Summary
Nieuwe generaties van functionele testen zoals gamma interferon (IFN-γ) ELISPOT, die cytokineproductie detecteren op enkele cel en bieden zowel kwantitatieve als kwalitatieve karakterisering van T cel responsen kunnen worden gebruikt om celgemedieerde immuunresponsen tegen varicella zoster beoordelen virus (VZV).
Abstract
Varicella zoster-virus (VZV) is een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit na transplantatie van navelstrengbloed (UCBT). Daarom is antiherpetic profylaxe systematisch toegediend aan pediatrische UCBT ontvangers complicaties met VZV-infectie te voorkomen, maar er is geen sterk bewijs gebaseerde consensus dat de optimale duur bepaalt. Omdat T-cel gemedieerde immuniteit is verantwoordelijk voor de controle van VZV-infectie, de beoordeling van de reconstructie van VZV-specifieke T-cel responsen na UCBT kan aanwijzingen verschaffen over de vraag of profylaxe moet worden gehandhaafd of kan worden gestaakt. Hiervoor werd een specifiek VZV gamma interferon (IFN-γ) enzym-gekoppelde immunospot (ELISPOT) assay ontwikkeld IFN-γ productie karakteriseren door T-lymfocyten als reactie op in vitro stimulatie met bestraalde levend verzwakt VZV-vaccin. Deze test geeft een snelle, reproduceerbare en gevoelige meting van VZV specifieke cell gemedieerde immuniteit geschikt voor het bewaken van de reconstructie van VZV specifieke immuniteit in een klinische setting en beoordelen immuunrespons te VZV antigenen.
Introduction
Eerste uitgevoerd in 1989, wordt UCBT steeds meer gebruikt als onderdeel van de behandeling van verschillende neoplastische en nonneoplastic bloed bij kinderen 1. VZV is een cytopatisch menselijk alfaherpesvirus die twee verschillende ziekten, varicella (na primaire infectie) en herpes zoster (na reactivering) veroorzaakt. Na primaire infectie, VZV blijft gedurende de gehele levensduur van de gastheer beschut binnen sensorische zenuwen van de dorsale wortel ganglia. Een van de meest bedreigende infectieuze complicaties na UCBT geassocieerd met VZV 2-4. In ons klinisch centrum, in afwezigheid van VZV profylaxe, de cumulatieve incidentie van VZV ziekte VZV ziekte op 3 jaar postUCBT was 46% 2. Bij deze patiënten is de novo infectie met of reactivering van VZV vaak geassocieerd met viscerale verspreiding onder het centrale zenuwstelsel, de longen en de lever 5-7. Dientengevolge, acyclovir, valacyclovir of famciclovir profylaxe gewoonlijk toegediend aan UBCT ontvangers 8,9. Echter, deze behandelingsstrategie geen rekening gehouden met de beschermende potentieel van VZV specifieke T-lymfocyten en de kinetica van reconstitutie van VZV specifieke T cel responsen. Mogelijke problemen in verband met het toenemende gebruik van lange termijn antiherpetic profylaxe onder a) patiënt overbehandeling; b) de ontwikkeling van resistentie tegen antivirale middelen 10,11; en c) bijzondere waardevermindering van VZV specifieke immuunreconstitutie 12,13. Omdat detectie van functionele VZV-specifieke T-lymfocyten correleert met de aanwezigheid van lange termijn bescherming tegen VZV infectie en betere klinische uitkomst 4,14,15, monitoring cel-gemedieerde immuunrespons gericht tegen VZV in de periode na transplantatie kan leiden tot een rationeler gebruik van antivirale behandeling doordat artsen aan patiënten die baat hebben bij VZV onderscheiden profylaxe van degenen bij wie het immuunsysteem is in staat de controle VZV replicatie 4,13.
De IFN-γ ELISPOT wordt veel gebruikt voor het bewaken celgemedieerde immuunresponsen in verschillende experimentele systemen en klinische voorwaarden. Spots gegenereerd na de splitsing van een chromogeen substraat, het genereren van een zichtbare en stabiel precipitaat op de plaats van de reactie. Elke individuele vlek daardoor vertegenwoordigt de voetafdruk van een individuele cytokine producerende cellen. IFN-γ ELISPOT meet niet alleen het vermogen van afzonderlijke cellen ex vivo IFN-γ produceren in reactie op in vitro stimulatie met verwant antigeen, maar ook een schatting van de frequentie van reagerende cellen in een bepaalde celpopulatie 16,17. Naast de hoge gevoeligheid, IFN-γ ELISPOT is eenvoudig uit te voeren, waarbij de toepassing mogelijk in het kader van gepersonaliseerde klinische protocollen die als leidraad initiatie of beëindiging van antivirale behandeling. De onderstaande procedure describ beschrevenes een ELISPOT-assay die specifiek is ontworpen voor het opsporen en meten van de productie van IFN-γ door perifere mononucleaire cellen na in vitro stimulatie met VZV afgeleide antigenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit onderzoek protocol werd goedgekeurd door de Institutional Ethics Review Board van CHU Sainte-Justine, Montreal, Quebec, Canada, waar de studie werd uitgevoerd. Informed consent werd gezocht en verkregen van alle deelnemers aan de studie, hun ouders of wettelijke voogden. Alle procedures uitgevoerd op dag 1 en 2 dienen onder steriele omstandigheden (dat wil zeggen onder een laminaire stroming kap) worden uitgevoerd. Standaard veiligheidsprocedures voor het omgaan met menselijk bloed moeten strikt worden nageleefd.
1. Coating de platen
- Permeabilize de polyvinylideendifluoride (PVDF) membranen onder in 96 putjes MultiScreen IP witte ELISPOT platen door aan elk putje 20 ui 35% ethanol gedurende 1 minuut. Membranen moeten licht doorschijnend geworden.
- Spoel de wells 3 maal met 200 ul van 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2PO 4, pH 7,4) met een mulnaals pipet of soortgelijk apparaat. Deze stap is van cruciaal belang gezien het feit dat ethanol residuen levensvatbaarheid van de cellen kan beïnvloeden en binding van vangantilichaam. ELISPOT-platen zijn kwetsbaar en dient voorzichtig behandeld: het gebruik van een geautomatiseerde plaatwasser wordt afgeraden.
- Coat de putjes met 10 pl gezuiverd muis-anti-humaan IFN-γ capture-antilichaam verdund in 1 x PBS tot een eindconcentratie van 10 ug / ml. Bedek de platen met gewone plastic wrap en incubeer overnacht bij 4 ° C.
2. Blokkeerplaten
- Leeg de putten, tikken ze droog, en was platen 5 maal met 200 ul 1x PBS.
- Vul de putjes met 200 ul volledig RPMI 1640 medium platen en incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C (blokkeringsstap).
- Was de plaatjes 5x met 200 ul 1x PBS en houden de putten vol 1x PBS tot cellen zijn klaar om te worden verzilverd.
3. Cell Plating en stimulatie
- Bereid peripheral bloed mononucleaire cellen (PBMC) uit menselijk veneuze bloedmonsters door centrifugatie op Ficoll-Paque gradiënten volgens standaardprocedures. Ook toepassing van standaardmethoden, ontdooien aliquots van PBMC onder vloeibare stikstof bevroren. Na de laatste centrifugatie, resuspendeer cellen in een eindconcentratie van 2 x 10 6 cellen / ml en incubeer overnacht bij 37 ° C onder een 5% CO2 atmosfeer in een watermantel incubator.
- Verwijder PBMC uit de incubator en resuspendeer ze in een eindvolume van 5 ml compleet RPMI 1640 medium.
- Incubeer PBMC in de aanwezigheid van 10 pi van genetisch gemanipuleerde endonuclease uit Serratia marcescens gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
- Verwijder een 50 pl aliquot van PBMC en mengen met 50 pi van trypan blauw kleurstof. Tellen cellen en schatten% levensvatbaarheid met behulp van een hemocytometer en microscopisch onderzoek (dye uitsluiting methode). Diverse geautomatiseerde methoden voor het tellen van cellen en de beoordeling van de levensvatbaarheid van de cel kan alzodanig gebruikt. PBMC moet> 95% levend. Gooi monster wanneer de levensvatbaarheid van lager dan 95%.
- Centrifugeer PBMC bij 700 xg gedurende 5 min, gooi supernatant en resuspendeer cellen in AIM V-medium aangevuld met 2% (v / v) geïnactiveerd humaan serum (HIS) bij een eindconcentratie van 2 x 10 6 cellen / ml. Bewaren bij 37 ° C totdat stimulatie mengsels worden toegevoegd aan de plaat.
- Aan de putjes een druppelsgewijs 100 ul van de juiste stimulatie mengsel. Drie stimulatie mengsels worden gebruikt zoals hieronder beschreven:
- Gebruik AIM-V medium aangevuld met 2% (v / v) geïnactiveerd humaan serum (IHS) als negatieve controle.
- Met anti-CD3 monoklonaal antilichaam (kloon OKT3) verdund in AIM V-medium aangevuld met 2% (v / v) IHS tot een eindconcentratie van 0,5 ug / ml als positieve controle).
- Gebruik VZV-antigeen, in de vorm van hetzij γ-bestraalde (10.000 Gy, 30 min. belichtingstijd) levend verzwakt VZV-vaccin (1350 plaque-vormende eenheden [PFU] / ml) verdunningted 1:200 in AIM V-medium aangevuld met 2% (v / v) IHS) of 1 ug van een equimolair mengsel van 67 peptiden (15 aminozuurresten) gesynthetiseerd gebaseerd op de sequentie van het VZV onmiddellijk vroeg (IE63) fosfoproteïne . Controle bestraling werkzaamheid door monitoring van de afwezigheid van zichtbare cytopathische effecten na 4 dagen in PBMC kweken.
- Bereid alle putten in tweevoud.
- Aan de putjes een druppelsgewijs 100 ul cellen bereid in stap 5.4 tot de geschikte putjes. Twee putten moet worden overgelaten zonder cellen (negatieve controle). Incubeer 20 uur bij 37 ° C onder een 5% CO2 atmosfeer in een watermantel incubator. Niet schudden, verplaatsen, of stapelen de platen boven op elkaar tijdens incubatie.
4. Spot Ontwikkeling en Opsporing
- Gooi de cellen en was de platen 10x met 1x PBS aangevuld met 0,05% (v / v) Tween 20 (PBST). Tween 20 helpt los cellen die zijn toegetreden tot de PVDF mijmbrane na overnacht incubatie.
- Met een multichannel pipet 100 pi 0,5 mg / ml biotine geconjugeerd anti-IFN-γ monoklonaal antilichaam (kloon 4S.B3) verdund in 1 x PBS bevattende 0,5% (w / v) runderserumalbumine (BSA). Incubeer de platen gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Was de putjes 6x met PBST en voeg elk putje 100 ui streptavidine conjugatd met alkalische fosfatase verdund 1:1000 in 1 x PBS bevattende 0,5% (w / v) BSA. Bedek de plaat en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Was de plaatjes 3x met PBST en 3x met 1x PBS. Voeg 100 ul van een 5-broom-4-chloor-3-indolyl fosfaat (BCIP) / nitro blauw tetrazolium chloride (NBT) substraat oplossing en incubeer 5 min bij kamertemperatuur geroerd.
- Was de plaatjes onder stromend gedestilleerd water. Verwijder het onderste gedeelte van de ELISpot plaat en was beide zijden van het membraan met gedestilleerd water. Lucht drogen de platen.
- Onderzoek de putten en sommen de vlekken met behulp van een stereoscopische dissection microscoop of scan de platen met behulp van een geautomatiseerde spot tegen. Houd de platen uit de buurt van licht als ze niet kunnen worden onderzocht op dezelfde dag.
- Gemiddeld het aantal vlekken geteld overeenkomstige duplo putjes en aftrekken van het aantal spots meegeteld negatieve controle putjes (zonder cellen) van het aantal vlekken geteld in de test wells.
- Express IFN-γ productie het aantal ter eenheden (SFU) per 10 6 PBMC.
- Bedenk dat monsters positief als het aantal SFU is> 50 10 6 PBMC en 2 standaarddeviaties (SD) boven de negatieve controle (cellen + AIM-V medium aangevuld met 2% (v / v) IHS).
- Gebruik een waarde van 400 SFU per putje als vlekken zijn te talrijk om te tellen.
- Test of ELISpot gegevens normaal verdeeld zijn of niet met behulp van de Kolmogorov-Smirnov test. Wanneer de gegevens normaal verdeeld zijn, uit te voeren statistische vergelijkingen met behulp van Student's t test (2 groepen) of ANOVA en Bonferroni post-test (meerdere vergelijkingen). Als de gegevens niet normaal verdeeld zijn, gebruik maken van de Mann-Whitney U-test (2 groepen) of de Kruskal-Wallis-test en post-test Dunn's (meerdere vergelijkingen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De IFN-γ ELISPOT protocol hierboven beschreven werd ontwikkeld en geoptimaliseerd in ons laboratorium om de omvang en de kwaliteit van celgemedieerde immuunresponsen tegen VZV 4 meten. Diverse bronnen van VZV-antigeen kan worden gebruikt ter bevordering stap. Deze omvatten: a) de handel verkrijgbaar detergent geïnactiveerd uittreksels uit VZV geïnfecteerde Vero-cellen 18; b) pools van overlappende synthetische peptiden uit specifieke VZV gecodeerde eiwitten, waaronder IE63 15 en ORF4 19; c) levend verzwakt varicella zoster vaccin 20; en d) UV geïnactiveerd voorbereidingen van VZV antigenen uit de bovenstaande vloeistof van verstoorde VZV geïnfecteerde MRC cellen 14. In ons geval werden verdunningen van levend verzwakt vaccin VZV voorkeur boven celkweek verkregen VZV om de uniformiteit in antigeenbron en voorbereiding te verzekeren en om de cultuur en manipulatie van levende wildkleur VZV stammen beperken in een klinische setting waar nosocomiale transmission is een ernstig probleem 10. Bovendien werd γ bestraling voorkeur boven UV inactivatie 21 vanwege de vergelijkende nauwkeurigheid waarmee doses γ straling kan worden geleverd en omdat, in tegenstelling UV, γ-straling efficiënt dringen gesloten VZV bevattende flesjes. Bestraling van virale voorraden tot steeds hoger schattingen van de frequentie van VZV specifieke IFN-γ producerende cellen in PBMC verkregen uit een gezonde donor in alle verdunningen van VZV-antigeen getest (figuur 1). Dit is waarschijnlijk het gevolg van de beperking van cytopathische effecten veroorzaakt door levende, verzwakte VZV in celcultuur.
Om te bepalen welke verdunning VZV antigeen opgeleverd maximale uitlezing in termen van aantallen SFU per 10 6 PBMC werd IFN-γ ELISpot uitgevoerd met behulp van twee-voudige verdunningen van γ bestraald levend-verzwakt VZV vaccin en PBMC monsters verkregen van een groep van immuuncompetente kinderen leeftijd tussen 9 maanden en 12 years die een gedocumenteerde geschiedenis van varicella en / of een positieve serologie voor VZV (n = 50) had. . Proefpersonen werden ingeschreven op de Besmettelijke Ziekten Clinic en Speciale Immunologie Kliniek van CHU Sainte-Justine tussen juni 2007 en september 2009 werden statistisch significante verschillen waargenomen tussen mediaan frequenties van IFN-γ producerende cellen die werden verkregen met behulp van de 1:200, 1: 400 en 1:800 verdunningen van VZV-antigeen (p <0,0001, Kruskal-Wallis-test) (Figuur 2). Deze verschillen zijn toe te schrijven aan het verschil tussen de 1:200 verdunning (mediaan = 115,0 SFU per 10 6 PBMC; interkwartielbereik [IQR] = 75,0-232,5 SFU per 10 6 PBMC) en de 1:800 verdunning (mediaan = 50.0 SFU per 10 6 PBMC; IQR = 20,0-105,0 SFU per 10 6 PBMC), en tussen de 1:400 verdunning (mediaan = 92,5 SFU per 10 6 PBMC; IQR = 52,5-177,5 SFU per 10 6 PBMC) en 1:800 verdunning (p <0,001 en p (Figuur 2). Daarom de 1:200 verdunning van γ bestraald levend verzwakt VZV-vaccin voor gebruik bij routinemetingen van VZV specifieke celgemedieerde immuunresponsen.
Om te bepalen of IFN-γ productie verblijft in CD4 + en / of CD8 + T-lymfocyt subsets werden PBMC verkregen uit een gezonde donor onderworpen aan depletie van CD4 + of CD8 + cellen met anti-CD4 of anti-CD8 antilichaam gekoppelde magnetische korrels volgens de instructies van de fabrikant. In overeenstemming met eerder gepubliceerde rapporten 22,23, depletie van CD4 +-cellen resulteerde in een opvallende vermindering van de frequentie van IFN-γ producerende cellen die werden verkregen met de 1:100, 1:200 en 1:400 verdunningen van VZV-antigeen, terwijl depletie van CD8 + cellen niet tot een dergelijke vermindering en positieve controless (stimulatie met anti-CD3 monoklonaal antilichaam) werden niet beïnvloed gelijk (figuur 3). Deze resultaten suggereren dat de meeste cellen die IFN-γ in reactie op stimulatie met VZV-antigenen CD4 + T-cellen. Als alternatief zou deze resultaten voortkomen uit uitputting van CD4 + antigeen presenterende cellen (dwz monocyten, dendritische cellen) van de PBMC zwembad, wat leidt tot een vermindering van de presentatie van VZV antigenen aan CD8 + T-lymfocyten responder. Het gebruik van bestraalde VZV waarschijnlijk hebben bijgedragen aan het scheeftrekken van de reactie ten aanzien CD4 dominantie, werden gelijkaardige resultaten verkregen met andere groepen met verschillende technieken en antigeen bronnen 14,21,22. Een lage vergroting microfoto van representatieve ELISPOT putten is weergegeven in figuur 4.
| Probleem / issue | Mogelijke oorzaken | Oplossing / oplossing </ Td> |
| Hoge achtergrond / Slecht gedefinieerde of samenvloeiing plekken | Hoge aantallen dode cellen. | Beoordelen levensvatbaarheid van de cellen voor cultuur opzet en stimulatie. |
| Onvoldoende membraan pre-wetting stappen. | Zorg ervoor dat u voorbevochtiging tijd en dat membraan beurt respecteren tot grijs na 1 minuut. 35% ethanol onmiddellijk vóór gebruik worden bereid. | |
| Borden verplaatst tijdens de incubatieperiode. | Heeft platen niet naar slecht gedefinieerde snail trail vlekken te vermijden. | |
| Was stappen. | Handwas is efficiënter dan plaat ringen. | |
| Vorming van eiwitcomplexen. | Filter zowel capture en detectie antilichamen tegen de achtergrond en vals-positieve vlekken te verminderen. | |
| Secundaire en detectie concentratie antilichaam. | Pas gebiotinyleerde seconcentratie condary / detectieantilichaam voor de achtergrond te verminderen. | |
| Cold ontwikkelen reagentia. | Breng substraat op kamertemperatuur onderontwikkeling te voorkomen. | |
| Geen vlekken / Blank putten | Slecht gedefinieerd vlekken. | Heeft platen niet stapelen tijdens incubatietijd om een homogene temperatuur in de verschillende putten. |
| Stimulatie ondergrond niet goed voorbereid. | Breng het peptidemengsel monster tot kamertemperatuur gedurende 15 min om kristalvorming te voorkomen. | |
| Cel klonteren. | Resuspendeer cellen in single-celsuspensie tot onderschatting van spotvormende eenheden voorkomen. | |
| Cellen niet adequaat gestimuleerd. | Gebruik een polyklonale activator als positieve controle. | |
| Remming van enzymreactie door tween-20. | Wash platen met PBS voor het toevoegen van BCIP / NBT substraatoplossing. | |
| Verkeerde antilichaam paren. | Zorg ervoor dat het vangen en detectie antilichamen reageren met verschillende antigene epitopen. |
Tabel 1. Andere problemen oplossen.
Figuur 1. Effect van γ-straling van levende geïnactiveerd VZV entstof op de frequentie van IFN-γ producerende cellen bepaald met IFN-γ ELISPOT. VZV specifieke IFN-γ ELISPOT werd uitgevoerd zoals beschreven in protocol tekst met PBMC van controle vrijwilliger seriële verdunningen van γ bestraalde (10.000 Gy) levend verzwakt vaccin VZV als antigeen. Gegevens stellen het gemiddelde van duplicaat metegen en error bars geven de standaardafwijking van het gemiddelde. PBMC: perifere mononucleaire cellen; SFU: spot vormende eenheden; VZV: varicella zoster-virus.
Figuur 2. Kwantificering van VZV specifieke cel gemedieerde immuunrespons bij kinderen met een gedocumenteerd bewijs van eerdere infectie met VZV. VZV-specifieke IFN γ ELISpot werd uitgevoerd zoals beschreven onder Protocol tekst met behulp van PBMC geïsoleerd uit patiënten met een voorgeschiedenis van varicella (n = 50) en seriële verdunningen van γ bestraalde (10.000 Gy) levend verzwakt vaccin VZV als antigeen. Horizontale lijnen geven de mediaan, dozen vertegenwoordigen interkwartielafstand (IQR), en snorharen vertegenwoordigen het bereik van waarden. PBMC: perifere mononucleaire cellen; SFU: spot vormende eenheden; VZV: varicella zoster-virus .
Figuur 3. Effect van uitputting van CD4 + of CD8 + cellen op de frequentie van IFN-γ producerende cellen zoals gemeten middels IFN-γ ELISPOT. Depletie van CD4 + of CD8 + cellen en VZV specifieke IFN-γ ELISPOT werden uitgevoerd zoals beschreven onder Protocol tekst met behulp van PBMC van een controle-vrijwilliger en seriële verdunningen van γ bestraalde (10.000 Gy) levend verzwakt vaccin VZV als antigeen. Gegevens stellen het gemiddelde van duplo's en de foutbalken geven de standaardfout van het gemiddelde. PBMC: perifere mononucleaire cellen; SFU: spot vormende eenheden; VZV: varicella zoster-virus.
load/51643/51643fig4highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51643/51643fig4.jpg "/>
Figuur 4. Representatieve ELISpot putjes. VZV specifieke IFN-γ ELISPOT werd uitgevoerd zoals beschreven in protocol tekst met PBMC van vijf controle vrijwilligers en seriële verdunningen van γ bestraalde (10.000 Gy) levend verzwakt VZV-vaccin antigen. Eerste rij: negatieve controles (AIM-V medium aangevuld met 2% (v / v) IHS); tweede rij: positieve controles (anti-CD3 monoklonaal antilichaam); derde rij: VZV-antigeen. Nummers in de bovenhoeken vertegenwoordigen SFU per evenals gemeten met behulp van een geautomatiseerde spot tegen. PBMC: perifere mononucleaire cellen; SFU: spot vormende eenheden; VZV: varicella zoster-virus; IHS: geïnactiveerd humaan serum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wijzigingen en probleemoplossing: IFN-γ ELISPOT-tests werden gebruikt om celgemedieerde immuunresponsen tegen een verscheidenheid van microbiële pathogenen, waaronder humaan immunodeficiëntievirus type 1 (HIV-1) 24,25, hepatitis C virus (HCV) 26 onderzocht, 27, en Mycobacterium tuberculosis 28,29, om er maar een paar te noemen. Hier beschrijven we de ontwikkeling van een IFN-γ ELISpot test om cellulaire immuniteit tegen te meten, met de hoop van het definiëren van correlaten van VZV specifieke immuunreconstitutie bij het terugvinden van pediatrische UCBT ontvangers.
Belangrijke kenmerken van deze test viervoudig. Ten eerste is het niet vooraf in vitro expansie van T-cellen, hetgeen tijdrovend vereist. Anderzijds kan worden uitgevoerd middels gecryopreserveerd PBMC monsters, die best interassay variabiliteit te minimaliseren. Daarnaast worden cryopreservatie en parallelle verwerking goed aangepast aan lengterichtingnale studies, die eisen dat een monster in batches worden verwerkt. Ten derde, naar cel klonteren die tijdens het ontdooien van PBMC, behandeling met een ultrapuur genetisch gemanipuleerde endonuclease van Serratia marcescens werd gebruikt te voorkomen. Cel klonteren bij het ontdooien PBMC komt vaker voor bij gebruik van bloedmonsters die 's nachts worden achtergelaten bij kamertemperatuur vóór verwerking. De opname van genetisch gemanipuleerde endonuclease uit Serratia marcescens bekend cellevensvatbaarheid expressie van celoppervlak markers en respons op stimulatie met verwant antigeen niet worden beïnvloed in termen van SFU aangezien lage nuclease gebruikt en de blootstellingsduur korte 22. Ten vierde, γ bestraald levend verzwakt VZV-vaccin werd gebruikt om PBMC te stimuleren. Het werd voorkeur boven celkweek verkregen VZV om de uniformiteit in antigendosis en voorbereiding verzekeren en de noodzaak voor het manipuleren van levende VZV in een klinische omgeving waar de veiligheid van de patiënten en overwinnenlaboratoriumpersoneel is een grote zorg. Samengevat, werden de modificaties dat de VZV-ELISPOT geïntroduceerd doel het beter aangepast voor gebruik in een klinische omgeving.
Beperkingen van de techniek betekenis voor bestaande methoden: Eenvoudige, gevoelige en reproduceerbare zijn vereist om gastheercel gemedieerde immuunreacties tegen microbiële antigenen in de context van klinische follow meten. IFN-γ ELISpot is een robuuste, reproduceerbare en informatieve test die kan worden uitgevoerd op veneuze bloedmonsters met relatief low-tech apparatuur (centrifuges, incubators, dissectie microscoop). Dit betekent echter niet gemakkelijk mogelijk gelijktijdige detectie van meerdere cytokinen en celoppervlakte markers. Traditionele in vitro T-cel proliferatie assays die klassiek zijn gebruikt voor de telling van CD4 + en CD8 + antigeen specifiekc T-cel responsen, zijn arbeidsintensief, gebrek aan gevoeligheid en hebben de neiging te lijden aan een hoge mate van variabiliteit interassay 30,31. Anderzijds, cytotoxische T lymfocyt assays (CTL) gebaseerd op de lysis van autologe doelen geladen met 51 Cr en beperkende verdunning analyse vaak afhankelijk tijdrovende stappen in vitro uitbreiding van antigeen-specifieke CD8 + T-cellen die aanwezig zijn in een kwantificeren lage voorloper frequenties 32,33. Flowcytometrie gebaseerde testen die cytokine secretie te meten na antigene stimulatie (intracellulaire cytokine kleuring [ICS]) 34,35 kan ook gebruikt worden om antigeen-specifieke immuunresponsen te karakteriseren. ICS maakt de gelijktijdige detectie van cytokineproductie en celoppervlak expressie van fenotypische merkers in enkele cellen. De gevoeligheid van ICS vergeleken met die van ELISPOT, maar grotere aantallen cellen 36,37 vereist. Methoden die gebruik van fluorescerende klasse I of klasse II peptide-ma te makenjor histocompatibiliteitscomplex (pMHC) oligomeren (pMHC tetramers) 38-40 zijn nauwkeurig en staat Multiparametrische karakterisering van lymfocyten op basis van expressie van celoppervlaktemerkers. Echter, pMHC tetrameer kleuring vereist voorkennis van de patiënten 'menselijk leukocyt antigen (HLA) type, die lastig kan zijn en beperken patiënt inschrijving in een bepaalde studie. Een andere beperking van deze techniek is dat pMHC tetrameer kleuring kan hoofdzakelijk de detectie van T-cellen die gemiddelde tot hoge affiniteit T-celreceptoren (TCR) 41. Anderzijds, kunnen CD8 + T-cellen die lage affiniteit TCR die niet gekleurd door pMHC tetrameren gemakkelijk worden gedetecteerd met IFN-γ ELISpot 41. Bovendien kunnen pMHC tetrameren binden aan zogenaamde uitgeputte CD8 + T-lymfocyten die heersen bij chronische virale infecties 42,43, waardoor de functionele beoordeling antigeenspecifieke celgemedieerde immuunresponsen scheeftrekken. Finally, pMHC tetrameer kleuring en ICS vergen doorgaans hoog opgeleid personeel, relatief dure reagentia, geavanceerde instrumenten en gespecialiseerde voorzieningen, waardoor deze technieken notoir moeilijk te implementeren in een klinische follow-up setting.
Toekomstige toepassingen: Dual kleur ELISpot assays kan tegelijkertijd detecteren van de productie van zowel IFN-γ en IL-2 44 en dual-en triple-kleur fluorospot methoden 45 significant belang hebben gegenereerd, als zij toestaan dat specifieke beoordeling van de polyfunctionality van antigeen T lymfocyten, hetgeen een belangrijk kenmerk van een efficiënte cel-gemedieerde immuunresponsen 46.
Kritische stappen in het protocol: aanvullende technische problemen moeten worden overwogen. Omdat veel variabelen spot kwaliteit (dwz de grootte en dichtheid) en gevoelloos invloed kunneneh, de naleving van het protocol is essentieel om gevoelige en reproduceerbare resultaten te verkrijgen. Het consequente gebruik van specifieke merken van monoklonale antilichamen (capture en detectie), ELISpot platen met PVDF-membranen, en 35% ethanol voor membraan behandeling voorafgaand aan de coating is van groot belang. Zo kunnen overtreatment met ethanol de uitvoering van de test en spotkwaliteit beïnvloeden. Tot het verkrijgen van nietszeggende putten (dwz> 300 plekken) te voorkomen, raden wij u aan niet meer dan 2 x 10 5 PBMC per well. Wanneer we geconfronteerd worden met een lage frequenties van antigeen-specifieke T-cellen, kan assaygevoeligheid worden versterkt door prestimulating cellen in vitro met verwant antigeen of breiden ze met polyklonale activatoren zoals fytohemagglutinine (PHA) voor een bepaalde periode (meestal 3-7 dagen) 38 . Echter, de uiteindelijke geoptimaliseerde procedure voor VZV ELISPOT hierin vermelde niet op in vitro prestimulation en / of stappen expansie. Aantal en quality spots waren vergelijkbaar over een incubatie bereik van 16-21 uur. Beyond 21 uur incubatie, vlekken waren vaak meer diffuus en soms overlappende, het maken van hun opsomming moeilijker. Bovendien bewegen de platen terwijl de cellen incuberen kan leiden tot slecht gedefinieerde slak sleep plekken die ook moeilijker te tellen. Extra aanwijzingen voor probleemoplossing zijn weergegeven in Tabel 1.
Bij gebruik van een geautomatiseerde spot tegen, gevoeligheid en puntgrootte gating worden ingesteld met positieve controle (anti-CD3 monoklonaal antilichaam) en negatieve controle (AIM-V medium aangevuld met 2% (v / v) IHS). De belangrijkste kenmerken om te overwegen tijdens plek opsomming zijn grootte en vorm (figuur 4). De eerstgenoemde kan een T-cel afgeleide cytokinen spots onderscheiden vlekken achtergrond die moeten worden genegeerd. Spot nummer geeft een schatting van de frequentie van de VZV-specifieke T-cellen aanwezig in een bepaalde PBMC steekproef terwijl vlekgrootte geeft hoeveel IFN-γ geproduceerd door elke individuele cellen.
Bij ons weten is dit de enige IFN-γ ELISPOT methode die gebruik γ levend verzwakt VZV bestraald vaccin antigen 4 maakt. Panelen van overlappende synthetische peptiden (15-meren) zijn ook gebruikt als antigeen, zoals mengsel van peptiden gebaseerd op de aminozuursequentie van het VZV IE63 fosfoproteïne. IE63 zeer immunogeen is 47 en lijkt cruciaal voor virale infectiviteit en de vaststelling van latentie 48 zijn. IE63 specifieke T cellen waargenomen bij gezonde VZV seropositieve donoren 15, wat suggereert dat IE63 is een belangrijke doelstelling van celgemedieerde immuniteit tegen VZV. Echter, reactieve cellen bleken voornamelijk CD4 + T-cellen 15 zijn.
De VZV IFN-γ ELISpot test werd eerder door o gebruiktur groep om de VZV-specifieke T-cel responsen te beoordelen in 28 kinderen die UCBT onderging om neoplastische of erfelijke bloedziekten 4 behandelen. Resultaten die werden verkregen in de loop van deze studie suggereerde dat zowel CD4 + en CD8 + T cel subsets werden betrokken bij IFN-γ productie en reconstitutie van de naïeve CD8 + T cel compartiment tot robuustere VZV specifieke celgemedieerde immuunresponsen in termen van IFN-γ productie. Belangrijk is dat deze resultaten toonden ook aan dat de detectie van meer dan 150 SFU per 10 6 PBMC was consistent met T cel gemedieerde bescherming tegen VZV infectie of reactivatie 4. Echter, deze drempelwaarde voor VZV specifieke cel gemedieerde immuniteit in het kader van UCBT en daaruit voortvloeiende immuunreconstitutie of het gebrek daaraan zal moeten worden gevalideerd in grotere prospectieve multicenter studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
De auteurs willen studie deelnemers en hun ouders bedanken. Wij zouden ook graag Dr Rejean Lapointe (CHUM Notre-Dame, Montreal, Canada) bedanken voor toegang tot zijn ELISpot lezer, Dr Lubo Alexandrov voor statistische analyse, en Denis Blais, Sandra Caron, Silvie Valois en Martine Caty voor deskundige technische bijstand. Ondersteund door subsidies van le Fonds d'operation pour les projets de recherche clinique et d'Evaluatie des technologieën (CHU Sainte-Justine) aan GS en PO, door la Fondation Centre de cancérologie Charles-Bruneau, en door de Leukemia & Lymphoma Society of Canada. ISF werd ondersteund door beurzen van la Fondation CHU Sainte-Justine en le Fonds de la recherche du Quebec-sante (FRQS). AJG was de ontvanger van beurzen van de afdeling Microbiologie, infectiologie & Immunologie, Universite de Montreal (Gabriel-Marquis Scholarship), FRQS, en de Canadese Institutes of Health Rnderzoek (CIHR). NM werd ondersteund door la Fondation CHU Sainte-Justine, de Cole Foundation, en FRQS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leucocep tube | VWR | 89048-936/89048-932 | 12 ml or 50 ml tubes may be used depending on the volume of blood. |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-1440-02 | Protect from light. |
| Benzonase nuclease | Novagen | 70746-3 | Keep at -20 °C. |
| MultiScreenHTS-IP Filter Plate | Millipore | MSIPS4W10 | Sterile with pore size of 0.45 µm. |
| Mouse anti-human IFN-γ capture antibody | BD Biosciences | 551221 | NIB42 clone. |
| Pepmix VZV IE63 | JPT Peptide Technologies | PM-VZV-IE63 | Dissolve contents of one vial in 40 μl of DMSO. Use within 6 months. |
| Biotin-conjugated anti-IFN-γ monoclonal antibody | BD Biosciences | 554550 | 4SB3 clone. |
| Streptavidin conjugated with alkaline phosphatase | Bio-Rad Life Science | 170-3554 | Dilute for use on the same day. |
| BCIP/NBT | Bio-Rad Life Science | 170-6432 | Protect from light. |
References
- Ballen, K. K., et al. Umbilical cord blood transplantation: the first 25 years and beyond. Blood. 122 (4), 491-498 (2013).
- Vandenbosch, K., et al. Varicella-zoster virus disease is more frequent after cord blood than after bone marrow transplantation. Biol. Blood Marrow Transplant. 14 (8), 867-871 (2008).
- Barker, J. N., et al. Serious infections after unrelated donor transplantation in 136 children: impact of stem cell source. Biol. Blood Marrow Transplant. 11 (5), 362-370 (2005).
- Merindol, N., et al. Reconstitution of protective immune responses against cytomegalovirus and varicella zoster virus does not require disease development in pediatric recipients of umbilical cord blood transplantation. J. Immunol. 189 (10), 5016-5028 (2012).
- Feldman, S., et al. Varicella in children with cancer: Seventy-seven cases. Pediatrics. 56 (3), 388-397 (1975).
- Arvin, A. M. Varicella-Zoster virus: pathogenesis, immunity, and clinical management in hematopoietic cell transplant recipients. Biol. Blood Marrow Transplant. 6 (3), 219-230 (2000).
- Wiegering, V., et al. Varicella-zoster virus infections in immunocompromised patients - a single centre 6-years analysis. BMC Pediatr. 11, 31 (2011).
- Boeckh, M., et al. Long-term acyclovir for prevention of varicella zoster virus disease after allogeneic hematopoietic cell transplantation--a randomized double-blind placebo-controlled study. Blood. 107 (5), 1800-1805 (2006).
- Boeckh, M. Prevention of VZV infection in immunosuppressed patients using antiviral agents. Herpes. 13 (3), 60-65 (2006).
- Tomblyn, M., et al. Guidelines for preventing infectious complications among hematopoietic cell transplantation recipients: a global perspective. Biol. Blood Marrow Transplant. 15 (10), 1143-1238 (2009).
- Ljungman, P., et al. Long-term acyclovir prophylaxis in bone marrow transplant recipients and lymphocyte proliferation responses to herpes virus antigens in vitro. Bone Marrow Transplant. 1 (2), 185-192 (1986).
- Selby, P. J., et al. The prophylactic role of intravenous and long-term oral acyclovir after allogeneic bone marrow transplantation. Br. J. Cancer. 59 (3), 434-438 (1989).
- Distler, E., et al. Recovery of varicella-zoster virus-specific T cell immunity after T cell-depleted allogeneic transplantation requires symptomatic virus reactivation. Biol. Blood Marrow Transplant. 14 (12), 1417-1424 (2008).
- Levin, M. J., et al. Decline in varicella-zoster virus (VZV)-specific cell-mediated immunity with increasing age and boosting with a high-dose VZV vaccine. J. Infect. Dis. 188 (9), 1336-1344 (2003).
- Jones, L., et al. Phenotypic analysis of human CD4+ T cells specific for immediate-early 63 protein of varicella-zoster virus. Eur. J. Immunol. 37 (12), 3393-3403 (2007).
- Czerkinsky, C., et al. Reverse ELISPOT assay for clonal analysis of cytokine production. I. Enumeration of gamma-interferon-secreting cells. J. Immunol. Methods. 110 (1), 29-36 (1988).
- Hutchings, P. R., et al. The detection and enumeration of cytokine-secreting cells in mice and man and the clinical application of these assays. J. Immunol. Methods. 120 (1), 1-8 (1989).
- De Castro, N., et al. Varicella-zoster virus-specific cell-mediated immune responses in HIV-infected adults. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 27 (10), 1089-1097 (2011).
- Jones, L., et al. Persistent high frequencies of varicella-zoster virus ORF4 protein-specific CD4+ T cells after primary infection. J. Virol. 80 (19), 9772-9778 (2006).
- Malavige, G. N., et al. Viral load, clinical disease severity and cellular immune responses in primary varicella zoster virus infection in Sri Lanka. PLoS One. 3 (11), (2008).
- Sadaoka, K., et al. Measurement of varicella-zoster virus (VZV)-specific cell-mediated immunity: comparison between VZV skin test and interferon-gamma enzyme-linked immunospot assay. J. Infect. Dis. 198 (9), 1327-1333 (2008).
- Smith, J. G., et al. Development and validation of a gamma interferon ELISPOT assay for quantitation of cellular immune responses to varicella-zoster virus. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 8 (5), 871-879 (2001).
- Ouwendijk, W. J., et al. T-cell immunity to human alphaherpesviruses. Curr. Opin. Virol. 3 (4), 452-460 (2013).
- Rowland-Jones, S. L., et al. Cytotoxic T cell responses to multiple conserved HIV epitopes in HIV-resistant prostitutes in Nairobi. J. Clin. Invest. 102 (9), 1758-1765 (1998).
- Alter, G., et al. Human immunodeficiency virus (HIV)-specific effector CD8 T cell activity in patients with primary HIV infection. J. Infect. Dis. 185 (6), 755-765 (2002).
- Lechner, F., et al. Analysis of successful immune responses in persons infected with hepatitis C virus. J. Exp. Med. 191 (9), 1499-1512 (2000).
- Fournillier, A., et al. A heterologous prime/boost vaccination strategy enhances the immunogenicity of therapeutic vaccines for hepatitis C virus. J. Infect. Dis. 208 (6), 1008-1019 (2013).
- Adetifa, I. M., et al. Interferon-γ ELISPOT as a biomarker of treatment efficacy in latent tuberculosis infection: a clinical trial. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 187 (4), 439-445 (2013).
- Lalvani, A., Pareek, M. A 100 year update on diagnosis of tuberculosis infection. Br. Med. Bull. 93, 69-84 (2010).
- Berger, R., et al. A dose-response study of a live attenuated varicella-zoster virus (Oka strain) vaccine administered to adults 55 years of age and older. J. Infect. Dis. 178 Suppl. 1, (1998).
- Trannoy, E., et al. Vaccination of immunocompetent elderly subjects with a live attenuated Oka strain of varicella zoster virus: a randomized, controlled, dose-response trial. Vaccine. 18 (16), 1700-1706 (2000).
- Brunner, K. T., et al. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).
- Moretta, A., et al. Quantitative assessment of the pool size and subset distribution of cytolytic T lymphocytes within human resting or alloactivated peripheral blood T cell populations. J. Exp. Med. 158 (2), 571-585 (1983).
- Jung, T., et al. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 159 (1-2), 197-207 (1993).
- Maecker, H. T., et al. Standardization of cytokine flow cytometry assays. BMC Immunol. 6, 13 (2005).
- Nomura, L., et al. Standardization and optimization of multiparameter intracellular cytokine staining. Cytometry A. 73 (11), 984-991 (2008).
- Letsch, A., Scheibenbogen, C. Quantification and characterization of specific T-cells by antigen-specific cytokine production using ELISPOT assay or intracellular cytokine staining. Methods. 31 (2), 143-149 (2003).
- Merindol, N., et al. Umbilical cord blood T cells respond against the Melan-A/MART-1 tumor antigen and exhibit reduced alloreactivity as compared with adult blood-derived T cells. J. Immunol. 185 (2), 856-866 (2010).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Scriba, T. J., et al. Ultrasensitive detection and phenotyping of CD4+ T cells with optimized HLA class II tetramer staining. J. Immunol. 175 (10), 6334-6343 (2005).
- Stone, J. D., et al. Interaction of streptavidin-based peptide-MHC oligomers (tetramers) with cell-surface TCRs. J. Immunol. 187 (12), 6281-6290 (2011).
- Pantaleo, G., et al. Evidence for rapid disappearance of initially expanded HIV-specific CD8+ T cell clones during primary HIV infection. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 94 (18), 9848-9853 (1997).
- Wherry, E. J. T cell exhaustion. Nat. Immunol. 12 (6), 492-499 (2011).
- Boulet, S., et al. A dual color ELISPOT method for the simultaneous detection of IL-2 and IFN-gamma HIV-specific immune responses. J. Immunol. Methods. 320 (1-2), 18-29 (2007).
- Ahlborg, N., Axelsson, B. Dual- and triple-color fluorospot. Methods Mol. Biol. 792, 77-85 (2012).
- Precopio, M. L., et al. Immunization with vaccinia virus induces polyfunctional and phenotypically distinctive CD8(+) T cell responses. J. Exp. Med. 204 (6), 405-1416 (2007).
- Sadzot-Delvaux, C., et al. Recognition of the latency-associated immediate early protein IE63 of varicella-zoster virus by human memory T lymphocytes. J. Immunol. 159 (6), 2802-2806 (1997).
- Malavige, G. N., et al. IE63-specific T-cell responses associate with control of subclinical varicella zoster virus reactivation in individuals with malignancies. Br. J. Cancer. 102 (4), 727-730 (2010).
