Summary
Générations nouveaux de dosages fonctionnels, tels que l'interféron gamma (IFN-γ) ELISpot, qui détecte la production de cytokines au niveau de la cellule unique et fournissent à la fois la caractérisation quantitative et qualitative des réponses des cellules T peuvent être utilisés pour évaluer les réponses immunitaires à médiation cellulaire dirigées contre la varicelle zoster virus (VZV).
Abstract
Virus varicelle-zona (VZV) est une cause importante de morbidité et de mortalité à la suite ombilical transplantation de sang de cordon (UCBT). Pour cette raison, la prophylaxie anti-herpétique est administré systématiquement aux bénéficiaires UCBT pédiatriques pour prévenir les complications associées à l'infection VZV, mais il n'existe aucune preuve fondée sur le consensus solide, qui définit sa durée optimale. Parce T immunité à médiation cellulaire est responsable du contrôle de l'infection VZV, l'évaluation de la reconstitution des réponses des lymphocytes T spécifiques de VZV suivante UCBT pourrait fournir des indications quant à la prophylaxie doivent être maintenues ou peuvent être interrompues. A cette fin, un interféron gamma spécifique VZV (IFN-γ) immunospot lié à une enzyme (ELISPOT) a été développée pour caractériser la production d'IFN-γ par les lymphocytes T en réponse à une stimulation in vitro avec le vaccin contre VZV vivant atténué irradié. Ce test fournit une mesure rapide, reproductible et sensible du VZV c spécifiqueell immunité approprié pour la surveillance de la reconstitution de l'immunité spécifique VZV dans un environnement clinique et d'évaluation de la réponse immunitaire aux antigènes de VZV médiation.
Introduction
Tout d'abord effectuée en 1989, UCBT est de plus en plus utilisé dans le cadre du traitement de différentes maladies du sang néoplasiques et non néoplasiques chez les enfants de 1. Le VZV est un alphaherpèsvirus humaine cytopathique qui provoque deux maladies différentes, la varicelle (après l'infection primaire) et l'herpès zoster (après réactivation). Après l'infection primaire, le VZV persiste tout au long de la vie de l'hôte à l'abri dans les nerfs sensoriels de ganglions rachidiens. Une des complications infectieuses les plus menaçants suivants UCBT est associé à VZV 2-4. Dans notre centre clinique, en l'absence de prophylaxie VZV, l'incidence cumulative de la maladie VZV maladie de VZV à 3 ans était de 46% postUCBT 2. Chez ces patients, l'infection de novo avec ou réactivation du VZV est souvent associée à la diffusion viscérale pour le système nerveux central, les poumons et le foie 5-7. En prophylaxie résultat, l'acyclovir, le valacyclovir ou le famciclovir est couramment administré à UBBénéficiaires CT 8,9. Cependant, cette stratégie de traitement ne prend pas en compte le potentiel de protection de lymphocytes T spécifiques de VZV ou la cinétique de reconstitution des réponses des lymphocytes T spécifiques de VZV. Problèmes potentiels liés à l'utilisation croissante de la prophylaxie anti-herpétiques à long terme comprennent a) surtraitement patient; b) le développement de la résistance aux antiviraux 10,11; et c) la dégradation du VZV reconstitution immunitaire spécifique 12,13. Parce que la détection des lymphocytes T spécifiques fonctionnels VZV est en corrélation avec la présence d'une protection à long terme de l'infection VZV et l'amélioration de l'issue clinique 4,14,15, le suivi des réponses immunitaires à médiation cellulaire dirigée contre le VZV pendant la période post-transplantation pourrait aboutir à une utilisation plus rationnelle des médicaments antiviraux traitement en permettant aux médecins de distinguer les patients qui pourraient bénéficier de la prophylaxie VZV de celles dont le système immunitaire est capable de contrôler la réplication du VZV 4,13.
Le test ELISPOT IFN-γ est largement utilisé pour les réponses immunitaires médiées par des cellules de contrôle dans une variété de systèmes expérimentaux et les conditions cliniques. Taches sont générées suivant le clivage d'un substrat chromogène, la génération d'un précipité visible et stable au niveau du site de la réaction. Chaque spot individu représente ainsi l'empreinte d'une cellule de cytokine production individuelle. IFN-γ ELISpot non seulement mesure la capacité des cellules individuelles ex vivo pour produire de l'IFN-γ en réponse à une stimulation in vitro avec l'antigène apparenté, mais il fournit également une estimation de la fréquence de la réponse des cellules dans une population cellulaire donnée 16,17. En plus de sa grande sensibilité, l'IFN-γ ELISpot est simple à effectuer, ce qui rend son utilisation possible dans le cadre de protocoles cliniques personnalisés destinés à guider l'initiation ou l'arrêt du traitement antiviral. La procédure décrite ci-dessous décrivantes un test ELISpot qui est spécifiquement conçu pour détecter et mesurer la production d'IFN-γ par les cellules mononucléaires du sang périphérique après stimulation in vitro avec des antigènes dérivés du VZV.
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Protocol
Ce protocole de recherche a été approuvé par le Conseil du CHU Sainte-Justine, Montréal, Québec, Canada, où l'étude a été menée institutionnelle d'évaluation éthique. Le consentement éclairé a été demandé et obtenu de tous les participants à l'étude, leurs parents ou tuteurs légaux. Toutes les procédures effectuées aux jours 1 et 2 doivent être effectuées dans des conditions stériles (c'est à dire sous une hotte à flux laminaire). Les procédures de sécurité standard pour la manipulation du sang humain doivent être strictement respectées.
1. Revêtement des plaques
- Perméabiliser le polyfluorure de vinylidène (PVDF) des membranes en bas de 96 puits MultiScreen IP plaques ELISpot blanc en ajoutant à chaque puits 20 ul d'éthanol à 35% pendant 1 min. Membranes devraient être légèrement translucide.
- Laver immédiatement les puits 3 fois avec 200 pi de 1x tampon phosphate salin (PBS; mM NaCl 137 mM, KCl 2,7, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, pH 7,4) en utilisant un multichannel pipette ou un dispositif similaire. Cette étape est essentielle dans la mesure où les résidus d'éthanol peuvent affecter la viabilité des cellules et la liaison de l'anticorps de capture. Plaques ELISpot sont fragiles et doivent être manipulés avec soin: l'utilisation d'un laveur de plaques automatique n'est pas recommandée.
- Enduire les puits avec 10 pi de souris purifié anticorps de capture d'IFN-γ d'anti-humaine diluée dans 1 x PBS à une concentration finale de 10 pg / ml. Couvrir les plaques avec une pellicule de plastique ordinaire et incuber une nuit à 4 ° C.
2. Plaques de blocage
- Vider les puits, en tapant les sécher et laver les plaques 5 fois avec 200 pi de PBS 1x.
- Remplir les puits avec 200 pi de milieu RPMI 1640 complet et incuber les plaques pendant 2 heures à 37 ° C (étape de blocage).
- Laver les plaques 5x avec 200 pi de PBS 1x et gardent les puits plein de 1x PBS jusqu'à ce que les cellules sont prêtes à être plaqué.
3. Cellule de placage et de stimulation
- Préparer peripheral cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) à partir d'échantillons de sang veineux humain par centrifugation sur des gradients de Ficoll-Paque à l'aide de procédures standard. Sinon, en utilisant des méthodes standards, décongeler aliquotes de PBMC congelés dans l'azote liquide. Après centrifugation, les derniers, remettre les cellules à une concentration finale de 2 x 10 6 cellules / ml et incuber une nuit à 37 ° C sous une atmosphère de CO2 à 5% dans un incubateur à chemise d'eau.
- Retirer les PBMC de l'incubateur et de les remettre en suspension dans un volume final de 5 ml de milieu RPMI 1640 complet.
- Incuber les PBMC en présence de 10 ul de l'endonucléase de génie génétique à partir de Serratia marcescens pendant 5 min à température ambiante.
- Supprimer une aliquote de 50 ul de PBMC et mélanger avec 50 pi de colorant bleu trypan. Compter les cellules et estimer% de viabilité en utilisant un hématimètre et l'examen microscopique (méthode d'exclusion de colorant). Divers procédés automatisés pour le comptage des cellules et l'évaluation de la viabilité des cellules can aldonc être utilisé. PBMC doit être> 95% viable. Jeter l'échantillon lorsque la viabilité est inférieure à 95%.
- Centrifugeuse PBMC à 700 xg pendant 5 minutes, jeter le surnageant et remettre les cellules dans du milieu AIM-V supplémenté avec 2% (v / v) de sérum humain inactivé (HIS) à une concentration finale de 2 x 10 6 cellules / ml. Maintenir à 37 ° C jusqu'à ce que des mélanges de stimulation sont ajoutés à la plaque.
- Ajouter dans les puits, une goutte à la fois, 100 ul du mélange de stimulation approprié. Trois mélanges de stimulation doivent être utilisées comme décrit ci-dessous:
- Utilisez milieu AIM-V complété avec 2% (v / v) de sérum humain inactivé (IHS) de contrôle négatif.
- Utilisation d'anticorps monoclonal anti-CD3 (OKT3 clone) dilué dans du milieu AIM-V supplémenté avec 2% (v / v) IHS à une concentration finale de 0,5 ug / ml comme contrôle positif).
- Utilisez antigène VZV, sous la forme soit de γ-irradiés (10000 Gy; 30 min d'exposition) vaccin vivant atténué VZV (unités formant plaque 1350 [UFP] / ml) de dilutionted 1:200 dans du milieu AIM-V supplémenté avec 2% (v / v) IHS) ou 1 ug d'un mélange équimolaire de 67 peptides (15 résidus d'acides aminés) synthétisé sur la base de la séquence du VZV immédiatement précoce (IE63) phosphoprotéine . Contrôler l'irradiation efficacité en surveillant l'absence de signes visibles d'effets cytopathiques après 4 jours dans les cultures de CMSP.
- Préparer tous les puits en double.
- Ajouter dans les puits, une goutte à la fois, à 100 ul de cellules préparées à l'étape 5.4 dans les puits appropriés. Deux puits devraient être laissés sans cellules (contrôle négatif). Incuber pendant 20 heures à 37 ° C sous une atmosphère de CO2 à 5% dans un incubateur à chemise d'eau. Ne secouez pas, déplacer ou empiler les plaques l'une sur l'autre pendant l'incubation.
4. Spot de développement et de détection
- Jeter les cellules et laver les plaques 10x avec 1x PBS additionné de 0,05% (v / v) de Tween 20 (PBST). Tween 20 permet que les cellules ont adhéré au PVDF me détacherMbrane après incubation pendant la nuit.
- En utilisant une pipette multicanaux, ajouter 100 ul de 0,5 mg / ml de biotine conjugué à un anticorps monoclonal anti-IFN-γ (4S.B3 clone) dilué dans 1 x PBS contenant 0,5% (p / v) de sérum-albumine bovine (BSA). Incuber les plaques pendant 2 h à température ambiante.
- Laver les puits 6x avec du PBST et ajouter dans chaque puits 100 pi de streptavidine conjugatd avec la phosphatase alcaline dilué 1:1000 dans 1x PBS contenant 0,5% (p / v) de BSA. Couvrir et incuber les plaques pendant 1 heure à température ambiante.
- Laver les plaques 3 fois avec PBST et 3x avec PBS 1x. Ajouter 100 ul d'un phosphate de 5-bromo-4-chloro-3-indolyle (BCIP) / nitro bleu de tétrazolium chlorure (NBT) Solution de substrat et incuber 5 minutes à température ambiante.
- Laver les plaques sous l'eau distillée. Retirer la partie inférieure de la plaque ELISpot et laver les deux côtés de la membrane avec de l'eau distillée. Air sécher les plaques.
- Examiner les puits et énumérer les points à l'aide d'un d stéréoscopiquemicroscope issection ou scanner les plaques à l'aide d'un compteur de point automatique. Garder les assiettes abri de la lumière si elles ne peuvent pas être examinés le même jour.
- Calculer la moyenne des nombres de points comptés dans les puits en double correspondantes et soustraire le nombre de spots comptés dans les puits témoins négatifs (pas de cellules) à partir du nombre de points comptés dans les puits de test.
- Exprimer la production d'IFN-γ en tant que le nombre d'unités formant des taches (SFU) pour 10 6 CMSP.
- Considérez que les échantillons d'essai sont positifs si le nombre de SFU est> 50 10 6 PBMC et 2 déviations standard (SD) au-dessus du contrôle négatif (cellules + milieu AIM-V complété avec 2% (v / v) IHS).
- Utilisez une valeur de 400 SFU par puits lorsque les taches sont trop nombreux pour être comptés.
- Tester si les données ELISpot sont normalement distribués ou non à l'aide du test de Kolmogorov-Smirnov. Lorsque les données sont distribuées normalement, effectuer des comparaisons statistiques en utilisant les T-tes de l'étudiantt (2 groupes) ou analyse de la variance et le post-test de Bonferroni (de comparaisons multiples). Si les données ne sont pas distribuées normalement, utiliser le test de Mann-Whitney (2 groupes) ou le test de Kruskal-Wallis et post-test de Dunn (comparaisons multiples).
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Representative Results
Le protocole ELISPOT IFN-γ détaillé ci-dessus a été développé et optimisé dans notre laboratoire pour mesurer l'ampleur et la qualité des réponses immunitaires à médiation cellulaire dirigées contre le VZV 4. Diverses sources d'antigène VZV peuvent être utilisés pour l'étape de stimulation. Il s'agit notamment: a) disponible dans le commerce détergents extraits inactivés du VZV infectés cellules Vero 18; b) les piscines de chevauchement des peptides synthétiques de protéines codées VZV spécifiques, y compris IE63 15 et ORF4 19; c) vaccin vivant atténué varicelle-zona 20; et d) UV préparations inactivées de VZV antigènes à partir du surnageant de cellules infectées par le VZV perturbé MRC 14. Dans notre cas, les dilutions de vaccin VZV vivant atténué ont été préférés à la culture cellulaire dérivée VZV afin d'assurer l'uniformité dans la source d'antigène et de la préparation et de limiter la culture et de la manipulation des souches de VZV de type sauvage vivants dans un milieu clinique où de transmissio nosocomialen est un grave problème 10. En outre, l'irradiation γ a été préférée à une inactivation UV 21 à cause de la précision relative avec laquelle les doses de rayonnement γ peut être délivrée et parce que, contrairement aux UV, des rayons γ pénètre efficacement des ampoules scellées contenant le VZV. L'irradiation des stocks viraux conduit à des estimations systématiquement plus élevés de la fréquence de VZV cellules spécifiques IFN-γ produisant dans des échantillons de PBMC provenant d'un donneur sain à toutes les dilutions d'antigène VZV testé (figure 1). C'est peut-être le résultat de l'atténuation des effets cytopathiques induits par VZV vivant atténué en culture cellulaire.
Pour déterminer quel antigène VZV de dilution a donné des lectures maximales en termes de nombre de SFU par 10 6 PBMC, IFN-γ ELISpot a été réalisée en utilisant des dilutions doubles de γ irradié vaccin vivant atténué VZV et des échantillons de PBMC obtenu à partir d'un groupe d'enfants immunocompétents âgés entre 9 mois et 12 vousars qui avait une histoire documentée de la varicelle et / ou une sérologie positive pour le VZV (n = 50). . sujets de l'étude ont été recrutés dans les clinique des maladies infectieuses et d'immunologie clinique spécial du CHU Sainte-Justine entre Juin 2007 et Septembre 2009 ont été observés différences statistiquement significatives entre les fréquences médianes des cellules productrices d'IFN-γ qui ont été obtenus en utilisant le 1:200, 1: 400 et 1:800 dilutions d'antigène VZV (p <0,0001, test de Kruskal-Wallis) (Figure 2). Ces disparités ont été comptabilisées par la différence entre la dilution 1:200 (médiane = 115,0 SFU par 10 6 PBMC; interquartile [IQR] = 75,0 à 232,5 SFU par 10 6 CMSP) et la dilution 1:800 (médiane = 50,0 SFU par 10 6 PBMC; IQR = 20,0 à 105,0 SFU par 10 6 CMSP), et entre la dilution 1:400 (médiane = 92,5 SFU par 10 6 PBMC; IQR = 52,5 à 177,5 SFU par 10 6 CMSP) et le 1:800 dilution (p <0,001 et p (figure 2). Pour cette raison, la dilution 1:200 de γ irradiée vaccin VZV vivant atténué a été sélectionné pour être utilisé dans les mesures de routine de réponses immunitaires à médiation cellulaire spécifique du VZV.
Afin de déterminer si la production d'IFN-γ se trouve dans les sous-ensembles de lymphocytes CD4 + et / ou CD8 + T, des échantillons de PBMC provenant d'un donneur sain ont été soumis à déplétion des lymphocytes CD4 + ou CD8 + à l'aide d'anti-CD4 ou anti-CD8 anticorps couplé billes magnétiques selon les instructions du fabricant. En concordance avec des rapports publiés antérieurement 22,23, épuisement des cellules CD4 + a entraîné une réduction remarquable dans les fréquences des cellules productrices d'IFN-γ qui ont été obtenus en utilisant les 1:100, 1:200 et 1:400 dilutions d'antigène VZV, tandis que l'épuisement des cellules CD8 + n'a pas conduit à une telle réduction et le contrôle positifs (stimulation avec un anticorps monoclonal anti-CD3) n'ont pas été affectés de manière similaire (figure 3). Ces résultats suggèrent que la majorité des cellules qui produisent de l'IFN-γ en réponse à une stimulation avec des antigènes de VZV sont des cellules T CD4 +. Sinon, ces résultats pourraient provenir de la déplétion des cellules CD4 + présentatrices d'antigènes (c'est à dire les monocytes, cellules dendritiques) de la piscine PBMC, conduisant à des niveaux réduits de présentation des antigènes de VZV répondeur lymphocytes T CD8 +. L'utilisation de irradié VZV est peu probable d'avoir contribué à l'inclinaison de la réponse CD4 vers la domination, des résultats similaires ont été obtenus comme par d'autres groupes en utilisant différentes techniques et sources d'antigènes 14,21,22. Un faible grossissement micrographie de puits ELISPOT représentatifs sont présentés dans la figure 4.
| Problème / question | Les causes possibles | Remède / solution </ Td> |
| Haut fond taches / mal définis ou confluentes | Un grand nombre de cellules mortes. | Évaluer la viabilité des cellules avant culture set-up et de stimulation. |
| Membrane insuffisante des étapes pré-mouillage. | Assurez-vous de respecter les temps de pré-mouillage et que la membrane tour au gris après 1 min. 35% d'éthanol doit être préparée immédiatement avant utilisation. | |
| Les plaques déplacées au cours de la période d'incubation. | Ne pas déplacer les plaques pour éviter les taches sur la piste de l'escargot mal définis. | |
| Étapes de lavage. | Lavage à la main est plus efficace que les laveuses de plaques. | |
| La formation d'agrégats de protéines. | Filtrer les anticorps de capture et de détection pour réduire le fond et les taches de faux positifs. | |
| Concentration de l'anticorps secondaire et de détection. | Réglez biotinylé soicondaires / détection concentration d'anticorps pour réduire le fond. | |
| Froid réactifs de développement. | Apportez substrat à température ambiante pour éviter le sous-développement. | |
| Pas de taches / puits à blanc | Taches mal définie. | Ne pas empiler des plaques au cours de la période d'incubation à une température homogène dans les différents puits. |
| substrat de stimulation pas bien préparé. | Amener l'aliquote de mélange de peptides à la température ambiante pendant 15 min afin d'éviter la formation de cristaux. | |
| Cellule agglutination. | Remettre les cellules en suspension à cellule unique afin d'éviter une sous-estimation des unités formant des taches. | |
| Les cellules non stimulées de manière appropriée. | Utilisation d'un activateur polyclonal comme témoin positif. | |
| L'inhibition de l'enzyme par réaction de tween-20. | Étaith plaques avec du PBS avant d'ajouter la solution de substrat BCIP / NBT. | |
| Paires d'anticorps mauvaises. | Assurez-vous que les anticorps de capture et de détection réagissent avec différents épitopes antigéniques. |
Tableau 1. Dépannage supplémentaires.
Figure 1. Effet de la γ-irradiation de vaccin VZV inactivé en direct sur la fréquence de cellules produisant de l'IFN-γ comme déterminé en utilisant l'IFN-γ ELISpot. VZV spécifique de l'IFN-γ ELISpot a été réalisée comme décrit sous protocole texte en utilisant des PBMC d'un volontaire de commande et dilutions en série de γ irradiés (10000 Gy) vivent vaccin VZV atténué comme antigène. Les données représentent la moyenne de deux exemplaires MeasureMents et les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne. PBMC: cellules mononucléaires du sang périphérique; SFU: repérer unités de formation; VZV: virus varicelle-zona.
Figure 2. Quantification du VZV cellule spécifique réponses immunitaires chez les enfants avec des preuves documentées d'une infection antérieure par le VZV. VZV spécifique IFN-γ ELISpot a été réalisée comme décrit en vertu du protocole texte en utilisant des PBMC isolés chez des sujets ayant des antécédents de varicelle (n = 50) et des dilutions en série de γ irradiés (10000 Gy) vivent vaccin VZV atténué comme antigène. Les lignes horizontales représentent la médiane, les boîtes représentent intervalle interquartile (IQR), et les moustaches représentent la plage de valeurs. PBMC: cellules mononucléaires du sang périphérique; SFU: repérer unités de formation; VZV: virus de la varicelle et du zona .
Figure 3. Effet de la déplétion de cellules CD4 + ou des cellules CD8 + de la fréquence de cellules produisant de l'IFN-γ, mesurée à l'aide d'IFN-γ ELISpot. Déplétion des cellules CD4 + ou CD8 + spécifiques du VZV et de l'IFN-γ ELISpot ont été réalisées comme décrit dans la Protocole texte en utilisant des PBMC d'un bénévole de contrôle et des dilutions en série de γ irradiés (10000 Gy) vaccin vivant atténué VZV comme antigène. Les données représentent la moyenne des mesures en double et les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne. PBMC: cellules mononucléaires du sang périphérique; SFU: repérer unités de formation; VZV: virus varicelle-zona.
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Figure 4. Représentative puits ELISPOT. VZV spécifique de l'IFN-γ ELISpot a été réalisée comme décrit sous protocole texte en utilisant des PBMC provenant de cinq volontaires de commande et des dilutions en série de γ irradiées (10000 Gy) vaccin vivant atténué comme antigène VZV. Première rangée: contrôles négatifs (milieu AIM-V complété avec 2% (v / v) IHS); deuxième rangée: contrôles positifs (anticorps anti-CD3 monoclonal); troisième rangée: antigène VZV. Numéros dans les coins supérieurs représentent SFU par ainsi que mesurée à l'aide d'un compteur de point automatique. PBMC: cellules mononucléaires du sang périphérique; SFU: repérer unités de formation; VZV: virus de la varicelle et du zona; IHS: sérum humain inactivé.
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Discussion
Modifications et dépannage: essais IFN-γ ELISpot ont été utilisées pour examiner les réponses immunitaires à médiation cellulaire dirigée contre une variété de pathogènes microbiens, y compris le type de virus de l'immunodéficience humaine 1 (VIH-1) 24,25, virus de l'hépatite C (VHC) 26, 27, et Mycobacterium tuberculosis 28,29, pour n'en nommer que quelques-uns. Ici, nous avons décrit le développement d'un test ELISPOT IFN-γ pour mesurer l'immunité cellulaire contre, avec l'espoir de définir les corrélats de VZV reconstitution immunitaire spécifique à récupérer bénéficiaires UCBT pédiatriques.
Les principales caractéristiques de cet essai sont quatre fois. En premier lieu, il ne nécessite pas l'expansion préalable in vitro des lymphocytes T, ce qui prend du temps. En second lieu, elle peut être réalisée en utilisant des échantillons de PBMC cryopréservées, ce qui est mieux pour minimiser la variabilité inter-essai. En outre, la cryoconservation et le traitement parallèle sont bien adaptés à longitudinalementétudes internes, qui exigent que les échantillons soient traitées par lots. Troisièmement, pour empêcher l'agglutination de cellules rencontrées lors de la décongélation de PBMC, un traitement avec un ultra-pure de l'endonucléase génétiquement de Serratia marcescens a été utilisé. Cellule agglutination lors de la décongélation PBMC survient plus fréquemment lors de l'utilisation des échantillons de sang qui sont laissés toute une nuit à température ambiante avant le traitement. L'incorporation de l'endonucléase de génie génétique à partir de Serratia marcescens est connu pour ne pas affecter la viabilité cellulaire, l'expression des marqueurs de surface cellulaire et de la réponse à la stimulation avec l'antigène apparenté sur le plan de l'USF depuis un faible niveau de nucléase sont utilisés et la durée d'exposition est courte 22. Vaccin VZV vivant atténué Quatrièmement, γ irradiées a été utilisé pour stimuler les PBMC. Il a été préféré à une culture de cellules dérivée VZV afin d'assurer l'uniformité de la dose d'antigène et à la préparation et à surmonter la nécessité pour la manipulation de VZV vivant dans un milieu clinique où la sécurité des patients etpersonnel de laboratoire est une préoccupation majeure. Pris ensemble, les modifications qui ont été introduites dans le test VZV ELISpot visaient à faire mieux adapté pour une utilisation dans un environnement clinique.
Limites de l'importance de la technique par rapport aux méthodes existantes: méthodes simples, sensibles et reproductibles sont nécessaires afin de mesurer les réponses immunitaires à médiation cellulaire de l'hôte dirigés contre des antigènes microbiens dans le cadre de suivi clinique. IFN-γ ELISpot est un test robuste, reproductible et informative qui peut être effectuée sur des échantillons de sang veineux en utilisant un équipement relativement faible technologie (centrifugeuses, des incubateurs, dissection microscope). Toutefois, elle ne permet pas aisément la détection simultanée de plusieurs cytokines et des marqueurs de surface cellulaire. T in vitro des dosages traditionnels de la prolifération cellulaire, qui ont été utilisés classiquement pour la numération des CD4 + et CD8 + antigène spécifiles réponses des lymphocytes T c, beaucoup de travail, manquent de sensibilité et ont tendance à souffrir d'un degré élevé de variabilité inter-essai 30,31. D'autre part, cytotoxiques dosages de lymphocytes T (CTL) basées sur la lyse des cibles autologues chargées avec du 51Cr et analyse de dilution limitante ont tendance à dépendre du temps des étapes d'expansion in vitro pour quantifier les lymphocytes T CD8 + de l'antigène spécifiques qui sont présents à une précurseur basses fréquences 32,33. Essais basés cytométrie de flux qui permettent de mesurer la sécrétion de cytokines après une stimulation antigénique (cytokine de coloration intracellulaire [ICS]) 34,35 peuvent également être utilisés pour caractériser les réponses immunitaires spécifiques de l'antigène. ICS permet la détection simultanée de la production de cytokines et l'expression de surface cellulaire des marqueurs phénotypiques dans des cellules individuelles. La sensibilité de la SCI compare à celle de ELISpot, mais il nécessite un plus grand nombre de cellules 36,37. Les procédés qui font usage de fluorescence classe I ou de classe II peptide-major complexe d'histocompatibilité (PMHC) des oligomères (tétramères de PMHC) 38 à 40 sont précises et permettent la caractérisation multiparamétriques de sous-ensembles de lymphocytes sur la base de l'expression de marqueurs de surface cellulaire. Cependant, pMHC tétramère coloration nécessite la connaissance préalable de l'homme antigène leucocytaire des patients (HLA) de type, qui peut être lourde et limiter le recrutement des patients dans une étude donnée. Une autre limite de cette technique est que la coloration tétramère pMHC permet principalement la détection de cellules T exprimant moyenne à haute affinité des récepteurs de cellules T (TCR) 41. D'autre part, les cellules T CD8 + exprimant des TCR de faible affinité qui ne sont pas colorées par des tétramères pMHC peuvent être facilement détectés à l'aide d'IFN-γ ELISpot 41. En outre, tétramères pMHC peuvent se lier à ce qu'on appelle les lymphocytes T CD8 + épuisés qui sont répandues dans les infections virales chroniques 42,43, ce qui fausse l'évaluation fonctionnelle de la réponse immunitaire à médiation cellulaire spécifique de l'antigène. Finally, pMHC tétramère coloration et ICS nécessitent généralement un personnel hautement qualifié, des réactifs relativement coûteux, d'instruments sophistiqués, et des installations spécialisées, ce qui rend ces techniques notoirement difficiles à mettre en œuvre dans un cadre de suivi clinique.
Les applications futures: double couleur dosages ELISpot capables de détecter simultanément la production d'IFN-γ à la fois et d'IL-2 et 44 méthodes à double et triple-couleurs FLUOROSPOT 45 ont suscité beaucoup d'intérêts, car ils permettent l'évaluation spécifique de la polyfonctionnalité de l'antigène T lymphocytes, ce qui est une caractéristique importante des cellules efficace des réponses immunitaires à médiation 46.
Les étapes critiques dans le protocole: questions techniques supplémentaires doivent être soigneusement examinées. Parce que de nombreuses variables peuvent affecter la qualité de tache (c'est à dire de la taille et de la densité) et engourdier, le respect du protocole est essentiel pour obtenir des résultats sensibles et reproductibles. L'utilisation systématique des marques spécifiques d'anticorps monoclonaux (de capture et de détection), plaques ELISpot avec des membranes de PVDF, et de l'éthanol à 35% pour le traitement de la membrane avant le revêtement est d'une grande importance. Par exemple, un surtraitement avec de l'éthanol peut affecter les performances du test et de la qualité du spot. Pour éviter l'obtention de puits non informatifs (par exemple> 300 spots), nous vous recommandons d'utiliser pas plus de 2 x 10 5 PBMC par puits. Face à de faibles fréquences de cellules T spécifiques de l'antigène, sensibilité de l'essai peut être renforcée par des cellules prestimulating in vitro avec l'antigène apparenté ou de les étendre à des activateurs polyclonaux tels que la phytohémagglutinine (PHA) pendant une période de temps définie (habituellement 3-7 jours) 38 . Toutefois, la procédure optimisée finale pour le test ELISpot VZV présentées ici ne comprend pas dans préstimulation vitro et / ou les étapes de dilatation. Nombre et quality des taches étaient similaires sur une plage d'incubation de 16-21 heures. Au-delà de 21 heures d'incubation, les taches sont souvent plus diffus et parfois se chevauchent, ce qui rend leur énumération plus difficile. En outre, le déplacement des plaques, tandis que les cellules sont en période d'incubation peut conduire à des taches de sentiers escargot mal définis qui sont également plus difficiles à compter. Dépannage supplémentaires des repères sont fournis dans le tableau 1.
Lors de l'utilisation d'un compteur de point automatique, la sensibilité et la taille du spot de déclenchement sont fixés en utilisant le contrôle positif (anticorps monoclonal anti-CD3) et de contrôle négatif (milieu AIM-V complété avec 2% (v / v) IHS). Les caractéristiques importantes à considérer lors de l'énumération place sont de taille et de forme (figure 4). La première permet de distinguer des lymphocytes T taches de cytokines dérivées de taches de fond qui doivent être ignorés. Numéro de spot fournit une estimation de la fréquence des cellules T spécifiques de VZV présent dans un PB proposéeÉchantillon MC, tandis que la taille du spot reflète combien IFN-γ est produit par chacune des cellules individuelles.
À notre connaissance, c'est la seule méthode ELISPOT IFN-γ qui fait usage de γ irradiée vaccin vivant atténué comme antigène VZV 4. Panneaux de peptides synthétiques chevauchants (15-mères) ont également été utilisés comme antigène, y compris mélange de peptides basés sur la séquence d'acides aminés de la phosphoprotéine IE63 de VZV. IE63 est hautement immunogène et 47 semble être cruciale pour l'infectivité virale et l'établissement de la latence 48. Cellules spécifiques IE63 T ont été détectés dans VZV séropositifs donneurs sains 15, ce qui suggère que IE63 est une cible importante de l'immunité à médiation cellulaire dirigée contre le VZV. Cependant, les cellules réactives sont révélés être en grande partie des cellules T CD4 + 15.
Le dosage de l'IFN-γ VZV ELISpot a déjà été utilisé par our groupe pour évaluer les réponses des cellules T spécifiques de VZV dans 28 enfants qui ont subi UCBT pour traiter les troubles sanguins héréditaires néoplasiques ou 4. Les résultats qui ont été obtenus au cours de cette étude suggèrent que la fois CD4 + et des sous-ensembles de cellules T CD8 + ont été impliqués dans la production d'IFN-γ et que la reconstitution du compartiment naïve de lymphocytes T CD8 + a conduit à des réponses immunitaires à médiation plus robuste de cellules spécifiques du VZV dans termes de production d'IFN-γ. Fait important, ces résultats montrent également que la détection de plus de 150 SFU par 10 6 PBMC était compatible avec la protection médiée par les cellules T contre une infection par le VZV ou réactivation 4. Toutefois, cette valeur de seuil pour le VZV spécifique immunité à médiation cellulaire dans le contexte de UCBT et qui a suivi la reconstitution immunitaire ou l'absence de celui-ci devra être validé dans les grandes études multicentriques prospectives.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier les participants de l'étude et de leurs parents. Nous tenons également à remercier le Dr Réjean Lapointe (CHUM Notre-Dame, Montréal, Canada) pour l'accès à son lecteur ELISpot, le Dr Lubo Alexandrov pour l'analyse statistique, et Denis Blais, Sandra Caron, Silvie Valois et Martine Caty pour expert technique assistance. Pris en charge par des subventions du Fonds d'opération le Pour Les Projets de recherche clinique et D'évalutation des technologies (CHU Sainte-Justine) à HS et PO, par la Fondation Centre de cancérologie Charles-Bruneau, et par la Leukemia & Lymphoma Society de Canada. ISF a été soutenu par des bourses de la Fondation CHU Sainte-Justine et le Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQS). AJG a été le récipiendaire de bourses du Département de microbiologie, infectiologie et d'immunologie de l'Université de Montréal (Bourse Gabriel-Marquis), FRQS, et les Instituts de la santé Recherche du Canada (IRSC). NM a été soutenu par la Fondation CHU Sainte-Justine, la Fondation Cole, et FRQS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leucocep tube | VWR | 89048-936/89048-932 | 12 ml or 50 ml tubes may be used depending on the volume of blood. |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-1440-02 | Protect from light. |
| Benzonase nuclease | Novagen | 70746-3 | Keep at -20 °C. |
| MultiScreenHTS-IP Filter Plate | Millipore | MSIPS4W10 | Sterile with pore size of 0.45 µm. |
| Mouse anti-human IFN-γ capture antibody | BD Biosciences | 551221 | NIB42 clone. |
| Pepmix VZV IE63 | JPT Peptide Technologies | PM-VZV-IE63 | Dissolve contents of one vial in 40 μl of DMSO. Use within 6 months. |
| Biotin-conjugated anti-IFN-γ monoclonal antibody | BD Biosciences | 554550 | 4SB3 clone. |
| Streptavidin conjugated with alkaline phosphatase | Bio-Rad Life Science | 170-3554 | Dilute for use on the same day. |
| BCIP/NBT | Bio-Rad Life Science | 170-6432 | Protect from light. |
References
- Ballen, K. K., et al. Umbilical cord blood transplantation: the first 25 years and beyond. Blood. 122 (4), 491-498 (2013).
- Vandenbosch, K., et al. Varicella-zoster virus disease is more frequent after cord blood than after bone marrow transplantation. Biol. Blood Marrow Transplant. 14 (8), 867-871 (2008).
- Barker, J. N., et al. Serious infections after unrelated donor transplantation in 136 children: impact of stem cell source. Biol. Blood Marrow Transplant. 11 (5), 362-370 (2005).
- Merindol, N., et al. Reconstitution of protective immune responses against cytomegalovirus and varicella zoster virus does not require disease development in pediatric recipients of umbilical cord blood transplantation. J. Immunol. 189 (10), 5016-5028 (2012).
- Feldman, S., et al. Varicella in children with cancer: Seventy-seven cases. Pediatrics. 56 (3), 388-397 (1975).
- Arvin, A. M. Varicella-Zoster virus: pathogenesis, immunity, and clinical management in hematopoietic cell transplant recipients. Biol. Blood Marrow Transplant. 6 (3), 219-230 (2000).
- Wiegering, V., et al. Varicella-zoster virus infections in immunocompromised patients - a single centre 6-years analysis. BMC Pediatr. 11, 31 (2011).
- Boeckh, M., et al. Long-term acyclovir for prevention of varicella zoster virus disease after allogeneic hematopoietic cell transplantation--a randomized double-blind placebo-controlled study. Blood. 107 (5), 1800-1805 (2006).
- Boeckh, M. Prevention of VZV infection in immunosuppressed patients using antiviral agents. Herpes. 13 (3), 60-65 (2006).
- Tomblyn, M., et al. Guidelines for preventing infectious complications among hematopoietic cell transplantation recipients: a global perspective. Biol. Blood Marrow Transplant. 15 (10), 1143-1238 (2009).
- Ljungman, P., et al. Long-term acyclovir prophylaxis in bone marrow transplant recipients and lymphocyte proliferation responses to herpes virus antigens in vitro. Bone Marrow Transplant. 1 (2), 185-192 (1986).
- Selby, P. J., et al. The prophylactic role of intravenous and long-term oral acyclovir after allogeneic bone marrow transplantation. Br. J. Cancer. 59 (3), 434-438 (1989).
- Distler, E., et al. Recovery of varicella-zoster virus-specific T cell immunity after T cell-depleted allogeneic transplantation requires symptomatic virus reactivation. Biol. Blood Marrow Transplant. 14 (12), 1417-1424 (2008).
- Levin, M. J., et al. Decline in varicella-zoster virus (VZV)-specific cell-mediated immunity with increasing age and boosting with a high-dose VZV vaccine. J. Infect. Dis. 188 (9), 1336-1344 (2003).
- Jones, L., et al. Phenotypic analysis of human CD4+ T cells specific for immediate-early 63 protein of varicella-zoster virus. Eur. J. Immunol. 37 (12), 3393-3403 (2007).
- Czerkinsky, C., et al. Reverse ELISPOT assay for clonal analysis of cytokine production. I. Enumeration of gamma-interferon-secreting cells. J. Immunol. Methods. 110 (1), 29-36 (1988).
- Hutchings, P. R., et al. The detection and enumeration of cytokine-secreting cells in mice and man and the clinical application of these assays. J. Immunol. Methods. 120 (1), 1-8 (1989).
- De Castro, N., et al. Varicella-zoster virus-specific cell-mediated immune responses in HIV-infected adults. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 27 (10), 1089-1097 (2011).
- Jones, L., et al. Persistent high frequencies of varicella-zoster virus ORF4 protein-specific CD4+ T cells after primary infection. J. Virol. 80 (19), 9772-9778 (2006).
- Malavige, G. N., et al. Viral load, clinical disease severity and cellular immune responses in primary varicella zoster virus infection in Sri Lanka. PLoS One. 3 (11), (2008).
- Sadaoka, K., et al. Measurement of varicella-zoster virus (VZV)-specific cell-mediated immunity: comparison between VZV skin test and interferon-gamma enzyme-linked immunospot assay. J. Infect. Dis. 198 (9), 1327-1333 (2008).
- Smith, J. G., et al. Development and validation of a gamma interferon ELISPOT assay for quantitation of cellular immune responses to varicella-zoster virus. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 8 (5), 871-879 (2001).
- Ouwendijk, W. J., et al. T-cell immunity to human alphaherpesviruses. Curr. Opin. Virol. 3 (4), 452-460 (2013).
- Rowland-Jones, S. L., et al. Cytotoxic T cell responses to multiple conserved HIV epitopes in HIV-resistant prostitutes in Nairobi. J. Clin. Invest. 102 (9), 1758-1765 (1998).
- Alter, G., et al. Human immunodeficiency virus (HIV)-specific effector CD8 T cell activity in patients with primary HIV infection. J. Infect. Dis. 185 (6), 755-765 (2002).
- Lechner, F., et al. Analysis of successful immune responses in persons infected with hepatitis C virus. J. Exp. Med. 191 (9), 1499-1512 (2000).
- Fournillier, A., et al. A heterologous prime/boost vaccination strategy enhances the immunogenicity of therapeutic vaccines for hepatitis C virus. J. Infect. Dis. 208 (6), 1008-1019 (2013).
- Adetifa, I. M., et al. Interferon-γ ELISPOT as a biomarker of treatment efficacy in latent tuberculosis infection: a clinical trial. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 187 (4), 439-445 (2013).
- Lalvani, A., Pareek, M. A 100 year update on diagnosis of tuberculosis infection. Br. Med. Bull. 93, 69-84 (2010).
- Berger, R., et al. A dose-response study of a live attenuated varicella-zoster virus (Oka strain) vaccine administered to adults 55 years of age and older. J. Infect. Dis. 178 Suppl. 1, (1998).
- Trannoy, E., et al. Vaccination of immunocompetent elderly subjects with a live attenuated Oka strain of varicella zoster virus: a randomized, controlled, dose-response trial. Vaccine. 18 (16), 1700-1706 (2000).
- Brunner, K. T., et al. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).
- Moretta, A., et al. Quantitative assessment of the pool size and subset distribution of cytolytic T lymphocytes within human resting or alloactivated peripheral blood T cell populations. J. Exp. Med. 158 (2), 571-585 (1983).
- Jung, T., et al. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 159 (1-2), 197-207 (1993).
- Maecker, H. T., et al. Standardization of cytokine flow cytometry assays. BMC Immunol. 6, 13 (2005).
- Nomura, L., et al. Standardization and optimization of multiparameter intracellular cytokine staining. Cytometry A. 73 (11), 984-991 (2008).
- Letsch, A., Scheibenbogen, C. Quantification and characterization of specific T-cells by antigen-specific cytokine production using ELISPOT assay or intracellular cytokine staining. Methods. 31 (2), 143-149 (2003).
- Merindol, N., et al. Umbilical cord blood T cells respond against the Melan-A/MART-1 tumor antigen and exhibit reduced alloreactivity as compared with adult blood-derived T cells. J. Immunol. 185 (2), 856-866 (2010).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Scriba, T. J., et al. Ultrasensitive detection and phenotyping of CD4+ T cells with optimized HLA class II tetramer staining. J. Immunol. 175 (10), 6334-6343 (2005).
- Stone, J. D., et al. Interaction of streptavidin-based peptide-MHC oligomers (tetramers) with cell-surface TCRs. J. Immunol. 187 (12), 6281-6290 (2011).
- Pantaleo, G., et al. Evidence for rapid disappearance of initially expanded HIV-specific CD8+ T cell clones during primary HIV infection. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 94 (18), 9848-9853 (1997).
- Wherry, E. J. T cell exhaustion. Nat. Immunol. 12 (6), 492-499 (2011).
- Boulet, S., et al. A dual color ELISPOT method for the simultaneous detection of IL-2 and IFN-gamma HIV-specific immune responses. J. Immunol. Methods. 320 (1-2), 18-29 (2007).
- Ahlborg, N., Axelsson, B. Dual- and triple-color fluorospot. Methods Mol. Biol. 792, 77-85 (2012).
- Precopio, M. L., et al. Immunization with vaccinia virus induces polyfunctional and phenotypically distinctive CD8(+) T cell responses. J. Exp. Med. 204 (6), 405-1416 (2007).
- Sadzot-Delvaux, C., et al. Recognition of the latency-associated immediate early protein IE63 of varicella-zoster virus by human memory T lymphocytes. J. Immunol. 159 (6), 2802-2806 (1997).
- Malavige, G. N., et al. IE63-specific T-cell responses associate with control of subclinical varicella zoster virus reactivation in individuals with malignancies. Br. J. Cancer. 102 (4), 727-730 (2010).
