单通道细胞贴附膜片钳记录
Summary
这里描述的是获得当前记录的很长一段距离与细胞贴附膜片钳技术一种离子通道的过程。这种方法允许观察，实时的背后的生物信号开闭通道构象的图案。这些数据的通知关于在不受干扰的生物膜通道属性。
Abstract
离子通道蛋白是通过生物膜快速通信的通用设备。离子通量它们产生的瞬时签名取决于固有的每个通道蛋白，以及由其所产生和控制的机制的属性和表示当前研究的重要领域。关于离子通道蛋白的经营动态信息，可通过观察当前很长一段由单个分子制造来获得。这里描述的是一种协议，用于获取一条通道细胞贴附膜片钳记录电流为配体门控离子通道，NMDA受体，异源表达在HEK293细胞中或在本地皮层神经元。本发明还提供关于如何通过呈现在机械性敏感通道PIEZO1的例子中，方法适应其他感兴趣的离子通道的指示。这种方法可以对于该通道的电导特性和氧化聚乙烯的时间序列数据提供正封闭构象组成通道的激活机制，从而有助于了解他们在健康和疾病的功能。
Introduction
过生物膜的快速通信几乎完全依赖于低聚孔形成的膜蛋白，通常被称为信道。这些蛋白质在活化信号，门控机制，传导性能有很大的出入。通道蛋白的毛孔是有选择性的离子被列为离子通道;它们的活化产生的离子电流穿过细胞膜，并且它们的响应可以使用电生理技术来记录具有高分辨率的实时性。激活信号跨越的化学和物理输入，包括浓度梯度，机械和电气的力量和温度浩如烟海;因此，进一步的分类离子通道进入配体门控，机械敏感性，电压门控，或热敏感的类型。在这篇文章中，协议被描述为从一个配体门控通道，NMDA受体和机械敏感性离子通道，PIEZO1记录单声道活动，用膜片钳技术。0;
膜片钳电是最早，最广泛使用的实验方法足够灵敏，以允许观察单个分子1，2。除了这个精致的灵敏度，它已大大扩展了生物制剂适合于电生理记录，并允许离子通道在细胞膜完整的观察。首先，因为这两个电压钳位与当前记录被完成与同一电极，它可以用来通过小的细胞或膜的补丁记录的信号。该技术表明，离子通道并不局限于蛙肌肉，鳗鱼electroplaques或乌贼巨轴突3，4，而是它们所代表的跨膜信号传导机制无处不装置及有固有的单向或所有细胞膜类型的可兴奋膜多细胞有机体，并且还细胞内膜。进口antly，通过简单的连接玻璃吸管，以完整的细胞，记录跨膜电流的能力提供了前所未有的机会，从离子通道在家乡不间断的膜录制活动。因此，细胞贴附式膜片钳技术，这是在本协议中所述，允许连续监测离子通道的活性数十分钟或在他们的母语环境的时间。
在正常温度波动，所有的蛋白质，包括离子通道蛋白，经过了广泛的时间尺度上的结构变化，与代表最有可能通过侧链运动和整个的定位表示要慢得多，那么频繁变化最快和最频繁的重排结构域或亚基，或在某些情况下，通过翻译后修饰或蛋白质-蛋白质相互作用5,6。观察活动由一个分子产生长时间可以帮助了解功能离子通道的完好生理膜际动力学，并提供关于所观察到的分子的运行机制的有价值的信息。
与此相反的离子通道穿过细胞类型和发育阶段，知识的离子通道在原生膜的分子组成的多样性，人们越来越认识仍然有限。所有离子通道是多聚体蛋白，大部分天然离子通道的从几种类型的亚基产生的宽分子多样性，这是经常伴随着不同的电导和门控性质的蛋白质的组装。出于这个原因，定义分子组成的离子通道表达时在异源系统的研究。特别地，HEK293细胞，这是永生化人胚胎肾细胞7的品系，获得广泛接受，作为重组的离子通道的异源表达的优选系统。其中男子该升高的HEK293细胞的选择系统用于离子通道电Ÿ优点是易于进行培养的承受能力和保持长期稳定的培养，其进行翻译后折叠，加工和贩卖的哺乳动物蛋白质的能力，并且在许多情况下，其低的水平，甚至不存在内源性表达的感兴趣7,8的通道。表达重组的离子通道，并研究在HEK293细胞中其功能特性仍然是一个有价值的方法，以获得关于离子通道的结构 – 功能特性以及离子通道亚型和它们在天然组织角色的特定属性的信息。本文中所描述的协议同样可以很好地应用于表达在HEK293细胞重组离子通道和原生的离子通道。
综上所述，膜片钳技术，通过其前所未有的能力来解决信号从1分子遗体，迄今为止，最直接的方法，观察单个分子的行为。在其细胞贴附模式下，膜片钳记录允许长期观察期间，当一个分子中完成的，可以提供出色的洞察离子通道的操作。下面给出一个协议，用于获得高分辨率当前记录从含有一种离子通道蛋白的细胞贴附式膜片。
Protocol
Representative Results
Discussion
在离子通道字段，一个重要的研究领域致力于了解的事件，导致信道的开口或通道的门控机制的序列。对于大多数信道，该过程是复杂的，涉及不能从宏观的多声道信号推导出几个反应步骤。相比之下，实验可设计其中观察在单通道记录打开/闭合事件的顺序可以产生约门控机制的更详细的信息。在这里所描述的方法，由NMDA受体所具有的位于外部的配体结合域允许将在恒定条件下执行微创的膜片?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由F31NS086765（KAC）的支持，F31NS076235（MAP）和R01 NS052669（GKP）和EIA9100012。作者感谢艾琳Kasperek的专业知识，并与分子生物学和组织培养的援助;和杰森迈尔斯分享从早期的前额叶皮层神经元获得的数据。
Materials
| Chemicals | Sigma | Various | |
| Borosillicate Glass | Sutter | BF-150-86-10 | |
| Bright field inverted microscope | Olympus | 1×51 | Nikon also has similar microscopes |
| Fluroescent box | X-cite | Series 120 | |
| Liquid Light Guide | X-cite | OEX-LG15 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MP-225 | |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS1001 | |
| Amplifier | Molecular Devices | Axon Axopatch 200B | |
| Table | TMC | 63561 | |
| NIDAQ card | National Instruments | 776844-01 | |
| Puller | Narishige | PC-10 | |
| Polisher | Narishige | Microforge MF-830 | |
| Faraday Cage | TMC | 8133306 | |
| High Speed Pressure Clamp | ALA Scientific Instruments | ALA HSPC | |
| Pressue/Vaccuum Pump | ALA Scientific Instruments | ALA PV-PUMP | For HSPC-1 |
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