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Biology

एक Published: June 6, 2014 doi: 10.3791/51641
Automatic Translation
1, 1, *1, *1
1Pole of Cell Biology, Université catholique de Louvain & de Duve Institute
* These authors contributed equally

Abstract

थायराइड थायराइड हार्मोन T3, टी -4, और कैल्सीटोनिन उत्पादन, गर्दन के आधार पर स्थानीयकृत एक bilobated अंत: स्रावी ग्रंथि है. कैल्सीटोनिन के रोम और रक्त केशिकाओं के एक घने नेटवर्क के बीच में interspersed सी कोशिकाओं, द्वारा संश्लेषित है जबकि T3 और T4, रोम बुलाया बंद क्षेत्रों में संगठित विभेदित thyrocytes, द्वारा उत्पादित कर रहे हैं. वयस्क थायराइड वास्तुकला और कार्यों में बड़े पैमाने पर वर्णित है और अध्ययन किया गया है, "Angio-कूपिक" इकाइयों, पैरेन्काइमा में सी कोशिकाओं के वितरण और उपकला और endothelial कोशिकाओं के बीच पैराक्राइन संचार के गठन में अब तक समझा जा रहा से है.

इस विधि semiporous फिल्टर पर या माइक्रोस्कोपी प्लास्टिक स्लाइड पर माउस भ्रूण थायराइड ANLAGEN विच्छेदन और अपनी संस्कृति के अनुक्रमिक चरणों का वर्णन है. चार दिन की अवधि के भीतर, इस संस्कृति प्रणाली ईमानदारी विवो थायराइड विकास में स्मरण दिलाता है. दरअसल, (मैं) अरबअंग की obation (E12.5 explants के लिए) तब होता है, (द्वितीय) व्यापारियों के रोम में संगठित करने और फूट डालना, (iii) thyrocytes और सी कोशिकाओं को अलग, और (iv) microdissected ऊतक पैदा में मौजूद endothelial कोशिकाओं, में विस्थापित thyrocytes वे vivo में कर के रूप में बारीकी से थायराइड पालियों, और, उपकला कोशिकाओं के साथ सहयोगी.

थायराइड ऊतकों जंगली प्रकार, पीटा या फ्लोरोसेंट ट्रांसजेनिक भ्रूण से प्राप्त किया जा सकता है. इसके अलावा, immunostaining और RT-qPCR द्वारा पूर्व vivo विकास वास्तविक समय में विश्लेषण किया जा सकता है. संस्कृति एंटीबॉडी, वृद्धि कारक है, या यहां तक कि कोशिकाओं या वातानुकूलित माध्यम अवरुद्ध, inhibitors के अलावा द्वारा चालाकी से किया जा सकता है explants, या संस्कृति के किसी भी समय.

बहाव के पूरे माउंट के साथ या वर्गों इमेजिंग और जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा थायराइड ओ के morphogenetic और भेदभाव की घटनाओं से छेड़छाड़ और अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली प्रणाली प्रदान करता है पर संयुक्त निष्कर्ष, थायराइड explant संस्कृति मेंrganogenesis.

Introduction

थायरॉयड ग्रंथि endothelial केशिकाओं के एक घने नेटवर्क से घिरा रोम बुलाया स्वतंत्र उपकला क्षेत्रों का एक संग्रह है. इस संगठन थायराइड समारोह की अनुमति देता है: endothelial केशिकाओं T3 और T4 हॉर्मोन संश्लेषण के लिए आवश्यक आयोडीन साथ thyrocytes, प्रदान, और पूरे शरीर को इन बाद वितरित. रोम और केशिकाओं के बीच में बिखरे हुए, सी कोशिकाओं 1 कैल्सीटोनिन hypocalcemic हार्मोन का उत्पादन. वयस्क थायराइड वास्तुकला और कार्यों में अच्छी तरह से जाना जाता है, थायराइड भ्रूण विकास (कूप गठन और भेदभाव) में शामिल सेलुलर और आणविक तंत्र अब तक समझा जा रहा से कर रहे हैं.

Embryogenesis दौरान, (सी कोशिकाओं पूर्वज छोटी बूंद के आकार का उभार के रूप में E11.5 पर उत्पन्न जबकि पूर्वज भ्रूण दिन में अग्रांत्र अन्तर्जनस्तर के उदर दीवार का एक मोटा होना (midline मूलरूप) (ई) माउस भ्रूण में 8.5, के रूप में निकलती है thyrocytes ultimobranchial बोचौथे ग्रसनी पाउच 2-6 की) मर जाता है. midline कली तो, अन्तर्जनस्तर से detaches श्वासनली के प्रत्येक पक्ष पर ultimobranchial निकायों के साथ E13.5 पर फ्यूज करने के लिए द्विपक्षीय फैलता है. अंत में, thyrocytes रोम में संगठित करने और सी कोशिकाओं को अलग.

थायराइड गठन पर वर्तमान ज्ञान मुख्य रूप से तय ऊतकों के histological विश्लेषण से आता है, लेकिन थायराइड गठन में शामिल morphogenetic घटनाओं अत्यधिक गतिशील हैं और विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के बीच और बाह्य मैट्रिक्स के साथ संचार और बातचीत शामिल है. हाल ही में काम thyrocyte progenitors विकासशील थायराइड के लिए endothelial कोशिकाओं की भर्ती के लिए VEGF के उच्च स्तर का उत्पादन, और बदले में, endothelial कोशिकाओं कूप गठन को बढ़ावा देने और सी कोशिकाओं के भेदभाव 7 भर्ती दिखाया.

थायराइड पर ज्यादातर पूर्व vivo अध्ययन या तो 2 डी टिशू कल्चर प्लास्टिक डी पर हो, पृथक वयस्क थायराइड व्युत्पन्न कोशिकाओं पर प्रदर्शन किया गया हैISHES या 3 डी matrices में. संस्कृतियों के इन प्रकार, विभेदित कूपिक कोशिकाओं polarized रहते हैं और रोम के रूप में संगठित या एक 3 डी संगठन 8-10 reacquire या तो उपयोग करना. हालांकि, उनके मनोवैज्ञानिक वातावरण से explanted, और 2 डी में सुसंस्कृत इन शुद्ध उपकला कोशिकाओं, बाह्य मैट्रिक्स, साइटोकिन्स, वृद्धि कारकों के साथ और वे सामान्य रूप से विवो में मुठभेड़ कि ऐसे endothelial या नसों की कोशिकाओं के रूप में अन्य प्रकार की कोशिकाओं के साथ बातचीत की अनदेखी. एक बहुत अच्छा अध्ययन हाल ही में 3 डी Matrigel 11 में एक अंतिम संस्कृति कदम का उपयोग थायराइड के रोम में ES कोशिकाओं की एक भेदभाव प्रोटोकॉल का वर्णन किया. हालांकि, इन 3 डी संस्कृतियों अन्य प्रकार की कोशिकाओं के साथ संपर्क की कमी है.

अग्न्याशय और लार पर पिछले विशेषज्ञता के आधार पर अंग संस्कृति 12-14, माउस भ्रूण थायराइड ANLAGEN विदारक और semiporous फिल्टर पर या माइक्रोस्कोपी प्लास्टिक स्लाइड पर explants संवर्धन के लिए एक विधि ग्रंथियों विकसित किया गया था.

जबE12.5 भ्रूण के साथ काम कर रहे, थायराइड ANLAGEN (midline मूलरूप और दो पार्श्व ultimobranchial निकायों) की दोहरी मूल ऊतक का एक बड़ा टुकड़ा के microdissection लगाया. इस ट्रेकिआ, लेकिन नहीं घेघा निहित, और arytenoid सूजन के लिए ऊपर ग्रसनी मेहराब धमनियों से बढ़ाया. फिल्टर पर सुसंस्कृत जब वे अभी भी एक संकीर्ण isthmus से जुड़े दो थायराइड पालियों, के लिए फार्म ultimobranchial निकायों के साथ फ्यूज जहां, midline मूलरूप, श्वासनली के प्रत्येक पक्ष पर laterally फैली हुई है.

संस्कृति में, उपकला कोशिकाओं को पैदा करना, रोम में संगठित करने और उनके मूल के आधार पर, thyrocytes और सी कोशिकाओं में अंतर. Microdissected ऊतक में निहित Endothelial कोशिकाओं भी पैदा करना और अंत में स्वतंत्र रूप से रक्त प्रवाह या परिसंचारी कारकों की उपकला कूपिक संरचना, के साथ मिलकर संबद्ध करने के लिए थायराइड पालियों आक्रमण. Explants के विकास के लिए ईमानदारी से विकसित विवो में स्मरण दिलाता रूपजाहिर है, इस संस्कृति प्रणाली morphogenetic और थायराइड विकास के दौरान होने वाली भेदभाव की घटनाओं का अध्ययन करने के इष्टतम है.

थायराइड ऊतकों जंगली प्रकार, पीटा या फ्लोरोसेंट ट्रांसजेनिक भ्रूण से प्राप्त किया जा सकता है, और संस्कृति प्रणाली घाटे और लाभ के समारोह के प्रयोगों के लिए उत्तरदायी है. अंत में, माइक्रोस्कोपी प्लास्टिक के बर्तन पर fluorescently लेबल थायराइड explants के समय चूक इमेजिंग बेहतर विवो में होते हैं कि कैनेटीक्स और morphogenetic आंदोलनों की निरंतरता की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. समय चूक इमेजिंग पहले ही अग्न्याशय 15,16 या ureteric कली की 17 शाखाओं में बंटी morphogenesis अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है.

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Protocol

चूहे विश्वविद्यालय के पशु कल्याण समिति की प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल के सिद्धांतों के अनुसार उठाया और इलाज किया गया. सभी प्रक्रिया और प्रोटोकॉल इस समिति द्वारा अनुमोदित किया गया.

1. माइक्रोस्कोपी प्लास्टिक की संस्कृति मंडलों की कोटिंग

नोट: एक लामिना का प्रवाह हुड में बाँझ शर्तों के तहत सभी निम्न चरणों का पालन. कोटिंग के दो प्रकार के कार्यात्मक समकक्ष हैं.

  1. फ़ाइब्रोनेक्टिन पूर्व थायराइड ऊतकों के अलगाव के लिए एक दिन के साथ कोट प्लास्टिक संस्कृति कक्षों:
    1. 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, 0.25 माइक्रोग्राम / एमएल fungizone और 2 मिमी glutamine 12 के साथ पूरक M199 मध्यम में एक 50 माइक्रोग्राम / एमएल अंतिम एकाग्रता के लिए बाँझ फ़ाइब्रोनेक्टिन पतला.
    2. पतला fibronectin की 200 μl के साथ कुओं कवर और एक 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में रातोंरात सेते हैं.
    3. विच्छेदन के दिन, एम 1 के साथ एक बार कुओं कुल्ला, फ़ाइब्रोनेक्टिन महाप्राण99 और एंटीबायोटिक दवाओं, glutamine और 10% भ्रूण बछड़ा सीरम के साथ पूरक M199 के 200 μl की एक न्यूनतम मात्रा में जोड़ें.
    4. Explants थाली करने के लिए तैयार है जब तक इनक्यूबेटर में लेपित कक्षों छोड़ दें.
  2. प्रकार के साथ कोट प्लास्टिक संस्कृति कक्षों मैं थायराइड ऊतकों के अलगाव से पहले 2 घंटा कोलेजन:
    1. मैं 10 मिमी एचसीएल में 50 माइक्रोग्राम / एमएल अंतिम एकाग्रता कोलेजन बाँझ प्रकार पतला. नोट: बर्फ पर कोलेजन स्टॉक समाधान रखें.
    2. मैं कोलेजन पतला प्रकार के 200 μl के साथ कुओं कवर और कमरे के तापमान (आर टी) में 2 घंटे के लिए सेते हैं.
    3. मैं समाधान कोलेजन टाइप Aspirate, M199 के साथ एक बार कुओं कुल्ला और एंटीबायोटिक दवाओं, glutamine और 10% भ्रूण बछड़ा सीरम के साथ पूरक M199 के 200 μl की एक न्यूनतम मात्रा में जोड़ें.
    4. Explants थाली करने के लिए तैयार है जब तक इनक्यूबेटर में लेपित कक्षों छोड़ दें.

थायराइड ANLAGEN युक्त ऊतकों की 2. विच्छेदन (E12.5) या थायराइड पालियों (E13.5-E14.5)

नोट: साफ विदारक उपकरण और पेट्री / संस्कृति प्लेटों का प्रयोग करें. नीचे वर्णित सामान्य कदम और चीरों E12.5 और E14.5 भ्रूण के लिए ही कर रहे हैं.

  1. वांछित भ्रूण (E12.5 से E14.5 करने के लिए) (ई) दिन में समय गर्भवती मादा चूहों बलिदान और विदारक उपकरणों का उपयोग कर गर्भाशय निकालना.
  2. HBSS युक्त एक 10 सेमी की थाली में विच्छेदित गर्भाशय रखें.
  3. संदंश के साथ गर्भाशय का एक सिरा पकड़ और उत्तरोत्तर सभी भ्रूण को आजाद कराने के लिए छोटे कैंची के साथ गर्भाशय खुला.
  4. कैंची से नाल से भ्रूण को अलग किया और HBSS युक्त एक नया 10 सेमी की थाली में उनके extraembryonic झिल्ली के साथ भ्रूण हस्तांतरण.
  5. जर्दी थैली और भ्रूणावरण निकालें. नोट: इस बिंदु से, नीचे से transillumination साथ एक stereomicroscope के तहत काम करते हैं; विच्छेदन कदम के साथ बढ़ाई बढ़ रही है. उपकरण विदारक के रूप में कांच capillaries में टंगस्टन सुई का प्रयोग करें.
  6. जैसे सुई का प्रयोगएक चाकू और कांटा, ऊपरी जबड़े और कान (एक साथ काटा चित्रा 1 ए) सहित, सिर के ऊपरी भाग को हटा दें.
  7. अपनी पीठ पर भ्रूण पकड़ो और पहले न्यूरल ट्यूब के एक अतिरिक्त टुकड़ा (ख के साथ काटा चित्रा 1 ए), भ्रूण की तो निचले हिस्से, बस पूर्वकाल अंगों के तहत और दिल (चित्रा 1 बी) के ऊपर हटा दें.
  8. HBSS युक्त एक नया 10 सेमी की थाली में जीभ (ऊतक उन्मुख करने के लिए) और गर्दन क्षेत्र युक्त भ्रूण टुकड़ा हस्तांतरण.
  9. न्यूरल ट्यूब निकालें और ऊतकों (एक साथ काटा चित्रा 1C) घुटकी / ट्रेकिआ के पीछे.
  10. धीरे खंड (ख और ख 'के साथ काटा चित्रा 1C) जीभ के दोनों पक्षों के साथ ऊतक टुकड़ा.
  11. जीभ की मोहलत में, घेघा और ट्रेकिआ जानें, और (चित्रा -1, एक साथ कटौती), और बीओटी पर ऊतक सूजन arytenoid छोड़ने, जीभ दूर काटना(बी और बी 'के साथ काटा चित्रा -1) घुटकी / श्वासनली की ज पक्षों.
  12. घेघा निकालें, और अपने उदर पक्ष का सामना करना पड़ के साथ ट्रेकिआ जगह है.
  13. ऐसे थाइमस (चित्रा 1E) और ग्रसनी मेहराब धमनियों को laterally स्थित सभी ऊतकों के रूप में अवांछित ऊतकों दूर काटना. (चित्रा 1F, लाल बिंदीदार रेखा) E13.5 या E14.5 भ्रूण के लिए, श्वासनली के प्रत्येक पक्ष पर थायराइड पालियों कल्पना और आगे श्वासनली से पालियों काटना.
  14. एंटीबायोटिक दवाओं, glutamine और 10% भ्रूण बछड़ा सीरम के साथ पूरक पूर्व गर्म M199 मध्यम युक्त एक 35 मिमी संस्कृति की थाली में पृथक E12.5 श्वासनली क्षेत्र, या E13.5-E14.5 थायराइड पालियों स्थानांतरण. एक पी 200 micropipette पर एक prewetted फिल्टर टिप का उपयोग explants स्थानांतरण. E12.5 explants के लिए खोलने को चौड़ा करने के लिए टिप का सिरा काट दिया. नोट: भ्रूण एक ही जीनोटाइप है अगर नियमित, और, सभी भ्रूण पर कदम 6 और 7 प्रदर्शन,n 9-11, और अंत में 12 और 13.

थायराइड explants के 3. चढ़ाना और संस्कृति

  1. पूर्व गर्म संस्कृति के माध्यम से 1 मिलीलीटर युक्त एक 24 अच्छी तरह से थाली के तीन कुओं में लगातार स्थानांतरण द्वारा explants धो (= M199 एंटीबायोटिक दवाओं, glutamine और 10% भ्रूण बछड़ा सीरम के साथ पूरक).
  2. लेपित माइक्रोस्कोपी प्लास्टिक संस्कृति कक्षों पर थायराइड पालियों की चढ़ाना:
    1. लेपित कक्षों से महाप्राण M199 संस्कृति के माध्यम से.
    2. ध्यान से, एक micropipette और फिल्टर सुझावों का उपयोग संस्कृति कक्षों में थायराइड explants हस्तांतरण. प्रत्येक कक्ष के केन्द्र में एक explant रखें.
    3. अतिरिक्त मध्यम निकालें और एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में संस्कृति चैम्बर जगह (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) 2 घंटे के लिए explants मैट्रिक्स को देते हैं बताने के लिए.
    4. धीरे अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए पूर्व गर्म संस्कृति के माध्यम से 200 से 300 μl जोड़ें.
    5. टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में लंबे समय तक संस्कृति के लिए सेते हैं.
  3. चढ़ाना ओsemiporous फिल्टर पर च श्वासनली क्षेत्र या थायराइड पालियों:
    1. पूर्व गर्म संस्कृति के माध्यम से 330 μl के साथ आवश्यक 24 अच्छी तरह से थाली के कुओं की संख्या भरें.
    2. संस्कृति फिल्टर नीचे हवा के बुलबुले के फँसाने से बचने के ख्याल रख माध्यम पर जगह फिल्टर (जैसे 0.4 माइक्रोन Millipore फिल्टर),.
    3. ध्यान से, एक micropipette और फिल्टर सुझावों का उपयोग, फिल्टर के केंद्र (अधिकतम 4/filter) पर माध्यम की एक न्यूनतम मात्रा के साथ थायराइड explants हस्तांतरण.
    4. एक टंगस्टन सुई के साथ explants बाहर मध्यम और अंतरिक्ष के अतिरिक्त हटा दें.
    5. टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में लंबे समय तक संस्कृति के लिए सेते हैं. नोट: लामिना का प्रवाह हुड के तहत बदल संस्कृति के माध्यम से हर दूसरे दिन. 7 दिनों के लिए संस्कृति explants.

थायराइड Explants के लिए 4. साबुत माउंट immunofluorescence धुंधला प्रोटोकॉल

टंगस्टन सुई या का उपयोग (नीचे चरण 2 के बाद) फिल्टर पर हो explants बेदखलठीक संदंश और प्राथमिक चरण (5) और माध्यमिक (7) एंटीबॉडी incubations (96 अच्छी तरह से थाली) को छोड़कर सभी चरणों के लिए 24 अच्छी तरह से थाली में स्थानांतरण. माइक्रोस्कोपी प्लास्टिक कक्षों पर सुसंस्कृत पक्षपाती explants के लिए, संस्कृति कक्षों में सभी चरणों को पूरा.

  1. महाप्राण M199 संस्कृति मध्यम और 20 मिनट (24 अच्छी तरह से थाली में 500 μl और माइक्रोस्कोपी स्लाइड में 300 μl) के लिए ठंडा 4% paraformaldehyde (पीएफए) के साथ explant तय कर लो.
  2. ट्राइटन साथ Tris खारा बफर 2x 10 मिनट धोने (TBST, 50 मिमी Tris एचसीएल 7.5 पीएच, 150 मिमी NaCl, 0,1% ट्राइटन X-100) आरटी पर.
  3. -20 डिग्री सेल्सियस पर तुरंत explants या संग्रह प्रक्रिया नोट: -20 डिग्री सेल्सियस पर लंबी अवधि के भंडारण के लिए, धीरे - धीरे 100% मेथनॉल तक पहुँचने के लिए TBST में मेथनॉल एकाग्रता में वृद्धि से मेथनॉल में explants निर्जलीकरण. तैयार immunostaining (चरण 4) के साथ जारी रखने के लिए करते हैं, धीरे - धीरे मेथनॉल के लिए TBST जोड़कर explants rehydrate.
  4. अवरुद्ध समाधान (10% TBST में सामान्य बकरी सीरम के साथ TBST बदलें) और आरटी पर 30-60 मिनट के लिए एक समुद्र देखा घुमाव पर सेते हैं.
  5. (शर्त प्रति 100-200 μl) अवरुद्ध समाधान में प्राथमिक एंटीबॉडी पतला. एक 96 अच्छी तरह से थाली करने के लिए एक 24 अच्छी तरह से थाली से "फिल्टर" explants स्थानांतरण. 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात एक समुद्र देखा घुमाव पर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ explants सेते
  6. अगले दिन, प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान त्यागें वापस एक 24 अच्छी तरह से थाली में "फिल्टर" explants हस्तांतरण, और 45-60 मिनट आरटी पर प्रत्येक के लिए एक समुद्र देखा घुमाव पर TBST के साथ कम से कम पांच बार धो लो.
  7. सामान्य बकरी सीरम का 1% से युक्त TBST में माध्यमिक एंटीबॉडी (1:2,000 कमजोर पड़ने पर जैसे बकरी विरोधी एक्स एलेक्सा Fluor) पतला और 4 डिग्री सेल्सियस और अंधेरे में एक समुद्र देखा घुमाव पर रातोंरात इस कमजोर पड़ने के साथ explants सेते हैं. परमाणु counterstaining के लिए, एक साथ माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के साथ बीआईएस Benzimide (Hoechst) की 1 ग्राम / एमएल शामिल हैं.
  8. अगले दिन, माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान त्यागें और एक समुद्र देखा पर TBST के साथ 5x धोने45-60 मिनट आरटी पर प्रत्येक के लिए घुमाव. Washes के दौरान, अंधेरे में explants रखना.
  9. TBST धीरे अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात घूमता में एक अतिरिक्त धोने प्रदर्शन करना.
  10. पोस्टफिक्स 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% पीएफए ​​में immunostained explants.
  11. TBST के साथ 2x 10 मिनट धो लें.
  12. -20 डिग्री सेल्सियस पर लंबी अवधि के भंडारण के लिए या तो धीरे - धीरे मेथनॉल में 100% explants स्थानांतरण, या तुरंत विश्लेषण. फिल्टर पर सुसंस्कृत, और एक 24 अच्छी तरह से थाली में immunostained, पिछले एक Multiphoton या confocal खुर्दबीन के साथ विश्लेषण करने के लिए TBST या बेहतर फ्लोरोसेंट बढ़ते मध्यम के साथ एक माइक्रोस्कोपी कक्ष (जैसे LabTek या Ibidi) में स्थानांतरण explants लिए.

थायराइड से शाही सेना के 5. एक्सट्रैक्शन

एक RNase मुक्त वातावरण में काम करते हैं. इसलिए, न्यूक्लिक एसिड और nuclease मुक्त विंदुक युक्तियाँ का उपयोग करें और contaminants और RNases से बेंच और उपकरण दोनों साफ. फिनोल / क्लोरोफॉर्म के आधार पर किया जा रहा यह प्रोटोकॉल, पहला कदम प्रदर्शनएक रासायनिक हुड के नीचे (1-7).

  1. 1.5 मिलीलीटर ट्यूब के लिए एक डिस्पोजेबल मूसल का उपयोग करते हुए शाही सेना निकासी समाधान के 300 μl के साथ एक थायराइड explant या दो थायराइड पालियों homogenize. में नमूने के बीच, इथेनॉल, फिर पानी फिर, 2% एसडीएस में मूसल धो लो.
  2. शाही सेना निकासी के समाधान का एक और 100 μl, भंवर 10 सेकंड जोड़ें और 10 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं.
  3. 30 सेकंड के लिए भंवर और प्रत्येक नमूने के tRNA के 20 एनजी जोड़ें.
  4. 1 मिनट के लिए भंवर और क्लोरोफॉर्म के 80 μl जोड़ें.
  5. भंवर सख्ती 30 सेकंड के लिए और आरटी पर 15 मिनट सेते हैं.
  6. एक प्रशीतित (4 डिग्री सेल्सियस) अपकेंद्रित्र में 19,000 XG पर 15 मिनट के लिए स्पिन.
  7. Coprecipitant रूप में ग्लाइकोजन की 20 ग्राम से युक्त एक ताजा ट्यूब में ध्यान से बेरंग ऊपरी जलीय चरण हस्तांतरण.
  8. भंवर और 100% isopropanol शराब के 200 μl जोड़ें.
  9. 15-30 सेकंड के लिए सख्ती भंवर और 2-3 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर या 1 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर शाही सेना वेग चलो.
  10. 19,000 से कम 30 मिनट के लिए स्पिन4 डिग्री सेल्सियस पर XG, और सतह पर तैरनेवाला खत्म.
  11. गोली बेदखल करने के लिए ठंड 75% इथेनॉल और भंवर के 450 μl के साथ गोली धो लें.
  12. 4 डिग्री सेल्सियस पर 19,000 XG पर 10 मिनट के लिए स्पिन, और सतह पर तैरनेवाला खत्म.
  13. 5 मिनट के लिए हुड के नीचे गोली सूखी.
  14. RNase मुक्त पानी के 10 μl के साथ गोली Resuspend और आरटी पर 10 मिनट सेते हैं.
  15. परख शाही सेना एकाग्रता, -80 डिग्री सेल्सियस पर दुकान या रिवर्स जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए टाइप करना.

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Representative Results

थायराइड anlages (midline और यूबी, एक साथ आसपास के ऊतकों के साथ), और थायराइड पालियों क्रमश E12.5 और e13.5/e14.5 पर माउस भ्रूण, चित्रा (1) से विच्छेदित कर रहे हैं. फिल्टर पर संस्कृति में एक दिन के बाद, midline मूलरूप श्वासनली के शीर्ष पर फैले एक लम्बी ऊतक के रूप में (2A चित्रा) से दिखाई देता है. यह उत्तरोत्तर श्वासनली के प्रत्येक पक्ष पर दो पालियों रूपों. पृथक थायराइड पालियों (E13.5 या E14.5) सुसंस्कृत हैं, वे विस्तार morphogenesis और उपकला कोशिकाओं macroscopically दिखाई कूपिक संरचनाओं (चित्रा 2 बी) में आयोजित होगा गुजरना होगा.

संगठन और ई cadherin के साथ लेबल उपकला कोशिकाओं के ध्रुवीकरण, एजरिन immunolabeling (चित्रा 3) से देखे जा सकते हैं. एजरिन पॉजिटिव intracellular संरचना उत्तरोत्तर, और एक ठोस तरीके से, शिखर ध्रुव बन जाएगा कि सेल के एक ध्रुव के साथ फ्यूज. इस प्रक्रिया के दौरान, endothelial कोशिकाओं स्थितिPECAM पैदा करने के लिए सक्रिय और Angio-कूपिक इकाइयों (3B चित्रा) के रूप में विकसित करने के रोम के आसपास का आयोजन. Thyrocytes और सी कोशिकाओं के भेदभाव यों, आरएनए सुसंस्कृत थायराइड पालियों से अलग, और RT-qPCR (चित्रा -3 सी) द्वारा assayed जीन अभिव्यक्ति हो सकती है. थायराइड प्रतिलेखन कारक Nkx2.1 की अभिव्यक्ति संस्कृति के दौरान परिवर्तन नहीं करता है, thyrocyte विशेष thyroglobulin की और सी सेल विशिष्ट कैल्सीटोनिन की अभिव्यक्ति में नाटकीय रूप से कार्यात्मक भेदभाव का संकेत है, की वृद्धि हुई.

चित्रा 1
E14.5 माउस भ्रूण से थायराइड अलग करने के लिए चित्रा 1. विच्छेदन कदम. चीरों पीले बिंदीदार रेखा से चित्रित कर रहे हैं. (ए) के सिर का ऊपरी हिस्सा जीभ को बेनकाब करने के लिए दो चीरों से निकाल दिया जाता है. (बी) NECकश्मीर क्षेत्र ऊपरी अंगों नीचे और दिल से ऊपर भ्रूण सेक्शनिंग द्वारा शरीर के बाकी हिस्सों से अलग है. (सी) एक गाइड के रूप में (से) जीभ रखते हुए, न्यूरल ट्यूब (NT) और पार्श्व ऊतकों और अंगों को हटा दें. (डी) जीभ, arytenoid सूजन (*) और घेघा / श्वासनली पूरी तरह से जुड़ रहे हैं. सबसे पहले जीभ को हटाने और फिर ऊतकों घेघा / श्वासनली क्षेत्र के लिए पार्श्व. (ई) थायराइड पालियों आंशिक रूप से खारिज कर दिया जाना चाहिए जो थाइमस (thym) से छिपा रहे हैं. (एफ) थायराइड पालियों ट्रेकिआ (लाल बिंदीदार ovoids) के प्रत्येक पक्ष पर दिखाई दे रहे हैं, या बेहतर फ्लोरोसेंट संवाददाता भ्रूण का उपयोग कल्पना (PAX8-Cre, रोजा बंद YFP; इनसेट). लघुरूप:. (जीभ) के लिए, thym (थाइमस), टीआरए (ट्रेकिआ), * (arytenoid सूजन) इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.


फ़ाइब्रोनेक्टिन पर फिल्टर और थायराइड पालियों पर चित्रा 2. विच्छेदित थायराइड explants अच्छी तरह से पूर्व vivo विकास. Semiporous फिल्टर पर 1, 2 और 3 दिनों के लिए सुसंस्कृत एक E12.5 थायराइड explant के (ए) फोटो, हवा मध्यम इंटरफेस में. थायराइड उपकला कोशिकाओं श्वासनली के प्रत्येक पक्ष पर द्विपक्षीय विस्थापित और दो बढ़ रहा थायराइड पालियों के रूप में. (बी) दिन 1 और माइक्रोस्कोपी प्लास्टिक संस्कृति कक्षों पर सुसंस्कृत एक E14.5 थायराइड पालि के दिन 2 पर Brightfield छवियों. अंततः दिन 7 चारों ओर बड़े (20-100 माइक्रोन) के रोम कि फार्म. पीला बिंदीदार रेखा थायराइड की उपकला परिधि रूपरेखा बनाती उपकला के विस्तार और remodeling नोट. स्केल सलाखों, 100 माइक्रोन. कृपया सीएलआईइस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए सी.के..

चित्रा 3
चित्रा 3. पुटमकों का बनना, angiogenesis और संस्कृति में थायराइड की भिन्नता. थायराइड पालियों संकेत समय के लिए सुसंस्कृत थे. (ए) स्थाई ऊतकों पूरे माउंट basolateral मार्कर ई cadherin के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ immunostained थे, और subapical झिल्ली मार्कर एजरिन. संस्कृति में एक दिन के बाद, intracellular पुटिका 7 के अनुरूप है कि थायरॉयड पैरेन्काइमा मौजूद छोटे एजरिन पॉजिटिव संरचनाओं की उपकला कोशिकाओं. सन्निकट कक्षों से पुटिका के ठोस फ्यूजन दिन 2 पर छोटे लुमेन बनेगी; लुमेन के आसपास के आसपास की कोशिकाओं के अपने प्रगतिशील विकास, और संगठन 4 दिनों के बाद पूर्व कूपिक संरचनाओं चित्रित करना होगा. स्केल बार, 20 माइक्रोन. (बी) थायराइड एलप्लेटलेट और endothelial सेल आसंजन अणु (PECAM) और एजरिन के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ immunostained ओबीई. रोम endothelial संरचनाओं से घिरे हैं. स्केल बार, 50 माइक्रोन. थायराइड पालियों से निकाले (सी) शाही सेना, रिवर्स मात्रात्मक पीसीआर से पहले लिखित था. थायराइड प्रतिलेखन कारक Nkx2.1 की अभिव्यक्ति, और दो भेदभाव जीन, thyroglobulin और कैल्सीटोनिन की, विशिष्ट प्राइमर जोड़े का उपयोग कर मापा गया था. रिश्तेदार जीन अभिव्यक्ति की गणना करने के लिए, ΔΔ सीटी विधि संदर्भ जीन और 100% के रूप में संस्कृति के अंतिम समय बिंदु के रूप में ई cadherin का उपयोग, इस्तेमाल किया गया था. ए और बी में दिखाया गया छवियाँ पूरे माउंट immunostained थायराइड पालियों की एकल confocal ऑप्टिकल वर्गों रहे हैं. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

इस पत्र विदारक और थायराइड गठन के लिए प्रमुख जटिल घटनाओं का अध्ययन करने और बेहतर ढंग से समझने के क्रम में थायराइड explants (E12.5) या पालियों (E14.5) संवर्धन के लिए एक विधि का वर्णन करता है. कारण थायराइड ANLAGEN (midline मूलरूप और दो पार्श्व ultimobranchial निकायों), और उनके छोटे आकार, ग्रसनी मेहराब धमनियों को E12.5 ऊतक स्थानीयकृत विजय - स्तम्भ का एक टुकड़ा है, और श्वासनली युक्त, लेकिन नहीं घेघा की दोहरी मूल के microdissected है. सचित्र, चार दिनों की अवधि के भीतर, इस संस्कृति प्रणाली ईमानदारी के बाद से इन विवो थायराइड विकास में स्मरण दिलाता है: (i) midline मूलरूप द्विपक्षीय प्रवास करती है और यूबी के साथ, एक संकीर्ण isthmus से जुड़े दो थायराइड पालियों (2A चित्रा) के रूप में फैलता है (ii) थायराइड व्यापारियों के रोम में कोशिकाओं का एक जन से पुनर्निर्माण और अंततः में (iii) endothelial कोशिकाओं मौजूद है, (आंकड़े 2 बी और 3 ए) फूट डालनाmicrodissected ऊतक पैदा करना, थायराइड पालियों में विस्थापित, और बारीकी से उपकला कोशिकाओं (चित्रा 3 बी) के साथ संबद्ध है, और वे विवो 7 में कर के रूप में (चतुर्थ) thyrocytes और सी कोशिकाओं (चित्रा -3 सी) गुणात्मक अंतर. विच्छेदन शारीरिक रूप से गर्भ के विकास में व्यवधान और explanted टिशू कल्चर हालत के लिए अनुकूल करने के लिए कहा जाता है, रूपात्मक और भेदभाव की घटनाओं थोड़ा vivo में स्थिति की तुलना में देरी कर रहे हैं.

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम

इस पद्धति का महत्वपूर्ण पहलू विच्छेदन में है. संस्कृति में उनके विस्तार थायराइड पालियों के समुचित विकास में बाधा के रूप में सबसे पहले, यह पार्श्व ऊतकों, साथ ही सही और E12.5 explants से थाइमस ग्रंथि के बाएँ पालियों, दूर करने के लिए आवश्यक है. एक endothelial बनाए रखने के लिए चाहता है, तो दूसरा, तेज़ी भी महत्वपूर्ण हैजीवित कोशिकाओं. विच्छेदन एक बाँझ वातावरण के तहत नहीं किया जाता है, तो यह बाँझ संस्कृति के माध्यम में कई बार explants धोने के लिए महत्वपूर्ण है. Semiporous फिल्टर पर explants संवर्धन अंत में, जब यह माध्यम की एक छोटी मात्रा का उपयोग करने के लिए और फिल्टर के केंद्र पर explants स्थान के लिए महत्वपूर्ण है. बहुत ज्यादा मध्यम फिल्टर की परिधि के प्रवाह और फिल्टर दीवार के साथ एक meniscus पैदा करेगा. इस मामले में, explant मध्यम पालन करें और meniscus पहुँचता होगा; इसके विकास के बजाय हवा / मध्यम इंटरफेस में से मध्यम में किया जाएगा.

संभावित संशोधनों और सीमाएं

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल E12.5 थायराइड explants करने और E13.5 और थायराइड पालियों पृथक E14.5 पर लागू होता है. छोटे और बड़े विकास के चरणों संबोधित वैज्ञानिक सवाल के समारोह में परीक्षण किया जा सकता है. अन्य संस्कृति की स्थिति भी परीक्षण किया जा सकता है: थायराइड explants या पालियों 3D matrig में उगाया जा सकता हैएल, या मध्यम इंसुलिन / Transferrin / सेलेनियम के साथ के बजाय 10% सीरम के साथ पूरक हो सकता है.

टिशू कल्चर का एक महत्वपूर्ण पहलू ऑक्सीजन एकाग्रता है. माइक्रोस्कोपी प्लास्टिक स्लाइड पर हो, जब ऑक्सीजन एकाग्रता यह explants ऊपर माध्यम की ऊंचाई के साथ कम हो जाएगा के रूप में की सराहना करने के लिए मुश्किल है. फिल्टर पर हो, हवा / मध्यम इंटरफेस में, explants इसलिए ऑक्सीजन के 21% के साथ, वातावरण के साथ संपर्क में हैं. इस उत्तरार्द्ध मामले में, एक इनक्यूबेटर अंदर कम पीओ 2 एकाग्रता का उपयोग utero वातावरण में "hypoxic" पुन: पेश करने की कोशिश कर सकते.

E12.5 explants के tissular जटिलता सही विकास के लिए एक फायदा है तो उपकला कोशिकाओं को वायरस या अभिकर्मक अभिकर्मकों के लिए सुलभ नहीं हैं, यह भी एक मुख्य दोष है. हेरफेर प्रसारण अभिकर्मकों (निरोधक, अवरुद्ध एंटीबॉडी, वृद्धि कारकों, साइटोकिन्स, वातानुकूलित माध्यम) के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है, रखनाएक्सोजेनस यौगिक सभी प्रकार की कोशिकाओं को प्रभावित करता है कि मन में आईएनजी. इसके अलावा, ऊतक जटिलता और पूरे ऊतक explant (2A चित्रा, सही पैनल देखें) के सापेक्ष पालियों की छोटे आकार, तैयार अर्क (आरएनए या प्रोटीन) की पवित्रता कम कर देता है.

इस पत्र में प्रस्तुत आंकड़ों के सबसे 4-5 दिनों सुसंस्कृत explants से प्राप्त किया गया है, यह चित्रा 2 बी (देखें रोम के एक सतत विकास के साथ, ऊपर से 10 दिनों प्लास्टिक पर, लंबे समय के लिए संस्कृति में अंग रखने के लिए संभव है सुबह 7 बजे). अब संस्कृतियों के लिए प्रदर्शन किया जाना है, तो एक endothelial कोशिकाओं सहित सभी प्रकार की कोशिकाओं,, explants में जीवित है, इसकी पुष्टि होना चाहिए.

मौजूदा तरीकों या अन्य वैकल्पिक तरीकों के संबंध में तकनीक का महत्व

2 डी व्यंजन या 3 डी matrice में thyrocytes का शुद्ध आबादी की संस्कृति की तुलनाएस, इस अंग संस्कृति प्रणाली microdissected टुकड़े के प्राकृतिक और शारीरिक संरचना को बनाए रखने का लाभ प्रस्तुत करता है. दरअसल, thyrocytes और सी कोशिकाओं के progenitors के अलावा, explants mesenchymal और endothelial कोशिकाओं के साथ ही बाह्य मैट्रिक्स होते हैं. जैसा कि पहले ही लार ग्रंथियों, गुर्दे, फेफड़े या अग्न्याशय, अंग संस्कृतियों अच्छी तरह से नकल vivo में विकास के साथ प्रदर्शन किया. इसके अलावा, यह तेजी से जंगली प्रकार और पीटकर अंगों का विश्लेषण और (लाभ या हानि के समारोह) में हेरफेर करने के लिए एक तरीका प्रदान करता है.

इस तकनीक के माहिर के बाद भविष्य अनुप्रयोगों या दिशाओं

इस पत्र में थायराइड विकास के सेलुलर और आणविक पहलुओं एक खुर्दबीन के साथ या RT-qPCR द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है कि पता चलता है, सीटू संकरण या पश्चिमी सोख्ता में भी किया जा सकता है. इस संस्कृति प्रणाली उत्तरदायी है लाभ और विशिष्ट अवरोध करनेवाला के अलावा के माध्यम से नुकसान के समारोह के प्रयोगों के लिएएस, अवरुद्ध एंटीबॉडी, वृद्धि कारकों, साइटोकिन्स, या संस्कृति के माध्यम 7 में भी कोशिकाओं. हालांकि, ऊतकों में उपस्थित सभी प्रकार की कोशिकाओं को प्रभावित कर रहे. यह वायरस आधारित सेल प्रकार विशिष्ट लक्षित विकसित करने के लिए दिलचस्प होगा.

एक फ्लोरोसेंट संवाददाता तनाव का उपयोग करते हैं, एक फ्लोरोसेंट विदारक माइक्रोस्कोप के साथ, ऊतक टुकड़ा (चित्रा 1F, इनसेट) की microdissection की सुविधा है, लेकिन यह भी एक झिल्ली टैग फ्लोरोसेंट प्रोटीन 16 का उपयोग कर दूसरों के द्वारा की सूचना के रूप में, वास्तविक समय प्रदर्शन करने की अनुमति देता है 3 डी 15,16, या संस्कृति में एक विशेष सेल की आबादी का पालन करने में विकासशील अंग की इमेजिंग. नए फ्लोरोसेंट संवाददाता उपभेदों के विकास को ध्यान से morphogenetic घटनाओं कल्पना करने के लिए आवश्यक हो जाएगा.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
µ-slide 8 well, ibiTreat, tissue culture treated, sterile proxylab 80826
Collagen Type I, rat tail Millipore 08-115
Fibronectin from human plasma Invitrogen # 33010-018
M199 Invitrogen 31150-022
HBSS Invitrogen 14025-100
Tungsten wire Goodfellow LS237450
culture plate insert (12 mm diameter) Millipore PICM01250
GlycoBlue Invitrogen AM9516
E-cadherin BD Biosciences 610182 1/1,000
Ezrin Thermo Scientific MS-661-P1 1/400
PECAM BD Biosciences 550274 1/100
Hoechst Sigma B2261

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References

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सेलुलर जीवविज्ञान अंक 88 विकास सेलुलर जीव विज्ञान थायराइड अंग संस्कृति उपकला morphogenesis immunostaining इमेजिंग आरएनए
एक<em&gt; पूर्व vivo</em&gt; संस्कृति सिस्टम थायराइड विकास का अध्ययन करने के लिए
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Delmarcelle, A. S., Villacorte, M.,… More

Delmarcelle, A. S., Villacorte, M., Hick, A. C., Pierreux, C. E. An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development. J. Vis. Exp. (88), e51641, doi:10.3791/51641 (2014).

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