This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.
الغدة الدرقية هي غدة الصماء bilobated المترجمة في قاعدة العنق، وتنتج هرمونات الغدة الدرقية T3، T4، والكالسيتونين. ويتم إنتاج T3 و T4 من قبل thyrocytes المتباينة، التي نظمت في مجالات مغلقة تسمى المسام، في حين يتم تصنيعه بواسطة C الكالسيتونين الخلايا، ويتخلل بين بصيلات وشبكة كثيفة من الشعيرات الدموية. على الرغم من أن العمارة الغدة الدرقية الكبار وظائف وقد وصفت على نطاق واسع، ودرس، وتشكيل وحدات "الوعاء الجريبي"، وتوزيع خلايا C-في لحمة والاتصالات نظير الصماوي بين الظهارية والخلايا البطانية بعيد كل البعد عن أن يكون مفهوما.
يصف هذا الأسلوب في خطوات متتابعة من الماوس الغدة الدرقية الجنينية ANLAGEN تشريح وثقافتها على مرشحات semiporous أو على شرائح البلاستيك المجهري. في غضون أربعة أيام، وهذا النظام الثقافة يلخص بأمانة في التنمية الغدة الدرقية الجسم الحي. في الواقع، (ط) مليارobation من الجهاز يحدث (لإإكسبلنتس E12.5)، (ب) تنظيم thyrocytes السلائف في بصيلات واستقطاب، (ج) C وthyrocytes الخلايا التفريق، و (iv) الخلايا البطانية موجودة في الأنسجة تتكاثر microdissected، تهاجر إلى فصوص الغدة الدرقية، وبشكل وثيق مع ربط الخلايا الظهارية، كما يفعلون في الجسم الحي.
ويمكن الحصول على أنسجة الغدة الدرقية من النوع البري، بالضربة القاضية أو الأجنة وراثيا الفلورسنت. علاوة على ذلك، إإكسبلنتس الثقافة يمكن التلاعب بها عن طريق إضافة مثبطات، ومنع الأجسام المضادة، عوامل النمو، أو حتى الخلايا أو المتوسطة مكيفة. يمكن تحليلها خارج الحي التنمية في الوقت الحقيقي، أو في أي وقت من الثقافة التي كتبها المناعية وRT-QPCR.
في الختام، والثقافة ازدراع الغدة الدرقية جنبا إلى جنب مع المصب كامل جبل أو على توفر أقسام التصوير والتعبير الجيني التنميط نظام قوي لمعالجة ودراسة التخلق والتمايز أحداث س الغدة الدرقيةrganogenesis.
الغدة الدرقية هي عبارة عن مجموعة من المجالات الظهارية مستقلة، ودعا بصيلات، وتحيط بها شبكة كثيفة من الشعيرات الدموية البطانية. هذه المنظمة تسمح وظيفة الغدة الدرقية: توفير الشعيرات الدموية البطانية thyrocytes مع اليود، اللازمة لT3 و T4 هرمون التوليف، وتوزيع هذه الأخيرة إلى الجسم كله. منتشرة في بين بصيلات والشعيرات الدموية، C خلايا إنتاج هرمون الكالسيتونين نقص كلس الدم 1. على الرغم من أن العمارة الغدة الدرقية الكبار وظائف معروفة، الآليات الخلوية والجزيئية المشاركة في التطور الجنيني الغدة الدرقية (تشكيل المسام والتمايز) بعيدة كل البعد عن أن يكون مفهوما.
خلال مرحلة التطور الجنيني، thyrocytes السلف كما تنبع سماكة (بدأة خط الوسط) من الجدار البطني من الأديم الباطن المعى الأمامي في اليوم الجنينية (ه) 8.5 في جنين الفأر، في حين C خلايا الأسلاف تنشأ في E11.5 كما نتوءات على شكل قطرات ( بو التالية للخيشوميةيموت) من الحقائب البلعوم الرابع 2-6. برعم خط الوسط ثم يفصل من الأديم الباطن، ويوسع ثنائيا لتندمج في E13.5 مع الهيئات التالية للخيشومية على كل جانب من القصبة الهوائية. أخيرا، thyrocytes تنظيم في بصيلات وخلايا C-التفريق.
المعرفة الحالية على تشكيل الغدة الدرقية يأتي أساسا من التحليل النسيجي لأنسجة ثابتة، ولكن الأحداث التخلق المشاركة في تشكيل الغدة الدرقية هي ديناميكية للغاية وتنطوي على الاتصالات والتفاعلات بين أنواع مختلفة من الخلايا ومع المصفوفة خارج الخلية. وأظهرت الأعمال الأخيرة التي الأسلاف thyrocyte تنتج مستويات عالية من VEGF لتجنيد الخلايا البطانية إلى الغدة الدرقية النامية، وبدوره بتجنيد الخلايا البطانية تشجيع تشكيل بصيلات وخلايا C التمايز 7.
وقد أجريت معظم الدراسات المجراة سابقا على الغدة الدرقية على الخلايا المشتقة من الغدة الدرقية الكبار معزولة، ونمت إما على 2D البلاستيك زراعة الأنسجة ديتضاءل المجموع المذكور أعلاه أو في المصفوفات 3D. باستخدام هذه الأنواع من الثقافات، والخلايا الجريبي متباينة إما البقاء الاستقطاب وتنظيمها في بصيلات أو إعادة الاستحواذ على منظمة 3D 8-10. ومع ذلك، وهذه الخلايا الظهارية نقية، explanted من بيئتهم الفسيولوجية، والمثقف في 2D، تجاهل التفاعل مع المصفوفة خارج الخلية، السيتوكينات وعوامل النمو ومع أنواع الخلايا الأخرى مثل الخلايا البطانية أو الأعصاب التي يواجهونها عادة في الجسم الحي. وصفت دراسة لطيفة جدا مؤخرا بروتوكول تمايز الخلايا ES في بصيلات الغدة الدرقية باستخدام الخطوة النهائية في الثقافة 3D matrigel 11. ومع ذلك، هذه الثقافات 3D تفتقر اتصال مع أنواع الخلايا الأخرى.
بناء على الخبرة السابقة على البنكرياس والغدد اللعابية ثقافة الجهاز 12-14، طريقة لتشريح الفأر الجنينية ANLAGEN الغدة الدرقية وزراعة لل explants على مرشحات semiporous أو على شرائح البلاستيك المجهر وقد وضعت.
عندماالعمل مع الأجنة E12.5، والأصل المزدوج للANLAGEN الغدة الدرقية (بدأة خط الوسط واثنين من الهيئات التالية للخيشومية الجانبي) فرضت تسليخ مجهري من جزء كبير من الأنسجة. يرد هذا القصبة الهوائية، ولكن ليس المريء، وامتدت من الشرايين البلعوم القوس حتى تورم الطرجهالي. عند تربيتها على مرشحات، وبدأة خط الوسط يمتد أفقيا على كل جانب من القصبة الهوائية، حيث تلتحم مع الهيئات التالية للخيشومية لتشكيل اثنين من فصوص الغدة الدرقية، لا تزال متصلة بواسطة برزخ ضيق.
في الثقافة، وتتكاثر الخلايا الظهارية، وتنظيم في بصيلات والتمايز إلى خلايا thyrocytes وC، اعتمادا على أصلهم. الخلايا البطانية الواردة في الأنسجة microdissected أيضا تتكاثر وتغزو فصوص الغدة الدرقية لربط أخيرا بشكل وثيق مع هيكل مسامي الظهارية، بصرف النظر عن تدفق الدم أو عوامل المنتشرة. كما تطور لل explants يلخص بأمانة في الجسم الحي تطويرمنة، وهذا النظام هو الأمثل الثقافة لدراسة التخلق والتمايز الأحداث التي تحدث أثناء نمو الغدة الدرقية.
ويمكن الحصول على أنسجة الغدة الدرقية من النوع البري، بالضربة القاضية أو الأجنة وراثيا الفلورسنت، ونظام الثقافة هي قابلة للخسارة والربح من وظيفة التجارب. أخيرا، يمكن استغلال الوقت الفاصل بين التصوير من إإكسبلنتس الغدة الدرقية fluorescently المسمى على أطباق البلاستيك المجهري للتحقيق أفضل حركية واستمرارية حركات التخلق التي تحدث في الجسم الحي. وقد تم بالفعل استخدام الوقت الفاصل بين التصوير لدراسة التشكل المتفرعة من البنكرياس 15،16 أو الحالبي برعم 17.
وتصف هذه الورقة طريقة لتشريح وزراعة إإكسبلنتس الغدة الدرقية (E12.5) أو فصوص (E14.5) من أجل دراسة وفهم أفضل للأحداث المعقدة التي تفضي إلى تشكيل الغدة الدرقية. ويرجع ذلك إلى الأصل المزدوج للANLAGEN الغدة الدرقية (بدأة خط الوسط واثنين من الهيئات التالية للخيشومية الجانبية)، وصغر…
The authors have nothing to disclose.
The work was supported by grants from the Université catholique de Louvain (Action de recherché concertées) and the Fund for Scientific Medical Research (F.R.S.-FNRS, Belgium). A.-S.D. is a doctoral fellow from Télévie, A.-C.H. held a fellowship from the Fonds pour la formation à la Recherche dans l’Industrie et dans l’Agriculture (Belgium), M.V. is supported by the de Duve Institute and C.E.P. is a senior research associate of the F.R.S.-FNRS (Belgium).
µ-slide 8 well, ibiTreat, tissue culture treated, sterile | proxylab | 80826 | |
Collagen Type I, rat tail | Millipore | 08-115 | |
Fibronectin from human plasma | Invitrogen | # 33010-018 | |
M199 | Invitrogen | 31150-022 | |
HBSS | Invitrogen | 14025-100 | |
Tungsten wire | Goodfellow | LS237450 | |
culture plate insert (12 mm diameter) | Millipore | PICM01250 | |
GlycoBlue | Invitrogen | AM9516 | |
E-cadherin | BD Biosciences | 610182 | 1/1000 |
Ezrin | Thermo Scientific | MS-661-P1 | 1/400 |
PECAM | BD Biosciences | 550274 | 1/100 |
Hoechst | Sigma | B2261 |