子通道进入配体门控,机械敏感性,电压门控,或热敏感的类型。在这篇文章中,协议被描述为从一个配体门控通道,NMDA受体和机械敏感性离子通道,PIEZO1记录单声道活动,用膜片钳技术。0;

膜片钳电是最早,最广泛使用的实验方法足够灵敏,以允许观察单个分子1,2。除了这个精致的灵敏度,它已大大扩展了生物制剂适合于电生理记录,并允许离子通道在细胞膜完整的观察。首先,因为这两个电压钳位与当前记录被完成与同一电极,它可以用来通过小的细胞或膜的补丁记录的信号。该技术表明,离子通道并不局限于蛙肌肉,鳗鱼electroplaques或乌贼巨轴突3,4,而是它们所代表的跨膜信号传导机制无处不装置及有固有的单向或所有细胞膜类型的可兴奋膜多细胞有机体,并且还细胞内膜。进口antly,通过简单的连接玻璃吸管,以完整的细胞,记录跨膜电流的能力提供了前所未有的机会,从离子通道在家乡不间断的膜录制活动。因此,细胞贴附式膜片钳技术,这是在本协议中所述,允许连续监测离子通道的活性数十分钟或在他们的母语环境的时间。

在正常温度波动,所有的蛋白质,包括离子通道蛋白,经过了广泛的时间尺度上的结构变化,与代表最有可能通过侧链运动和整个的定位表示要慢得多,那么频繁变化最快和最频繁的重排结构域或亚基,或在某些情况下,通过翻译后修饰或蛋白质-蛋白质相互作用5,6。观察活动由一个分子产生长时间可以帮助了解功能离子通道的完好生理膜际动力学,并提供关于所观察到的分子的运行机制的有价值的信息。

与此相反的离子通道穿过细胞类型和发育阶段,知识的离子通道在原生膜的分子组成的多样性,人们越来越认识仍然有限。所有离子通道是多聚体蛋白,大部分天然离子通道的从几种类型的亚基产生的宽分子多样性,这是经常伴随着不同的电导和门控性质的蛋白质的组装。出于这个原因,定义分子组成的离子通道表达时在异源系统的研究。特别地,HEK293细胞,这是永生化人胚胎肾细胞7的品系,获得广泛接受,作为重组的离子通道的异源表达的优选系统。其中男子该升高的HEK293细胞的选择系统用于离子通道电Ÿ优点是易于进行培养的承受能力和保持长期稳定的培养,其进行翻译后折叠,加工和贩卖的哺乳动物蛋白质的能力,并且在许多情况下,其低的水平,甚至不存在内源性表达的感兴趣7,8的通道。表达重组的离子通道,并研究在HEK293细胞中其功能特性仍然是一个有价值的方法,以获得关于离子通道的结构 - 功能特性以及离子通道亚型和它们在天然组织角色的特定属性的信息。本文中所描述的协议同样可以很好地应用于表达在HEK293细胞重组离子通道和原生的离子通道。

综上所述,膜片钳技术,通过其前所未有的能力来解决信号从1分子遗体,迄今为止,最直接的方法,观察单个分子的行为。在其细胞贴附模式下,膜片钳记录允许长期观察期间,当一个分子中完成的,可以提供出色的洞察离子通道的操作。下面给出一个协议,用于获得高分辨率当前记录从含有一种离子通道蛋白的细胞贴附式膜片。

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Protocol

1,细胞培养和蛋白表达

  1. 保持HEK293细胞通道22和40之间(ATCC编号CRL-1573),它包括由ATCC执行的,在DMEM中单层培养在补充有10%胎牛血清(FBS)的通路,并在5%CO 2的1%青霉素/链霉素的混合物和37°C。实验之间,传代细胞进T25烧瓶在10毫升的最终体积5-20倍稀释液。注意:在这些通道使用的细胞可以保证良好的健康细胞,这将使以获得最佳的密封形成和补丁的稳定性。
  2. 对于转染,板的HEK293细胞于35 mm培养皿中以约10 5细胞/皿的密度,它对应于〜0.5-0.6毫升每皿的细胞悬浮液,并于2ml培养基中生长的细胞18-24小时。
  3. 在无菌1.5毫升离心管中,加入(按顺序)四个35mm培养皿准备转染混合物:(1)1微克每一个基因(GluN1,GluN2A,和GFP)的; (2)315微升双蒸水(双蒸2 O); (3)350微升42毫4 - (2 -羟乙基)-1 -哌嗪乙磺酸(HEPES),和(4)35微升的2.5M的CaCl 2滴,这是用于形成沉淀物。
  4. 涡流管,持续5秒,并在每四个35mm培养皿中添加175微升转染悬浮液的镀覆的前一天,现在包含的细胞在50-60%汇合,并于室温孵育在37℃下搅拌2小时。
  5. 抽吸掉转染培养基,洗净,用PBS并用2ml生长培养基补充了2mM MgCl 2的更换,以防止NMDA受体介导的兴奋性中毒9。注意:该细胞可用于电生理记录24-48小时后的转染。

2,电极的制备

  1. 通过与垂直车夫拉着硼硅玻璃管产生2对称录音移液器。根据所得到的电极头的尺寸和几何形状,还形状移液器用抛光机。注:针尖大小可以直观和电气进行评估。从外观上看,外直径应在1.4-5.6微米范围内。电,最佳大小尖端,当充满细胞外溶液时,应在12-24MΩ范围产生的电阻( 见图2B)。
  2. 用移液管的解决方案,这对于细胞附着实验代表了细胞外环境,将产生最大通道活性和高电流幅值。注意:对于NMDA受体,这对应于包含激动剂(谷氨酸和甘氨酸),1mM EDTA中,其中螯合二价阳离子抑制剂和阻断剂的饱和浓度的溶液中,并具有钠的生理浓度(150毫米)作为唯一的透膜物离子(以mM:1谷氨酸,0.1甘氨酸,150氯化钠,氯化钾2.5,1 EDTA和10 HEPBS,缓冲在pH 8.0用1N NaOH)。

3,细胞贴附膜片钳记录

  1. 打开QUB数据采集softwa重(www.qub.buffalo.edu),并选择在'布局'的采集窗口。通过点击下的下拉菜单名为“文件”“新数据”,打开一个新的QUB数据文件(QDF),并输入以下初始参数:采样率,40千赫; A / D转换比例,3000元;输出信道,1;和A / D数据大小,2。通过右键单击数据文件,选择属性,并单击“数据”选项卡中调整幅度缩放到0.1 V / PA。注:这些参数可以细化为使用中的细胞贴附模式的典范,每个单元格设置。数据采集​​与QUB软件和QDF属性的其他指令都在网上www.qub.buffalo.edu。
  2. 选择含有表达细胞的离子通道在35毫米培养皿,并用2毫升的PBS含有钙和镁取代生长培养基;安装盘安装于显微镜舞台,用相差显微镜来评估细胞是健康的,以及附着在培养皿集中在蜂窝领域上在单层时尚( 图1A)。切换到荧光检测来验证转染成功( 图1B)。注意:荧光强度的范围可被用来作为粗测量蛋白表达的影响。
  3. 对于单声道录音,设置放大器的输出增益为x10,补丁配置,β= 1,模拟滤波器为10 kHz,模式,电压钳和施加电压+100 mV的。在OFF位置的电压保持命令,选择“密封试验”按钮。
  4. 基于荧光和细胞的健康,请选择一个单元格修补。根据相衬确认电池是否装的菜,有细胞表面暴露的修补,很大一部分否则看起来很健康。注意:保持相衬照明,以避免做法和膜片钳漂白过程中的单元格。
  5. 填写新鲜抛光的吸管只有足够的解决方案,因此它与electrod接触e和轻轻摇晃,以清除可能被困在尖气泡。通过拧紧吸液管保持密封螺钉,并确保该银线浸渍在吸移管溶液固定记录吸管到放大器探头。
  6. 使用小的(5毫升)塑料注射器,其通过管道连接到所述吸液管保持器,轻轻地施加正压力,以防止杂质进入和方法时堵塞的前端( 图2A)。
  7. 用显微操作器,直接吸入熔池,并直接在选定的修补( 图1C)的细胞定位,闭合电路。采取了示波器的说明,其中应说明对应于放大器的密封测试信号( 图2B)的矩形波。注意:一旦进入浴,在最佳范围内的移液管阻力为12-24MΩ。对于一个5毫伏的测试信号,测得的电流R昂热对应〜20-40 pA的。
  8. 而在示波器上监测吸移管的位置在视觉上通过显微镜和移液管电阻电,则继续该方法以较小的增量,直到吸液管轻轻地撞击在细胞上,并在测试信号略有下降,表明增加的抗性( 图2B)。
  9. 以形成密封,拿起注射器,通过横向管道拉动针筒柱塞,其中拉细胞膜到记录滴管的尖端,并启动一个GΩ电阻密封件10的形成施加轻微的负压。就拿示波器上的测试信号波形,其中密封的形成是由它的完全压扁表示,只有电容瞬态可见( 图2B)的注意。注意:如果信号不完全压平或基线变得嘈杂,这表明弱密封与周围的密封圈大量电流泄漏。这将防止Řesolving一个通道电流。如果是这样的话,从细胞抽出吸管和远离浴,从头部阶段将其取出并丢弃它。重复上述过程,用新鲜抛光的吸管,直到获得一个密封在适当的范围内(≥1GΩ)。
  10. 在放大器,开关由“封测'为'off'的外部命令切换;切换电压保持命令阳性(这是以前设置为“关”);并增加增益以X100。观察示波器通道活性,其中,如果存在的话,将显示为从以前平坦的基线( 图2C)的平方向上偏转。
  11. 如果显示在示波器通道活性,获取到的数据在QUB先前打开的数字文件,按“播放”按钮,然后按“记录”按钮。要停止采集数据,按在QUB停止按钮,QDF文件保存到一个容易retriev通过在下拉菜单中题为“文件”中选择“将数据保存为...”计算机硬盘驱动器上能位置。

4,数据预处理和理想化

注:重要信息可以从单通道记录进行统计分析,每个数据点分配到合适的电导类(在简单的情况下,关闭或打开)中提取。这个过程被称为数据理想化和数据理想化与节段性k均值(SKM)在QUB方法11在下面描述的简要描述。

  1. 打开QUB数据文件,并查看当前的痕迹在“预”界面下的“布局”。显示录制的文件未过滤(除去数字滤波器)通过取消标记框'的Fc。“
  2. 视觉扫描记录发现违规行为和文物( 图4A)。正确的短暂电流尖峰occur中的微量内( 图4A)通过选择同一电导类的相邻洁净区,突出该区域中,右键单击并选择“设置擦除缓冲区。”放大秒杀到各个采样点是可见的,选择要替换的区域,并通过突出显示只有这个区域,然后用鼠标右键单击“擦除”擦除。
  3. 通过选择记录,其中基线是稳定的早期部分定义了零电流基准为整个记录,高亮显示,单击鼠标右键并选择“设置基准”。验证从而准确地出现在指引代表基线水平(紫图4B)
  4. 在原始数据的基线明显偏离从设置基线记录识别点。在偏离区域内选择基线的一小部分纠正此问题,请右键单击并选择“添加一个基准节点的命令。
  5. 识别吨地区他录制含有过量的噪音或文物,不能轻易纠正( 图4C)。突出显示要被丢弃的区域,单击鼠标右键,并选择“删除”。注意:在这种情况下的动力学信息将会丢失:将处理结果将缩短并在拼接点之后产生的点将显示为连续的,预噪声区域。
  6. 要使用SKM算法11理想化的记录,彰显含微量的开放和封闭事件的部分,然后输入下的“国防部”接口“布局”。在“模式”面板,彰显一丝干净的部分是代表基线的整个文件中,用鼠标右键单击黑色正方形(闭合状态),然后选择“抢”。通过突出开放电导做同样的通道开口上,右键单击“模型”面板中的红色方块,然后选择“抢”。
  7. 执行idealization的由下选择“文件”按钮,整个记录“数据源”。在“理想化”的“建模”部分下面选项卡上单击鼠标右键,以验证分析所需的参数是否正确,然后单击“运行”。理想化的结果,随着振幅直方图整个文件,重叠的数据,以允许对理想化的目视检查( 图5)。注:理想化不足可能导致的“假事件”的一代,其中QUB检测通道开口和不实际发生倒闭。内记录的分辨率,它是由放大器的模拟滤波器和采样率设置,与该SKM检测打开和关闭事件的分辨率可以通过设置死区时间的分析来控制。最佳死区时间必须通过试验和错误被选中,将取决于采样率,但是,一个好的经验法则是选择一个死区时间是2-3个样品12。
  8. 要验证理想化准确表示原始数据,手动扫描理想化的痕迹。经鉴定理想化的错误,突出跟踪过假事件,点击右键,选择“加入用idl。”注:如需其他选项和QUB各种命令和函数的详细说明,请参考QUB手动在线(www.qub.buffalo.edu)。

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Representative Results

重组NMDA受体

NMDA受体结合并以两个共激动剂随之而来的行动作出回应:谷氨酸和甘氨酸。他们组装成两个甘氨酸异源结合GluN1亚基和两个谷氨酸结合GluN2亚基。 GluN2亚基是由这四个基因(AD)和编码在大脑的最广泛形式的转录是GluN2A在成年和GluN2B在幼龄动物。由于NMDA受体亚型在原生的准备,表达受体在HEK293细胞( 图1A)允许控制的亚基组成的,以及记录从目前的渠道使用精细抛光的玻璃吸管( 图1C)的能力的多样性。

一旦吸管接触细胞,明显减少在测试中的脉冲波形的振幅发生( 图2B),这表明以形成密封的能力。含一个足够的密封通道产生清晰通道活性,显示为从基线向下变形,具有良好的信号为正电压( 图2C)的噪声提出申请的比例。可以实现对野生型重组NMDA受体通道的最大活动时,两个受体激动剂是目前在高浓度的,当抑制剂和通道阻滞剂缺席。这是理想的,因此,当贴剂含有一个以上的通道,同时开口是显而易见13( 图3B)。对于非常低的活性水平的蛋白质,如果信道开放概率是已知的或可以近似14,一个伸展的一个水平开口只从一个信道始发的概率可以计算出来。正因为如此,较长的观察期可能是必要的。

在这些条件下,并施加100毫伏的移液管保持电位(导致-120毫伏的近似膜电位)时,SIngle重组GluN1/GluN2A和GluN1/GluN2B是开放的概率高(P O,0.3〜0.5),一个相对高电导水平(> 50 PS)( 图3A5B)15-17。录制时,电流噪声尖峰,基线漂移,或噪音过大的时期可能表现( 图4A-C),但如前所述,这些可如果短暂而轻微的修正。是很重要的,但是,信道活动记录不间断的足够量的时间(≥10分钟,10,000个事件),以保证信道行为的整个宽度被捕获。

从这种记录所得到的数据可以提供在两个信道的动力学和渗透性能的信息。在这里,我们展示了使用SKM算法( 图5A)由QUB进行,但理想化的数据可以使用其它软件程序,如pClamp执行或扫描12,一个理想化ND可以进行使用不同的算法或标准,如半阈值法,与每个选项包含自己的优点和缺点。拟合这些数据到动力学模型的可能,以获得进一步洞察离子通道的行为来执行。最大似然拟合,可以用软件如QUB或HJCFIT 18来进行,其中每个程序实现的算法都有自己的利益。而在图5中显示了理想化只需要1关闭状态下被执行的,拟合为离子通道的完整的动力学模型尽可能简单的模型和一个打开状态,需要依次加入闭合和打开状态,直到在一定的准则为止。这个过程表明,野生型GluN1/GluN2A受体有五种不同的动力学关闭状态二至四动力学截然不同的开放状态( 5C)19,在这些门特性是用于确定所述NMDA受体介导的突触信号20,21的形状是至关重要的。分析这种风格可以延伸到更小的电导等离子通道,如AMPA受体,能够深入了解,以自己独特的门控机制22,23,24。一个需要注意的是,然而,由于AMPA受体有多种传导水平,使用QUB成功的理想化,可能需要更多的国家被纳入一个预先构建的模型。

这些方法也可以扩展通过改变渗透离子的组合物和/或浓度,以获得关于离子通道的渗透和电导的信息。通过使用这里描述的方法单一GluN1/GluN2A受体录制活动,但更换150 mM氯化钠与75毫米氯化钙2中的记录电极,产生的电流与〜电导的20%(约10 PS)。这表明,尽管钙渗透NMDA受体在喜GH水平在生理条件下,它实际上是穿过通道比钠离子更慢,这表明可能存在一个潜在的钙结合位点的渗透通道内。另外,尽管这个小电导的录音可以充分利用QUB的SKM算法,拉开中间分段电导,这是约50%的主电导水平的电流振幅( 图6AB)的存在理想化。这些分段的开口,但是,只能在QUB理想化当一个附加电导类并入初始动力学模型。进一步的动力学分析表明,在这些条件下,受体仍表现出5动力学上独特的封闭状态,然而这些状态具有非常不同的时间常数和占有率相比,信道只通过钠离子( 图6C)时。此外,只有两个开放状态观察üNDER这些条件表明,除了影响沟道电导,钙离子能够调节受体门控。

没有一定的方式来获取只有一个通道的补丁。相反,一些实验操作可以有助于提高成功的可能性。首先,通过评估转染的细胞( 图1B)的荧光强度的目标通道的表达水平低。成功的方法可能是:减少用于转染或降低的cDNA的量为所需要的子单元,正如GluN1 cDNA的总金额;以降低孵化用DNA /磷酸钙沉淀物的时间;和选择用于从视场修补只能模糊的荧光细胞。这些方法应该追求,如果获得的补丁通常包含多个通道。此外,减少吸头的大小也有助于捕获只有一个通道在PATC小时。最终然而,变成成功获得一个信道的补丁通过从记录长时间从补丁,清楚地包含多个信道系统克制。

重组PIEZO1通道

在这个协议中描述的方法可以容易地应用到任何配体门控离子通道,实际上可以适用于从任何的离子通道记录一个通道的活性,无论是通过化学,电压,力,温度,或其它手段激活。如何使用此协议可以被用于记录从其他离子通道中的一个通道电流的一个例子,具体而言鼠标PIEZO1,一个机械敏感性离子通道,被介绍如下( 7)25,26。

作为与NMDA受体通道,PIEZO1和GFP是由磷酸钙介导的转染表达在HEK293细胞和细胞用于24-48小时转染后作为在1.2节中描述。因为PIEZO1是由膜拉伸激活,应注意打补丁过程中形成和交付施加的机械力和控制相应的设备轻轻操纵膜应该可用。这些条件可通过使较大的记录移液管,与电阻在2-3MΩ范围,并使用通过对放大器探头的移液管固定器连接到记录吸管高速压力夹紧装置(HSPC)来实现。放大器的设置是相似的3.3节中描述的NMDA受体,除了对“外部”命令旋钮开关,使得放大器可以通过采集软件来控制。

从PIEZO1记录活动中,使用一记录吸管充满(以mM计):130氯化钠,氯化钾5,10 HEPES,1的CaCl 2,1 MgCl 2的,10 TEA-氯,pH值7.3,用NaOH。在这些条件下,开口可以被监控,因为我nward钠电流,这将出现在示波器上从零电流基准向下偏转。将记录电极放大器上的头阶段,并确保对HSPC表盘是零。在进入浴池,适用3-5毫米汞柱的正压力。利用显微操作,降低移液管进入浴缸,检查所需的移液管阻力,使靠近吸管选定单元格为3.6节所述。轻轻触摸细胞显微镜指导下,通过监测示波器,观察略有减少密封试验波形的振幅以类似的方式作为做了NMDA受体(3.7节)。快速释放,通过移液管以从3-5到0毫米汞柱改变压力保持水平施加的正压力。等待GΩ的密封,形成通过监测密封试验波形。在这种情况下,没有施加负压,以形成一个密封。一旦一个最佳的密封得到按‘在QUB记录“按钮,开始采集数据图7显示了通过应用-20毫米汞柱的压力补丁吸管活化mPIEZO1单通道电流的代表痕迹。这些电流分别经过低通滤波以2千赫和采样在20千赫。

相反,与细胞外配体结合域的配体门控通道,将刺激激活机械敏感性离子通道可以下2协议来改变。第一种是“无间隙”,其中一个恒定的负压被施加到补丁对整个记录时间。这个协议是在获得分钟长的记录有用的,并且是用较小的压力刺激(0至20毫米汞柱),其中保留的膜完整性最成功的。通过高压,这很可能破裂的膜产生的活性,最好是用“偶发性”录音,其中不同的压力的脉冲可以被施加到补丁的时间较短(<得到STRONG>图7)。与配体门控通道,从录音细胞附着一个通道的补丁提供了丰富的关于两者的电导和被调查的通道的门控属性的信息。

神经元NMDA受体

这里描述的细胞贴附单声道记录的方法可以用来获得关于电导和通道的内源性门控性,适用于特定的细胞类型和/或发育阶段的信息。如许多其他异信道的情况下,本机NMDA受体的确切的分子组成是未知​​的。通过比较从已知组合物的重组体受体与那些从天然制剂得到的得到的结果,假说有关的亚基组成,并在其天然环境中通道的功能可以被配制或测试17。

神经元是从前额分离大鼠胚胎皮质和生长在培养长达6周17。除了重组NMDA受体录音在2.2节中描述的组件,电极内液中还含有CNQX(20微米)和荷包牡丹碱(10微米),以抑制本地AMPA和GABA受体,分别。根据不同的文化的时代,从本地NMDA受体所得到的记录显示,有相当不同的动力学。从早期的( 图8A,5体外 )录音的文化更接近于描述GluN1/GluN2B受体和录音晚期( 图8B 27 天体外 )的文化更接近的GluN1/GluN2A受体描述的动力学( 图3A动力学和5A)。这个观察结果与NMDA受体亚型的表达方式和仔细刻画从臀部细胞连接一个通道补丁记录电流一致pocampal文化16。

图1
图1。选择HEK293细胞进行细胞附着记录A)的HEK293细胞在35毫米培养皿中培养被放置在显微镜载物台上,并与相位在40X放大率B)GFP荧光从相同的视场在面板的对比观察确定转染的细胞。箭头表明表达GFP的细胞,出现健康的,而且是在一个位置适合用于吸管连接。C)的记录电极采用视觉引导下微动操纵带来了接近附近选定的单元格。 请点击这里查看更大的版本这个数字。


图2。细胞连接形成密封。 A)小注射器连接到所述吸液管保持器的侧面可以手动控制,通过浸渍在镀液中响应于所述放大器的测试,它在5 mV(0.5千赫)的移液管的移液B)的电流流通内压力18 pA的,并且对应于28兆欧的移液管的尺寸。在触摸的细胞(左箭头),所观察到的电流减小,表明增加的移液管阻力的水平。通过移液管(右箭头)施加负压启动封接形成,并降低由测试脉冲到只有电容瞬变产生的信号。℃)不存在测试脉冲,并且如果没有电压通过移液管(0 V)时,施加基准是稳定的(箭头所示的左侧)。施加正电压(箭头,100毫伏)公关 oduces随机单一的电流,指示通道开口。红色虚线表示的零电流基准。

图3
图3从GluN1/GluN2A受体细胞记录的附加 ​​电流A)单声道补丁连续记录的50秒片段显示通道开口到一个统一的幅度b)多通道补丁:连续记录的50秒片段示出了通道开口2的振幅电平指示所述贴片包含至少2个活性通道。红色虚线表示零电流基准。 请点击此处查看该图的放大版本。

“> 图4
图4。数据处理A)校正噪声尖峰。与基准信号的显示数据未经过滤,手动替换外来信号(红色)。扩展视图显示了秒杀前(中)和后(下)秒杀(红色)被替换为基线信号B)校正基线漂移。早在记录中,选择一小部分基线,并将其设置为零电流水平为整个记录(紫线)。通过选择一小部分正确的基线漂移基线漂移(箭头),并增加了基线节点(紫圈)的纪录。C)更长的时间与基线噪音(红色)是很难纠正可以被删除。 请点击这里查看一个更大的版本这个数字。

图5
图5。数据理想化。A)电流迹线(黑色),记录从一个GluN1/GluN2A受体与细胞贴附膜片钳技术仅通过钠离子。理想化的数据点的(红)示出了30秒1信道区段。这些重叠良好,表明理想化是准确的。 乙)的电流幅值的直方图说明,既受只有两个零(高斯函数的峰0.02±0.8 PA),表示封闭的通道事件,并在10.3±1.3中所述的分配pA的指示只有一种类型的明渠事件的整个记录时间(130分钟)。 的C)闭(左)和开放(右)驻留时间直方图中(A)所示的整个记录。的概率概率密度函数的直方图(粗线)和个人的动能分量(细线)重叠,并计算通过将数据拟合到含有5闭状态与三个开放状态的模型。插图提供的时间常数(τ),并为每个单独的动力组件的相对区域(a)。

图6
通过单一的NMDA受体。A)电流的痕迹(黑色) 图6。钙电流从一个GluN1/GluN2A受体与细胞贴附膜片钳技术仅通过钙离子的记录。电流幅值的理想化的数据点(红色)示30秒段B)直方图表明,广受三个高斯函数峰在零说明(0±0.3 pA的),表示密切的分布D信道事件,1.3±0.4 pA的指示明渠事件的一个分段电导和2.1±0.3,表明明渠事件的主电导水平。 三)闭(左),主要电导水平打开状态(中间)和分段电导打开状态(右)驻留时间直方图中(A)所示的整个记录​​。概率密度函数的直方图(粗线)和个人动力学组件(细线)重叠,并计算由数据拟合包含五个关闭状态,两个主要的电导层次的开放状态和一个分段电导打开状态的模型。插图提供的时间常数(τ),并为每个单独的动力组件的相对区域(a)。

图7
图7。细胞附着一个通道记录从mPIEZO1表达在HEK293细胞。活动是通过施加-20毫米汞柱的压力与HSPC设备通过补丁吸管,在电压恒定的应用(80毫伏)引起。红色虚线表示的零电流的水平。

图8
图8。细胞从原生通道连接一个通道录音。的移液管连接在被从大鼠胚胎的前额叶皮层分离,并保持在培养5天(A)或27日( 二)神经元的胞 ​​体。连续NMDA受体活性被记录了用含有谷氨酸(1毫摩尔)和甘氨酸(0.1毫米),并且还CNQX(20μM)和荷包牡丹碱(10μM)抑制天然AMPA和GABA受体,分别移液管的解决方案。活动引起了通过施加100毫伏吨hrough的记录电极。红色虚线表示的零电流的水平。

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Discussion

在离子通道字段,一个重要的研究领域致力于了解的事件,导致信道的开口或通道的门控机制的序列。对于大多数信道,该过程是复杂的,涉及不能从宏观的多声道信号推导出几个反应步骤。相比之下,实验可设计其中观察在单通道记录打开/闭合事件的顺序可以产生约门控机制的更详细的信息。在这里所描述的方法,由NMDA受体所具有的位于外部的配体结合域允许将在恒定条件下执行微创的膜片钳记录。这个协议可能需要被修改以适合于调查其他的配体门控离子通道取决于这两个配位体和受体的性质。

单通道活动的记录提供了两种类型的有价值的信息。首先,由于整体式电流振幅,可直接测量,实验可设计成获得关于孔隙性质如沟道电导,渗透性和选择性的信息。第二,由于打开和关闭事件的持续时间,也可以直接从记录测量,实验可设计成获得关于门控动力学信息,因此,使左右通道的操作机构的推论。对于这两种类型的实验,有意义的统计分析需要分级每一个人​​的一点从目前跟踪到一个特定的电导类。这里介绍的是这样的一个这样的方法,通过使用段的k-means(SKM)11算法,但是,这可以由几个或多或少复杂的算法,包括半阈值,扫描12完成,鲍姆-韦尔奇,维特比,等等

采用细胞贴附配置录音是强大的离子通道被保留在生物膜与细胞内泰然自若milieus。因为这一点,这是至关重要的密封膜得到充分形成,并且在整个记录保存有两个目的:1)实验连续性和2)保持良好的信号 - 噪声比(峰值到峰值基线噪声<2 PA)。所产生的移液管尖端的尺寸和形状决定的含有正好一个信道成功的膜密封的概率。阿平的端部可以确保当吸管接近细胞就会碰触并压在细胞膜上与整个前端面一次,这有助于均匀地密封到细胞。有一个技巧,就是太宽移液器将不太可能导致单通道补丁;与此相反,当拉出吸管与一个提示,太窄会导致Ω形膜循环,它可以密封在底座和堵塞移液管10。

有利的信噪比可通过最大限度地减少电源管理噪声。 Axopatch 200B上的探头冷却功能允许以获得最佳信号的分辨率;然而噪声仍然可以由任何参与电生理仪器的设置,以及外部源,如光或无关的电子来制造。幸运的是,几个策略可以实施,以尽量减少噪音对所需的2,27。简要地说,确保件设备,其能够产生的噪声被设置于接地到一个单点。当这样做时,它防止形成接地回路,这将导致显著噪声是很重要的。此外,如果60周期噪声存在时,一定要关闭可能与录制信号干扰任何灯光。最后,放置一个法拉第笼的记录装置周围会阻止附近的障碍造成的电气噪声。

观察一个通道的很长一段时间已经证明,选通构象变化可以发生在很宽的范围内的时间尺度。在时间上,膜片钳数据在“短”端通过放大器的带宽,并在其中被放大的信号数字化,并在通过所述观察窗的“长”端的速率限制。对于比低限速度更快的构象变化,膜片钳记录只能提供信息,再加上互补实验方法的时候。对于非常慢速率发生,从而构象变化不频繁采样,可以增加观察次数或增加记录的持续时间,但是,这并不总是可能的。

尽管有这些限制,从个别信道获得特别是当膜片钳数据,往往含有比立即与当前计算的方法可提取的信息。因此,期望的是,在计算能力和SOPH未来增长分析算法istication将有可能额外的应用程序。待该等垫款的出现,可以预见的是从单一的渠道膜片钳记录可能可以与FRET测量,钙成像,甚至在体内的准备同时进行,以提供对结构,功能和离子通道动力学的进一步信息本机和控制的环境。

作为离子通道的多样性研究的增加,其门控机制的详细了解,并最终理解如何运作有助于其独特的生物学功能将受益于单分子观测。特别是,与1通道膜片钳承诺来通知酉电导特性和门控序列用于重组和天然渠道获得的数据。

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Disclosures

这个手稿的作者宣称,他们有没有竞争的财务权益。

Acknowledgments

这项工作是由F31NS086765(KAC)的支持,F31NS076235(MAP)和R01 NS052669(GKP)和EIA9100012。作者感谢艾琳Kasperek的专业知识,并与分子生物学和组织培养的援助;和杰森迈尔斯分享从早期的前额叶皮层神经元获得的数据。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals Sigma Various
Borosillicate Glass Sutter BF-150-86-10
Bright field inverted microscope Olympus 1x51 Nikon also has similar microscopes
Fluroescent box X-cite Series 120
Liquid Light Guide X-cite OEX-LG15
Micromanipulator Sutter Instruments MP-225
Oscilloscope Tektronix TDS1001
Amplifier Molecular Devices Axon Axopatch 200B
Table TMC 63561
NIDAQ card National Instruments 776844-01
Puller Narishige PC-10
Polisher Narishige Microforge MF-830
Faraday Cage TMC 8133306
High Speed Pressure Clamp ALA Scientific Instruments ALA HSPC
Pressue/Vaccuum Pump ALA Scientific Instruments ALA PV-PUMP For HSPC-1

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References

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神经科学,第88期,生物物理学,离子通道,单声道录音,NMDA受体,门控,电生理,膜片钳,动力学分析
单通道细胞贴附膜片钳记录
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Maki, B. A., Cummings, K. A.,More

Maki, B. A., Cummings, K. A., Paganelli, M. A., Murthy, S. E., Popescu, G. K. One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording. J. Vis. Exp. (88), e51629, doi:10.3791/51629 (2014).

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