一チャネルセル付パッチクランプ法
Summary
ここで説明するには、セルに接続されたパッチクランプ技術を用いて1イオンチャネルから現在の記録の長いストレッチを取得するための手順です。この方法は、リアルタイムで、観察するための生体信号の基礎となる開閉チャネルコンフォメーションのパターンを可能にする。これらのデータは、邪魔されずに生体膜におけるチャネルのプロパティをお知らせ。
Abstract
イオンチャネルタンパク質は、生体膜を通過高速通信用の汎用デバイスである。それらが生成するイオン流束の時間的なシグネチャは、各チャネルタンパク質ならびにその生成および制御される機構の固有の性質に依存しており、現在の研究の重要な領域を表す。イオンチャネルタンパク質の操作動力学に関する情報は、単一の分子によって生成される電流の長いストレッチを観察することによって得ることができる。リガンド依存性イオンチャネル、NMDA受容体に対する1チャネルセル付きパッチクランプ電流記録を取得するためのプロトコルがここに記載され、皮質ニューロンでHEK293細胞においてネイティブまたは異種発現。また、機械刺激感受性チャネルPIEZO1の例を提示することによって、関心のある他のイオンチャネルにメソッドを適応させる方法についても提供される。この方法は、チャネルのコンダクタンス特性とOPEの時系列に関するデータを提供することができますこのように健康と病気にそれらの機能を理解するために貢献し、チャネルの活性化機構を構成しているN-クローズコンフォメーション。
Introduction
生体膜を横切る高速通信は、一般にチャネルと呼ば膜タンパク質を形成するオリゴマーの細孔にほぼ排他的に依存している。これらのタンパク質は、活性化信号、ゲーティングメカニズム、コンダクタンス特性において大きく異なっている。細孔がイオンに対して選択的であるチャネルタンパク質をイオンチャネルとして分類される;それらの活性化は、膜を横切るイオン電流を生成し、その応答は、電気生理学的技術を使用して、即座に高解像度で記録することができる。活性化信号は、濃度勾配、機械的および電気的な力、および温度などの化学的および物理的入力の幅広いまたがる。従って、さらなるゲートさリガンドへのイオンチャネルを分類する機械受容電圧は、ゲート、または敏感型を加熱する。この記事では、プロトコルは、パッチクランプ技術を用いて、リガンド依存性チャネル、NMDA受容体、および機械受容チャネル、PIEZO1から1チャンネル活性を記録するために記載されている。0;
パッチクランプ電気生理学は、単一分子1,2の観察を可能にするのに十分な感度最初の最も広く使用された実験方法である。この優れた感度に加えて、それは非常に電気生理学的記録に従う生物学的製剤を拡大しており、また、無傷の膜におけるイオンチャネルの観察を可能にした。電圧クランプと電流の記録の両方が同じ電極を用いて達成されているので、まず、小さな細胞または膜パッチを横切って信号を記録するために使用することができる。技術は、イオンチャンネルがカエルの筋肉、ウナギelectroplaques、またはイカ巨大軸索3,4の興奮性膜に限定されないことが明らかになったのではなく、それらは、膜貫通シグナル伝達機構のユビキタス器具を表し、単方向または全ての細胞膜の種類に固有であること多細胞生物、また細胞内膜へ。インポートantly、単に無傷の細胞にガラスピペットを取り付けることにより、貫通電流を記録する機能は、ネイティブ破壊されていない膜内のイオンチャネルからの活動を記録するために前例のない機会を提供した。したがって、このプロトコルに記載されているセル取り付けパッチクランプ技術は、数十分又はそれらの天然の環境においてより長い連続イオンチャネルの活性をモニター可能にする。
通常の熱揺らぎの下では、イオンチャネルタンパク質を含む全てのタンパク質は、側鎖の動きと全体の再配置によって表される非常に遅く、あまり頻繁に変更することによって最も可能性の高い表現最速かつ最も頻繁に再編成に、幅広い時間スケールにわたる構造的な変化を受けるドメインまたはサブユニット、または翻訳後修飾またはタンパク質-タンパク質相互作用5,6によっていくつかの場合において。 1分子によって生成された活動の長い期間を観察すると、機能を理解するのに役立ちます完全な生理的膜におけるイオンチャネルのtionalダイナミクスと観測され、分子の動作メカニズムについての貴重な情報を提供します。
細胞型および発生段階を横切るイオンチャネルの多様性の増加理解とは対照的に、天然の膜におけるイオンチャネルの分子組成についての知識は、依然として限られている。すべてのイオンチャネルは、多量体タンパク質であり、天然イオンチャネルの大部分は、多くの場合、多様なコンダクタンスとゲーティング特性を伴う広い分子多様性のタンパク質を産生するサブユニットのいくつかのタイプから組み立てる。このため、規定された分子組成物のイオンチャネルは、異種系での発現の際に検討されている。具体的には、不死化したヒト胚性腎細胞のクローンライン7であるHEK293細胞は、組換え型イオンチャネルの異種発現のための好適なシステムとして広く受け入れを得た。男の中イオンチャネルの電気生理学のための選択システムは、培養の容易さと低価格であり、長寿命、安定した培養物を維持するように、哺乳動物タンパク質の翻訳後フォールディング、プロセシングおよび輸送を行う能力をHEK293細胞を上昇yの利点は、多くの場合、その低レベルまたは対象7、8のチャネルのための内因性発現のさえない状態。組換えイオンチャネルを発現し、HEK293細胞におけるそれらの機能的特性を研究することは構造 – 機能イオンチャネルの特性ならびにイオンチャネルアイソフォームおよび天然組織におけるそれらの役割の特定のプロパティに関する情報を取得する価値のあるアプローチであり続けている。この資料に記載されているプロトコルは、HEK293細胞において発現された組換えイオンチャネルおよび天然イオンチャネルにも同様に適用することができる。
要約すると、その前例のない能力を介してパッチクランプ技術は、信号を解決するために一つの分子からのsは、今日まで、単一分子の挙動を観察するための最も直接的な方法のままである。その細胞結合型モードでは、パッチクランプ記録は、一分子のために行わ、長い観察期間を可能にするイオンチャネルの動作中に例外的な洞察を提供することができる。以下に一つのイオンチャネルタンパク質を含む細胞取り付けパッチから高分解能電流記録を取得するためのプロトコルが提供される。
Protocol
Representative Results
Discussion
イオンチャネルフィールドで、研究の重要な領域は、開口部またはチャネルのゲート機構をチャネルにつながるイベントのシーケンスを理解するに捧げられています。ほとんどのチャネルの場合、このプロセスは複雑であり、巨視的なマルチチャネル信号から推定することができないいくつかの動力学的工程を含む。対照的に、実験は、単一チャネル記録内のオープン/クローズイベントのシ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、F31NS086765（KAC）、F31NS076235（MAP）、およびR01 NS052669（GKP）とEIA9100012によってサポートされていました。著者らは、分子生物学および組織培養に関する専門知識と支援のためのアイリーンKasperekに感謝。そしてジェイソン·マイヤーズ早期前頭前皮質ニューロンから得られたデータを共有するための。
Materials
| Chemicals | Sigma | Various | |
| Borosillicate Glass | Sutter | BF-150-86-10 | |
| Bright field inverted microscope | Olympus | 1×51 | Nikon also has similar microscopes |
| Fluroescent box | X-cite | Series 120 | |
| Liquid Light Guide | X-cite | OEX-LG15 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MP-225 | |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS1001 | |
| Amplifier | Molecular Devices | Axon Axopatch 200B | |
| Table | TMC | 63561 | |
| NIDAQ card | National Instruments | 776844-01 | |
| Puller | Narishige | PC-10 | |
| Polisher | Narishige | Microforge MF-830 | |
| Faraday Cage | TMC | 8133306 | |
| High Speed Pressure Clamp | ALA Scientific Instruments | ALA HSPC | |
| Pressue/Vaccuum Pump | ALA Scientific Instruments | ALA PV-PUMP | For HSPC-1 |
References
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).
- Piccolino, M. Animal electricity and the birth of electrophysiology: the legacy of Luigi Galvani. Brain Research Bulletin. 46, 381-407 (1998).
- Albright, T. D., Jessell, T. M., Kandel, E. R., Posner, M. I. Neural Science: A Century of Progress and the Mysteries that Remain. Neuron. 25, (2000).
- Popescu, G. K. Modes of glutamate receptor gating. The Journal of Physiology. 590, 73-91 (2012).
- Morimoto-Tomita, M., et al. Autoinactivation of Neuronal AMPA Receptors via Glutamate-Regulated TARP Interaction. Neuron. 61, 101-112 (2009).
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51, 187-200 (2005).
- Huang, Z., Li, G., Pei, W., Sosa, L. A., Niu, L. Enhancing protein expression in single HEK 293 cells. Journal of Neuroscience Methods. 142, 159-166 (2005).
- Raymond, L. A., Moshaver, A., Tingley, W. G., Huganir, R. L. Glutamate receptor ion channel properties predict vulnerability to cytotoxicity in a transfected nonneuronal cell line. Mol Cell Neurosci. 7, 102-115 (1996).
- Suchyna, T. M., Markin, V. S., Sachs, F. Biophysics and Structure of the Patch and the Gigaseal. Biophysical Journal. 97, 738-747 (2009).
- Qin, F. Restoration of single-channel currents using the segmental k-means method based on hidden Markov modeling. Biophys J. 86, 1488-1501 (2004).
- Colquhoun, D., Sigworth, F. J. . chapter in Single-channel recording. 2nd edn eds B. Sakmann and E Neher. , (1995).
- Popescu, G., Auerbach, A. Modal gating of NMDA receptors and the shape of their synaptic response. Nat Neurosci. 6, 476-483 (2003).
- Colquhoun, D., Hawkes, A. G. Stochastic properties of ion channel openings and bursts in a membrane patch that contains two channels: evidence concerning the number of channels present when a record containing only single openings is observed. Proc R Soc Lond B Biol Sci. 240, 453-477 (1990).
- Kussius, C. L., Kaur, N., Popescu, G. K. Pregnanolone Sulfate Promotes Desensitization of Activated NMDA Receptors. J. Neurosci. 29, 6819-6827 (2009).
- Amico-Ruvio, S., Popescu, G. Stationary gating of GluN1/GluN2B receptors in intact membrane patches. Biophysical Journal. 98, 1160-1169 (2010).
- Borschel, W. F., et al. Gating reaction mechanism of neuronal NMDA receptors. J Neurophysiol. 108, 3105-3115 (2012).
- Colquhoun, D., Hatton, C. J., Hawkes, A. G. The quality of maximum likelihood estimates of ion channel rate constants. The Journal of Physiology. 547, 699-728 (2003).
- Kussius, C. L., Kaur, N., Popescu, G. K. Pregnanolone Sulfate Promotes Desensitization of Activated NMDA Receptors. The Journal of Neuroscience. 29, 6819-6827 (2009).
- Popescu, G., Auerbach, A. Modal gating of NMDA receptors and the shape of their synaptic response. Nat Neurosci. 6, 476-483 (2003).
- Popescu, G., Robert, A., Howe, J. R., Auerbach, A. Reaction mechanism determines NMDA receptor response to repetitive stimulation. Nature. 430, 790-793 (2004).
- Prieto, M. L., Wollmuth, L. P. Gating Modes in AMPA Receptors. The Journal of Neuroscience. 30, 4449-4459 (2010).
- Poon, K., Nowak, L. M., Oswald, R. E. Characterizing Single-Channel Behavior of GluA3 Receptors. Biophysical Journal. 99, 1437-1446 (2010).
- Smith, T. C., Wang, L. -. Y., Howe, J. R. Heterogeneous Conductance Levels of Native AMPA Receptors. The Journal of Neuroscience. 20, 2073-2085 (2000).
- Coste, B., et al. Piezo1 and Piezo2 Are Essential Components of Distinct Mechanically Activated Cation Channels. Science. 330, 55-60 (2010).
- Coste, B., et al. Piezo proteins are pore-forming subunits of mechanically activated channels. Nature. 483, 176-181 (2012).
- Benndorf, K. . chapter in Single-channel recording. 2nd edn eds B. Sakmann and E Neher. , (1995).
